CN101672793B

CN101672793B - 一种苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN101672793B
Application number: CN2009101926213A
Authority: CN
Inventors: 林奇艺; 严全鸿
Original assignee: GUANGDONG INSTITUTE FOR DRUG CONTROL
Current assignee: GUANGDONG INSTITUTE FOR DRUG CONTROL
Priority date: 2009-09-23
Filing date: 2009-09-23
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2029-09-23
Also published as: CN101672793A

Abstract

本发明提供了一种苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，该试剂盒包括乙酸乙酯、稀盐酸、次氯酸钙饱和溶液、定性滤纸、吸管或注射器和标准比色卡。乙酸乙酯用于溶散待测样品和提取待测成分，稀盐酸用于萃取待测成分并去除复杂基质干扰，次氯酸钙饱和溶液用于与待测成分反应而显色，定性滤纸用于扩散、分离待测的系列成分及作为显色载体，并可有效排除待测成分溶液背景颜色的干扰，标准比色卡用于对所显现颜色的比对，从而可半定量判断所测定成分含量及限度。本试剂盒携带方便、操作简单、检测快速、成本低廉、半定量测定、准确度、灵敏度高，适用于监督现场快速筛查化妆品中禁用物质，也能够对限用物质快速进行半定量分析。

Description

一种苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种化学物质的理化分析领域，具体涉及一种苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒。

背景技术

苯二胺类物质包括对苯二胺(p-Phenylenediamine，PPD)及其盐类或衍生物(简称“对苯二胺类”)、邻苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)及其盐类或衍生物(简称“邻苯二胺类”)和间苯二胺(m-Phenylenediamine，MPD)及其盐类或衍生物(简称“间苯二胺类”)。对苯二胺、邻苯二胺和间苯二胺为同分异构体，分子式均为C₆H₈N₂，分子量均为108.14，其结构式如下：

近年来，实验研究和流行病学调查表明，化妆品中使用的部分氧化染料(氧化前体及偶合物)和氧化剂具有致癌及致突变作用，可导致机体染色体畸变、DNA断裂及膀胱癌、皮肤癌和胰腺癌等癌症的发病率增加。自1975年Ames实验室发现89％的氧化型染发剂具有致突变作用后，染发剂的致突变性研究就引起了人们的关注。研究表明，在体外诱变测试系统，染发剂的功效成分苯胺类衍生物、氧化剂和着色剂，可直接或在加用代谢活化系统后诱发原核细胞和真核细胞基因突变、染色体畸变和DNA损伤。对苯二胺主要用于制造偶氮染料和硫化染料等，并用作毛皮染料(毛皮黑D，即乌尔丝D或毛皮元D、Ursol D或Fur Black D)和显影剂等。口服毒性剧烈，易引起高铁血红蛋白血症、溶血性贫血和肝、肾损害。有很强的致敏作用，可引起接触性皮炎、湿疹、支气管哮喘等，当与氧化剂反应后产物易引致突变作用，是一种潜在致癌物质。邻苯二胺是对苯二胺的同分异构体，主要用作农药中间体，染料中间体。间苯二胺也是对苯二胺的同分异构体，毒性较大，是国际公认具有致癌、致敏、致畸作用，被严禁用于化妆品，主要用作染料中间体，用于制造碱性橙、碱性棕G、直接耐晒黑G等染料，并用作毛皮染料，也用作环氧树脂的固化剂、水泥的促凝剂等，但由于价格较之对苯二胺便宜，个别不法企业用之代替对苯二胺牟利。鉴于上述三者的毒性作用，2007年版《化妆品卫生规范》明确规定前者为限用品种，浓度不得超过6％，而后两者则禁止使用。国家也多次开展打击，而部分不法企业却以“无化学成分”、“纯植物”、“生态型”、“健康型”、“可以喝的”等噱头大肆宣传，而暗中却添加禁限用成分，甚至加入洗发剂中大肆宣传，从而引发多例严重过敏甚至死亡事件。

