CN101692045A - 基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法 - Google Patents

Abstract

一种基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法，涉及一种化学分析和光电信号处理方法，它是通过激光光源依次产生的多个相近波长激光照射到同一被测样品上，依次激发出由荧光和拉曼光组成的混合光谱；光谱仪采集到各混合光谱信号，对齐各混合光谱，通过全光谱积分值归一化校正光谱信号幅度，得到经过横坐标对齐和纵坐标幅度校正的光谱；求取各混合光谱两两间差值，该差值即为荧光信号的差分值，计算该差分值的逆差分，逆差分除以差分步长得到的是荧光背景值与一个常数的和，最后从混合光谱中扣除该荧光背景值，即可分离出纯净的拉曼光谱，实现拉曼光谱的荧光消除目的。本发明方法合理，能有效地消除背景荧光，而且成本低、使用方便，易于推广使用。

Description

基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法

【技术领域】：

本发明涉及一种化学分析和光电信号处理方法，特别是一种基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法。

【背景技术】：

拉曼光谱技术是一种非破坏性测试技术，它适用于物质的各种物理形态，其应用范围包括材料、化工、生物医学、环保、考古、地质，以致商贸和刑事司法等。光照射到物质上有三种去向，一部分被透射，一部分被吸收，还有一部分被反射或散射；散射光中包括与入射光波长相同的直接反射光，还包括部分与入射光波长不相同、波长变化与物质分子性质有关的光，其中，拉曼光由分子振动和转动导致的波长变化引起，荧光和磷光由物质被入射光激发导致的能级跃迁释放引起。对于拉曼光而言，荧光是最严重的干扰背景，有时会完全将拉曼光覆盖，以致测量失败。

拉曼光谱设备过去一直比较昂贵，直到近年来激光技术发展成熟，特别是阵列感光元件的使用，才使得应用取得突破性进展。但是由于荧光干扰，使得紫外-可见光拉曼光谱的使用受到限制，作为一般规律，通常遇到的物质中，能够吸收光子产生电子激发态的那些物质所占百分比随增大波长而减小，因此，近红外拉曼光谱在荧光背景方面所遇到的困难较小，目前近红外拉曼光谱被更多推荐和采用。

但是阵列式感光元件在紫外-可见段有更好的性能，在光谱分辨率、设备成熟度和价格优势明显，如果解决荧光背景问题，那么，无论是从仪器性能还是市场表现，紫外-可见拉曼将比近红外拉曼具备更大的优势。

现有的荧光背景处理采用的是样条拟合、傅里叶变换、小波变换等基线校正方法，基于基线校正方法，从原理上可以看出无法保证拉曼光谱纯净；也有采用荧光直接减除，但是荧光光谱远不如拉曼光谱稳定，测量条件对光谱形状有很大影响，很少有荧光光谱汇编，不具备实用价值。在实际应用中，普遍采用的还是调整激发波长至不产生荧光区域，从而绕过荧光产生的被动方法，然而，对于固定检测范围的微小型拉曼光谱仪是难以实现的解决方案。

【发明内容】：

本发明要解决的技术问题是：提供一种基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法，该方法能方便、低成本、有效地消除荧光干扰，从而得到纯净的拉曼光谱。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：一种基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法，该方法是通过激光光源依次产生的多个相近波长激发光照射到同一被测样品上，依次激发出不同的、由荧光和拉曼光组成的混合光谱；光谱仪采集到各个混合光谱信号，以光强度为纵坐标，激发光波长为原点，频移波数为横坐标，对齐各混合光谱，通过全光谱积分值归一化校正光谱信号幅度，得到经过横坐标对齐和纵坐标幅度校正的光谱；然后，求取各混合光谱两两间差值，该差值即为荧光信号的差分值，差分步长为两相互差减的混合信号的激发光波长之差，计算该差分值的逆差分，该逆差分除以差分步长得到的是荧光背景值与一个常数的和，最后从混合光谱中扣除该荧光背景值，即可分离出纯净的拉曼光谱，实现拉曼光谱的荧光消除目的。

