CN101677523A - 有条件的且可诱导的转基因表达来指导干细胞发育的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了一些方法，其中特定基因或基因组合的表达在空间和时间上受控来开发种内和种间嵌合体。创造了转基因的EC/ES/P/iPS细胞系，其有条件地表达自杀基因或损害子基因，所述基因被配置以损害除与目标组织/器官相应的谱系以外的所有细胞谱系。EC/ES/P/iPS细胞系被注射到具有特定目标基因缺陷的供体胚胎、或被遗传工程化以在相应于EC/ES/P/iPS系的目标组织/器官细胞谱系的谱系中是互补损害的胚胎。向所述胚胎提供一种或多种刺激来活化损害子基因，用于消融EC/ES/P/iPS系的非目标组织/器官和宿主胚胎的目标组织/器官，产生的嵌合动物具有来自所述转基因细胞系的基因型的目标组织/器官和来自所述供体胚胎的所有其余组织/器官。
Description
对相关申请的引用
本申请要求2007年3月9日提交的共同待决美国临时申请号60/690,169、标题为“有条件的且可诱导的转基因表达来特异性和精确地指导胚胎细胞、胚胎干细胞和前体细胞的发育的新方法”的优先权，其公开内容通过引用被合并在此。
背景技术
本公开涉及体外或体内以排他方式指导胚胎细胞、胚胎干细胞、前体细胞和诱导的多能干细胞(EC/ES/P/iPS)向任何细胞类型、组织或器官系统发育的方法，特别是用于嵌合体的创造。
人类和小鼠基因组序列一同创造了前所未有的机会来开发新的、遗传工程化的动物模型，以加快新的治疗方式的开发来解决和减轻由于疾病而引起的人类痛苦和受难。EC/ES/P/iPS细胞的分化程序是生物学中的中心问题之一。此外，组织特异性干细胞的分离代表了潜在的强大机会来开发有效的治疗剂以帮助受损或患病器官的修复。更快速地发现癌症、心血管疾病、糖尿病和其他灾难性人类疾病的有效预防和治疗的最好的希望是通过人类健康和疾病的增强的动物模型。
器官移植是许多人类疾病，例如，晚期的肾、肝、心脏和肺部疾病中公知的和接受的救命手术。从医学和经济学的角度看，器官移植常常优于可选择的治疗形式。但是，供体器官的数量不足限制了这种技术的应用，当其他的手术被证明不成功时，可能导致不必要的生命损失。一些实验技术，例如异种移植，对于开发创造器官可用性的新方法变得越来越重要。
在过去的几年中，已经分离了几种类型的EC/ES/P/iPS细胞，在体内和体外测试了它们的分化潜力。然而，这些早期研究都没有了解这样的干细胞和祖细胞作为正常发育的一部分的“真实的”生理学结局。几年前，开发了新的细胞作图系统，其基于在干细胞或祖细胞群体中表达Cre或Flp的重组酶。参见Dymecki和Tomasiewicz，Dev.Biol.201：57-65(1998)；Gu等人，Development 129：2447-2457(2002)；和Zinyk等人，Curr.Biol.8：665-668(1998)。报告基因构建体中Cre介导的“floxed”序列(即，loxP侧翼的终止序列)切除、或Flp介导的FRT侧翼序列切除显示了在所有后裔细胞中产生持久的报告基因表达。由于Cre或Flp可以通过使用小鼠中的干细胞(或祖细胞)特异性启动子和/或增强子元件被以转基因方式导入这些细胞中，这种策略允许分析这些前体细胞在体内复杂器官系统中细胞生命中的命运。这种新的基于重组的命运作图系统的能力的很好例子是小鼠中Flk1+细胞的命运鉴定，证明了Flk1+细胞也展现了对内皮细胞外的其他中胚层系统的分化潜力。参见，Motoike等人，Genesis 28：75-81(2003)。
Matsumura等人(2004)报道了具有用来表达DT的谱系的特异性的细胞破坏系统的新转基因小鼠模型，其在没有Cre重组酶的共表达的情况下是沉默的和无害的。当将这种小鼠与谱系/细胞特异性Cre表达小鼠起培育时，提供了用于多种研究的模型，所述研究探寻DT活化产生的特定细胞类型消融的结果。参见，例如Brockschnieder等人，Genesis44：322-327(2006)和Kisanuki等人，Developmental Biology 230，230-242(2001)。然而，这些有条件的基因靶向系统具有许多限制，因为它们不是空间可控制的就是时间可控制的，但不同时是这两种。
人类雌激素受体的突变的配体结合结构域也由Metzger和Chambon(2001)融合到Cre重组酶。在用这种修饰产生的转基因小鼠系中，Cre重组酶的核定位导致了他莫昔芬依赖性的行为。这些小鼠被用于产生细胞/器官特异性的空间-时间受控制的体细胞突变。该系统还用于在干细胞分化研究中富集期望的细胞类型。
已经开发了用于将ES细胞导入移植前阶段的胚胎中的两种主要的方法：所谓的注射嵌合体和聚集嵌合体。胚胎细胞向胚泡的腔中的直接注射是产生嵌合体的基本方法之一。ES细胞也可以被注射到胚泡中，这可能是用于通过产生种系传播嵌合体将ES细胞中进行的遗传学改变导入小鼠中的最常见的方法(Bradley等人，Nature 309：255-256(1984))。嵌合体也可以通过胚胎细胞与桑椹胚阶段胚胎的聚集来产生。虽然ES细胞典型地是从胚泡阶段被建立的，但是在进入八细胞阶段胚胎之前一天它们仍然能够整合。通过利用这种性质，已经开发了将ES细胞导回到胚胎环境的相对简单的方法(Nagy and Rossant，Gene Targeting：APractical Approach，pp.177-206 Oxford University Press(1999)。因而，ES细胞也可以与桑椹胚阶段胚胎聚合来产生嵌合体。
概述
根据当前的方法，已知的遗传学工具的新组合被用于提供遗传工程化的细胞、胚胎或动物模型，其中胚胎细胞、胚胎干细胞、前体细胞和诱导的多能干细胞(EC/ES/P/iPS)可以体外或体内地被精确地指导成具有不同地改变的细胞的种内或种间嵌合的组合物中期望的细胞类型。使用这种方法，特定基因或基因组合的表达可以被以空间方式和时间方式控制来开发种内嵌合体和种间嵌合体。
在优选的实施方式中，所述方法包括三个步骤。第一个步骤是产生转基因的EC/ES/P/iPS细胞系，其有条件地表达自杀或细胞发展/存在的损害子基因。适合的自杀/损害子基因包括白喉毒素A(DT A)、单纯性疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)或次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)，尽管也考虑其他这样的基因。在本方法的上下文中，自杀/损害子基因是可操作的，以便一旦它被表达就杀死目标细胞或将目标细胞置于不利条件下。目标细胞的时间和类型，即，何时何地发生损害子基因表达，是通过利用遗传学工具来控制的。在某些实施方式中，适合的遗传学工具包括Cre/loxP、Flp-FRT和Tet-可诱导的重组系统。在这个步骤中，损害子基因表达的位置是由相应于来自转基因细胞系的目标组织或器官细胞的基因谱系决定的。特别地，损害子基因被配置以损害除了与目标组织/器官相应的谱系以外的所有谱系。
第二步骤是将这些EC/ES/P/iPS细胞聚集/注射到供体胚胎中。所述胚胎可能具有相应于目标谱系的特异性基因缺陷(即，敲除胚胎)。作为选择，这些胚胎可以被遗传工程化以便在其中EC/ES/P/iPS细胞成分预计将会定居的谱系中是互补损害的，该谱系即是相应于目标组织/器官的谱系。所述胚胎将是导入的EC/ES/P/iPS细胞的宿主，建立了其中其细胞不被损害的生物体的部分。EC/ES/P/iPS细胞的贡献可以不被或可以被特定的损害子表达所撤除。生物体中的互补部分将专门地来自于导入的EC/ES/P/iPS细胞。
本实施方式的最后步骤是施加一种或多种刺激来活化损害子基因，用于消融EC/ES/P/iPS细胞和宿主胚胎的不想要的组织/器官。所述刺激可以包括将胚胎暴露于重组控制，例如特定的药物。在一个特定的实施例中，适合的药物是四环素。
本方法提供了用于基于完整的生物体或细胞的方法的遗传工程化系统，其可以以排他的方式体外或体内地特异性地和精确地指导EC/ES/P/iPS细胞发育成希望的细胞类型、组织或器官系统。使用这种方法，特定基因或基因组合的表达可以在空间上和时间上被控制来开发种内和种间的体内或体外嵌合状况。在这些嵌合体中，特定的细胞类型、组织和/或器官系统将排他地来自一种成分(基因型)，而其他细胞、组织和器官来自其他成分(基因型)。举例来说，这种方法容许在非人类物种例如小鼠或猪中建立人类血管系统(血管)和造血(血液)系统。所述方法还将使新的方法能够通过将EC/ES/P/iPS细胞分化为特定的细胞谱系来提高基因治疗方法的精确度。
根据可选择的实施方式，所述方法可以使用遗传修饰的早期卵裂期胚胎或桑椹期胚胎(胚胎细胞)代替遗传修饰的EC/ES/P/iPS细胞，与对应物早期卵裂期或桑椹期胚胎而不是胚泡组合。然后这些互补的遗传修饰的细胞可以被以物理方式聚集来产生活的胚胎嵌合体，其然后被转移到受体动物宿主，用于妊娠和活体后代的产生(Nagy等人，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，3d Ed.(2003)。这种方法的进一步的变体是产生EC/ES/P/iPS胚胎细胞聚集体。
附图说明
图1是显示在此公开的方法的一个实施方式的步骤的图表。
图2描绘了在所述方法的一个实施方式中使用的LoxP-tet-O-DT-A-pA-loxP[SEQ ID NO：1]质粒的构建。
图3描绘了在所述方法的一个实施方式中使用的HSC-SCL-Cre-ERT-pA质粒[SEQ ID NO：2]的构建。
图4描绘了在所述方法的一个实施方式中使用的内皮-SCL-Cre-ERT-pA质粒[SEQ ID NO：3]的构建。
优选实施方式的详细说明
特定的语言被用于描述本发明的几个实施方式来促进对本发明和它的原则的理解。要理解的是使用这种特定的语言不意图对本发明的范围进行特定的限制。所描述的方法或设备的任何改变或进一步的修饰，以及本发明的原理的任何应用也意图对于本领域技术人员来说是正常地发生的。
在此公开的方法提供了遗传工程化的动物模型，其对于提供新的治疗形式来解决人类疾病是极其有帮助的。这些动物模型可以提供产生可移植的人类器官或组织、或产生可用于例如药物测试的这种器官和组织的基础。在这个模型中，在体外和体内的嵌合生物体内，胚胎细胞、胚胎干细胞、前体细胞和诱导的多能干细胞(EC/ES/P/iPS)的发育可以以排他的方式被精确地导向任何细胞类型、组织或器官系统。在一个实施例中，这种方法容许在非人类物种例如小鼠或猪中建立人类血管内皮(血管)和造血(血液)系统。
本方法首先利用了由于损害子基因而致的细胞耗尽。适合的损害子基因的实例包括：Ivanova等人，在文章″In vivo genetic ablation byCre-mediated expression of diphtheria toxin fragment A″，Genesis43：129-135(2005)中所展现的白喉毒素A(DT A)，其公开内容通过引用被合并在此；或单纯性疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)。本方法进一步利用某些遗传学工具，例如：Sauer等人，在美国专利号4,959,317中公开的Cre/LoxP，其公开内容通过引用被合并在此；或Wahl等人，在美国专利号5,654,182中所描述的Flp/FRT，其公开内容通过引用被合并在此。这些工具进一步包括重组系统，例如Nagy在论文″Crerecombinase：the universal reagent for genome tailoring″，Genesis26：99-109(2000)中所展现的重组系统，其公开内容通过引用被合并在此。
在所述方法的最后的步骤中，实现了可诱导的基因表达系统，例如四环素诱导系统，由Bujard等人在美国专利号5,814,618中所描述，其公开内容通过引用被合并在此；或Belteki等人在论文″Conditional andinducible transgene expression in mice through the combinatorial use ofCre-mediated recombination and tetracycline induction″，Nucleic AcidsResearch 33，No.5(2005)中描述的，其公开内容通过引用被合并在此。利用这些工具的组合，本方法期待在发育或分化过程期间精确地在空间和时间上控制细胞特异性基因(损害子)的表达。
举例来说，在此公开的方法容许在非人类物种例如小鼠或猪中建立人类血管系统(血管)和造血(血液)系统。首先，将创造新的小鼠胚胎干细胞(ESC)系，其组合了所有需要的遗传学工具和诱导系统。在这种ESC系中，四环素可诱导的损害子基因侧翼是重组酶附着位点，例如loxP位点，从而重组酶将删除它的表达特异性的谱系中的损害子。将生产新的转基因小鼠系，其是特定基因缺陷的，或其中可诱导的损害子具有精确的表达互补特异性。这可以通过产生反向四环素反式激活物重组酶切除条件来实现，如Gossen等人在论文″Transcriptional activationby tetracyclines in mammalian cells″，Science 23 June 1995 268：1766-1769(1995)中所描述的，其公开内容通过引用被合并在此。
嵌合体将在这些ESC和胚胎之间形成，嵌合体将被孵育并被转移到伪孕受体，例如以Voncken在″Genetic modification of the mouse：Transgenic mouse-methods and protocols″，Methods in Molecular Biology，Volume 209(2003)中所描述的方法，其公开内容通过引用被合并在此。通过在胚胎发育中的特定时间向受体小鼠施用可诱导的药物，例如多西环素(四环素的衍生物)，将会调节嵌合胚胎/胎儿中重组酶和损害子基因的表达。这种方法将会被用于建立嵌合体，其中，通过非限制性实施例的方式，存在着来自一种基因型(即，来自供体ESC)的血管内皮和造血系统，所有其他组织来自另一种基因型(即，来自受体)，如图1的图表中所描绘的。
实施例
以下实施例将用来举例说明在此描述的方法的应用。
实施例1：内皮和造血特异性基因表达的空间和时间上的调节以及它在小鼠ESC-小鼠嵌合体中的应用
FLK1是受体酪氨酸激酶，是胚胎发育和成年人新血管形成期间血管内皮生长因子-A(VAGF-A)的主要信号传导受体。(Millauer等人，Cell 72：835-846(1993)，Nature 367：576-579(1994)；Goede等人，Lab Invest.78：1385-1394(1998))。Shalaby等人(Nature 376：62-66(1995)，Cell 89：981-990(1997))对FLK1敲除小鼠的分析揭示了FLK1在造血和内皮发育中的中心作用。Licht和同事创造了FLK1-Cre的新的转基因小鼠系，然后与LacZ报告小鼠系杂交育种。(Licht等人，DevelopmentDynamics 229：312-318(2003))。他们主要在血管的内皮中，但是也在循环的血液细胞中检测到强的、可重复的LacZ染色。在中期妊娠中发现几乎完全的血管染色，这种血管染色在成年小鼠中检查的所有器官系统中持续。