国家针对上述禁、限用物质的检测标准，多为精密仪器检测，如HPLC、GC、CE、LC-MS、GC-MS等方法，仪器设备价格昂贵、体积较大、检测环境要求较高、处理条件严格，必须使用标准物质同时对照检测，不便于开展现场监督使用。目前未见利用化学原理制备简便快速检测试剂盒的研究，尤其未见利用滤纸作为分离、扩散、化学反应显色载体同时半定量检测化学成分的研究。

发明内容

为克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供一种苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，能快速半定量的实现对苯二胺类物质的检测。

为实现上述目的，采用如下的技术方案：

本发明的一种苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒包括乙酸乙酯、稀盐酸、次氯酸钙饱和溶液、定性滤纸、吸管或注射器和标准比色卡，所述乙酸乙酯用于溶散待测样品和提取待测成分，所述稀盐酸用于萃取待测成分并去除化妆品复杂基质干扰，所述次氯酸钙饱和溶液用于与待测成分反应而显色，所述定性滤纸用于扩散、分离待测的系列成分及作为显色载体，并可有效排除待测成分溶液背景颜色的干扰，标准比色卡用于对所显现颜色的比对，从而可半定量判断所测定成分含量及限度，注射器(或吸管)用于转移并计量待测成分。本试剂盒还带有反应板，反应板为白色背景，用于承载定性滤纸并帮助判断颜色以及防止反应液体的流失。

优选的，所述定性滤纸的直径为4.0-4.5cm。

优选的，所述待测样品包括液体制剂、粉末、软膏或乳膏剂。

优选的，所述标准比色卡既可用于判断待测成分的最低检出限度，又可用于判断待测成分的最高限用限度，标准比色卡可半定量判断苯二胺类物质是否超过限用范围的最高浓度为6％的质量体积百分比浓度。

优选的，该试剂盒所检测的苯二胺类物质包括邻苯二胺类物质、间苯二胺类和对苯二胺类。

优选的，该试剂盒所检测的邻苯二胺类和间苯二胺类的最低检测限为0.01％的质量体积百分比浓度。

优选的，该试剂盒所检测的对苯二胺类的最低检测限为0.05％的质量体积百分比浓度，同时，可判断对苯二胺类限用限度为6％的质量体积百分比浓度。

与现有技术相比，本发明的苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒具有携带方便、操作简单、检测快速、成本低廉、半定量测定、准确度和灵敏度高等优点，检测时间不超过3分钟，适用于监督现场快速筛查化妆品中禁用物质，也能够对限用物质快速进行半定量分析，既可在户外监督现场，又可在户内固定场所进行操作，无需其他检测仪器辅助检测，无检测环境与条件限制，定位准确、效果理想。本发明的试剂盒利用一定直径圆形滤纸的扩散作用、过滤作用达到消除样品溶液颜色背景干扰和复杂基质干扰，达到同时进行多组份半定量分离检测的目的。

附图说明

图1是对苯二胺对照品的显色图；

图2是间苯二胺对照品的显色图；

图3是邻苯二胺对照品的显色图；

图4是样品14的显色图(样品14的相关信息见表7所示)；

图5是不同浓度(从左到右0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％)的对苯二胺对照品溶液的显色图；

