CN101679945A - 能够产生白蛋白和凝血因子的已分化的无限增殖细胞系、从白血病细胞系制备该细胞系的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来自具肝细胞表型能够产生白蛋白和凝血因子的已分化细胞的细胞系，所述细胞源自人白血病细胞系，优选人THP1细胞系，所述细胞保留无限增殖特性。在本发明细胞系中，优选称为PSC－THP1－EP、PSC－THP1－EP－FAST、PSC－THP1－HEP和PSC－THP1－EPEP的细胞系。本发明还涉及用于获得本发明细胞系的方法及所述细胞系的用途，尤其是用于制备白蛋白和/或凝血因子的用途。

Description

能够产生白蛋白和凝血因子的已分化的无限增殖细胞系、从白血病细胞系制备该细胞系的方法及其用途
本发明涉及源自白血病细胞系(优选市售THP1细胞系)的能够产生白蛋白和凝血因子的已分化细胞系。
本发明利用了通过亚克隆从THP1白血病细胞系衍生的多能干细胞(下文中称作“PSC-THP1”，即多能干细胞-THP1)。具体而言，PSC-THP1细胞来自THP1细胞系，THP1细胞系由对THP1-CD34+/CD14+/CD90+细胞独一的分选技术选出。
PSC-THP1，即THP1-CD34+/CD14+/CD90+多能干细胞，不借助外部诱导例如培养基或生长因子来挑选，而是仅仅借助于分离显示至少三种干细胞表面簇合物(即CD34、CD14和CD90标记)的标记呈阳性的组分而选出。
然后诱导PSC-THP1-CD34+/CD14+/CD90+细胞分化为人组织的各种表型特征，特别是人肝细胞表型。
因此，本发明还涉及用于从白血病细胞系(优选THP1)开始获得多能干细胞系的方法，使所述多能干细胞系分化成特征在于有特定表型(尤其是人肝细胞表型)的相关已分化细胞系的方法，以及具有源自多能干细胞系PSC-THP1-CD34+/CD14+/CD90+的具有人肝细胞表型的细胞系用于生产白蛋白和凝血因子的用途及相关治疗应用。
发明技术背景
干细胞对于所有生物体都极其重要，其特征在于有两种区别于其它细胞类型的特性。首先，它们构成能够复制的非特化细胞的连续无穷的来源。其次，干细胞具有特化的能力，可响应局部信号分化为不同细胞类型。所述事件在受损身体组织需要的时候发生。在某些生理条件或实验条件下，干细胞被诱导以经历变化并执行特化功能(例如肌肉中的肌细胞或肝中的肝细胞等等)。因此，干细胞具有繁殖的能力，也有经历变化以产生许多不同细胞类型的能力，最终，具有代替受损组织的潜能[1-15]。
“干细胞”的一个普遍公认的定义是具有以下两种特性的细胞[2]：
1)无限的或长期的自我更新的能力，即长期繁殖而不分化的能力；
2)产生具有有限增殖能力的暂时性祖细胞的能力，高度分化的细胞群(肝细胞、神经细胞、肌肉细胞、血液细胞、肠细胞等等)是所述祖细胞的后代。
干细胞分化为特定组织的能力随该细胞来源及其所取自的生物体的发育阶段而变化。因此，有几种干细胞类型[2]：
多能细胞，在某种意义上它们拥有分化为任何成熟动物细胞类型的潜能，但它们不是能够产生胚胎的全能细胞。在受精后的第4天或第5天(桑椹胚期)，胚胎仍由相同的胚胎细胞组成，但所述细胞不再能形成胚胎。从受精后的第5及第6天(胚泡期，存在100个或更多个细胞)开始，在桑椹胚里面形成球形腔，其外部细胞团开始分化成将形成胎盘和环绕胚胎的膜的细胞，同时内部细胞团开始分化成将形成真正胚胎的细胞。从内腔细胞团分离的后者这些细胞，正好就是多能干细胞。实际上，如果将这些细胞转移到子宫，它们没有植入和发育的能力，因为除非使胚胎与其从中摄取营养的胎盘发育同步化，否则胚胎发育不能进行下去。在成年人的各种组织(骨髓、肝、滑液、牙髓、心脏、肠、外周血等等)中也已经鉴定出多能干细胞。
然而，胚胎干细胞具有增殖并分化为众多不同的细胞类型的巨大能力，这些细胞类型包括双潜能肝卵圆细胞和肝细胞。它们是最有希望大规模生产的肝细胞。但是，正象胎儿细胞一样，它们的有用性受到伦理考虑、分离困难、排斥的可能性和诱导肿瘤发展的风险的限制。
从研究成体干细胞开始的过去30年间，业已清楚地显示干细胞存在于很多成体组织中，但它们仅能产生特定组织细胞。也就是说不能考虑其重新程序化的可能性。然而，最近在各种人组织中，在骨髓、大脑中、在各种器官间充质细胞中、在脐带血中和在外周血中，还发现了能够产生若干细胞类型(主要有血液、肌肉和神经)的多能干细胞。研究人员一直在观察怎样识别它们、选择它们，怎样维持它们发育，和怎样借助生长因子和其它调控蛋白诱导它们形成各种成熟的细胞类型。足可提及的是，在人骨髓干细胞(其它血液细胞系由其形成)中有CD14+和/或CD29+和/或CD34+和/或CD44+和/或CD45+和/或CD71+和/或CD90+和/或CD105+和/或CD117+分子作为识别标记，当其被纯化时，它们能够重建接受辐射和化疗切除剂量(ablative doses)的患者的整体血细胞群，它们能以与所用细胞数量成比例的速率做到这点[1]。
已知对源自脐带或其它来源的干细胞(CD14+和/或CD29+和/或CD34+和/或CD44+和/或CD45+和/或CD71+和/或CD90+和/或CD105+和/或CD117+造血祖细胞)移植而言，供体-受体的相容性是必不可少的。为此，已经建立了很多骨髓和胎盘血库。在同种异体移植情况下，寻找相容性供体可能花费相当长的时间；另一方面，在自体移植情况下，即干细胞来自相同移植患者(来自骨髓或外周血)，干细胞必须首先经取出，分离、培养、增殖并完好地储存甚至是相当长的时间。
实际上，祖干细胞(CD14+和/或CD29+和/或CD34+和/或CD44+和/或CD45+和/或CD71+和/或CD90+和/或CD105+和/或CD117+)的发育能力对移植得以实现的能力具有重要作用[1-2]。
在成年人中，各种组织(包括骨髓、外周血、肝、肠、牙髓、滑液等等)含有能够分化为成体肝细胞的干细胞。假设可以容易地培养它们(离体培养)的话，这样的细胞的治疗用途将非常令人感兴趣。因为它们源自患者，所以总是可相容，没有与伦理有关的问题[1]。
成体骨髓含有造血祖细胞(来自血液)和基质祖细胞(其形成器官支架)。造血细胞系之一的所谓“HSC”细胞长期产生各种细胞系，包括内皮细胞系。骨髓间质细胞具有同样的能力[2]。
成体血液含有造血祖干细胞。根据Huberman(2003年)的工作，在多能造血细胞中尤其可鉴别“HSC”(CD14+和/或CD34+)细胞，当用生长因子刺激时，可分化并特化为身体许多部分(包括肝脏)的细胞类型[1-2]。
在2003年，Huberman等[1]鉴定了存在于人外周血单核细胞分离物的具干细胞样和多能特性的一组细胞(CD14+和/或CD34+)(PSC，多能干细胞)，也就是说：显示了细胞可怎样被诱导获得巨噬细胞、淋巴细胞、上皮细胞、表皮细胞、神经细胞和肝细胞表型而不必与预先存在的成熟的组织融合。
很不幸，这些生长在补充生长因子的培养基中的细胞在体外不是无限增殖的，在分离后30-40天内，它们衰老死亡。当这些细胞在不含生长因子的培养基中培养时，这种现象加快，即在体外分离后7-8天内，它们衰老死亡。
因此，可将由Huberman等[1]发现并在专利WO2006044842中阐述的多能循环CD14+/CD34+单核干细胞定义为“必死的(MORTAL)”[1]。此外，由我们自己按照Huberman等的方法对从10位志愿者的外周血分离的PSC群进行的关于细胞死亡的研究，在用生长因子处理的细胞中第30天时和在用无生长因子培养基处理的细胞中第7天时，业已显示出p27蛋白(控制细胞凋亡的核蛋白)的重要性增加；这一资料看来确证了依赖进行性细胞衰老的“细胞程序性死亡”的存在。
这些涉及细胞死亡、衰老和凋亡的观察报告也在BlasticonBiotechnologische Furschung GmbH(US2005/0233447)的欧洲专利申请EP1436381B1或EP1506999[Kremer Bernd Karl Friedrich(DE)；Faendrich Fred(DE)；Ruhnke Maren)(DE)]中提出，题目为“Dedifferentiated，programmable stem cells of monocytic origin，and theirproduction and use(单核细胞来源的去分化的程序性干细胞及其生产和应用)”；根据Kremer等，人单核细胞来源的去分化干细胞特征为存在膜相关单核细胞特异性表面抗原CD14和存在选自CD117、CD123和CD135的至少一种多能标记。
前述专利提及通过分离人血液获得单核细胞，并在第59段中提及，如果不能从人血液分离就直接从内脏器官分离，例如在贫血或白血病患者的情况中。因此，以该专利内容为基础，能够假定讨论中的细胞有依赖进行性细胞衰老的“细胞程序性死亡”倾向，因为它们是非肿瘤细胞。
发明说明
本发明目的是提供多能干细胞系，所述细胞系容易获得，无限增殖(因为其来源于白血病所以无限增殖)，随时间过去稳定，并容易分化以获得适用于生产生物学分子的特化细胞系。