干细胞性白血病基因(SCL)编码基础的螺旋-环-螺旋转录因子，在血细胞生成和内皮发育中具有关键作用。在小鼠发育期间，SCL首先在胚胎外中胚层中被表达，并且是所有造血谱系的产生和正常的卵黄囊血管生成所需的。SCL缺陷胚胎缺乏卵黄囊血细胞生成和大的卵黄血管，而内皮毛细管间隙存在于SCL-/-卵黄囊中，如Lorraine等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，VOL.92，pp.7075-7079)所展现的，由Shivdasani等人(Nature(London)373：432-434(1995))证实。为了了解小鼠中存在的胚胎和成年造血干细胞(HSC)之间的谱系关系，Joachim等人(Blood1 April，Vol.105，No.7(2005))产生了转基因小鼠，其表达处在SCL基因座的干细胞增强子控制下的他莫昔芬可诱导的Cre-ERT重组酶(HSC-SCL-Cre-ERT-pA)(Sanchez等人，Development 126：3891-3904(1999)，Development 128：4815-4827(2001)；Gottgens等人，EMBOJ 21：3039-3050(2002))，证明了在超过90％的成年长期的HSC中发生他莫昔芬依赖性重组。这个实验是体内HSC的成功的可诱导基因操纵的清楚的证明。
FLK1和SCL在小鼠中造血和内皮细胞谱系的建立中起到关键作用。Changwon等人(Development and Disease 131：2749-2762(2004))早先使用了胚胎干(ES)细胞的体外分化模型，展现了造血和内皮细胞经由连续地产生的FLK1+和SCL+细胞发育。
当Cre重组酶表达特异性由内皮和血液前体特异性启动子决定时，来自嵌合体的ESC成分并分化成所有非内皮和非造血(即，非目标)谱系的细胞将通过诱导损害子基因的表达而被消除。同时，来自供体ESC系的发育成目标内皮和造血谱系的细胞将不表达损害子基因并因而存活。相反地，来自嵌合体的胚胎成分并且分化成内皮和造血谱系的细胞将通过诱导损害子基因的表达而被消除。反之，来自胚胎成分并且发育成所有非内皮和非造血谱系的细胞将不会表达损害子基因并因而存活。结果，在这些嵌合体中，ESC和胚胎成分将相互补充；内皮和造血细胞将由ESC成分构建而成，而胚胎成分将提供嵌合体的其余细胞/结构。
将本方法应用于这个实施例，将创造新的小鼠ESC系，其含有LoxP-tet-O-DT-A-pA-loxP(图2和序列号1)、Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-pA(增强的绿色荧光蛋白质，如在美国专利号5,625,048中公开的，其公开内容通过引用被合并在此)、FLK1-Cre-pA和HSC-SCL-Cre-ERT-pA(图3和序列号2)。小鼠SCL-/-受体的胚泡将通过繁育SCL-/+小鼠而被创造，或将会创造小鼠受体胚泡，使其含有tet-O-DT-A-pA、Rosa26-LoxP-STOP-LoxP-rtTA-IRES-EGFP-pA、FLK1-Cre-pA和HSC-SCL-Cre-ERT-pA。然后新的ESC系将会被注射到受体的胚泡中，根据适合的技术，例如Voncken所描述的技术进行胚胎移植。
Tet-On和Cre-LoxP系统将会被组合来通过向宿主胚胎中导入重组控制药物例如四环素来调节特异性基因的表达。在干细胞系统中，当FLK1和SCL的内皮/造血细胞特异性启动子表达时，Cre重组酶将会被表达，然后切除含有DT-A的LoxP识别位点。同时，除了目标内皮和造血谱系之外的谱系将会表达杀死细胞的DT-A。在受体的胚泡系统中，SCL-/-胚泡是造血和内皮细胞缺陷的，这将通过干细胞来拯救，因为在所述胚泡中，这种基因调节程序是以相对于干细胞系中的相反的途径工作的。当表达FLK1和SCL时，Cre重组酶被表达，然后切除停止rtTA表达的所述STOP基因。在这种STOP被移除后，tet-O系统被活化，并且DT-A将会被表达。结果是，受体的胚泡将是造血和内皮缺陷的，并且将通过来自供体干细胞系统的细胞而被“拯救”。
通过对产生的嵌合体进行表型分析来确认血管内皮和造血系统相对其他组织的不同基因型，将可能的是鉴定从ESC系分化的内皮和造血细胞是否拯救受体的胚泡的目标谱系。
备选地，将使用SCL-Cre和Rosa 26-loxP-TK-loxP的构建体来制造干细胞系。通过将这个细胞系注射到SCL-/-胚胎中，SCL-/-胚胎中的造血和内皮系统将被来自干细胞系的相应系统替换。
实施例2：内皮和造血特异性基因表达的空间和时间调节以及它在人类ESC-小鼠嵌合体中的应用
已经在小鼠和斑马鱼中显示了高度保守的基础螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子SCL在中胚层的图式发育成为血液和内皮谱系中通过调节成血管细胞的发育而起到关键作用。参见，例如，Labastie等人，Blood 92：3624-3635(1998)和Lorraine等人，EMBO J.15：4123-4129(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.92，pp.7075-7079(1995)。为了了解SCL在正常人类发育性血细胞生成中的作用，Elias的工作(Elias等人，Blood 106：860-870(2005))提供了对于关键的造血基因可能在人类胚胎发育中所起的作用的洞察。Elias的数据揭示了SCL是与原始的血细胞生成的出现相巧合的最先和最戏剧性地上调的基因，并且在所有的造血群落中被丰富地表达。
SCL基因在血细胞、内皮细胞以及脑和脊髓的特定区域的子集中被表达。这种表达模式在从斑马鱼到哺乳动物的整个脊椎动物进化中是高度保守的。对鼠SCL基因座的系统分析已经鉴定了一系列独立的增强子，这些增强子中的每一个都将报告基因表达指向正常的SCL表达模式的子域。特别感兴趣的是在整个个体发生期间将表达指向血液和内皮祖代的3′增强子。参见，Sanchez等人，Development 126：3891-3904(1999).Joachim等人(Blood 104：1769-1777(2004))利用由SCL基因座的5-内皮增强子驱动的可诱导的Cre重组酶产生的内皮-SCL-Cre-ERT小鼠。通过与Cre报告基因小鼠杂交，Joachim在发育着的血管系统的几乎所有的内皮细胞中都发现了Cre介导的重组。
组合所有这些信息，可以利用实施例1中描述的方法来制造小鼠-人类嵌合体。将会创造新的人类ESC系，其含有LoxP-tet-O-DT-A-pA-loxP(图2和序列号1)、Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-pA和SCL-Cre-pA(图3和序列号3)。同时，将会创造小鼠SCL-/-受体胚泡，或备选地，创造受体胚泡，其含有tet-O-DT-A-pA、Rosa26-LoxP-STOP-LoxP-rtTA-IRES-EGFP-pA、FLK1-Cre-pA和HSC-SCL-Cre-ERT-pA。新的ESC系将会被注射到受体的胚泡中，并且将会进行胚胎移植。
将通过给予重组控制，例如药物多西环素来在胚胎发育中的预定的时间使位点特异性重组系统活化。在ESC系和供体胚胎中自杀/损害子基因的表达将会导致ESC系中非目标细胞以及供体胚胎中目标细胞的彼此相反的消融。ESC系将因而提供了目标细胞，在本案中是提供血管内皮和造血组织，用于发育中的嵌合小鼠。可以对产生的嵌合体进行表型分析来确认血管内皮和造血系统相对于其他组织的不同的基因型。在这些嵌合体中，内皮和造血细胞将是人类基因组背景的，而所有的其他组织和器官将是小鼠基因组背景的。
实施例3：内皮和造血特异性的基因表达的空间和时间上的调节以及它在人类ESC-猪嵌合体中的应用
用于移植的人类器官、组织和细胞的长期短缺鼓舞了关于利用动物供体组织代替人类供体组织的可能性的研究。跨越物种屏障的移植与难以控制的排斥相关。因此，已经提出了成功的从猪到人的异种移植需要供体猪是遗传修饰的。参见，Prather等人的Theriogenology 59：115-123(2003)；和Kolber-Simonds等人的PNAS 101：7335-7340(2004)。血管内皮是异种供体器官与宿主免疫和非免疫性防御体系之间最直接的屏障。因而，这些细胞是这种遗传学修饰的重要目标。
Godwin等人(Xenotransplantation 13(6)：514-521(2006))克隆和表征了猪细胞间的粘附分子-2(ICAM-2)基因的调节元件。他们观察到，0.90-kb猪ICAM-2启动子片段在猪内皮细胞中而不在非内皮细胞中具有强活性。删除分析揭示了大部分的启动子活性由与人类ICAM-2启动子显著同源的0.48-kb子片段确定。在猪ICAM-2基因的第一内含子内鉴定了显著的增强子活性。
早先已经显示了Tie2启动子和内含子/增强子元件在体外和体内驱动报告基因。如Schlaeger等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA 94：3058-3063(1997))所报道的，如预期的那样，在Tie2-βgal转基因小鼠中与Tie2启动子一起包含Tie2内含的增强子元件产生了在胚胎和成年内皮中的表达。这种相同类型启动子元件转基因设计被用于产生Tie2-Cre和Tie2-GFP转基因小鼠以及Tie2-GFP转基因斑马鱼(Constien等人的Genesis 30：36-44(2001)；Motoike等人的Genesis 28：75-81(2000))。Hao等人(Transgenic Research DI 10.1007/s11248-00609020-8(2006))产生了转基因的Yucatan猪，其表达处在Tie2内皮特异性启动子和Tie2内含子/增强子元件下的eNOS cDNA，并且通过免疫组织化学展现了在Tie2-eNOS转基因猪中内皮区室中的相似的表达分布。
迄今为止，还没有已知的将会调节来自胚胎干细胞的造血干细胞的分化的特异性基因。但是已知的是，SCL基因表达的模式在从斑马鱼到哺乳动物的整个脊椎动物进化中是高度保守的。SCL基因的启动子可以被用于调节猪中的造血发育。
结果，可以利用实施例1中描述的方法来制造猪-人嵌合体。将创造新的人类ESC系，使其含有LoxP-tet-O-DT-A-pA-loxP、Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-pA、SCL-Cre-pA和ICAM-Cre-pA/Tie2-Cre-pA。同时，将创造猪SCL-/-受体胚泡，或备选地，创造受体胚泡，使其含有tet-O-DT-A-pA、Rosa26-LoxP-STOP-LoxP-rtTA-IRES-EGFP-pA、SCL-Cre-pA和ICAM-Cre-pA/Tie2-Cre-pA。新的ESC系将被注射到受体的胚泡中，并且将要进行胚胎移植。
将通过给予重组控制，例如药物多西环素来在胚胎的发育中预定的时间将位点特异性重组系统活化。在ESC系和供体胚胎中自杀/损害子基因的表达将导致在ESC系中非目标细胞和在供体胚胎中目标细胞的彼此相反的消融。ESC系将因而提供了目标细胞，在本案中是提供血管内皮和造血组织，用于发育中的嵌合猪。最后，可以对产生的嵌合体进行表型分析来确认血管内皮和造血系统相对于其他组织的不同的基因型。在这些嵌合体中，内皮和造血细胞将是人类基因组背景的，而所有的其他组织和器官将是猪基因组背景的。
实施例4：任何器官/组织特异性的基因表达的空间和时间上的调节以及它在嵌合体中的应用
根据上文描述的方法，任何物种的嵌合体可以是其EC/ES/P/iPS细胞是可以获得的，并且在遗传上控制嵌合特征所需的其特异性启动子/增强子是已知的。这些嵌合体可以在胚胎发育的各个阶段被创造。在本实施例中，这个过程可以在起初三个(三胚层)组织层，即，内胚层、外胚层和中胚层的形成中的发育中的一个时点处被使用。在本实施例中，在这些组织谱系之一中诱导嵌合性将使得所有随后的细胞、组织和器官来自不同的基因型。
举例来说，使用这种方法，可以制造具有人类内胚层谱系的猪。在一个特定的实施方式中，当内胚层的特异性启动子/增强子被观察到时，其可以被称为END，将创造任何背景类型的新的ESC系，使其含有LoxP-tet-O-DT-A-pA-loxP、Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-pA和END-Cre-pA。同时，将创造末端END-/-受体胚泡，或备选地，创造任何背景类型的胚泡，使其含有tet-O-DT-A-pA、Rosa26-LoxP-STOP-LoxP-rtTA-IRES-EGFP-pA和END-Cre-pA。新的ESC系将会被注射到受体的胚泡中并进行胚胎移植。
将通过给予重组控制，例如药物多西环素来在胚胎的发育中预定的时间将位点特异性的重组系统活化。在ESC系和供体胚胎中自杀/损害子基因的表达将导致在ESC系中非目标细胞和在供体胚胎中目标细胞的彼此相反的消融。ESC系将因而提供用于发育中的嵌合动物的目标细胞。最后，可以对产生的嵌合体进行表型分析来确认来自内胚层的所有组织/器官相对于其他组织/器官的不同的基因型。在这些嵌合体中，来自内胚层的细胞将是一个基因组背景的，而所有其他组织和器官将是另一个基因组背景的。
实施例5：特异性基因表达的空间和时间上的调节以及它在体外胚胎细胞衍生的嵌合体中的应用
上面描述的实施例1-4考虑体内的特异性基因表达的空间和时间上的调节。在本实施例中，这种方法也将被用于体外。如在先前的实施例中那样，将创造新的ESC系或EC，使其含有三个转基因：(1)loxP-tet-O-DT-A-pA-loxP，(2)Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-pA，(3)FLK1-Cre-pA/HSC-SCL-Cre-ERT-pA。代替胚泡注射，将通过ES细胞二倍体/四倍体胚胎聚集和注射来制作嵌合体。
将创造新的ESC系，使其含有LoxP-tet-O-DT-A-pA-loxP、Rosa26-rtTA-IRES-EGFP-pA和END-Cre-pA。同时，将创造END-/-受体二倍体胚胎，或备选地，将创造任何背景类型的胚胎，使其含有tet-O-DT-A-pA、Rosa26-LoxP-STOP-LoxP-rtTA-IRES-EGFP-pA和END-Cre-pA。ESC系将与受体胚胎一起聚集并被体外培养。在胚胎移植之前，将给予可诱导的药物，其将导致胚胎嵌合体具有来自ESC系的内胚层谱系，而外胚层和中胚层谱系则来自受体的胚泡。
将对产生的嵌合体进行体外表型分析来确认来自内胚层的所有组织/器官相对于其他组织/器官的不同的基因型。在这些嵌合体中，来自内胚层的细胞将是一个基因组背景的，而所有的其他组织和器官将是另一个基因组背景的。
序列表
序列号1
对pMC-loxp-tight-DTa-(R)序列的限制分析
甲基化：dam-无dcm-无
没有显示含有＞3个位点的酶
采用51种酶筛选，发现了64个位点
AatII GACGT/C 1： 5117
Acc651 G/GTACC 1： 532
ApaI GGGCC/C 1： 466
ApaLI G/TGCAC 3： 220，3616，4862
BamHI G/GATCC 1： 1682
BglI GCCNNNN/NGGC 3： 294，461，4315
BglII A/GATCT 1： 468
BsaBI GATNN/NNATC 1： 1876
BssHII G/CGCGC 1： 1357
ClaI AT/CGAT 1： 475
EcoICRI GAG/CTC 2： 2552，2909
EcoRI G/AATTC 3： 445，719，2517
EcoRV GAT/ATC 1： 482
HindIII A/AGCTT 2： 486，2944
HpaI GTT/AAC 1： 1775
KpnI GGTAC/C 1： 536
loxp 2： 514，2867
MscI TGG/CCA 2： 1042，1983