本发明的进一步技术方案是：所述的激光光源采用半导体激光器，并采用控制半导体激光器温度的方式调整激光波长。

所述的激光光源的波长漂移范围控制在1～2nm之间。

本发明的基本原理是：

用激光照射被测材料会产生拉曼效应和荧光效应，在激光拉曼光谱中，荧光会对拉曼散射产生干扰。对于固定样品，其荧光波长总是大于激发光波长，如果某一波长的激发光能够激发荧光，该荧光的发射光谱形状与激发波长无关，即荧光的波长处于“绝对”位置；而拉曼光谱目前总是取大于激发光波长的斯托克斯散射，拉曼光谱的横向坐标通常采用“相对”于激发光波长偏移的波数，同一样品，拉曼频移“相对”于激发光波长是固定的。当改变激发光波长时，荧光的形状和位置不改变，而拉曼光谱随激发光波长移动，但频移波数不变。

本发明采用多个不同波长激光激发方式，利用荧光和拉曼光对激发光的不同响应将荧光信号从混合信号中分离，达到消除荧光的目的。在不同波长激光激发的荧光和拉曼光中，相近激发波长不会导致荧光发射波长改变，但不同激发波长产生的拉曼迁移波数固定，即拉曼光谱的波长随激发波长改变，此差异可用于荧光和拉曼信号的分离。

由于采用了上述技术方案，本发明之基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法具有以下有益效果：

1、方法合理，能有效地消除背景荧光：

由于本发明之基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法是从散射光形成机理上实现荧光扣除，比较目前的基线拟合扣除，从原理上避免了直接基线扣除的盲目性，不论是合理性，还是有效性都有较大提高，所得到的拉曼信号更纯净、准确，可以充分发挥紫外-可见波段拉曼光谱测量的高灵敏度、高分辨率、设备成熟度以及低成本的优势。

2、成本低：

由于本发明并未增加任何光路，可以沿用目前的仪器设备，仅需在激光光源设置温控装置即可实现多波长的激发，光谱信号采集后，通过本发明提出的数据处理步骤，即可通过软件方法实现混合光谱中拉曼光谱的纯化，因而不会提高仪器的制造难度和生产成本。

3、使用方便：

可将依据本发明编制的拉曼光谱荧光消除程序，集成至各厂家拉曼光谱仪的驱动程序或数据处理程序，不需要调整现有仪器的使用步骤，因此，本发明在操作步骤上简单易行，使用起来非常方便。

4、对环境要求低，易于推广应用。

下面，结合附图和实施例对本发明之基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法的技术特征作进一步的说明。

【附图说明】：

图1：本发明之基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法中实际测量的混合光谱与纯拉曼光谱、背景荧光光谱之间的关系示意图；

图2：本发明之基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法的流程框图；

图3～图7：本发明之基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法的原理图，

图3：实际测得的混合光谱示意图，图4：各混合光谱对齐后的示意图，

图5：光谱差分图，              图6：逆差分得到的荧光光谱示意图，

图7：扣除荧光背景后的纯拉曼光谱示意图；

【具体实施方式】：

实施例一：

一种基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法，该方法是通过激光光源半导体激光器依次产生的多个相近波长激发光照射到同一被测样品上，依次激发出不同的、由荧光和拉曼光组成的混合光谱；阵列式感光光谱仪采集到各个混合光谱信号，以光强度为纵坐标，激发光波长为原点，频移波数为横坐标，对齐各混合光谱，通过全光谱积分值归一化校正光谱信号幅度，得到经过横坐标对齐和纵坐标幅度校正的光谱；然后，求取各混合光谱两两间差值，该差值即为荧光信号的差分值，差分步长为两相互差减的混合信号的激发光波长之差，计算该差分值的逆差分，该逆差分除以差分步长得到的是荧光背景值与一个常数的和，最后从混合光谱中扣除该荧光背景值，即可分离出纯净的拉曼光谱，实现拉曼光谱的荧光消除目的(流程框图参见图2)。