根据本发明，达到所述目的是由于在以上权利要求中明确要求保护的解决方法。权利要求构成了本文提供的涉及本发明的技术教导的组成部分。
本发明一个特别优选的实施方案涉及源自无限增殖人单核白血病细胞系(优选人细胞系THP1)的无限增殖白血病多能干细胞系。
在另外的实施方案中，本发明涉及调节和刺激人单核细胞样白血病细胞系成为无限增殖白血病多能干细胞系的方法。更具体地说，在特定实施方案中，该无限增殖单核细胞样白血病细胞系为THP1细胞系，其通过单-双-三克隆增殖和天然未成熟的无限繁殖THP1白血病干细胞的增殖来选出，THP1白血病干细胞显示表示潜在多能干细胞特性的至少三种细胞表面标记，即CD34+、CD14+和CD90+，藉此获得PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+细胞系。
无限增殖PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+细胞系涉及源自多能无限增殖干细胞系的无限增殖细胞系，该无限增殖细胞系具有作为人组织特征的细胞株表型，尤其是人肝细胞表型。
在另一优选实施方案中，本发明涉及诱导无限增殖多能干细胞系分化为具有感兴趣的人组织细胞株表型的衍生的(已分化)无限增殖细胞系的方法。具体而言，本发明涉及使无限增殖细胞系PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+分化为具有以下两个主要特征的衍生的无限增殖细胞系的方法：成熟的肝细胞单克隆表型和无限增殖。
被诱导分化为肝细胞的PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+细胞成为成熟的肝细胞(PSC-THP1-EP)，因而它们可用于诊断、研究和预防及治疗慢性和急性肝病。
在特别优选的实施方案中，本发明无限增殖成熟人肝细胞细胞系是指定为PSC-THP1-EP的细胞系，于2006年11月10日将其保藏于意大利热那亚的高级生物技术中心-国际实验室细胞系保藏中心(Advanced Biotechnology Centre-Interlab Cell Line Collection(ICLC)，Genoa，Italy)，保藏号为ICLC PD No.06005。
无限增殖PSC-THP1-EP细胞系具有成熟的肝细胞表型。该细胞系的某些细胞标记特征列举如下：人HLA-DR1 MHC II类、CD34+、CD44+、CD68+、CD71+、CD81+、CD90+、CD105+、CD117+、TLR5、CDw328、CDw156c、CD172g、LDL Rec(LDL5/6+)+、GATA-4+、HNF-1α+、HNF-3β+、IL-1 RT 1+、CK8+、CK18+、CK7-/+、CK19--/+、C-Met、α甲胎蛋白--/+、白蛋白+。
所述具有成熟的肝细胞PSC-THP1-EP表型的无限增殖细胞系，显示以下的代谢特征：每2-3天的倍增细胞周期，从培养的第3天到第5天分泌白蛋白和凝血因子。
优选在更换培养基后，所述PSC-THP1-EP细胞系在培养的第72小时到第120小时显示分泌白蛋白和凝血因子的特性(白蛋白：在更换培养基后每培养72-120小时30-60g/l；在更换培养基后每培养72-120小时凝血因子为存在于人循环血液中的含量的5％-90％)。
此外，借助PSC-THP1-EP细胞系(ICLC PD No.06005，2006年11月10日)的多次连续分裂，业已选出新的细胞群，即指定为PSC-THP1-EP-FAST的无限增殖细胞系，其具有成熟的肝细胞表型，分离自具有如下特定代谢特征的集落：每6-8小时的快速倍增细胞周期，从更换培养基后第3个小时开始分泌白蛋白和凝血因子，且产生高峰在8-12小时之间(白蛋白：在更换培养基后每培养8-12小时8-10g/l；在更换培养基后每培养8-12小时凝血因子为存在于人循环血液中的含量的5％-90％)。
指定为PSC-THP1-EP-FAST的本发明无限增殖人成熟肝细胞细胞系，于2006年12月15日保藏于意大利热那亚的高级生物技术中心-国际实验室细胞系保藏中心(ICLC)，保藏号为ICLC PD No.06008。
指定为PSC-THP1-EP-FAST的无限增殖细胞系具有已分化为成熟肝细胞的多能干细胞的典型性质。此外，它保留了来源于白血病细胞系所赋予的原有的无限增殖性，并且其基于如下若干特定代谢特征被选出：快速细胞周期；每6-8小时细胞倍增，每12小时更换培养基(每12小时更换50-70％的培养基)；快速新陈代谢和分解代谢(8-12小时)。
该细胞系的某些细胞标记特征列举如下：人HLA-DR1 MHC II类、CD34+、CD44+、CD68+、CD71+、CD81+、CD90+、CD105+、CD117+、TLR5、CDw328、CDw156c、CD172g、LDL Rec(LDL5/6+)+、GATA-4+、HNF-1α+、HNF-3β+、IL-1 RT 1+、CK8+、CK18+、CK7-/+、CK19--/+、C-Met、α甲胎蛋白--/+、白蛋白+。
如上所述，具有上述成熟的肝细胞表型的无限增殖细胞系源自用于产生白蛋白和凝血因子的PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+无限增殖多能干细胞系。
此外，通过聚乙二醇(PEG)介导人HepG2细胞系(可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得)与PSC-THP1-EP细胞系的细胞融合，业已获得新型细胞系(PSC-THP1-HEP)，其具有已分化为肝细胞和成肝细胞的多能干细胞的典型特性，并且保留了其来源于白血病细胞系所赋予的原有的无限增殖性。
在特别优选的实施方案中，本发明无限增殖人肝细胞细胞系是指定为PSC-THP1-HEP的细胞系，于2006年12月15日保藏于意大利热那亚的高级生物技术中心-国际实验室细胞系保藏中心(ICLC)，保藏号为ICLC PD No.06006。
具体而言，本发明涉及所述PSC-THP1-HEP无限增殖细胞系的用途，该细胞系具有已分化为成熟的和未成熟的肝细胞的多能干细胞的典型性质，并且保留了其来源于白血病细胞系所赋予的原有的无限增殖性。
具有成熟的和未成熟的肝细胞表型的本发明PSC-THP1-HEP无限增殖细胞系的核型经由以下实例阐明：
“50～52，XY/XXY，-Y，der(1)？t(1；12)(p32；q13)，+der(1)del(1)(p22p3？4)add(1)(q21)，+del(6)(p21？1)，+del(6)(p21？1)，12，14，+der(14)？t(3；14)(p11；p12)，+del(17)(p11)，18，+mar1，+mar2，+mar3，+mar4”。
所述具有成熟的肝细胞PSC-THP1-HEP表型的无限增殖细胞系具有以下代谢特征：每2-3天的倍增细胞周期，从培养的第3天一直到第7天分泌白蛋白和凝血因子。
优选在更换培养基后，所述PSC-THP1-HEP细胞系在培养的第72-144小时显示分泌白蛋白和凝血因子的特性(白蛋白：在更换培养基后每培养72-144小时30-60g/l；在更换培养基后每培养72-144小时凝血因子为存在于人循环血液中的含量的5％-90％)。
此外，通过优选的PEG介导的人HepG2细胞系与PSC-THP1-EP细胞系与原代成熟的人肝细胞的细胞融合，业已获得新型细胞系，该细胞系具有已分化为成熟的肝细胞的多能干细胞的典型特性，并且保留其来源于白血病细胞系所赋予的原有的无限增殖性。
在特别优选的实施方案中，本发明无限增殖成熟人肝细胞细胞系是指定为PSC-THP1-EPEP的细胞系，于2006年12月15日保藏于意大利热那亚的高级生物技术中心-国际实验室细胞系保藏中心(ICLC)，保藏号为ICLC PD No.06007。
所述PSC-THP1-EPEP无限增殖细胞系具有已分化为成熟的肝细胞的多能干细胞的典型性质，并且保留了其来源于白血病细胞系所赋予的原有的无限增殖性。
PSC-THP1-EPEP无限增殖细胞系具有成熟的肝细胞表型，其核型经由实例列出：
“50～52，XY/XXY，Y，der(1)？t(1；12)(p32；q13)，+der(1)del(1)(p22p3？4)add(1)(q21)，+del(6)(p21？1)，+del(6)(p21？1)，12，14，der(14)？t(3；14)(p11；p12)，+del(17)(p11，+mar1，+mar2，+mar3”。
所述具有成熟的肝细胞PSC-THP1-EPEP表型的无限增殖细胞系具有以下代谢特征：每2-3天的倍增细胞周期，从培养的第3天一直到第5天分泌白蛋白和凝血因子。