NcoI C/CATGG 2： 1392，2504
NdeI CA/TATG 1： 227
NheI G/CTAGC 1： 2845
NotI GC/GGCCGC 1： 2892
PmeI GTTT/AAAC 1： 2902
PstI CTGCA/G 3： 816，1013，2940
PvuI CGAT/CG 2： 322，4565
PvuII CAG/CTG 3： 351，1066，3127
SacI GAGCT/C 2： 2554，2911
ScaI AGT/ACT 1： 4675
SmaI CCC/GGG 2： 458，2927
SpeI A/CTAGT 1： 2913
StuI AGG/CCT 3： 591，662，2567
XbaI T/CTAGA 2： 538，1883
XbaI<Methy> T/CTAGATC 1：538
XhoI C/TCGAG 2： 450，2919
XmaI C/CCGGG 2： 456，2925
XmnI GAANN/NNTTC 2： 2881，4794
非切割酶
Acc65I<Methy>AflII ApaI<Methy>BstEII BstXI ClaI<Methy>
I-PpoI I-SceI MscI<Methy>NruI NruI<Methy>SacII
SalI
起点
1 CTGCCTCGCG CGTTTCGGTG ATGACGGTGA AAACCTCTGA CACATGCAGC TCCCGGAGAC
61 GGTCACAGCT TGTCTGTAAG CGGAGCCGGG AGCAGACAAG CCCGTCAGGG CGCGTCAGCG
121 GGTGTTGGCG GGTGTCGGGG CGCAGCCATG ACCCAGTCAC GTAGCGATAG CGGAGTGTAC
181 TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT GTACTGAGAG TGCACCATAT GCGGTGTGAA
241 ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC CGCATCAGGC GCCATTCGCC ATTCAGGCTA
301 CGCAACTGTT GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC TATTACGCCA GCTGGCGAAG
361 GGGGGATGTG CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG GTAACGCCAG GGTTTTCCCA GTCACGACGT
421 TGTAAAACGA CGGCCAGGGC CAGTGAATTC TCGAGCCCGG GGGGCCCAGA TCTATCGATG
481 ATATCAAGCT TGGTACTATA ACTTCGTATA GCATACATTA TACGAAGTTA TGGTACCTCT
541 AGATCGACAG TGTGGTTTTG CAAGAGGAAG CAAAAAGCCT CTCCACCCAG GCCTGGAATG
601 TTTCCACCCA ATGTCGAGCA GTGTGGTTTT GCAAGAGGAA GCAAAAAGCC TCTCCACCCA
661 GGCCTGGAAT GTTTCCACCC AATGTCGAGC AAACCCCGCC CAGCGTCTTG TCATTGGCGA
721 ATTCGAACAC GCAGATGCAG TCGGGGCGGC GCGGTCCCAG GTCCACTTCG CATATTAAGG
781 TGACGCGTGT GGCCTCGAAC ACCGAGCGAC CCTGCAGCCA ATATGGGATC GGCCATTGAA
841 CAAGATGGAT TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC
901 TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTGTC AGCGCAGGGG
961 CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC TGAATGAACT GCAGGACGAG
1021 GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT
1081 GTCACTGAAG CGGGAAGGGA CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG
1141 TCATCTCACC TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG
1201 CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG CATCGAGCGA
1261 GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG ATCTGGACGA AGAGCATCAG
1321 GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG CTCAAGGCGC GCATGCCCGA CGGCGAGGAT
1381 CTCGTCGTGA CCCATGGCGA TGCCTGCTTG CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT
1441 TCTGGATTCA TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GTGGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG
1501 GCTACCCGTG ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG CTGACCGCTT CCTCGTGCTT
1561 TACGGTATCG CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT ATCGCCTTCT TGACGAGTTC
1621 TTCTGAGGGG ATCGGCAATA AAAAGACAGA ATAAAACGCA CGGGTGTTGG GTCGTTTGTT
1681 CGGATCCGTC GAGGCAGTGA AAAAAATGCT TTATTTGTGA AATTTGTGAT GCTATTGCTT
1741 TATTTGTAAC CATTATAAGC TGCAATAAAC AAGTTAACAA CAACAATTGC ATTCATTTTA
1801 TGTTTCAGGT TCAGGGGGAG GTGTGGGAGG TTTTTTAAAG CAAGTAAAAC CTCTACAAAT
1861 GTGGTATGGC TGATTATGAT CCTCTAGACT CACACCACAG AAGTAAGGTT TCCTTCACAA
1921 AGAGATCGCC TGACACGATT TCCTGCACAG GCTTGAGCCA TATACTCATA CATCGCATCT
1981 TGGCCACGTT TTCCACGGGT TTCAAAATTA ATCTCAAGTT CTACGCTTAA CGCTTTCGCC
2041 TGTTCCCAGT TATTAATATA TTCAACGCTA GAACTCCCCT CAGCGAAGGG AAGGCTGAGC
2101 ACTACACGCG AAGCACCATC ACCGAACCTT TTGATAAACT CTTCCGTTCC GACTTGCTCC
2161 ATCAACGGTT CAGTGAGACT TAAACCTAAC TCTTTCTTAA TAGTTTCGGC ATTATCCACT
2221 TTTAGTGCGA GAACCTTCGT CAGTCCTGGA TACGTCACTT TGACCACGCC TCCAGCTTTT
2281 CCAGAGAGCG GGTTTTCATT ATCTACAGAG TATCCCGCAG CGTCGTATTT ATTGTCGGTA
2341 CTATAAAACC CTTTCCAATC ATCGTCATAA TTTCCTTGTG TACCAGATTT TGGCTTTTGT
2401 ATACCTTTTT GAATGGAATC TACATAACCA GGTTTAGTCC CGTGGTACGA AGAAAAGTTT
2461 TCCATCACAA AAGATTTAGA AGAATCAACA ACATCATCAG GGTCCATGGT GGCGGCGAAT
2521 TCTCCAGGCG ATCTGACGGT TCACTAAACG AGCTCTGCTT ATATAGGCCT CCCACCGTAC
2581 ACGCCTACCT CGACATACGT TCTCTATCAC TGATAGGGAG TAAACTCGAC ATACGTTCTC
2641 TATCACTGAT AGGGATAAAC TCGACATACG TTCTCTATCA CTGATAGGGA GTAAACTCGA
2701 CATACGTTCT CTATCACTGA TAGGGAGTAA ACTCGACATA CGTTCTCTAT CACTGATAGG
2761 GAGTAAACTC GACATCGTTC TCTATCACTG ATAGGGAGTA AACTCGACAT ACGTTCTCTA
2821 TCACTGATAG GGAGTAAACT CGACGCTAGC ATAACTTCGT ATAGCATACA TTATACGAAG
2881 TTATTCTAGC GCGGCCGCGT TTAAACGAGC TCACTAGTCT CGAGCCCGGG ATCGACTGCA
2941 GCCAAGCTTG GCGTAATCAT GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC
3001 AATTCCACAC AACATACGAG CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT
3061 GAGGTAACTC ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC
3121 GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGCGC
3181 TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA
3241 TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG
3301 AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG
3361 TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG
3421 TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG
3481 CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA
3541 AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC
3601 TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT
3661 AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT
3721 GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG
3781 CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT
3841 ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT
3901 GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT
3961 TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG
4021 GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT
4081 AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT
4141 GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC
4201 GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG
4261 CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC
4321 GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG
4381 GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA
4441 GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA
4501 TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT
4561 CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG
4621 CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA
4681 ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA
4741 CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT
4801 TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT
4861 CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA
4921 ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC
4981 ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA
5041 TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA
5101 AAAGTGCCAC CTGACGTCTA AGAAACCATT ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG
5161 CGTATCACGA GGCCCTTTCG TCTTCAAGAA
//
序列号2
HSC-CRE-ERt
基因座 无标题的 13033bp DNA 线性的 SYN 03-JAN-2008
定义 .