图6是不同浓度(从左到右2.0％、4.0％、6.0％、8.0％)的对苯二胺对照品溶液的显色图；

图7是样品15的显色图(样品15的相关信息见表7所示，右边滤纸为样品15空白的颜色。)；

图8是样品15稀释10倍后的显色图(样品15的相关信息见表7所示)；

图9是样品31及其稀释10倍后的显色图(样品31的相关信息见表7所示，左图为样品31的显色结果，右图为样品31稀释10倍后的显色结果)；

图10是同时采用方法C和方法D检测样品1的显色图(样品1的相关信息见表7所示，方法C和方法D具体见实施例5)；

图11是对照品溶液的图谱，其中从左至右依次为邻苯二胺、对苯二胺、间苯二酚和间苯二胺；

图12是对照品溶液TIC图，其中从左至右依次为邻苯二胺、对苯二胺和间苯二胺；

图13是邻苯二胺二级质谱图；

图14是邻苯二胺谱库检索图；

图15是对苯二胺二级质谱图；

图16是对苯二胺谱库检索图；

图17是间苯二胺二级质谱图；

图18是间苯二胺谱库检索图；

图19～23为样品21的TIC图、二级质谱图和谱库检索图(样品1的相关信息见表7所示)：

图19是样品21的TIC图谱；

图20是样品21保留时间10.149min峰的二级质谱图；

图21是样品21保留时间10.149min峰的谱库检索图；

图22是样品21保留时间10.896min峰的二级质谱图；

图23是样品21保留时间10.896min峰的谱库检索图；

图24是样品6和样品22的显色图，其中左边为样品6，右边为样品22，右下角滤纸为样品22空白的颜色(样品6和22的相关信息见表7所示)。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例中所用到的仪器型号等信息如下：

天平：Sartorius CP-225D；高效液相色谱仪：Agilent 1100 Series；气相色谱仪：Agilent 6890N；气相-质谱联用仪：Agilent 6890N-5975B。

实施例中所用到的试剂来源等信息如下：

乙酸乙酯：分析纯，广州化学试剂厂；盐酸：分析纯，广州化学试剂厂；次氯酸钙：化学纯，上海润捷化学试剂有限公司；定性滤纸：分析用、中性(102)，杭州新华纸业有限公司；玻璃棒(Φ0.5cm，用于蘸取试剂的一头应平整)；塑料吸管(1ml，带刻度，一次性使用，1滴约0.05ml)；

苯二胺类对照品：

对苯二胺(p-Phenylenediamine，PPD)：化学纯，上海化学试剂采购供应五联化工厂，批号：20070827；

间苯二胺(m-Phenylenediamine，MPD)：分析纯，上海晶纯试剂有限公司，批号：10428；

邻苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)：化学纯，上海化学试剂采购供应五联化工厂，批号：20081103；

贮备液：PPD、MPD、OPD各配制成浓度5mg/ml；

样品：共51种(其中：市售样品50种、国家专项抽验阳性样品1种)。

实施例1：对苯二胺、邻苯二胺和间苯二胺对照品与次氯酸钙的理化反应

取对苯二胺、邻苯二胺和间苯二胺对照品各约0.5g置100ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，作为各自的对照品贮备液。

取对苯二胺贮备液适量置于不同的试管中，分别加入稀盐酸1ml，振摇，静置片刻，分别取下层溶液4滴和5滴滴于预先滴加有1滴次氯酸钙饱和溶液的定性滤纸上，显紫色。见图1，图1是对苯二胺滴加后3min的显色图。

取间苯二胺贮备液适量置于不同的试管中，分别加入稀盐酸1ml，振摇，静置片刻，分别取下层溶液4滴和5滴滴于预先滴加有1滴次氯酸钙饱和溶液的定性滤纸上，显黄色至橙黄色。见图2，图2是间苯二胺滴加后3min的显色图。

取邻苯二胺贮备液适量置于不同的试管中，分别加入稀盐酸1ml，振摇，静置片刻，分别取下层溶液4滴和5滴滴于预先滴加有1滴次氯酸钙饱和溶液的定性滤纸上，显橙红至橙黄色。见图3，图3是邻苯二胺滴加后3min的显色图。

实施例2：样品的显色检测

在收集的样品中随机抽取样品14，样品14的相关信息见表7所示，取样品14约1.5g置于15ml具塞试管中，加入乙酸乙酯9ml，拧紧瓶塞，用力振摇1分钟使溶散，静置片刻，取上层溶液6ml置试管中，加入稀盐酸1ml，振摇使混合均匀，静置片刻，取下层溶液5滴，滴于临用前预先加入次氯酸钙饱和溶液1滴的定性滤纸处，显紫色。样品14的显色情况如图4所示，图4显示样品14检测结果为对苯二胺类呈阳性。

实施例3：半定量检测

配制不同浓度的对苯二胺对照品溶液，各取5ml用稀盐酸1ml萃取，取下层溶液5滴滴于滴加1滴次氯酸钙饱和溶液的滤纸上，3分钟内，显紫色，颜色随着对照品浓度的减小而变浅。当浓度小于1.0％时，显淡紫色；当浓度为1.0％～2.0％为紫色；当浓度为4.0％～8.0％为深紫色。结果见图5-6，(图5从左至右右浓度依次为：0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％，图6从左到右浓度依次为2.0％、4.0％、6.0％、8.0％)。该方法可以实现对苯二胺类物质的半定量检测。