优选在更换培养基后，本发明PSC-THP1-EPEP细胞系在培养的第72-120小时显示分泌白蛋白和凝血因子的特性(白蛋白：在更换培养基后每培养72-120小时30-60g/l；在更换培养基后每培养72-120小时凝血因子为存在于人循环血液中的含量的5％-90％)。
此外，本发明涉及白蛋白作为治疗剂和作为用于药物或疫苗的载体的用途；所述白蛋白由具有成熟的肝细胞表型的无限增殖细胞系产生，该细胞系来源于通过分选尤其是通过分离和增殖所述PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+细胞系，从无限增殖多能干细胞克隆的选择。
无限增殖THP-1细胞系为人单核细胞样细胞系(因此为白血病性并无限增殖)，其来源于1名罹患单核细胞白血病的一周岁日本儿童的外周血的细胞培养物(白血病单核细胞)(Tsuchiya等)[16]。置于培养基中的来自该儿童供体的循环单核细胞没有死亡，却以高频率(每2天)进行体外复制；由于其白血病来源使得所述单核细胞无限增殖。
单核白血病细胞定义为“单核细胞样细胞(monocytoids)”，即其具有与其来源细胞相似但不一样的表型特征；实际上，单核细胞是具有确定细胞形态的细胞，其经历不依赖外部因素的细胞衰老(生物学衰老)和死亡，而单核细胞样白血病细胞被肿瘤基因永生化，因此它们永不衰老，具有与环境条件密切相关的极为可变的形态。
能够不断无限复制的无限增殖细胞群，即THP-1细胞系，分离自所述日本儿童的单核细胞样细胞[16]。因此，对无限增殖THP-1细胞的合适的限定并不是限定为单核细胞，而是因其具有白血病特性，限定为具有高度未成熟和无限增殖的典型特征的单核细胞样细胞[1-27]。
措辞无限增殖细胞系意即一旦将其置于培养基中就能够永远繁殖而不会衰老(生物学衰老)的一类细胞。
业已通过体内分选从所述THP1无限增殖细胞系中选择而获得源自THP1无限增殖细胞系的PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+无限增殖多能干细胞系，这些细胞显示至少三种指定为CD34+eCD14+eCD90+的干细胞表面标记呈阳性，藉此获得并增殖具有多能干细胞的典型特性同时还保留了极为重要的无限增殖特征的细胞。
随后对该无限增殖细胞系PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+的调节使得可获得同样为无限增殖并具有成熟肝细胞的典型功能的细胞系(PSC-THP1-EP)。特定情况为，这些无限增殖PSC-THP1-EP细胞被诱导分化，由此获得无未成熟组成的均一细胞群中的成熟肝细胞的形态学和功能特征。
此外，经PSC-THP1-EP细胞系多次连续分裂，选出了新的细胞群，即从显示特定代谢特征的集落中分离的具有成熟肝细胞表型的PSC-THP1-EP-FAST无限增殖细胞系。
此外，通过优选的PEG-介导的人HepG2细胞系与PSC-THP1-EP细胞系的细胞融合，获得新型细胞系(PSC-THP1-HEP)，其具有已分化为成熟的肝细胞和成肝细胞的多能干细胞的典型特性，并且保留了其来源于白血病细胞系所赋予的原有的无限增殖性。
此外，通过优选的PEG-介导的人HepG2细胞系与PSC-THP1-EP细胞系与原代成熟的人肝细胞的细胞融合，获得新型细胞系(PSC-THP1-EPEP)，其具有已分化为成熟的肝细胞的多能干细胞的典型特性，并保留了其来源于白血病细胞系所赋予的原有的无限增殖性。
肝细胞是产生负责维持稳态和凝血的血浆蛋白质的功能肝细胞。
因以下可能性：
-诱导无限增殖PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+细胞分化为无限增殖成熟肝细胞(PSC-THP1-EP)；
-选出具有确定和特定代谢特性的细胞亚克隆(PSC-THP1-EP-FAST)；
-通过细胞融合制备新型稳定的成熟肝细胞细胞系(PSC-THP1-HEP和PSC-THP1-EPEP)；
所以提供用于生产具有人白蛋白和人凝血因子的物理化学、生物学和生理学特性的白蛋白和凝血因子的连续稳定的无限增殖细胞系统，该细胞系统由此成为用于制备治疗多种疾病所需的这样的蛋白质的选择来源。
举例来说，就白蛋白而言，其可能在以下病理中使用：肝功能衰竭、低白蛋白血症、血容量过低、肾病综合征、Menetrier病、小肠小肠瘘、烧伤、肝炎、肝纤维化、肝硬化、在肝硬化中或放液穿刺术后及在吸收障碍综合征中的严重高盐潴留(hydrosaline retention)。
举例来说，就凝血因子而言，其可能在以下病理中使用：
出血；
血管壁的先天性或获得性缺陷；
血小板减少症或血小板病(即在即使血小板数量可能正常时与其有关的疾病)；
涉及一种或多种凝血因子的先天性或获得性缺乏，即：
因子VIII或IX缺乏症(血友病)、因子V和VIII联合缺乏症、因子XIII缺乏症、抗纤溶酶、增加纤溶酶原活性和PAI(纤溶酶原激活剂的抑制剂)缺乏症、单独的血小板因子3缺乏症、异常血纤维蛋白原血、血管性血友病(Von Willebrand’s disease)、可能的因子XII缺乏症、激肽释放酶原和高分子量激肽原缺乏症；
肝病、循环抗凝剂、口服抗凝血剂治疗、肝素、弥散性血管内凝血；
过分的纤维蛋白溶解机制活性；
血栓症；
血管壁缺陷(通常是获得性)；
先天性或获得性天然凝血抑制剂缺乏症(例如AT III、蛋白C或蛋白S缺乏症)；
显著并持久地升高血小板；
纤维蛋白溶解机制缺陷。
发明详述
现在将引用几个优选实施方案纯粹作为非限制性实例来详述本发明。
PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+细胞业已定向特化(在成熟和分化意义上)，它们全部均一地成为具有成熟肝细胞典型功能的细胞(PSC-THP1-EP)。
举例而言，具有肝细胞表型的无限增殖PSC-THP1-EP细胞系显示具有与以下某些细胞标记有关的特征：人HLA-DR1 MHC II类、CD34+、CD44+、CD68+、CD71+、CD81+、CD90+、CD105+、CD117+、TLR5、CDw328、CDw156c、CD172g、LDL Rec(LDL5/6+)+、GATA-4+、HNF-1α+、HNF-3β+、IL-1 RT 1+、CK8+、CK18+、CK7-/+、CK19--/+、C-Met、α甲胎蛋白--/+、白蛋白+。
所述具有成熟的肝细胞PSC-THP1-EP表型的无限增殖细胞系具有以下代谢特征：每2-3天的倍增细胞周期，从培养的第3天一直到第5天分泌白蛋白和凝血因子。
优选在更换培养基后，所述PSC-THP1-EP细胞系在培养的第72-120小时显示分泌白蛋白和凝血因子的特性(白蛋白：在更换培养基后每培养72-120小时30-60g/l；在更换培养基后每培养72-120小时凝血因子为存在于人循环血液中的含量的5％-90％)。
此外，通过PSC-THP1-EP细胞系(2006年11月10日的PD 06005)的多次连续分裂，业已选出新的细胞群PSC-THP1-EP-FAST细胞系，其分离自具有如下特定代谢特征的集落：每6-8小时的快速倍增细胞周期，从更换培养基后第3个小时开始分泌白蛋白和凝血因子，且生产高峰在第8-12小时之间(白蛋白：在更换培养基后每培养8-12小时8-10g/l；在更换培养基后每培养8-12小时凝血因子为存在于人循环血液中的含量的5％-90％)。
具体而言，所述具有已分化为成熟肝细胞的多能干细胞的典型性质并保留了其来源于白血病细胞系所赋予的原有无限增殖性的PSC-THP1-EP-FAST无限增殖细胞系，为了以下特定代谢特性业已经过分离、选择和克隆增殖：快速细胞周期；每6-8小时倍增，需要每12小时更换培养基(每12小时更换50-70％的培养基)。
举例而言，所述具有成熟的肝细胞表型和快速代谢周期的无限增殖PSC-THP1-EP-FAST细胞系具有与以下某些细胞标记有关的特征：人HLA-DR1 MHC II类、CD34+、CD44+、CD68+、CD71+、CD81+、CD90+、CD105+、CD117+、TLR5、CDw328、CDw156c、CD172g、LDL Rec(LDL5/6+)+、GATA-4+、HNF-1α+、HNF-3β+、IL-1 RT 1+、CK8+、CK18+、CK7-/+、CK19--/+、C-Met、α甲胎蛋白--/+、白蛋白+。
这些细胞业已被诱导分化，获得成熟肝细胞的形态和功能特征，通过使其在培养中经受由以下生长因子产生的连续刺激物来实现诱导：HGF(肝细胞生长因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激生长因子)、庆大霉素(gentamycin)、EGF(表皮生长因子)、葡萄糖、白介素2和白介素6组合和氨基酸。
除了白蛋白外，本发明细胞系PSC-THP1-EP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-HEP和PSC-THP1-EPEP还分泌详细列举于表1中的凝血因子到培养上清液中，检测到其5％-80％的活性。
表1.