登录号 .
关键词 .
特征 位置/合格者
碱基数 3087 a 3120 c 3427 g 3399 t
起点
1 ACGACTGGAG AGATGGCTCA CTGGTTAAGA GCACTGACTA TTCTTCCAGA GGTCCTGAGT
61 TCAATTCCCA ACAACCACAT GGTGGCTCAG AACCATCTGT AATGGGATCT GATGCCCTCT
121 CCTAGTGTGT CTGAAGGCAG CCACAGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTATACATA
181 TACATATATA TGTATATATA TAATTTTTGC ATATTAAATC TATAAAAAAA AAACCCAGTG
241 AGATCCGAGT TCTGTGTATT GAGAATACCA AGGTGTATGG TGTGTGTGTG TGGGGGGGAA
301 GAGGACACTT CATTGGAATA ATTCAAGGAA GAGCTTTCTT TATATTTTCT CCATCAGGAG
361 GGGAGCCCAG ATTCTAGTGA CTTCTGGAGC ACTTTCCCAA GTCTTAAGAG TCCAGCTGAG
421 CAGAATGGGG TGGAGTGTGA AGGGTAGTAG GACCAGAATC CAGGATTAGC TTCAGTCCTT
481 GACTCCCTTT CTTATGATAG GGTAGCTACT TGCAGAATAC AACGGTGGGT TTGCTTAGTG
541 TAGGCTGCTT TCCTCTTGGC CGGGAATATT TCTGACATCC TTGGTTGAAT AGAGCAGAGT
601 TCTTGCAGCT TCCACACCCT ACTTCACCAC CATAGTCTTT CTGGGTGTAT ATTTGCAGCG
661 CATGTGTGTA GCAGTAGATC GGGAGAGGGT TCCTATAGCA CTGGACAGAT TCCCCGCCAA
721 AACCAAAAGG GGGGCGGGAA GGACACGCTT GCTCGGGGGA TTAGTTCCCT CCCCTTCCCC
781 TGTGGCCTAA GAAGGAGGGA CTGGGTGATC TTTCTCTTCT CTGTGCATTT CCTTCCTCCT
841 TTTTCCCGTC GATTTTTGTC TCTCTGCCTG TATTCCTTTT CTCCCAAGGT TTCTGCCATC
901 TTTCTCCAGC ACAATTCCTA CCCTTGGACA CTGTGCCTTC CGGGCTTGTC CCACCCTTTT
961 CTTCCAATCT AGAGACACCC CCACATTGCT CCAGCTCCAG GCCTGTGGGC CTTCACGCCA
1021 GCAGGGTTGG GGTGTGCGTC CACGTGGTGC TGAGTTTGTC CTGTCCGCTT TTCAGGTTTC
1081 AGTGCGTGAT CTCCTCTCTG CCCCTTACCC TGTTACAGGA TGACGGAGCG GCCGCCGAGC
1141 GAGGCGGCAC GCAGTGACCC GCAACTAGAG GGACAGGACG CGGCCGAGGC CCGCATGGCC
1201 CCCCCGCACC TAGTCCTGCT CAACGGCGTC GCCAAGGAGA CGAGCCGCGC AGCCCCGGCT
1261 GAGCCCCCCG TCATCGAGCT AGGAGCGCGC AGCGGCGCGG GGGGCGGCCC TGCCAGTGGG
1321 GGCGGTGCCG CGAGGGACTT AAAGGGCCGC GACGCAGTAG CAGCCGAAGC TCGCCTTCGG
1381 GTGCCCACCA CCGAGCTGTG CAGACCTCCC GGACCCGCCC CGGCGCCCGC GCCCGCTTCG
1441 GTTCCTGCAG AGCTGCCTGG AGACGGCCGC ATGGTGCAGC TGAGCCCGCC CGCGCTGGCA
1501 GCCCCTGCCG GCCCCGGCCG AGCGCTGCTC TATAGCCTTA GCCAGCCGCT CGCCTCACTA
1561 GGCAGGTGAG CATCCCGGTC CCCTGCGGCG TTCTGGGTGC AGGCGAGGGT CGAGAGGAGG
1621 GGGTGGTGGC TTAAGATTCC AAGAGGAACG AGCCCAGAGA CCAGAGTCTC TCCCGCAACC
1681 CTCCCGCTAG TGGGAAAGGG GTCCCCTGTG AGACAGACTG TCAGGAAGGA CCGGTGGTCA
1741 GGGGACGACA GTTGTGTAGA AACCGGGGGT GGTCGCCTGC ACTGTTGAGG GTGCGGGTCT
1801 GTGGGTGAGT GTAAAAAGCT GCAGAGGTTG CTGACTACTG TTGAGTAGGC GGGATTCTTT
1861 AATATGAGTT CTGGGCCAGT GTCTGAATGC CCCTCTGCAG CAGAGGTGAG GTTCGCCACA
1921 AAGGGTGAAC TCTTCAGGAA GCTGCCGCGG TGGGTGGACA GGCTGGAGAG AAAGATCTAA
1981 GGCCGTTGCT GAGGGCAGCT CTTCTCAGCC TCTGCTAGGA TGCAGTGAGC GACACTGTCA
2041 TCCGCTCCTA ATCCTTCTGT CCCTTACCTG CGTGGTTGGT CTCCTTGCTG GGCCCTGTGG
2101 TGAGGGAAGC TGAATGGCCA GCAGAGTGTA GGACAGGCGG TAGGAAAGAA TTATAGGACA
2161 ACACGATGGT AGAGCAGTAG GGAGCGCTGT CAAGGGTTGG TGAGTGGGAG GTGGGGGGTG
2221 GTGCCGATCT GTGATCAGAG AGTGATGGTC GGTGAGGTCT GAGGGGACAA TGTGAGACCC
2281 TTTGTGGTGT GGGAGTTCTC TACTAGCACT TCCATCCCTC ACGTGTTGTC CTGTGTAGGT
2341 ACTTGTCTCT GAGCAAAGGT CTACCAGGAT TGAAGGAGAT TTTGTGTGTG TGTGTGTGTG
2401 TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTA CTTCAGCACA GGAATACGCC GCCTTGCCCC
2461 TCCCATTTAT GTATTGTTCC ATATATTCAC CCTCTTCGCT TCTGTGAATG CATGCATACT
2521 CAATTCAATC TGCATTTTAA GTGTGCAGGA GCAGGGGGTG CCTTAGCAGG AGGGGACTGA
2581 AGACACACAG GGAGAATCCA TCTAAGGAGT CTTTTTGTCT TTAACCTCAT TGTGATCTAC
2641 CTTCTCTTTC CATAGTGGGT TCTTTGGGGA ACCGGATGCC TTCCCCATGT TCACCAACAA
2701 CAACCGGGTG AAGAGGAGGC CCTCCCCATA AATTCCACCA TGTCCAATTT ACTGACCGTA
2761 CACCAAAATT TGCCTGCATT ACCGGTCGAT GCAACGAGTG ATGAGGTTCG CAAGAACCTG
2821 ATGGACATGT TCAGGGATCG CCAGGCGTTT TCTGAGCATA CCTGGAAAAT GCTTCTGTCC
2881 GTTTGCCGGT CGTGGGCGGC ATGGTGCAAG TTGAATAACC GGAAATGGTT TCCCGCAGAA
2941 CCTGAAGATG TTCGCGATTA TCTTCTATAT CTTCAGGCGC GCGGTCTGGC AGTAAAAACT
3001 ATCCAGCAAC ATTTGGGCCA GCTAAACATG CTTCATCGTC GGTCCGGGCT GCCACGACCA
3061 AGTGACAGCA ATGCTGTTTC ACTGGTTATG CGGCGGATCC GAAAAGAAAA CGTTGATGCC
3121 GGTGAACGTG CAAAACAGGC TCTAGCGTTC GAACGCACTG ATTTCGACCA GGTTCGTTCA
3181 CTCATGGAAA ATAGCGATCG CTGCCAGGAT ATACGTAATC TGGCATTTCT GGGGATTGCT
3241 TATAACACCC TGTTACGTAT AGCCGAAATT GCCAGGATCA GGGTTAAAGA TATCTCACGT
3301 ACTGACGGTG GGAGAATGTT AATCCATATT GGCAGAACGA AAACGCTGGT TAGCACCGCA
3361 GGTGTAGAGA AGGCACTTAG CCTGGGGGTA ACTAAACTGG TCGAGCGATG GATTTCCGTC
3421 TCTGGTGTAG CTGATGATCC GAATAACTAC CTGTTTTGCC GGGTCAGAAA AAATGGTGTT
3481 GCCGCGCCAT CTGCCACCAG CCAGCTATCA ACTCGCGCCC TGGAAGGGAT TTTTGAAGCA
3541 ACTCATCGAT TGATTTACGG CGCTAAGGAT GACTCTGGTC AGAGATACCT GGCCTGGTCT
3601 GGACACAGTG CCCGTGTCGG AGCCGCGCGA GATATGGCCC GCGCTGGAGT TTCAATACCG
3661 GAGATCATGC AAGCTGGTGG CTGGACCAAT GTAAATATTG TCATGAACTA TATCCGTAAC
3721 CTGGATAGTG AAACAGGGGC AATGGTGCGC CTGCTGGAAG ATGGCGATCT CGAGCCATCT
3781 GCTGGAGACA TGAGAGCTGC CAACCTTTGG CCAAGCCCGC TCATGATCAA ACGCTCTAAG
3841 AAGAACAGCC TGGCCTTGTC CCTGACGGCC GACCAGATGG TCAGTGCCTT GTTGGATGCT
3901 GAGCCCCCCA TACTCTATTC CGAGTATGAT CCTACCAGAC CCTTCAGTGA AGCTTCGATG
3961 ATGGGCTTAC TGACCAACCT GGCAGACAGG GAGCTGGTTC ACATGATCAA CTGGGCGAAG
4021 AGGGTGCCAG GCTTTGTGGA TTTGACCCTC CATGATCAGG TCCACCTTCT AGAATGTGCC
4081 TGGCTAGAGA TCCTGATGAT TGGTCTCGTC TGGCGCTCCA TGGAGCACCC AGGGAAGCTA
4141 CTGTTTGCTC CTAACTTGCT CTTGGACAGG AACCAGGGAA AATGTGTAGA GGGCATGGTG
4201 GAGATCTTCG ACATGCTGCT GGCTACATCA TCTCGGTTCC GCATGATGAA TCTGCAGGGA
4261 GAGGAGTTTG TGTGCCTCAA ATCTATTATT TTGCTTAATT CTGGAGTGTA CACATTTCTG
4321 TCCAGCACCC TGAAGTCTCT GGAAGAGAAG GACCATATCC ACCGAGTCCT GGACAAGATC