在收集的样品中随机抽取样品15，样品15的相关信息见表7所示，取样品15约1.5g置于15ml具塞试管中，加入乙酸乙酯9ml，拧紧瓶塞，用力振摇1分钟使溶散，静置片刻，取上层溶液6ml置试管中，加入稀盐酸1ml，振摇使混合均匀，静置片刻，取下层溶液5滴，滴于临用前预先加入次氯酸钙饱和溶液1滴的定性滤纸处，显紫褐色。样品15的显色情况如图7所示。取“样品15约1.5g置于15ml具塞试管中，加入乙酸乙酯9ml，拧紧瓶塞，用力振摇1分钟使溶散，静置片刻”的上层溶液1.2ml置试管中，加入稀盐酸2ml，振摇使混合均匀(即将样品15稀释10倍)，静置片刻，取下层溶液5滴，滴于临用前预先加入次氯酸钙饱和溶液1滴的定性滤纸处，显紫色。样品15稀释10倍后的显色情况如图8所示，显示样品15检测结果为对苯二胺类呈阳性。将图8与图5-6比较，颜色相当于2.0％～4.0％浓度，与样品15的GC检测结果(含对苯二胺30.91％)相吻合，已超过6.0％。

在收集的样品中随机抽取样品31，样品31的相关信息见表7所示，取样品31约1.5g置于15ml具塞试管中，加入乙酸乙酯9ml，拧紧瓶塞，用力振摇1分钟使溶散，静置片刻，取上层溶液6ml置试管中，加入稀盐酸1ml，振摇使混合均匀，静置片刻，取下层溶液5滴，滴于临用前预先加入次氯酸钙饱和溶液1滴的定性滤纸处，显紫红色伴浅绿色，不易判断。样品31的显色情况如图9(左图)所示。取“样品31约1.5g置于15ml具塞试管中，加入乙酸乙酯9ml，拧紧瓶塞，用力振摇1分钟使溶散，静置片刻”的上层溶液1.2ml置试管中，加入稀盐酸2ml，振摇使混合均匀(即将样品31稀释10倍)，静置片刻，取下层溶液5滴，滴于临用前预先加入次氯酸钙饱和溶液1滴的定性滤纸处，显淡紫色。样品31稀释10倍后的显色情况如图9(右图)所示，显示样品9检测结果为对苯二胺类呈阳性。将图9(右图)与图5-6比较，颜色相当于0.2％浓度，与样品31的GC检测结果(含对苯二胺1.93％)相吻合，未超过6.0％。

实施例4：滤纸的选择

分别选用定性分析、定量分析和层析用三种分析滤纸，剪成直径2.5cm、4.0cm、12.5cm圆形，实验时用玻璃棒蘸取次氯酸钙饱和溶液，取出，垂直点于上述滤纸中心，并分别用一次性塑料吸管吸取上述苯二胺类对照品贮备液配制成的不同浓度标准溶液0.25ml注入滤纸中心，使之均匀扩散并与次氯酸钙进行化学反应而显色。通过试验，选择扩散速度快、扩散均匀、颜色变化明显的滤纸作为正式试验载体。按如上方法，最后确定定性滤纸作用本法所用滤纸。

各分别选择OPD、MPD、PPD三种相同浓度(质量体积百分比浓度为0.1％、1％、5％)对照品溶液分别混合，并经2ml盐酸溶液提取后，在三种不同性质的滤纸上(Φ2.5cm、4.0cm、12.5cm)进行溶液扩散性、显色分离性反应，结果如表1所示。表1显示三种滤纸的试验效果。由该表可以看出，定性滤纸的溶液扩散速度快，显现颜色分离度好，颜色变化明显。