凝血因子
抗凝血酶III
Von Willebrand因子前蛋白原
Ser/Cys蛋白酶抑制剂C
尿激酶型纤溶酶激活物受体(人UPAR)
凝血酶的缓慢抗凝血形式(人THRB)
凝血因子V
凝血因子VII
凝血因子VIII
凝血因子XIIIB
α-2-巨球蛋白
蛋白C(凝血因子Va和Viiia的灭活剂)
蛋白S(α)
APC(活化的蛋白质C受体)
α-1-抗胰蛋白酶前体(α-1蛋白酶抑制剂/α-1-抗蛋白酶
C1酯酶抑制剂
细胞系
通过在室温下于磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)中将THP-1单核细胞样细胞[16]以160g离心10分钟来洗涤三次，并以再次在磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)中以10X106个细胞/ml的终浓度重新悬浮于50ml管(Nunc，丹买卡姆鲁普)中。
经过在37℃下以160g离心10分钟来洗涤三次后，构成本研究主题的所有细胞样品用缀合以下物质的抗人小鼠单克隆抗体(Mab)来进行体内标记：R-藻红蛋白、抗人CD34(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗人CD14(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗人CD90(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)，并通过分选来进行体内分析和选择(Coulter，Hialeath，美国弗罗里达州)。通过体内无菌细胞荧光测定法(细胞分选仪)分离的细胞表达我们自己认为是基本的至少三种干细胞标记，也就是CD34、CD14和CD90。
将未分化多能干细胞(PSC-THP1-CD34+eCD14+eCD90+)以每ml1X106个细胞的终浓度重新悬浮在6孔板(Lab-Tekchamber slide，Nunc，Kamstrup，Denmark)中，每孔含0.5ml包含补充如下物质的AIM-V培养基(GIBCO)的最终溶液：
10％FCS(Celbio，意大利米兰)；
100单位/mL青霉素(penicillin)；
100μg/mL链霉素(streptomycin)；
160mg/L庆大霉素(Schering-Plough，意大利米兰)；
2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies；生长培养基)；
25ng/mL M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子，Peprotech Inc.，美国新泽西州)。
所述细胞用每3天更换的0.25ml培养基在Heraeus控温培养箱中于37℃温度下在含有5％恒流CO2(空气中v/v)的气氛中孵育10天。
孵育期过后，细胞都显示成纤维样(fibroblastoid)形态。将用2％利多卡因(lidocaine)(Sigma Aldrich，意大利米兰)/PBS[17，21]收获的细胞在37℃下于RPMI 1640(Life Technologies，纽约州的大岛)中以160g离心10分钟洗涤3次，按照以下说明孵育第二次。
将预定用于刺激成为特化肝细胞(PSC-THP1-EP)的样品以每ml 1X106个细胞的终浓度重新悬浮于6孔板(Lab-Tekchamber slides，Nunc，Kamstrup，Denmark)中，每孔含0.5ml包含如下所述培养基的最终溶液：
表1
  试剂   量/L
  AIM-V培养基(Sigma 12055-091)   700ml/L
  F-12(Gibco 31765)   200ml/L
  L-15培养基LEIBOVITZ(Sigma L 1518)   100ml/L
  MEM非必需氨基酸(Sigma M 7145)   10ml/L
  HANKS平衡盐溶液(H9269，500ml，Sigma)   4ml/L
  葡萄糖   10g/L
  L-谷氨酰胺(Sigma G 7513)   2mM
  庆大霉素(gentalyn小瓶80mg/2ml)   160mg/L
  地塞米松(Dexamethasone)(小瓶4mg/1ml)   10-7M
  东莨菪碱(Scopolamine)(解痉灵(buscopan)小瓶20mg/ml)   2mg/L
  α-烟酰胺(Sigma N6754，25mg)   10mg/L
  β-烟酰胺(Sigma N1630，100mg)   10mg/L
  胰高血糖素(Glucagen，1mg/1ml，NovoNordisk)   10-7M
  胰岛素(I-9278，5ml Sigma)   10mg/L
  Synthechol NSO(S5442，10ml，Sigma)   4ml/L
  亚油酸(L1012，100mg Sigma)   100mg/L
  转铁蛋白H.(T8158，100mg Sigma)   40mg/L
  亚硒酸钠(S5261，10g Sigma)   6.25μg/L
  IL-2(Peprotech)   25μg/L
  IL-6(Prospec Techno Gene)   25μg/L
  MCSF(Prospec Techno Gene)   25μg/L
  HGF(Prospec Techno Gene)   25μg/L
  EGF(E 9644，2mg，Sigma)   25μg/L
此外，加入列入表2中的物质作为蛋白质来源：
表2
  IMA(铁-甘露醇-白蛋白，LDO，VC)   20g/L
  γ氨基丁酸(GABA)   2mM
  δ氨基乙酰丙酸   0.1％
培养23天后，收集研究的培养上清液并储存于-80℃用于实验室分析以下物质的浓度：微白蛋白、钙、α甲胎蛋白、葡萄糖、糖原和尿素。
再培养23天后，用2％利多卡因(Sigma Aldrich，意大利米兰)/PBS孵育5-8分钟后，用移液枪反复吹打孔中的细胞悬液，然后收获所得溶液，从而获得所有研究样品的细胞悬液，如参考文献[17，21]所述。
通过用未补充的RPMI 1640(Life Technologies，Grand Island，NY)于37℃下以160g离心10分钟来将细胞洗涤三次。
从获得的细胞沉淀中，取小部分细胞以5X105个细胞/ml的终浓度重新悬浮于15ml管(Lab-Tek
Figure G2007800519261D00171
chamber slides，Nunc，Kamstrup，Denmark)中用于随后的表型分析(蛋白质印迹、直接免疫荧光法和FACS)，取一部分细胞于4℃下在PBS中以160g离心10分钟，完全干燥所得的细胞沉淀，并立即于-80℃下冷冻用于随后的RNA分析(PCR)。
细胞亚克隆
将PSC-THP1-EP细胞样品以每孔1/3细胞的终浓度重新悬浮于96孔板(Lab-Tek
Figure G2007800519261D00172
chamber slides，Nunc，Kamstrup，Denmark)中，每孔含0.05ml(50μg)包含如下所述培养基的最终溶液：
表1之二
  试剂   量/L
  AIM-V培养基(Sigma 12055-091)   900ml/L
  F-12(Gibco 31765)   20ml/L
  L-15培养基LEIBOVITZ(Sigma L 1518)   10ml/L
  MEM非必需氨基酸(Sigma M 7145)   1ml/L
  HANKS平衡盐溶液(H9269，500ml，Sigma)   0.4ml/L
  葡萄糖   1g/L
  L-谷氨酰胺(Sigma G 7513)   0.2mM
  庆大霉素(gentalyn小瓶80mg/2ml)   16mg/L
  地塞米松(小瓶4mg/1ml)   10-8M
  东莨菪碱(解痉灵小瓶20mg/ml)   0.2mg/L
  α-烟酰胺(Sigma N6754，25mg)   1mg/L
  β-烟酰胺(Sigma N1630，100mg)   1mg/L
  胰高血糖素(Glucagen，1mg/1ml，NovoNordisk)   10-8M
  胰岛素(I-9278，5ml Sigma)   1mg/L
  Synthechol NSO(S5442，10ml，Sigma)   0.4ml/L
  亚油酸(L1012，100mg Sigma)   10mg/L
  转铁蛋白H.(T8158，100mg Sigma)   4mg/L
  亚硒酸钠(S5261，10g Sigma)   0.625μg/L
  IL-2(Peprotech)   2.5μg/L
  IL-6(Prospec Techno Gene)   2.5μg/L
  MCSF(Prospec Techno Gene)   2.5μg/L
  HGF(Prospec Techno Gene)   2.5μg/L
  EGF(E 9644，2mg，Sigma)   2.5μg/L
此外，加入列入表2中的物质作为蛋白质来源：
表2
  IMA(铁-甘露醇-白蛋白，LDO，VC)   20g/L
  γ氨基丁酸(GABA)   0.25mM
  δ氨基乙酰丙酸   0.1％
培养23天后，收集研究的培养上清液并储存于-80℃用于实验室分析以下物质的浓度：微白蛋白、钙、α甲胎蛋白、葡萄糖、糖元和尿素。在进行代谢分型之后，从PSC-THP1-EP细胞系选出具有特定的快速代谢周期的细胞亚克隆(称为PSC-THP1-EP-FAST)并进行增殖。
细胞融合
可借助细胞融合将各种来源的细胞中所含遗传信息组合在单个核中。细胞融合需要细胞得以接触，包括用化学试剂短暂破坏细胞膜。当发生膜重建时，邻近细胞可使它们的膜一起重新形成，由此产生单个杂交细胞。最初，由融合产生的细胞含有2-4个核(多核的异核体)，但在细胞分裂后，两个细胞中的染色体组包裹在单个核(融核体)中。
细胞融合技术使用PEG(聚乙二醇)。
细胞融合方法
对于考虑用于细胞融合的两种或多种人细胞类型(白血病或原代)中的每种悬浮或贴壁细胞类型(即，用于PSC-THP1-HEP为：HEPG2细胞和PSC-THP1-EP细胞；用于PSC-THP1-EPEP为：HEPG2细胞、PSC-THP1-EP细胞和原代人肝细胞)，收获两百万个细胞的样品。根据细胞类型如上所述以特定方式使贴壁细胞脱附。将考虑用于融合的所有细胞收集在单个50ml管(Lab-Tek
Figure G2007800519261D00191
chamber slides，Nunc，Kamstrup，Denmark)中，通过于37℃下在无血清DMEM-LG培养基(Gibco；Grand Island，NY)中以160g离心7分钟来洗涤2次。通过用移液枪反复吹打60秒来使由沉淀获得的细胞重新悬浮在每4百万个细胞所对应的2mlPEG中。在吹打60秒后，加入10ml的FCS或FBS，通过于37℃以160g离心7分钟来洗涤细胞。由此获得的细胞通过于37℃下在含20％血清(FCS或FBS)的DMEM-LG培养基(Gibco；GrandIsland，NY)中以160g离心7分钟来洗涤2次，以1X106个细胞/ml浓度重新悬浮于补充20％FCS的AIM-V培养基中，并在Heraeus温控培养箱中于37℃温度在含有5％恒流CO2(空气中v/v)的气氛中孵育3天。
完成孵育后，通过于37℃下在RPMI 1640(Life Technologies，Grand Island，NY)中以160g离心10分钟来将由此获得的细胞(PSC-THP1-HEP或PSC-THP1-EPEP)洗涤3次，然后将其置于25cm2培养瓶(Nunc，Kamstrup，Denmark)中以1X106个细胞/ml的终浓度在包含如下所述培养基的终溶液中培养：
表1
  试剂   量/L
  AIM-V培养基(Sigma 12055-091)   700ml/L
  F-12(Gibco 31765)   200ml/L
  L-15培养基LEIBOVITZ(Sigma L 1518)   100ml/L
  MEM非必需氨基酸(Sigma M 7145)   10ml/L
  HANKS平衡盐溶液(H9269，500ml，Sigma)   4ml/L
  葡萄糖   10g/L
  L-谷氨酰胺(Sigma G 7513)   2mM
  庆大霉素(gentalyn小瓶80mg/2ml)   160mg/L
  地塞米松(小瓶4mg/1ml)   10-7M
  东莨菪碱(解痉灵小瓶20mg/ml)   2mg/L
  α-烟酰胺(Sigma N6754，25mg)   10mg/L
  β-烟酰胺(Sigma N1630，100mg)   10mg/L
  胰高血糖素(Glucagen，1mg/1ml，NovoNordisk)   10-7M
  胰岛素(I-9278，5ml Sigma)   10mg/L
  Synthechol NSO(S5442，10ml，Sigma)   4ml/L
  亚油酸(L1012，100mg Sigma)   100mg/L
  转铁蛋白H.(T8158，100mg Sigma)   40mg/L