4381 ACAGACACTT TGATCCACCT GATGGCCAAG GCAGGCCTGA CCCTGCAGCA GCAGCACCAG
4441 CGGCTGGCCC AGCTCCTCCT CATCCTCTCC CACATCAGGC ACATGAGTAA CAAAGGCATG
4501 GAGCATCTGT ACAGCATGAA GTGCAAGAAC GTGGTGCCCC TCTATGACCT GCTGCTGGAG
4561 ATGCTGGACG CCCACCGCCT ACATGCGCCC ACTAGCCGTG GAGGGGCATC CGTGGAGGAG
4621 ACGGACCAAA GCCACTTGGC CACTGCGGGC TCTACTTCAT CGCATTCCTT GCAAAAGTAT
4681 TACATCACGG GGGAGGCAGA GGGTTTCCCT GCCACAGTCT GAGAGCTCCC TGGCGGAATT
4741 CGGATCTTAT TAAAGCAGAA CTTGTTTATT GCAGCTTATA ATGGTTACAA ATAAAGCAAT
4801 AGCATCACAA ATTTCACAAA TAAAGCATTT TTTTCACTGC ATTCTAGTTG TGGTTTGTCC
4861 AAACTCATCA ATGTATCTTA TCATGTCTGG TCGAGATCTA AGGAAGACCC TGAATTCTGT
4921 TCTCATACTC CATACCCCAT ATCTTTCTTC CTCTGTGTCT TCCTTGCCCT TAAAGAAATT
4981 GCAGCATTCC AAGAACAATA TCTGTACAAA GGGGGAAATG TAAGCATGAG AAAACATTAA
5041 AAAAAAAAAA CAGTGATGAA CATAACCACA GAGAGAATCC CACCCTTCAA GAATAATTCA
5101 TGTTTATTTG TGGTGGCAAA TAACAAAATG GTACAACCTT TATCCTTTTC CAGAAACAAA
5161 AACCAAGGGC ACAGCAACTA GAGTGAGCTG ACAGCTATTT TGGCCTTTTT GGTGGGTCTA
5221 GCCGTACTTG GGATCCCAGT GGTACATGAC CCTCTGCCGA AGGCTTGCCT CAGTCTGTGT
5281 ACATAGCACG CCATGTCTGT GGGCAAGCCC AGCACTTTGC GTCAGTGTCG TACTGTATGT
5341 AATGAACTGT GTTGGTCTCT GTGTTTTTTT TTTCTGAAGA AGAGGAGTAA CTACTCCGGG
5401 TACCTTGATA TTTGTACAGC CTATAGGCCA ACACTGCGGG CGTGTGACTC TTTATTGAAA
5461 AACAAAAACA AAAAAATACC AGTGTGGTGA TGATAGTGTG TGTATATATA TATAAGGTTA
5521 TATGGGGAAG ATTTCTAAAT AAAAGTTTTA CAAAGGGGCC TGGACTTTGT ACTTGGACTT
5581 TGCCCCCTAG AGTCTGAGAA TGGGAACATC AAGGGGAAAG GCTGACAGCT TTTAGGAAGT
5641 AGGATCTAGC TTCCAGTCTC AGCCTGTCGG GGAGGAAGGA GGCTACCCTA TGGGGGGGTT
5701 TCCTTTTCCC CCCTTCTGCA AGGCTCCAAG GGCTTCAGTA TCCTGTCCTT GTGTTTGCAG
5761 CCCTAGACAG CCTAGACCTC TCTGTGTAGG GTCAGCTTTC TCCTTGTTAG ATCACTTTCC
5821 CAAGTTGGGA CCATTGCTCC CAGTGAGAGC TTAGGACAGA AAAATGTAGC TGTTATCCAC
5881 CATTGGTGTC CATAGATTTC CTGATGACTC AGTGGGGGTT GCATCTTTTA CACTTGACTT
5941 TTTTTTTAAA GGTTAAAAAA TATTTTATGT ATAGAGATGT TTTATGTGTA TAGGTACAGT
6001 GCCCACAGAT GCCAGAAAAG GGAGTCGGAT TCCCTGGAAC TGGAGTTGCA AACCGTTGTG
6061 AGTTGCCCTG TAGGTGCTGG AGTTTCATGA ATAGAATTTG GGAAAGAGAC TGGGTCTTGG
6121 GGAGGCCATT ATGCATGGAC GTTTGGTCTC CTGGGAGTTT GTAAGCTGGG CATCTTCTGT
6181 CTTCTCATTT AACAAGCATT TGCTGAGCTC CTGCTCTGGG CAGACACTGT TCTGTTGGGG
6241 AGGGTTCAGC ATTGAATGAA ACAAGCATGG ATGCTCTCCA CTGCACCTTA CATTTTAGCA
6301 GGGGGATGTT GAATGCAGAA ACACATACAA GTAGAGTTAA ATAGTTAGAA AGCAAATTAG
6361 TATTAACCCA CAGTGAGTTT TATTCAGGCC AGCCTGGGCT ACAGTCTCAA AAACCAAAGC
6421 CAAGAAAGGT GGTAAGGAAC AAAAGTGGGC AGATCAACAG GGATAGTTCA GGAAGGCCC
6481 TAGGGTGCCA TCTTTTTCAT TCAGGATCAG ATGATTCCTG GTGTCAGAGA CAGTTTTGTC
6541 CCAGGGACAG GTTGGGTCTT TCTATCTACA TGCCCTGAGA TGGCTTTTTT CTTTCTTCTT
6601 CTCTGGACCT CAGTACTCAA CCCCAAATCT ACAGACATGG ACTAGCTCAG ATTCAACAAT
6661 TGGGAGGGAA TTCAATAGTC TCACCGTTAA TTCCCAGCTG GCCTGTCTCT AGTCTCAGCT
6721 GTGTTTTGTC CTCTTAGCTT CTATCCATCT ACAGGGAGAG GGTAGGATTC AGCCTGAGTG
6781 TCAATATCTG ATCCAGCTAC TGGGAAGCTC CTCAGATATG CCTCTCTTTG GCCTAGGACA
6841 AGGATGGTAG GATTTGGCCT TGGGGAGGGG AGAAAAATGG ATATTTAGGC TTATAGACCT
6901 GAGGAACTAT CATGATAGGA GAGAAAGAAA GAGGACAGAG AAGGAAGAAT GTGTTTGGG
6961 GTGGAGGAAG TGGCCAGTAT GCTCAGTACA ACTGAGGGGC CATGCACGGA AAGGCTGAGT
7021 TAACTGGTTT GAGGCAGCTG GTGACTGGAA AGAGCTGCAG AGAGGAGTGA ATAGAGGTAG
7081 TGACCTGAGG ACTCAGAGAT GTCACTTCCC ATCTTGTAAG ATTTTCCTCA GGAGAAATGA
7141 AGCTTTCCAT GTAATGGTGA CAAAGAGAGC CCGAGGATTC TGATCACTCC CGGAGTTCAT
7201 CGATGGGGCA GAGACCCAGA GAGAAAATGT CTTCTCAAGC CTTGTATCTC AGAGTGGTGT
7261 GTAGGCAGGC CCATTCTCCC TGTCCCAAGA AAATGTTGTC TCTGAAGCCC AGAATCCCTG
7321 ACTCCACAAG GGAAGAAAAG TGCCCTGAGG CCTGGCCTGA GGTGTTTTGC TGATCTGTTC
7381 CCCTTTATTT CTTACCACTC CATTTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTTTGCTTA
7441 TTTGTTTTTC TGAAACAGGG TCTCATGTGG CCTCAAACCC ACTAAGTTGC TGAGGCTGAC
7501 TTTGAACTTC CGATCTTCCT GCCTCTGTCT CCAGAGTGCT GGGATTACAG GTGTGCACTA
7561 GAATACCAGG TTTATTCAGT GACAGGAGCT AAATCCAGAG CTTTGTGCAT ATTAGGCAAG
7621 CACTCTACAA CCAGACTGCA TCCCCACCCC ACGCCTCACT CTTTTGTGCC TACCGTACTA
7681 GCTTTCTTCC TTTTTGTTTT AGACTGTTTT ATTGGTTTTT GACTCCCAGA TGTTGAATTT
7741 TGGTTTATTT TTCACATAAC AGCCCATCTT CCTCTTTGCC CACTCTCATT TGGTTGAATT
7801 GTCCCTGAAG TCCAGGAAGT TTTCCTGACT CCATGGGACT GGGTGCCTCC TTTGCATCCC
7861 CATGGGACCC CAGGTATGCT GGCCCTTCCT GCCCTAACAT TTGCTTATTT AGTTGCTTCT
7921 TCACTGAAAC ACAAACCCCT CAGAGCTGAA ACCAAGTCTG ATTAAGCCCT CTGCACCAGC
7981 ACCTTAGGGT ACAGACACTC GGTTCTTTCC CCACTGGCCA TGAACAGCCC TTCTCCTCCC
8041 ACTGGCTCTC TATTTTCTCT CTGGGCCTGG CGTCTGACCT GGCATCTGGC AAGGACCTGA
8101 AAGGCTGGTA TAGAGTGGTG AAGACCAGGC ATGGAGGCTA TGGATCCAGT CAGCTGTCTG
8161 GCCTCCTCAC GCCGGTCCCT ACCTGCTTCC TTTTTAATAA AATAAGTGTG TGTTCCTCAG
8221 AAGCTGTCAC TGTGTCATTA GCTTCCTCGC ACCCCCTACC CGGACACACC CCCCTGCCCA
8281 TGTAAACCTG TTACCTATTC ACAGAGCTTA ATTGTCATGA ATCTAAGTAA AGGGTTACCC
8341 AGGGGAGGTG ACACAAAGCC CTGAGTTGGA AGGGGCTTGA GCAAGGTGAA GTAGGTGTGA
8401 ATTCAGGGCG ACACCCAAGG TTAGAGATCC AGACCACATA GGAAGGTCAG GAAATAGAAG
8461 AGGAGGCCAG TAGACAGCTA GAGTTCATAG AGAAAATGGC TTTACTTTCC TTATGGGCAA
8521 GAGGGCTACA CAAATTTAGG CCCAGGACAG GTGGTGGTAG TGAAGAGCTT GCTGGCTGGA
8581 GGACTGGCTC TGTGGATGAC CATGGGGACA GTGAGGAAGG ACAGTTGGTG TGGAACAGTT
8641 GGTGAAGGGA GTAACTGGGG CCTGGGTGGA AGTGAGAAGA AAAGAGCAGC CAGGCTCTGG
8701 AGGAGCTTGG CCTGGTCAGA ATCACTTGGG GCTTAAGGGC TTAAGTATTG CTACTGGGTG
8761 TGCTGGCTTG TGACTTTGAG TGAGTCACTA TCATTCTGAG GTTTGGTTTC TTTATCTGTT