表1

滤纸类型试验效果

定性滤纸溶液扩散速度快，显现颜色分离度好，颜色变化明显

定量滤纸溶液扩散速度慢，显现颜色分离度差，颜色变化不明显

层析滤纸溶液扩散速度较快，显现颜色分离度较好，颜色变化较明显

而且，选用Φ2.5cm无法分离、选用Φ12.5cm均匀性较差、选用Φ4.0cm效果最好，既可使溶液快速均匀扩散，又可使各组份显现颜色有效分离，颜色变化也明显。本发明选用Φ4.0cm、中速、定性分析滤纸作为试验用载体材料。

实施例5：供试品溶液体积

最初采用方法A(取供试品约0.5g，加乙酸乙酯5ml溶解，再用稀盐酸2ml萃取的溶液进行点样实验)，发现有的样品在5ml乙酸乙酯中有絮状沉淀，必须过滤；接着以相同的样品采用方法B(取供试品约1.5g，加乙酸乙酯15ml溶解，取上层5ml再用稀盐酸2ml萃取的溶液进行点样实验)，发现点样效果与方法A过滤后相同。

由于采用方法B对样品1(样品1的相关信息见表7，含对苯二胺0.09％)无法检出，故将供试品配制修改成方法C(取供试品约1.5g，加乙酸乙酯9ml溶解，取上层6ml再用稀盐酸2ml萃取的溶液进行点样实验)和方法D(取供试品约1.5g，加乙酸乙酯9ml溶解，取上层6ml再用稀盐酸1ml萃取的溶液进行点样实验)，方法D的效果最明显，见图7。故采用方法D进行实验，该法点样的供试品溶液浓度约相当于方法B的4倍，有效地降低了检测限。图10为样品1的不同方法的显色情况，左边为方法C的显色结果，右边为方法D的显色结果。

实施例6：显色条件的确定

(1)显色时间

选用不同浓度OPD、MPD、PPD三种系列标准溶液，按上述检测与评价方法进行显色试验，结果见表2。表2是三种对照品标准溶液的显色时间比较。

表2

上述试验颜色显现时间到3分钟为量，清晰，且维持至5分钟不变色，之后，颜色则无可比性。因此确定显色时间为3-5分钟。

(2)显色试剂的选择

根据染发剂中可能添加的常用组份(MPD、OPD、PPD)及氧化剂的氧化特性，选择过氧化氢(30％)、次氯酸钙(饱和溶液)、高锰酸钾(0.02mol/L)等三种不同等级的强氧化剂进行试验，结果见表3。表3是显色试剂试验结果。

表3

由上表可知，在样品溶液定量且过量的情况下(一部分被漂白，余下部分则根据其量的大小起氧化反应而显现不同深浅和色泽的颜色)，选择次氯酸钙饱和溶液作为氧化剂既可起到快速显色的作用，又可区分组份的种类，并可根据所显颜色的深浅进行半定量。

(3)用量的确定

选用显色试剂及样品溶液的不同用量对检出限及检测敏感度的影响进行研究，结果见表4。表4是显色试剂及样品溶液不同用量试验结果。

表4

由表4可知，在选择中性滤纸为Φ4.0cm时，次氯酸钙饱和溶液用量为0.05ml(1滴)点于滤纸中心处，样品溶液用量为0.25ml(约5滴)显色效果最好。

实施例7：检测限及呈色特征

用上述确定的滤纸、显色试剂及样品溶液用量，对不同浓度的对照品标准溶液进行试验，结果见表5，表5是检测限评价表。

表5

由上表可知，OPD及MPD从0.01％开始显色，此后颜色逐渐加深，因此，确定最低检测限均为0.01％；而PPD则从0.05％开始显色，此后颜色逐渐加深，因此，确定最低检测限均为0.05％，随着浓度的增大，不同浓度范围显现的颜色不同，当浓度增大到6％时，不易察觉出颜色变化，在操作时应将样品供试液稀释到10倍后再同法测定，并将显色结果与标准比色卡进行比对，折算出可能含量，从而初步判断PPD是否超出规定的限量(6％)。

实施例8：标准比色卡的制作

因为间苯二胺类和邻苯二胺类实际含量都比较小，而且禁止添加，本法虽可实现半定量，对其定量意义不大。而对苯二胺类属限用成分，在化妆品中允许其使用量不得超过6％，且必须标注“含苯二胺类”，若未标注或在其他洗发剂、焗油、头发定型剂等化妆品中添加，则亦属禁止使用，因而半定量检测对苯二胺类具有比较实际的意义。