  亚硒酸钠(S5261，10g Sigma)   6.25μg/L
  IL-2(Peprotech)   25μg/L
  IL-6(Prospec Techno Gene)   25μg/L
  MCSF(Prospec Techno Gene)   25μg/L
  HGF(Prospec Techno Gene)   25μg/L
  EGF(E 9644，2mg，Sigma)   25μg/L
此外，加入表2中所列出的物质作为蛋白质来源：
表2
  IMA(铁-甘露醇-白蛋白，LDO，VC)   20g/L
  γ氨基丁酸(GABA)   0.2mM
  δ氨基乙酰丙酸   0.1％
细胞融合：光学显微镜检查
通过于室温下在PBS(pH7.4)中以160g离心10分钟洗涤三次后，将细胞沉淀接到载玻片上，使液体在空气中蒸发。在室温下用95％乙醇将样品固定15分钟。用PBS轻轻漂洗3次(每次30秒)后，用苏木精(Sigma Aldrich)溶液处理细胞5分钟；为了避免切片上有任何沉降，使载玻片在称为“表面皿”的合适容器中保持染色面朝上。接着用PBS轻轻漂洗大约10分钟；在此阶段，如此操作是为了使染色稳定，染上的颜色从暗红变成(develope)蓝色，使结合稳定。用曙红溶液(SigmaAldrich Inc.)处理细胞1分钟；在该情况下，为了避免切片上有任何沉降，再次使载玻片在称为“表面皿”的合适容器中保持染色面朝上。接着用PBS轻轻漂洗大约10秒，然后在99％乙醇中快速脱水。最后，将一滴热(56℃)moviol(Vectashield)滴在所述载玻片的中心，封上盖玻片(cover slide)。通过光学显微镜(100X)观察该制备物，评估细胞核和细胞质的形态[10-11]。
细胞融合：荧光显微镜检查
使细胞沉淀于室温下重新悬浮于含4％多聚甲醛的RPMI 1640(pH7.4)固定溶液中1小时。用PBS洗涤三次后，使细胞于4℃下重新悬浮于PBS和0.1％Triton溶液中1小时。用PBS洗涤三次后，将细胞接到盖玻片(slide cover)上，让液体在空气中蒸发；然后加入Hoechst溶液(DAPI，1∶1000稀释)并保持1分钟，Hoechst溶液是一种通过与DNA双螺旋结合来将核染成蓝色的染料。最后再洗涤3次，将含细胞的盖玻片用Moviol(Vectashield)封在载玻片上，Moviol是一种让荧光保留大约一个月的粘合剂。在4℃下经一夜后，细胞可随时用于通过荧光显微镜观察。
属于经过细胞融合的样品的细胞具有显著高的细胞融合百分比(与未处理对照的0％相比为样品的90％)。
与未处理对照的0％相比，融合后3个月的样品细胞核型分析显示95％四倍性。
理所当然的是，在不偏离所附权利要求中限定的本发明保护范围下，就所描述和记载的细节而言，可在大程度上改变实施方案的细节和形式。
蛋白质印迹
样品用以下物质通过蛋白质印迹进行有关各标记的表型分析：抗CD 14(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 29(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 34(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 44(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 45(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 71(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 90(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 105(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 117/c-KIT(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗c-MET(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白7(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白8(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白18(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白19(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白7/17(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗白蛋白(RocklandImmunochemicals，美国宾夕法尼亚州)、抗α甲胎蛋白(MonosanEuropa，荷兰)。在洗涤5次后，让膜与缀合辣根过氧化物酶(HRP，SantaCruz Biotechnologies Inc.，Santa Cruz，美国加利福尼亚州)的对应的第二抗体(1∶1000)在室温孵育1小时，其如下表所报告。
免疫荧光实验方案
让悬浮细胞在37℃下与0.2mM MitoTracker Red孵育10分钟。通过于室温下在PBS(pH7.4)中以160g离心10分钟洗涤三次后，在室温将细胞沉淀重新悬浮于含4％多聚甲醛的RPMI 1640(pH7.4)固定溶液中1小时。用PBS洗涤3次后，让细胞于4℃下重新悬浮于PBS和0.1％ Triton溶液中1小时。用PBS洗涤三次后，将细胞接到盖玻片上，让液体在空气中蒸发。用20％正常山羊血清封闭细胞1小时，然后与缀合藻红蛋白(PE)或异硫氰酸荧光素(FITC)的以下抗人单克隆抗体孵育30分钟：抗CD 14(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 29(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 34(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 44(SantaCruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 45(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 71(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 90(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 105(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 117/c-KIT(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗c-MET(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白7(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白8(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白18(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白19(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白7/17(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗白蛋白(RocklandImmunochemicals，美国宾夕法尼亚州)、抗α甲胎蛋白(Monosan Europa，荷兰)。对于每种单克隆抗体设计了具有对应的同种型的特定对照(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)。用Hoechst溶液(稀释1∶1000)染色核。通过光学显微镜检查用moviol使盖玻片封在载片上[16-17]。
荧光流式细胞分析(FACS)
将细胞转移到50ml管(Lab-Tek
Figure G2007800519261D00241
chamber slides，Nunc，Kamstrup，Denmark)中，通过于室温下在PBS(pH7.4)中以160g离心10分钟洗涤三次。使沉淀以5X105个细胞/ml的终浓度重新悬浮于PBS中。让悬浮细胞与0.2mM MitoTracker Red在37℃下孵育10分钟。在用PBS洗涤三次后，让细胞于室温下在含4％多聚甲醛的PBS(pH7.4)中固定1小时。用PBS洗涤3次后，让细胞于4℃下重新悬浮于PBS和0.1％Triton溶液中1小时。在用PBS洗涤5次后，让细胞在20％正常山羊血清封闭液中悬浮1小时。在用PBS洗涤三次后，让样品与以下抗人单克隆抗体孵育30分钟：抗CD 14(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 29(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 34(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 44(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 45(SantaCruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 71(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 90(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 105(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗CD 117/c-KIT(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗c-MET(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白7(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白8(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白18(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白19(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗细胞角蛋白7/17(Santa CruzBiotechnology，美国加利福尼亚州)、抗白蛋白(RocklandImmunochemicals，美国宾夕法尼亚州)、抗α甲胎蛋白(Monosan Europa，荷兰)。所用的所有抗体都为缀合R-藻红蛋白(PE)或异硫氰酸荧光素(FITC)的单克隆抗体。对于每种单克隆抗体设计了具有对应的同种型的特定对照(Santa Cruz Biotechnology，美国加利福尼亚州)。用激光细胞荧光计(Epics Profile II，Coulter，Hialeath，FL)在488nm处对样品进行定量分析，将荧光细胞百分比(PFC)记作几何平均数。用标记了相应同种型的样品确定阈值(门值(gates))。用15,000个细胞的最小阈值分析了所有的值。
RNA-PCR(RNA-聚合酶链反应)
RNA提取
用Tri试剂溶液(Molecular Research Center，Inc.)按照厂商说明进行RNA提取。将每一样品的细胞沉淀重新悬浮于1ml的Tri试剂溶液中，在室温孵育5分钟。孵育后加入100μl溴氯丙烷，让样品在室温下再孵育15分钟。在4℃下以12000g离心15分钟后，回收水相，连同500μl异丙醇转移到Eppendorf型管(大约500μl)中。让样品在室温孵育10分钟，然后在4℃下以12000g离心8分钟，用1ml的75％乙醇洗涤，然后以7500g离心5分钟，最后用注射器移走上清液，在通风橱中小心干燥沉淀。最后，将RNA样品重新悬浮于50μl无DNA酶的水中。
分光光度测量
让样品悬浮于50μl刚打开的高压灭菌的MilliQ H2O中，用分光光度计读5μl(稀释：1∶100)。
RT-PCR
用Applied Biosystems“cDNA Archive Kit”试剂盒(AppliedBiosystems)逆转录信使RNA。在0.25IU的RNA酶(Promega)存在下于50μl总体积中准备反应物，其中10μl样品溶液+H2O。样品在25℃下孵育10分钟，然后在37℃下孵育2小时。
表3.