8821 AAACAGAGAT GTTAACAGTC ATCTTCCAGG ACTGTCATGG GACTTCAGCA TAATATATGC
8881 AAAGTATCTG TGTTTCATTA AAAAATGATT CTATAGAAAG AGCTACGGAA ATATCTATAA
8941 GAAAGCATTC TTTTTCCAAG AAACAGGACC AGGAGGGATG GGACTGTCCT AACAGAAGAG
9001 ACGAGGGAAG GACATGAGTG TGAGGGAATA TTAATCCCTC ACTCAACAGC AGGACTTTTG
9061 TGTGCCTGTC TTATGTCAGG AAAGGAGGGG TAGCCAGTCT TGACCACCCA TTTTGACTTC
9121 AGAGGCTGGA GAGCAGAGTG GAAGCTGGGA ATAGGAAGGA ATCCTAGAGG CAAGTGCTAT
9181 GGGAGGAGCT TAGTGGTGTG GTGTGGGCAG CCTAGCTCTG ACAGTAAAGT CCCTGAGCAA
9241 GTTGTGCTGA ACTGAACTGT CCTGAGGGGC AAGGTTGGGA GGTATCTGGG AGATTTCACA
9301 TTCTGTCTTG AGCATTACCT AGTTTTCAGT GGTGGAGCGG GCTGGTCCAG GAATGCTGGC
9361 TTCCTCCTGG GCCCCATACT CTTGCCAAGG CTACCTGGGG TGAGGCAATG CTCCCCCACC
9421 TCACTTTGCC TTCCAGCTCC TACTTAAGCT CTCCCCACTG GTTTGCTCTG AGGCCTGCCC
9481 CTCCCCAGCT CCTGGGCTTT CTCTCCACAC AATAACAGGA TGTGATCTTC GAAGAGAGGA
9541 AGTGGGGGAG GACTGCTGTG CCGATAGCAG GGAAGGAGGG GGGCTTCTGA CTCTCCCCTC
9601 TCCAGCCCTC CTTTGCTCTG TAGGCCAGCC CCTGCAGCTC CTTGATCCCC CTAAGCCCTA
9661 CCTCAAGCTT CTATCTGAGA CAAGTAGGGA TGAAGGGTCT TTAGGCCCAT GTAGGACTGC
9721 TTGCCTATGG AGAGACATGC CTTGGCCACA CCGTCTTCAG GATCTACCTT CTGGAGAGAC
9781 TTGCTGGCCT AGCTTTAGAT GCTGGGTTGT TTTCTGCCCG GAGCTGCTGG AGTCTAAGGG
9841 TGGGCAGGTG GGTCATTCTG TAGGGCTCCA TCTGTCCAGT GCACTCCCAA GTCCACACGA
9901 GCATGATTCA GTGCAGGGAG TGCGTGATAG CATCAATCTA AAGGTCTATG TCAAATGCTG
9961 GTTTGGCTTG CACAGTGTGT GTCAGGCTGC AAAAATGGAC AGTGAAATCC AGAAAGACAA
10021 GGAGCATGAG GAAGGAGCAA GGCTAGGCTG GAACCCAGCA CTAGGTCATT GGGTTACCGC
10081 CTCTTCGAGC CAGGGATGTT CTTAGAACTT CCAAAGTTGA TGGGAAAGTT TTAGATCgaG
10141 TCGACCGATG CCCTTGAGAG CCTTCAACCC AGTCAGCTCC TTCCGGTGGG CGCGGGGCAT
10201 GACTATCGTC GCCGCACTTA TGACTGTCTT CTTTATCATG CAACTCGTAG GACAGGTGCC
10261 GGCAGCGCTC TTCCGCTTCC TCGCTCACTG ACTCGCTGCG CTCGGTCGTT CGGCTGCGGC
10321 GAGCGGTATC AGCTCACTCA AAGGCGGTAA TACGGTTATC CACAGAATCA GGGGATAACG
10381 CAGGAAAGAA CATGTGAGCA AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA AGGCCGCGT
10441 TGCTGGCGTT TTTCCATAGG CTCCGCCCCC CTGACGAGCA TCACAAAAAT CGACGCTCAA
10501 GTCAGAGGTG GCGAAACCCG ACAGGACTAT AAAGATACCA GGCGTTTCCC CCTGGAAGCT
10561 CCCTCGTGCG CTCTCCTGTT CCGACCCTGC CGCTTACCGG ATACCTGTCC GCCTTTCTCC
10621 CTTCGGGAAG CGTGGCGCTT TCTCATAGCT CACGCTGTAG GTATCTCAGT TCGGTGTAGG
10681 TCGTTCGCTC CAAGCTGGGC TGTGTGCACG AACCCCCCGT TCAGCCCGAC CGCTGCGCCT
10741 TATCCGGTAA CTATCGTCTT GAGTCCAACC CGGTAAGACA CGACTTATCG CCACTGGCAG
10801 CAGCCACTGG TAACAGGATT AGCAGAGCGA GGTATGTAGG CGGTGCTACA GAGTTCTTGA
10861 AGTGGTGGCC TAACTACGGC TACACTAGAA GAACAGTATT TGGTATCTGC GCTCTGCTGA
10921 AGCCAGTTAC CTTCGGAAAA AGAGTTGGTA GCTCTTGATC CGGCAAACAA ACCACCGCTG
10981 GTAGCGGTGG TTTTTTTGTT TGCAAGCAGC AGATTACGCG CAGAAAAAAA GGATCTCAAG
11041 AAGATCCTTT GATCTTTTCT ACGGGGTCTG ACGCTCAGTG GAACGAAAAC TCACGTTAAG
11101 GGATTTTGGT CATGAGATTA TCAAAAAGGA TCTTCACCTA GATCCTTTTA AATTAAAAAT
11161 GAAGTTTTAA ATCAATCTAA AGTATATATG AGTAAACTTG GTCTGACAGT TACCAATGCT
11221 TAATCAGTGA GGCACCTATC TCAGCGATCT GTCTATTTCG TTCATCCATA GTTGCCTGAC
11281 TCCCCGTCGT GTAGATAACT ACGATACGGG AGGGCTTACC ATCTGGCCCC AGTGCTGCAA
11341 TGATACCGCG AGACCCACGC TCACCGGCTC CAGATTTATC AGCAATAAAC CAGCCAGCCG
11401 GAAGGGCCGA GCGCAGAAGT GGTCCTGCAA CTTTATCCGC CTCCATCCAG TCTATTAATT
11461 GTTGCCGGGA AGCTAGAGTA AGTAGTTCGC CAGTTAATAG TTTGCGCAAC GTTGTTGCCA
11521 TTGCTACAGG CATCGTGGTG TCACGCTCGT CGTTTGGTAT GGCTTCATTC AGCTCCGGTT
11581 CCCAACGATC AAGGCGAGTT ACATGATCCC CCATGTTGTG CAAAAAAGCG GTTAGCTCCT
11641 TCGGTCCTCC GATCGTTGTC AGAAGTAAGT TGGCCGCAGT GTTATCACTC ATGGTTATGG
11701 CAGCACTGCA TAATTCTCTT ACTGTCATGC CATCCGTAAG ATGCTTTTCT GTGACTGGTG
11761 AGTACTCAAC CAAGTCATTC TGAGAATAGT GTATGCGGCG ACCGAGTTGC TCTTGCCCGG
11821 CGTCAATACG GGATAATACC GCGCCACATA GCAGAACTTT AAAAGTGCTC ATCATTGGAA
11881 AACGTTCTTC GGGGCGAAAA CTCTCAAGGA TCTTACCGCT GTTGAGATCC AGTTCGATGT
11941 AACCCACTCG TGCACCCAAC TGATCTTCAG CATCTTTTAC TTTCACCAGC GTTTCTGGGT
12001 GAGCAAAAAC AGGAAGGCAA AATGCCGCAA AAAAGGGAAT AAGGGCGACA GGAAATGTT
12061 GAATACTCAT ACTCTTCCTT TTTCAATATT ATTGAAGCAT TTATCAGGGT TATTGTCTCA
12121 TGAGCGGATA CATATTTGAA TGTATTTAGA AAAATAAACA AATAGGGGTT CCGCGCACAT
12181 TTCCCCGAAA AGTGCCACCT GACGCGCCCT GTAGCGGCGC ATTAAGCGCG GCGGGTGTGG
12241 TGGTTACGCG CAGCGTGACC GCTACACTTG CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT CCTTTCGCTT
12301 TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG TCAAGCTCTA AATCGGGGGC
12361 TCCCTTTAGG GTTCCGATTT AGTGCTTTAC GGCACCTCGA CCCCAAAAAA CTTGATTAGG
12421 GTGATGGTTC ACGTAGTGGG CCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCT TTGACGTTGG
12481 AGTCCACGTT CTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGG AACAACACTC AACCCTATCT
12541 CGGTCTATTC TTTTGATTTA TAAGGGATTT TGCCGATTTC GGCCTATTGG TTAAAAAATG
12601 AGCTGATTTA ACAAAAATTT AACGCGAATT TTAACAAAAT ATTAACGCTT ACAATTTGCC
12661 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT
12721 TACGCCAGCC CAAGCTACCA TGATAAGTAA GTAATATTAA GGTACGTGGA GGTTTTACTT
12781 GCTTTAAAAA CCTCCCACAC CTCCCCCTGA ACCTGAAACA TAAAATGAAT GCAATTGTTG
12841 TTGTTAACTT GTTTATTGCA GCTTATAATG GTTACAAATA AAGCAATAGC ATCACAAATT
12901 TCACAAATAA AGCATTTTTT TCACTGCATT CTAGTTGTGG TTTGTCCAAA CTCATCAATG
12961 TATCTTATGG TACTGTAACT GAGCTAACAT AACCCGGGAG GTACCGAGCT CTTACGCGTG
13021 CTAGCTCGAG ATC
//
序列号3
内皮-CRE-ERt
基因座 内-pGL2-启动子 12192 bp DNA 环状的 SYN 12-DEC-2007
定义 .
登录号 .
关键词 .