本发明采用控制半导体激光器温度的方式调整激光波长，即是将目前半导体激光器上单固定温度点控温调整为多点控温，激光器由单点准确波长调整为多点激光波长；由于所述的激光光源半导体激光器的管芯温度每变化1℃，激发光波长变化约0.3nm，因此可通过多点温控准确调整温度，改变激发光波长。

另外，由于较小的波长漂移对荧光和拉曼光的激发效率无显著影响，因此本发明将激光光源的波长漂移范围控制在1～2nm之间。

本发明所述基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法的具体原理如下：

通过激光光源半导体激光器依次产生a波长的激发光、b波长的激发光照射到同一被测样品上，依次激发出混合光谱H，该混合光谱H由背景荧光光谱Y和纯拉曼光谱L叠加而成(如图1所示)，通常荧光是构成背景的主体，其中由a波长的激发光激发的混合光谱为混合光谱H1，由b波长的激发光激发的混合光谱为混合光谱H2；阵列式感光光谱仪采集到混合光谱信号后，建立光谱坐标，即分别以激发光波长a、b为原点，频移波数为横坐标，光强度为纵坐标；所述的混合光谱H1信号和混合光谱H2信号在形状上存在差异(如图3所示)：混合光谱H1的第一波峰至激发光波长a之间的频移波数为Δ波数1，第二波峰至第一波峰之间的频移波数为Δ波数2，第三波峰至第二波峰之间的频移波数为Δ波数3；混合光谱H2的第一波峰至激发光波长b之间的频移波数为Δ波数1’，第二波峰至第一波峰之间的频移波数为Δ波数2’，第三波峰至第二波峰之间的频移波数为Δ波数3’。

对齐各混合光谱，通过全光谱积分值归一化校正光谱信号幅度，即是将混合光谱H1平移|a-b|波长，使Δ波数1与Δ波数1’对齐，Δ波数2与Δ波数2’对齐，Δ波数3与Δ波数3’对齐，得到经过横坐标对齐和纵坐标幅度校正的光谱，此时荧光背景出现平移(参见图4)；

求取各混合光谱在相同频移位置的差值，该差值即为荧光信号的差分值，差分步长为两相邻激发光波长之差，即差分步长为|a-b|波长(单位为：nm)，或|1/a-1/b|×10⁷波数(单位为：cm^-1)(参见图5)。

计算上述差分值的逆差分，然后将该逆差分除以差分步长得到荧光背景值与一个常数的和，从而得出荧光背景值(参见图6)。

最后从混合光谱中扣除该荧光背景值，即可分离出纯净的拉曼光谱(参见图7)，从而实现拉曼光谱的荧光消除的目的。

作为本实施例的一种变换，所述的激光光源也可以采用其它结构的激光光源，同样地，所述的光谱仪也可以采用其它结构的光谱仪。

Claims (3)

1.一种基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法，其特征在于：该方法是通过激光光源依次产生的多个相近波长激发光照射到同一被测样品上，依次激发出不同的、由荧光和拉曼光组成的混合光谱；光谱仪采集到各个混合光谱信号，以光强度为纵坐标，激发光波长为原点，频移波数为横坐标，对齐各混合光谱，通过全光谱积分值归一化校正光谱信号幅度，得到经过横坐标对齐和纵坐标幅度校正的光谱；然后，求取各混合光谱两两间差值，该差值即为荧光信号的差分值，差分步长为两相互差减的混合信号的激发光波长之差，计算该差分值的逆差分，该逆差分除以差分步长得到的是荧光背景值与一个常数的和，最后从混合光谱中扣除该荧光背景值，即可分离出纯净的拉曼光谱，实现拉曼光谱的荧光消除目的。

2.根据权利要求1所述的基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法，其特征在于：所述的激光光源采用半导体激光器，并采用控制半导体激光器温度的方式调整激光波长。

3.根据权利要求1或2所述的基于多波长激发的拉曼光谱的荧光消除方法，其特征在于：所述的激光光源的波长漂移范围控制在1～2nm之间。

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