 样品+H2O   10μl
 10x缓冲液   5μl
 25x dNTPs   2μl
 10x随机引物   5μl
 multi scribe RT   25μl
 核酸酶抑制剂   0.25U
将样品插入PCR仪中，在25℃下10分钟和37℃下2小时。cDNA储存于-20℃下。
除去基因组DNA
用“TURBO无DNA”体系(Ambion)通过在37℃下孵育30分钟除去基因组DNA。通过让每一样品与5μl DNA酶除去剂在室温孵育2分钟除去DNA酶。然后以10,000xg让样品离心1分钟，最后将1μl各个逆转录样品用于实时PCR扩增。
表4.
 RNA     50μl
 DNA酶缓冲液     5μl
 DNA酶     2μl
用“SYBR Green”方法(SYBR Green Master Mix试剂盒，AppliedBiosystems)将以下引物用于实时PCR扩增：
ALB_fw 5′-GAGATGCACACAAGAGTGAG-3′
ALB_rv 5′-CTGAGCAAAGGCAATCAACA-3′
AFP_fw 5′-GGGAGCGGCTGACATTATTA-3′
AFP_rv 5′-TCTTGCTTCATCGTTTGCAG-3′
MET_fw 5′-CTCCTCTGGGAGCTGATGAC-3′
MET_rv 5′-GGTGCCAGCATTTTAGCATT-3′
GAPDH_fw 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′
GAPDH_rv 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′
为扩增反应(两个方向)测定以下引物浓度(nM)：ALB 50/150；AFP50/300；MET 300/300；GAPDH 50/300。
通过用H2O将溶液调整到100μl来稀释反应物，1μl用于各个扩增反应。用“SYBR Green Master Mix”(Applied Biosystems)试剂盒在25μl总体积中准备反应物。反应进行三个平行。用“ABI Prism 7700序列检测仪”(Perkin Elmer)实施扩增反应。用Sequence Detection 1.9.1软件(Perkin Elmer)分析数据。
所测细胞培养上清液中的α甲胎蛋白、尿素、白蛋白和微白蛋白的水 平
用Modular Analytics P自动系统(Roche-Hitachi)实施所有的测量。
所测细胞培养上清液中的凝血因子的鉴定
用MALDI-TOF-MS(Micro MX，Waters，英国曼彻斯特)自动系统实施所有的测量。为了重建序列用ProFound-Peptide Mapping在线搜索引擎处理所鉴别的肽，用PMF((Peptide Mass Fingerprinting technique)肽质量指纹谱技术)(EMBL-EBI，欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformatic Institute)；NCBI，美国国家生物信息中心(National Centerfor Biotechnology Information))处理对应的蛋白质。
实施例1.光学显微镜检查
在分选和增殖所选出的细胞克隆后，孵育10天时样品显示THP1细胞形态学转变，从圆细胞变为贴附培养板的拉长的成纤维样形态。
对照表现出纯粹的圆形并且完全悬浮。
实施例2.光学显微镜检查：孵育23天
在如上所述补充的AIM-V培养基中孵育23天后，样品显示THP1细胞从圆形到贴附培养板的四面体形的形态学转变，以下物质的产生呈阳性：白蛋白、α甲胎蛋白、肝糖、细胞角蛋白7、8、17、18和19、OV-6、c-Met受体(FACS，免疫组织化学，WB，PCR)和几种凝血因子(蛋白质印迹，MALDI-TOF-MS，2D电泳)，其如表1所示。
对照仅显示圆形形态，所有细胞都为悬浮状态，且白蛋白、α-甲胎蛋白、肝糖、细胞角蛋白7、8、17、18和19、OV-6结果呈阴性。
实施例3.THP-1与PSC-THP-CD34+/CD14+/CD90+和PSC-THP1-EP 和PSC-THP1-EP-FAST相比较的特征
与CD14+、CD29+、CD34+、CD44+、CD45-/+、CD71+、CD90+、CD105+、CD117+、C-Met、细胞角蛋白7、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18、细胞角蛋白19、细胞角蛋白7/17的表达情况有关的结果以数量等级(quantitative scale)表示，其如下表5所示。
表5
表面抗原 THP-1 PSC-THP1-CD34+/CD14+/CD90+ PSC-THP1-EP、PSC-THP1-EP-FAST样品
CD14 ++ ++++ +
CD29 + ++ -----
CD34 +++ +++++ -----
CD44 ++ +++ -----
CD45 ++++ + -----
CD71 ++ ++++ +++
CD90 + +++++ -----
CD105 ++ +++ -----
CD117 ++ +++ +
表面抗原 THP-1   PSC-THP1-CD34+/CD14+/CD90+   PSC-THP1-EP、PSC-THP1-EP-FAST样品
  c-MET   +++   +++   ++
  细胞角蛋白7   +   ++   +++++
  细胞角蛋白8   +   ++   ++++
  细胞角蛋白18   ++   +++   +++
  细胞角蛋白19   ++   +++   +++++
  细胞角蛋白7/17   ++   ++   ++++
-----＝没有任何荧光
+＝每视野1-5个荧光细胞
++＝每视野6-10个荧光细胞
+++＝每视野10-20个荧光细胞
++++＝每视野20-50个荧光细胞
+++++＞每视野50个荧光细胞
实施例4.蛋白质印迹
通过蛋白质印迹对细胞的标记白蛋白和α甲胎蛋白进行了表型分析，其如下所示。
在下表中报告的定量表征必须按照以下解释来理解：
---＝没有任何条带
-/+＝存在微弱的条带
+＝存在淡淡的条带
++＝存在中等条带
+++＝存在宽条带
++++＝存在高含量的条带
+++++＝存在丰富含量的条带
1.白蛋白(Rockland Immunochemicals，美国宾夕法尼亚州)
结果显示，在对照THP-1细胞中人白蛋白的产生呈微弱的阳性，在PSC-THP1CD34+eCD14+eCD90+细胞中呈淡淡的阳性；相比之下，在HEPG2细胞中人白蛋白的产生呈显著的阳性，而在PSC-THP1-EP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-HEP、PSC-THP1-EPEP细胞中的人白蛋白呈程度大的阳性，如表6中所报告。
表6.
Figure G2007800519261D00301
2.α甲胎蛋白(Monosan Europa，荷兰)、
用抗α甲胎蛋白HRP Mab染色，得到下表7中的结果。
表7.
Figure G2007800519261D00302
实施例5.THP-1与PSC-THP-CD34+/CD14+/CD90+和PSC-THP1-EP 和PSC-THP1-EP-FAST细胞相比较的细胞荧光光度术(FACS)特征
成体血液含有造血祖细胞。在造血细胞中，所谓的“HSC”细胞(CD14+和CD34+)为多能细胞(Zhao，2003)，当其受到生长因子适当刺激时，可分化并特化为不同身体部分(包括肝脏)的典型细胞[1-2]。
通过分选选出高荧光阳性的CD14+、CD34+和CD90+的所培养的THP-1细胞；在培养中分离所述选出的细胞克隆并进行增殖，10天后，可能观察到所述荧光在培养中保持稳定的情况。未处理的对照显示CD29+、CD34+、CD44+、CD90+、CD105+的荧光微弱。
在培养中与25ng/mL HGF孵育50天的THP-1细胞显示没有CD14+、CD29+、CD34+、CD44+、CD45-/+、CD90+、CD105+(PSC-THP1)荧光，但对于c-Met和CD117呈微弱阳性，对于白蛋白、α甲胎蛋白和细胞角蛋白(7、17、8、18和19)和CD71显示高亮度荧光。未处理的对照显示CD14和CD45荧光。结果作为几何平均数+/-标准差(SD)报告于表8和9中。
表8.