特征 位置/合格者
碱基数 3021 a 3013 c 2707 g 3451 t
起点
1 CCCGGGAGGT ACCCTGGGCT ACACAGAGAT AGATGTCTTT TGCCACAGCT TCTCCTGGCA
61 ACCCAAAGCT ACCTGGCAGA GTCCAGTCTG CCTAACACCT ATGAATCTAT GAGATACCTT
121 AAAAAGCATA TCCTTCTTCT ATACATCTTT CCACTTCCTC CTCTTCTCCA CCCTATTCAT
181 CAGACAACTG TCTCAGTCAG TGGGGAACAT GAAGAGGGGA TATGGATGCT TGCTTTCACA
241 GGTGCCTCTG CATAAAGGGA GTTCTCAGTG AGCTGGAGCA GAGGCTATGG AGGAAGGAAG
301 CAGAGATGAC AGATTAAAGA CAGATGCAGA GACAAGGCCT TTATACAGGA AAGAGGAGCA
361 GATTCAGAGT TTGCCTGAGC CTAAGATAGA GACCGGAGAA ATGAAAGGCA GAGTGAGCAA
421 GATAAGAGAT GAAAGGAATA GACCCCGGGG TTCCTCCACT GCATCCTCAT TACAGATAGG
481 AAAACTGAAG GTCAGAGGAA GTGGTGGTTC TACTTCCTAC GGATGTATCC ATCACTCTTG
541 TAAATACACT GGGTCAGGTC CTCCCTTCTC CAGCACTTTC CTCTTGCCCT TGTGCACTAG
601 GACTGAGTAA CACAAGTGAC ACCCAGTGGG AGGCTCTTGG ACAAGTCAAC CAGGAAGAGG
661 GAGAGAGGAG ACAGTGTAGA CAAAATAGAT TGACAGGGAA GTTTTTCTGG ACTAGGTAAG
721 CTTGAAGAAG GGCACAGAGG GTGTAAACAA CTGTATTAAG GTATATGGTT TATGTGCAGT
781 AAGATATACC ATTTCAGCAT CCAGTTAGCT GAGGTTTGAC AACACTTTTA TAGTCATTAC
841 CACAATCAAT GTATAGAATA TGTCTTTGAT AGAAAGTTCC GTTGTGTCTC TTGTATCCAC
901 TCCATGTTGC ATTTTATCCT TCTGAACTCT GTCATTGTAG ATTCATTTTG CTTTTCTTCC
961 CCTAGGGTTT CATGTACATG TAGCTAGTTA CTATAGACAC TGTCTGATCG CTTTCACTCT
1021 GCATGAATTG GAGGTTTTCT ATGTTTTTAC ATGTATCTGA AGTTATTTTT ATTGCTCAGC
1081 CATATCCAGT TGCATGCCTG GACCAATATA TGTACCTATC TGTTGATATG CTTTGAAAGT
1141 ATTTCTACTT TTTTTTTGTT TGTTTTTTGT TTTGTTTTTG AGACTATGTG GCTCTGGCTG
1201 TCCTGGAACT CGAAATATAG GCCAGGCTGG TGTGGCACTC ACAGAGACTC ACCTGCTTCT
1261 GTCTCTCACA TTCTGGGATT AAAGGTGTGG ACCATTATGC CCTGCTTATT TATTTTTTGA
1321 TGCTATGGAT AAGTCTTTAT ATGCATATAT TCCTGTGGAT ATGTTTTTAT GTCTCTCAAT
1381 AAATATGTAT TATTAACCAT ATGATTAAAG GGGCTCAAGT GTGTGTATTT TTCTCCAATA
1441 TGGCTGAGTA GAGTTTGCAT TCCCTTCAGT GTACAAGAAT GCCAGTTGAC CTTTATTCCT
1501 ATCAACACTT GGTCTTGTCT GTCTTTCACG TTCTAGCCAT ATTGACAGAC TTGTCATGGT
1561 AGCTCTTTGT AGTTTGAATT TCTGTTTCTC TGGTGTAACT TTCTTTTCAT GAAAGTTTTG
1621 TTTTCTAAGT TCATAAGGAT TTTCAACTCA GACACATTAC AGTGATACTC ACTGTTCGGC
1681 TGAAGATTTT AAAGTAGTTC ACACAGGAAG AAATGTCATA TAGCCAACAG GGGTGGAGAG
1741 GACAATAGGC CATGTTGTTC TAGGCTACAC AGCAGTTAAA TGACAAGAGT GAGCCTGCTT
1801 TCTCACCTCC AAAGTAGCGT CACCAGGCGG CATGACACTG TCATTGTCTA CAGTCAGATG
1861 ACAGGTGGAC ACAAGGGCAG AAGAGGTACA CACAGAGAGA TGCTCAGTAC ATGCATGTGC
1921 AGGGCCTGGA GGCATATCTA CTGTCTTGAT GTGTGTCATA AACCTGGCCA CTGTCCTGAT
1981 GACCATCGGC AGCTATTTGC GACAGAGTTG GTGGTTGTGC GTGTATTGTC TTCTAATGGC
2041 TTGAACAAGT AAAACATTAA TGGCAGAATG CTCTCTCCTG AGGACAGAAA GCTTGGGAAC
2101 ACAAACTGGG GACACAGCTT TGGTCCTCTG TGTACTTCTA GAAGATGCAT AGGTTGCACA
2161 AGGAAGATAG GAGGCTAGAG AGCCCGCTGC CTTCTGCAGC TGCTCATTCA TTTTGCTTTG
2221 GATTTTTTCC TTTCATTTCT CTTTCTTTCT TTCTTTCTTT CTTCCTTTCT CACCAATGGT
2281 GCTCTAGTTC TTAAGCTGTG TGCTGCAGAC ATCATCCTGG AGGCTGGTGA AACACACCTG
2341 GCCTCTCTTC CAGAGGAGCC TAGGGTCCCC TTCCAGAACT GACTTCTCTA AGGACATGGC
2401 CCCTCCTTTG AAAGTCATAC ATTAGAGCAA AGCCCTTTCC ATCCCTGCAA ATGCTGATGG
2461 CAAGGCTGGG ATAAGAACAT GGAAATGATT TCATCTGTGG GGTTCTGGGC TCAGCCTTGC
2521 AAACTAGAAT GGCAGGGGCT CATTCCTAGT AAGGAACAGA GGCAAAATAT GGAGGACAGT
2581 TATATGGAAA TGAATTGGAG CAGGTTATGA CATCTCCTTA AATGGGCATA TTTACCATCA
2641 ATAAGTTTTA TAAAACCCAC TGTCAGGTAT GGGCAATTAT CACCTCCTCT TTACAGAGGA
2701 GGAAAATGGA AGAGGCTATC TTGCCTATGC TCATGCAGCC CAGTGAGAAA GCAGGAATGA
2761 GGGCTCAGAC ATGCTAGTCA ATGGTTCTGC TCTGCTGCCT GGAGGCACCA GAATGTCCCG
2821 GCTGGGAATT CTTTATTCAC AGCAAGTTGC TTAGATGTCT GAGCTATCTA CTAAGTGGAA
2881 GTCCCGACCT TCCCTACGTC TTTGAGCTGT TGTAAAATGA ACGGAATTGA CATTATGAAG
2941 TGTTTAGGTC TGGCACGATA CAAATTCGTT ATAAACCCAT CTGCCCACCA GAGTGCTGGC
3001 AGACCGAACT TCTCCAGGGG TGGAAGCTCA GAGATGGTAC AGCACCTGAA AACATTGCAA
3061 ACCCTGGACT CTGGAGGGCG GACAACGTAG GCCCTGGGAG TGGAGGAGCC TGTCCCCTGC
3121 TCTTGCCTAC CCGGGGCCAG ACTCCAGACT CCCTGGTTCC TCACCTCCCC GCCCCCTCAC
3181 CACCCCCACC GAGGCGCTCC GAATTTCCTG CCCGACCGAG GCCCGGCTCG GGCGGGTGGA
3241 GGAGGGCTGG CATTTCCTGG CCGCCGCGTC ACTGGCTCAG CGGTGCTCGG ACAAAGCGCT
3301 GACCGACAGG CACCAGAAGC TATTTCAGGC GGCGCCCAGC TTAGCGCGCA GTTTCCGTTT
3361 TTCCACCGTC GGAAACAGGG AACAGGGAGC TTGCAGACGT CACAAACCCC CAGCCTCAGG
3421 CGTGGGTCCA GGGACCAGGA GAGGCAAGGC CCATGTGTTA GAAACAGGGT AGAGGCAGAC
3481 GCTATCCCCG CACCTTCTAT CCAACCTTAC TCCTTAACTG TCCTTGGAAA CACCAGAGAA
3541 GGCCATTTCA CACCCAGGAA AATGATCCAG TCGTCGTTGG TCAAGCCAAA TGCATAACCT
3601 TTTCAAGCCC ATAAACCTCG AGACAGCCTT ACCCCATTCC CTCTCCTGAA TTAACTAACC
3661 TGCCCCCAGA CATCCTGGAT TCTTCGATTT TCATTATTCA ACGGCGTCGT AGTTCTTCCA
3721 AACTCAGTCT TAAATACCCT GTGCGAAACA TCTACCCCAC ACCTTCTCTT CCATCTCCTG
3781 GAAGGAGAAT TAGAACAAGC TCTAACCTCT TTTCTCTGGT CACAGAACAC TTAGCCTTCA
3841 CCTCCCAGCT CCCCACACCA ACACAGCCCC TACCGCCATT TCAACCCAAG GCTTTCCTTT
3901 CCTTTCCTTT CCTTTCCTTT CCTTTCCTTT CCTTTCCTTT CCTTTCCTTT CCTTTCCTTT
3961 CCTTTCCTTT CCTTTCCTTT CCTTTTTCCT TTTTTATTAG ATATTTTCTT TATTTACATT
4021 TCAAATGTTA TCCCTTTCCT AGTTTCCCCT CCGAAAGTCC CCTATCCCTT CCCCCTCCCC
4081 CTCCCCCTGC TCCCCAACCC ACCCACTCCT GCTTCCTGGC CCTGGCATTC CCCTATACTG
4141 GGGCATAGAG CCTTCACAGG ACCAAGGGCC TCTCCTCCCA TTGATGACCA ATTAGGCCAT
4201 ACTCATGGCT CTAACTGCAT ACTGCATATG CAGTTAGAGC CATGAGTCCC ACCATGTGTT
4261 TTCTTTGATT GGTGGTTTAG TCCCAGGGAG CTCTGGGGGC ACTGGTTAGT TCATATTGTT
4321 GTTCCTCCTA TGGGGCTGCA AACCCCTTCA GCTCCTTGGA TACTTTCTCT AGTTCCTTCA
4381 TTCCAAGGGT TTTCTAAAAA AGCAAATCCG ATCTTACATA GGACAGCAAG CCCTTATGTA
4441 AACACAGTGG TAAAAACAAA ACCCTCAATT CTTCCACCCA TACTGTACCA GTTTTCTGTT
4501 TCTTACATTA ACTTTCCCCC TTTCTGTGTC AGCCCTTGGT CCAGGACGCC TGGCTTTCCT
4561 GGGAAGCACA CCCAGTTAGC TCACATACAA TATAGTTAGC CCATATAACC AAGCGAAGGC
4621 AGCACAGCTG GACTTTCATC AAATGTCACA GAGGAACAGA CAGGTGTAAC TAATACTCCA
4681 TCTCCAGTAT TGGTCCTGAA ATCTAGGAGG GGCAGAACTC AAAACAGGTG CTACTCTTTG
4741 GAATCAGCCC TTGACTGAGT CTCAGTCTGT GACCGGGTTC AGAGCTACTG GAAGGTCAAT
4801 GCAGTTTGGG ATGCTTAGTG GGGTCTATGG AATGGAAATT GAACAAGAGA GTTCAGATAG
4861 GTGCTGGCGT TACTCTAGCT ATAAGTTTGA TCAAGTTACA TCTCTTTGCC CCCTACTTTC
4921 CTTTAACATT CTTAATTTCT GTATGGCAAC CAGACAAATG CCTATGATAT CTTATTAGCT
4981 CCCTACCACC CACTTTTTAT ATTATTTCTC ATGTATATGA AACTTTGGCA TTTAAAATAT
5041 TATTATTATT CATTTAGGCT TTTTGAGAAA GGGTTTCTCT GTGTAGTCTT GGCTGTCCTG
5101 AAACTCCATA TGTAGATTAG GCTGGCCTCT AACTCAAAGG ATCTGCCTGC CTGCCTCAAT