表面抗原 THP-1 PSC-THP1-CD34+/CD14+/CD90+   PSC-THP1-EPPSC-THP1-EP-FAST样品
  CD14   142+/-5   213+/-25   7+/-6
  CD29   2+/-2   20+/-8   2+/-2
  CD44   3+/-1   15+/-5   9+/-6
  CD34   12+/-5   220+/-9   9+/-6
  CD45   26+/-6   19+/-4   7+/-3
  CD71   23+/-1   38+/-5   59+/-30
  CD90   7+/-5   222+/-8   8+/-6
  CD105   3+/-1   28+/-7   2+/-2
  CD117   36+/-2   38+/-4   4+/-2
  c-Met   6+/-2   32+/-9   28+/-6
表9.
所测抗原 THP-1   PSC-THP1-CD34+/CD14+/CD90+   PSC-THP1-EPPSC-THP1-EP-FAST
  样品
  白蛋白   18+/-4   18+/-10   90+/-20
  α甲胎蛋白   10+/-8   3+/-1   18+/-12
  细胞角蛋白7   7+/-1   19+/-3   80+/-25
  细胞角蛋白8   5+/-2   22+/-3   85+/-53
  细胞角蛋白18   3+/-1   18+/-5   59+/-30
  细胞角蛋白19   6+/-2   25+/-5   72+/-24
白蛋白
用HGF以不同孵育时间(最具代表性时间为-7、15、23天)处理培养中的细胞样品，并对其进行分析。
与先前分析一致，数据显示来源于通过多能干细胞分选所选出的THP-1细胞系(PSC-THP1-CD34+/CD14+/CD90+)的成熟的肝细胞样细胞(PSC-THP1-EP)产生白蛋白。
涉及测试样品中微白蛋白的数据在数值和时间两个方面上都支持了先前关于白蛋白的数据。实际上，在用HGF处理、于实验的第7、15和30天取样的仅3个样品(PSC-THP1-EP)观察到在最小检测限之上的微白蛋白浓度。
未处理的THP-1对照细胞
在所有的孵育时间中，通过细胞荧光光度术显示THP-1对照细胞无显著的白蛋白存在。作为举例，出示了对照在第23天时的相关数据。
用MCSF处理的THP-1细胞(PSC-THP1)
在所有的孵育时间中，通过细胞荧光光度术显示用25ng/mLMCSF处理的THP-1细胞(PSC-THP1)没有可检测的白蛋白。作为举例，出示了对照在第23天时的有关数据。
与25ng/mL的HGF孵育的PSC-THP1细胞(7、15、23天)
在低浓度的包括HGF(2.5ng/mL和25ng/mL)在内的生长因子下，PSC-THP1细胞到肝细胞的分化缓慢，并且观察到产生高浓度白蛋白的成熟肝细胞外观，。
α甲胎蛋白
在不同孵育时间(第7、15和23天)分析了培养中的未处理的THP-1细胞(对照)、用50ng/mL MCSF处理的THP-1细胞(PSC-THP1)和用不同浓度(25ng/mL和2.5ng/mL)的生长因子处理的THP-1细胞(PSC-THP1-EP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-HEP和PSC-THP1-EPEP)的样品。观察到与HEPG2细胞和PSC-THP1-HEP细胞(肝细胞和成肝细胞混合细胞群)相似的关于生产α甲胎蛋白的概况。
在所有的孵育时间中，通过细胞荧光光度术显示THP-1对照细胞无显著的α甲胎蛋白产生。作为举例，出示了对照在第23天时的有关数据。
实施例6.实时PCR
GAPDH
数据显示GAPDH mRNA在测试的所有的样品中表达一致，确保了所提取的mRNA储存恰当和所检查样品的初始浓度的一致性。
白蛋白
数据显示仅在HepG2阳性对照和用HGF(最佳处理范围：25ng/mL HGF)刺激至少30天后的THP1-PSC肝样细胞中清楚存在白蛋白mRNA；在所有的其它对照中似乎没有白蛋白mRNA。
α甲胎蛋白
数据显示仅在HepG2阳性对照中清楚存在α甲胎蛋白mRNA。
c-Met
数据显示在所有测试细胞中相当高地表达c-Met mRNA的存在。c-Met mRNA似乎并没有被任何处理改变。
MALDI-TOF-MS
用蛋白质印迹法处理PSC-THP1-EP细胞培养上清液，切下获得的带并消化。从消化物中鉴定出许多肽。为了重建序列，用ProFound-Peptide Mapping在线搜索引擎处理获得的肽，用PMF(肽质量指纹谱技术)鉴定相应的蛋白质。
在PSC-THP1-EP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-HEP和PSC-THP1-EPEP细胞培养上清液中鉴定的几种蛋白质的相关序列附在下面，其与具有成熟的肝细胞表型的所述培养物产物的特征有关。白蛋白
Figure G2007800519261D00341
Figure G2007800519261D00361
细胞色素P450(CYP450)
细胞色素P-450是在体外和体内代谢大量药物、异生素和内源物质的超家族酶。细胞色素P450超家族酶催化多种物质的氧化代谢，这些物质包括诸如类固醇、脂肪酸、前列腺素、白三烯和维生素等天然化合物以及药物、致癌物质、诱变剂和异生素。细胞色素P450也称为P450血红素-硫铁蛋白(heme-thiolate protein)，通常在多组分电子传递链中起末端氧化酶的作用，称为含P450的单加氧酶系统。催化的特定反应包括羟基化作用、环氧化作用、N-氧化作用、磺化氧化作用、N-、S-和O-脱烷基化作用、脱硫酸盐作用、脱氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基团的还原作用。这些反应涉及动物中的糖皮质激素、皮质醇、雌激素和雄激素的类固醇生成作用；昆虫中的杀虫剂耐受；植物中的除草剂耐受和花着色；和微生物的环境生物除污。细胞色素P450对药物、致癌物质、诱变剂和异生素的作用可导致解毒或将物质转化为更具毒性的产物。细胞色素P450在肝脏中很丰富，但也出现在其它组织中。细胞色素P450家族成员以不同水平存在，其表达和活性受诸如化学环境、性别、发育阶段、营养和年龄等变量的控制。
已经鉴定出超过200种细胞色素P450的基因。这些P450有多种形式，每种单独的形式对上面化合物类别中的单种化学物质表现出特异性程度。在某些情况下，底物(不管是药物还是致癌物质)由不止一种细胞色素P450代谢。所有的细胞色素P450都使用血红素辅因子，享有共同的结构特征。大部分细胞色素P450长度为400-530个氨基酸。酶的二级结构为约70％α-螺旋和约22％β折叠。细胞色素P450的遗传性多态现象导致表型截然不同的亚群，这些亚群生物转化特定药物和其它化学化合物的能力不同。这些表型差别对于选择药物而言具有重要的含义。例如，给予大部分人时都安全的药物，可能在罹患缺乏解毒该药物所需的酶的个体中可引起毒性副作用。或者，在大部分人中有效的药物，可能在特定的亚群中无效，因为它们之中缺乏将该药物转化为代谢活性形式所需的酶。另外，缺乏生物转化酶的个体，由于不能使环境中的化学物质解毒，通常容易罹患由该化学物质导致的癌症。
人肝脏中的主要P450形式为P450 1A2(CYP 1A2)和P-450 3A(CYP 3A)。
人细胞色素P450 1A2构成人肝脏中的总P450的13％，是继人细胞色素P450 3A4后第二丰富的P450。P450 1A2催化大量不同药物和致癌物质的代谢。由人P450 1A2代谢的药物包括非那西丁(phenacetin)、R-华法林(R-warfarin)、氯米帕明(clomipramine)、丙咪嗪(imipramine)、茶碱(theophyline)、可可碱(theobromine)、副黄嘌呤(paraxanthine)、咖啡因(caffeine)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)、7-甲氧基试卤灵(7-methoxyresorufin)和7-乙氧基香豆素(7-ethoxycoumarin)。P450 1A2还在激活诱变剂和致癌物质中起主要作用。例如，1A2代谢性激活食物高温分解产物IQ和MeIQx以活化诱变剂。患者药物选择的复杂性在于尚未鉴定大部分药物是由P450 1 A2还是其它细胞色素P450代谢。不知道哪一种(哪些)细胞色素p450负责个别药物的代谢，就不能评价患者P450概况的适当性。对于这样的药物，若将药物给予代谢缺陷者则会有有害作用的风险。
细胞色素P-450 3A(CYP 3A)同工酶是细胞色素P-450超家族的成员。它构成总人肝脏微粒体细胞色素P-450的60％，负责大量药物的代谢，这些药物包括硝苯地平(nifedipine)、大环内酯抗生素(包括红霉素(erythromycin)和三-竹桃霉素(tri-oleandomycin))、环孢霉素A(cyclosporin A))、FK506、teffenadine、他莫昔芬(tamoxifen)、利多卡因、咪达唑仑(midazolam)、三唑仑(triazolam)、氨苯砜(dapsone)、地尔硫卓(diltiazem)、洛伐他汀(lovastatin)、奎尼丁(quinidine)、乙基雌二醇、睾酮和阿芬太尼(alfentanil)。另外，CYP 3A业已显示在体外涉及几种致癌物质的生物活化和解毒途径。除肝脏外，还在其它器官中发现CYP 3A的活性形式，这些器官包括肾脏上皮细胞、空肠粘膜和肺。细胞色素P450蛋白的量在这些器官中比在肝脏中低很多。细胞色素P-450 3A在肺微粒体中的存在表明，由CYP 3A(P450-3A)介导的代谢的药物和其它物质可能在肺中部分被代谢。对于局部类固醇(丙酸倍氯米松(beclomethasome dipropionate))这已经得到证明。还有研究显示只有约10％的由吸入器释放的药物可被肺利用。其余的量留在储雾装置和口腔中。从肺和胃肠道吸收的类固醇随后由肝脏细胞色素P450代谢。很多药物由CYP3A家族成员CYP3A4代谢，这些药物例如泼尼松(prednisone)、环孢霉素、环磷酰胺(cyclophosphamide)、洋地黄毒苷(digitoxin)、地西泮(diazepam)、乙炔基雌二醇、咪达唑仑、三唑苯二氮
Figure G2007800519261D00381
、二氢吡啶类钙通道阻滞剂、某些HMG-CoA还原酶抑制剂等等。
细胞色素P450和人肝细胞
有人研究了冷冻保存的人肝细胞中的细胞色素P450(CYP450)同工型1A2、2A6、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4[28，29]。该方法在测定药物间的相互作用中尤其有用[28，29]。