5161 GAGAGCTGGG ATTAAAGGTA TGTGCGTTTA TTCTTTGAGT ATTTTATAAA ATGAATTTTG
5221 ATCATATTCA CCTCCTATTA CCCCTCATCT CCTCCTATCC TGATGTCTTT TTTTTTTTTT
5281 TAAATCTACA GAGAGGCTAG AGAGATGGCT CAGTGGTTAA GAGCATTGGT TGCTCTTCTG
5341 GAGGACCTGG ATTTGATTTC CAGTGTCTAT ATGGTAGCTC ACAAACTCCT GTTTCAGAGG
5401 AGCTAATGTG TCTGCCTTCT TCTAGTCTCT GGATACAGTA CATAGACATT AATACAGGCA
5461 AAACCAGGGA CCACACCCTT AAAAATGATT CCCCTTCTCA AGAAGTGTTC AACTGTCAAT
5521 AGCTCTTCAG TTAGCGGTGA AGGCTCATGA ACACCCCCCC CCCACACACA CACACACACA
5581 TACACCTACC TTCTGGCTAG AATCTTGACT GGCTTGATCC TGAGCAGGCA ACCACAGCTG
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5701 ATCTTTTTCT TCTTTTCTTC TCTTCTGCTT CAAGGCAGGG TTTCACTATG AACCCGTGGC
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5941 TAGAAAGAAA AACCCAGATA CTCCTCAGCC CATTGGGTTC CTACAATGTA CCTATGGGCT
6001 TCAATGTCAA ACTTCTTTCA AATCAGGCTT CTGTCCCTCA CTAGAAATTT AATATTGAGT
6061 TATTGACACA GCCCTGTCAC CCCCTCCCCC CACTGTTTTC TCACCTATAA ATTAGGAATA
6121 ATAAAAGCAC CAATGGGGAG AAGTTGGATG AAGGGGGAAA AGTATCACTA AAGCACACTA
6181 TTATTCAAAG GTGCCCTAAT GATATCCAAT TGTATGGTAT TTAAAAAATA AAAAATAAAA
6241 GCATTACGAA ACCGGGTGTG GTGGTGCATG CCTTTAATCC CAGCACTCCA GAGGCAGAGA
6301 CAGGTGGATC TGCATCTCAA TTAGTCAGCA ACCATAGTCC CGCCCCTAAC TCCGCCCATC
6361 CCGCCCCTAA CTCCGCCCAG TTCCGCCCAT TCTCCGCCCC ATGGCTGACT AATTTTTTTT
6421 ATTTATGCAG AGGCCGAGGC CGCCTCGGCC TCTGAGCTAT TCCAGAAGTA GTGAGGAGGC
6481 TTTTTTGGAG GCCTAGGCTT TTGCAAAAAG CTCGATCcTG AGAACTTCAG GGTGAGTTTG
6541 gggacCCTTG ATTGTTCTTT CTTTTTCGCT ATTGTAAAAT TCATGTTATA TGGAGGGgGC
6601 AAAGTTTTCA GGGTGTTGTT TAGAATGGGA AGATGTCCCT TGTATCACCA TGGACCCTCA
6661 TGATAATTTT GTTTCTTTCA CTTTCTACTC TGTTGACAAC CATTGTCTCC TCTTATTTTC
6721 TTTTCATTTT CTGTAACTTT TTCGTTAAAC TTTAGCTTGC ATTTGTAACG AATTTTTAAA
6781 TTCACTTTTG TTTATTTGTC AGATTGTAAG TACTTTCTCT AATCACTTTT TTTTCAAGGC
6841 AATCAGGGTA TATTATATTG TACTTCAGCA CAGTTTTAGA GAACAATTGT TATAATTAAA
6901 TGATAAGGTA GAATATTTCT GCATATAAAT TCTGGCTGGC GTGGAAATAT TCTTATTGGT
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7021 CTGTTTGAGA TGAGGATAAA ATACTCTGAG TCCAAACCGG GCCCCTCTGC TAACCATGTT
7081 CATGCCTTCT TCTTTTTCCT ACAGCTCCTG GGCAACGTGC TGGTTATTGT GCTGTCTCAT
7141 CATTTTGGCA AAGAATTGTA ATACGACTCA CTATAGGGCG AATTCCACCA TGTCCAATTT
7201 ACTGACCGTA CACCAAAATT TGCCTGCATT ACCGGTCGAT GCAACGAGTG ATGAGGTTCG
7261 CAAGAACCTG ATGGACATGT TCAGGGATCG CCAGGCGTTT TCTGAGCATA CCTGGAAAAT
7321 GCTTCTGTCC GTTTGCCGGT CGTGGGCGGC ATGGTGCAAG TTGAATAACC GGAAATGGTT
7381 TCCCGCAGAA CCTGAAGATG TTCGCGATTA TCTTCTATAT CTTCAGGCGC GCGGTCTGGC
7441 AGTAAAAACT ATCCAGCAAC ATTTGGGCCA GCTAAACATG CTTCATCGTC GGTCCGGGCT
7501 GCCACGACCA AGTGACAGCA ATGCTGTTTC ACTGGTTATG CGGCGGATCC GAAAAGAAAA
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7741 TATCTCACGT ACTGACGGTG GGAGAATGTT AATCCATATT GGCAGAACGA AAACGCTGGT
7801 TAGCACCGCA GGTGTAGAGA AGGCACTTAG CCTGGGGGTA ACTAAACTGG TCGAGCGATG
7861 GATTTCCGTC TCTGGTGTAG CTGATGATCC GAATAACTAC CTGTTTTGCC GGGTCAGAAA
7921 AAATGGTGTT GCCGCGCCAT CTGCCACCAG CCAGCTATCA ACTCGCGCCC TGGAAGGGAT
7981 TTTTGAAGCA ACTCATCGAT TGATTTACGG CGCTAAGGAT GACTCTGGTC AGAGATACCT
8041 GGCCTGGTCT GGACACAGTG CCCGTGTCGG AGCCGCGCGA GATATGGCCC GCGCTGGAGT
8101 TTCAATACCG GAGATCATGC AAGCTGGTGG CTGGACCAAT GTAAATATTG TCATGAACTA
8161 TATCCGTAAC CTGGATAGTG AAACAGGGGC AATGGTGCGC CTGCTGGAAG ATGGCGATCT
8221 CGAGCCATCT GCTGGAGACA TGAGAGCTGC CAACCTTTGG CCAAGCCCGC TCATGATCAA
8281 ACGCTCTAAG AAGAACAGCC TGGCCTTGTC CCTGACGGCC GACCAGATGG TCAGTGCCTT
8341 GTTGGATGCT GAGCCCCCCA TACTCTATTC CGAGTATGAT CCTACCAGAC CCTTCAGTGA
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8581 AGGGAAGCTA CTGTTTGCTC CTAACTTGCT CTTGGACAGG AACCAGGGAA AATGTGTAGA
8641 GGGCATGGTG GAGATCTTCG ACATGCTGCT GGCTACATCA TCTCGGTTCC GCATGATGAA
8701 TCTGCAGGGA GAGGAGTTTG TGTGCCTCAA ATCTATTATT TTGCTTAATT CTGGAGTGTA
8761 CACATTTCTG TCCAGCACCC TGAAGTCTCT GGAAGAGAAG GACCATATCC ACCGAGTCCT
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8881 GCAGCACCAG CGGCTGGCCC AGCTCCTCCT CATCCTCTCC CACATCAGGC ACATGAGTAA
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9001 GCTGCTGGAG ATGCTGGACG CCCACCGCCT ACATGCGCCC ACTAGCCGTG GAGGGGCATC
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9181 TGGCGGAATT CGGATCTTAT TAAAGCAGAA CTTGTTTATT GCAGCTTATA ATGGTTACAA
9241 ATAAAGCAAT AGCATCACAA ATTTCACAAA TAAAGCATTT TTTTCACTGC ATTCTAGTTG
9301 TGGTTTGTCC AAACTCATCA ATGTATCTTA TCATGTCTGG TCGACCGATG CCCTTGAGAG
9361 CCTTCAACCC AGTCAGCTCC TTCCGGTGGG CGCGGGGCAT GACTATCGTC GCCGCACTTA
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10801 ACATGATCCC CCATGTTGTG CAAAAAAGCG GTTAGCTCCT TCGGTCCTCC GATCGTTGTC
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12061 GCTTATAATG GTTACAAATA AAGCAATAGC ATCACAAATT TCACAAATAA AGCATTTTTT
12121 TCACTGCATT CTAGTTGTGG TTTGTCCAAA CTCATCAATG TATCTTATGG TACTGTAACT
12181 GAGCTAACAT AA
//
Claims (20)
1.一种产生转基因动物的方法，包括下列步骤：
提供转基因细胞系，该细胞系有条件地表达相应于与目标谱系互补的预定谱系的损害子基因；
提供供体胚胎，该胚胎具有相应于所述目标谱系的特异性基因缺陷或有条件地表达与所述目标谱系相应的损害子基因；
将所述细胞系导入所述供体胚胎中；和
在所述供体胚胎的发育中的预定时间活化所述损害子基因，使得仅仅所述转基因细胞系的目标谱系存活以及仅仅所述胚胎的互补谱系存活。
2.权利要求1的方法，其中所述转基因细胞系是胚胎细胞、胚胎干细胞、前体细胞或诱导的多能干细胞[EC/ES/P/iPS细胞]。
3.权利要求1的方法，其中所述目标谱系相应于所述转基因动物的造血和内皮系统。
4.权利要求1的方法，其中所述目标谱系相应于所述转基因动物的器官。
5.权利要求1的方法，其中所述目标谱系相应于所述转基因动物的组织。
6.权利要求1的方法，其中所述转基因细胞系是人类。
7.权利要求6的方法，其中所述供体胚胎是非人动物。
8.权利要求7的方法，其中所述非人动物是小鼠或猪。
9.权利要求1的方法，其中所述供体胚胎是桑椹胚阶段胚胎。
10.权利要求1的方法，其中所述导入步骤是体内的。
11.权利要求1的方法，其中所述导入步骤是体外的。
12.权利要求1的方法，其中所述损害子基因选自白喉毒素A(DTA)、单纯性疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)或次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)。
13.权利要求1的方法，其中所述活化步骤包括将重组控制药物导入到所述的宿主胚胎中。
14.一种产生转基因动物的方法，包括下列步骤：
提供转基因细胞系，该细胞系有条件地表达相应于与目标谱系互补的预定谱系的损害子基因；
提供具有相应于所述目标谱系的特异性基因缺陷的供体胚胎或有条件地表达与所述目标谱系相应的损害子基因的供体胚胎；
将所述转基因细胞系导入所述供体胚胎中；和
在所述供体胚胎的生长中的预定时间活化所述损害子基因，使得仅仅所述转基因细胞系的目标谱系的分化的细胞将会存活以及仅仅所述胚胎的互补谱系的分化的细胞将会存活。
15.一种指导胚胎发育的方法，包括下列步骤：
提供转基因细胞系，该细胞系有条件地表达相应于预定谱系的损害子基因；
将所述细胞系导入具有特异性基因缺陷或相应于互补谱系的损害子基因的供体胚胎中；和
在所述供体胚胎的生长中的预定时间活化所述损害子基因，使得随着所述胚胎的发育，所述转基因细胞系的互补谱系将会代替所述供体胚胎的所述互补谱系。
16.一种嵌合动物，包括：
从转基因细胞系的基因型分化出来的目标组织和/或器官；和
从供体胚胎的基因型分化出来的所有其余非目标组织和/或器官。
17.权利要求16的嵌合动物，其中所述转基因细胞系是胚胎细胞、胚胎干细胞、前体细胞或诱导的多能干细胞[EC/ES/P/iPS细胞]。
18.权利要求16的嵌合动物，其中所述转基因细胞系是人类。
19.权利要求17的嵌合动物，其中所述供体胚胎是非人动物。
20.权利要求19的方法，其中所述非人动物是小鼠或猪。
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