人CYP2A6是CYP超家族的重要成员，在肝脏中存在高达总CYP含量的1％。人CYP2A6代谢性活化致癌物质黄曲霉毒素B1、烟草特有亚硝胺4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮和N-亚硝基二乙基胺。CYP2A6还在人中通过芳香羟化进行香豆素代谢。已经将香豆素7-羟基化用作体外CYP2A6活性的标记和测量体内表达CYP2A6的根据。业已发现CYP2A6的遗传性多态现象，这要归因于三个等位基因的变体形式，即分别为CYP2A6*1、2A6*2、2A6*3。
细胞色素P450 2D6也称为异喹胍(debrisoquine)羟化酶，是人群中表征最充分的多态P450。业已报道代谢不良者的表型，其表现为常染色体隐性品质，在北美和欧洲白人中发生率为5-10％。代谢不良者显示可以几乎可忽略量的细胞色素P450 2D6。细胞色素P450 2D6的遗传差异可与发展中的基于环境和职业的疾病的风险增加有关。
有些证据证明S-美芬妥英(S-mephenytoin)4′羟化酶的活性在于细胞色素P450 2C酶家族。许多2C人变体(指定为2C8、2C9和2C10)业已部分被纯化和/或克隆。各种P450 2C cDNA和其预测的氨基酸序列的比较表明在人P450 2C亚家族中约70％的氨基酸绝对保守。人P450 2C蛋白序列的某些区域具有尤为高度的保守性，这些区域可能参与各种共有的P450功能。其它区域显示更大的序列差异区域，很可能是造成2C成员间不同的底物特异性的原因。已知几种用于治疗心血管病和精神病的药物为细胞色素P450 2D6的底物。
细胞色素P450与PSC-THP1-EP、PSC-THP1-HEP、 PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-EPEP细胞系
可预测的是，本发明肝细胞样细胞系PSC-THP1-EP、PSC-THP1-HEP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-EPEP将象人肝细胞一样可用于测定化学物质和药物的相互作用，因而，很可能用于测量由细胞色素P450家族进行的化学物质/药物代谢。
本发明肝细胞样细胞系表达细胞色素P450，其由DNA微阵列所测量。具体而言，在本发明PSC-THP1-EP、PSC-THP1-HEP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-EPEP细胞系中业已鉴定出多种形式的细胞色素P450基因，其如下所示：
人细胞色素P450家族1亚家族A多肽2(CYP1A2)的mRNA
人细胞色素P450家族1亚家族A多肽1(CYP1A1)的mRNA
人细胞色素P450家族1亚家族B多肽1(CYP1B1)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族A多肽6(CYP2A6)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族A多肽7(CYP2A7)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族A多肽13(CYP2A13)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族B多肽6(CYP2B6)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族C多肽8(CYP2C8)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族C多肽9(CYP2C9)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族C多肽18(CYP2C18)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族C多肽19(CYP2C19)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家D多肽6(CYP2D6)转录变体1的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族E多肽2同系物(FLJ39501)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族E多肽1(CYP2E1)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族F多肽1(CYP2F1)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族J多肽2(CYP2J2)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族R多肽1(CYP2R1)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族S多肽1(CYP2S1)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族U多肽1(CYP2U1)的mRNA
人细胞色素P450家族2亚家族W多肽1(CYP2W1)的mRNA
人细胞色素P450家族3亚家族A多肽4(CYP3A4)的mRNA
人细胞色素P450家族3亚家族A多肽5(CYP3A5)的mRNA
人细胞色素P450家族3亚家族A多肽7(CYP3A7)的mRNA
人细胞色素P450家族3亚家族A多肽43(CYP3A43)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族A多肽11(CYP4A11)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族A多肽22(CYP4A22)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族B多肽1(CYP4B1)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族F多肽2(CYP4F2)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族F多肽3(CYP4F3)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族F多肽8(CYP4F8)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族F多肽11(CYP4F11)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族F多肽12(CYP4F12)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族X多肽1(CYP4X1)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族V多肽2(CYP4V2)的mRNA
人细胞色素P450家族4亚家族Z多肽1(CYP4Z1)的mRNA
由于本发明细胞系表达上述细胞色素P450形式，因而它们可潜在地用于进行以下体外试验：测定药物和化学物质的代谢情况和测定药物间的相互作用。
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Claims (16)

1.从源自人白血病细胞系的多能干细胞系获得的已分化细胞系，所述多能干细胞系在其细胞表面至少表达CD90、CD14和CD34标记，所述已分化细胞系特征在于其无限增殖和产生白蛋白和凝血因子。
2.权利要求1的细胞系，其特征在于具有肝细胞表型。
3.权利要求2的细胞系，其特征在于以下细胞标记表达谱：人HLA-DR1MHC II类、CD34+、CD44+、CD68+、CD71+、CD81+、CD90+、CD105+、CD117+、TLR5、CDw328、CDw156c、CD172g、LDL Rec(LDL5/6+)+、GATA-4+、HNF-1α+、HNF-3β+、IL-1RT 1+、CK8+、CK18+、CK7-/+、CK19--/+、C-Met、α甲胎蛋白--/+、白蛋白+。
4.权利要求1-3中任一项的细胞系，所述细胞系是被指定为PSC-THP1-EP的细胞系，其于2006年11月10日保藏于意大利热那亚的高级生物技术中心-国际实验室细胞系保藏中心(ICLC)，保藏号为ICLC PD No.06005。
5.无限增殖的已分化细胞系，其特征在于可通过在以下生长因子存在下培养权利要求4的细胞系获得：HGF(肝细胞生长因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激生长因子)和EGF(表皮生长因子)以及白介素2和白介素6。
6.权利要求5的细胞系，所述细胞系是被指定为PSC-THP1-EP-FAST的细胞系，其于2006年12月15日保藏于意大利热那亚的高级生物技术中心-国际实验室细胞系保藏中心(ICLC)，保藏号为ICLC PD No.06008。
7.无限增殖的已分化细胞系，其特征在于可通过人HepG2细胞系与权利要求4的细胞系的融合而获得。
8.权利要求7的细胞系，所述细胞系是被指定为PSC-THP1-HEP的细胞系，其于2006年12月15日保藏于意大利热那亚的高级生物技术中心-国际实验室细胞系保藏中心(ICLC)，保藏号为ICLC PDNo.06006。
9.无限增殖的已分化细胞系，其特征在于可通过人HepG2细胞系、权利要求4的细胞系与成熟的人原代肝细胞的融合而获得。
10.权利要求9的细胞系，所述细胞系是被指定为PSC-THP1-EPEP的细胞系，其于2006年12月15日保藏于意大利热那亚的高级生物技术中心-国际实验室细胞系保藏中心，保藏号为ICLC PD No.06007。
11.制备权利要求5或6的细胞系的方法，所述方法包括在以下生长因子存在下培养权利要求4的细胞系：HGF(肝细胞生长因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激生长因子)和EGF(表皮生长因子)以及白介素2和白介素6。
12.制备权利要求7或8的细胞系的方法，所述方法包括使人HepG2细胞系与权利要求4的细胞系融合。
13.制备权利要求9或10的细胞系的方法，所述方法包括使人HepG2细胞系、权利要求4的细胞系和成熟的人原代肝细胞融合。
14.权利要求1-10中任一项的细胞系用于制备白蛋白的用途。
15.权利要求1-10中任一项的细胞系用于制备一种或多种凝血因子的用途。
16.权利要求1-10中任一项的细胞系用于在体外进行以下试验的用途：测定药物和其它化学物质的代谢情况或测定药物间相互作用。
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