将上述对苯二胺对照品贮备液(浓度5mg/ml)分别配制成的系列浓度标准溶液(0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、2.0％、4.0％、6.0％、8.0％)，再分别与事先用玻璃棒蘸取、并点于上述滤纸中心的次氯酸钙(饱和溶液，临用前新配)进行化学反应，显色时间在3-5min，拍照，并以此作为样品检测结果的标准对照，塑封，即为标准比色卡(见图5-6)。与该标准比色卡比对，若待测样品检测结果显淡紫色，则表明待测样品中对苯二胺含量小于1.0％；若显紫色，则表明待测样品中对苯二胺含量为1.0％～4.0％；若显深紫色，则表明待测样品中对苯二胺含量大于4.0％。

实施例9：样品测定

(1)样品的处理

取样量：取样量约为液体制剂1.5ml(粉末、软膏或乳膏剂取样量约为1.5g)。

供试液的制备：取上述样品量置于15ml具塞试管中，加入乙酸乙酯9ml，拧紧瓶塞，用力振摇约1分钟使溶散(液体样品则混合均匀即可)，静置片刻，取上层溶液6ml作为供试液。

(2)检测与评价

将上述供试液6ml置试管中，加入稀盐酸1ml，振摇使混合均匀，静置片刻，取下层溶液0.25ml(约5滴)，注入临用前预先用玻璃棒蘸取并加入乙酸乙酯1滴的定性滤纸中心处，如3分钟内呈现标准比色卡中的橙红(黄)色至黄色系列颜色，则可判断样品中可能含有邻苯二胺或间苯二胺及其盐类或衍生物；如3分钟内呈现标准比色卡中的紫色系列颜色，则可判断样品中可能含有对苯二胺及其盐类或衍生物，若显示的颜色接近限用限度颜色，应将样品稀释10-20倍后重复上述过程，并将呈现的颜色与标准比色卡中的紫色系列颜色进行对比，从而初步判断该样品是否超出规定限度。

实施例10：气相色谱法初步确证

以DB-1(30m，0.25mm×0.1um)毛细管柱为气相色谱柱，FID检测，分流模式，分流比为5∶1。进样口温度为：260℃，检测器温度为：280℃，空气、氢气、氮气流速分别为400ml/min、40ml/min、40ml/min；恒压模式，柱温在80℃保持2分钟后以5℃/min的速度上升至190℃，再以20℃/min的速度上升至240℃，保持5分钟。

对照品溶液的制备与测定：精密称取对苯二胺、邻苯二胺和间苯二胺对照品各约0.5g置100ml量瓶中，加入乙酸乙酯适量，超声10分钟使溶解，放冷至室温，用乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。取贮备液，用乙酸乙酯稀释制成系列对照品溶液(浓度分别为500、250、100、50、10ug/ml)，分别取1μl注入气相色谱仪，记录色谱。依据各对照品溶液浓度及气相色谱峰面积建立拟合方程，计算相关系数(r值不小于0.99)。结果见表6，表6显示了线性关系及回收率。

表6

名称	线性曲线	R²	平均回收率
				邻苯二胺	Y＝2.735X-22.687	0.9987	105.0％
对苯二胺	Y＝2.5753X-25.445	0.9985	106.7％

间苯二胺

Y＝2.5692X-20.038

0.9988

107.8％

供试品溶液的制备与测定：取本品约0.5g置50ml具塞试管中，加乙酸乙酯约20ml超声振摇10分钟，放冷至室温，加乙酸乙酯至25ml，摇匀，滤过，取续滤液1ul注入气相色谱仪，记录其色谱图。

由于染发剂中经常添加间苯二酚，故取对苯二胺、邻苯二胺和间苯二胺混合对照品溶液2ml与间苯二酚(0.5g置100ml，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度)2ml置同一20ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，作为四种对照品混合溶液，取1ul注入气相色谱仪，图谱如图11。图11为对照品溶液图谱(从左至右依次为邻苯二胺、对苯二胺、间苯二酚和间苯二胺，四个组分的分离度均大于1.5)。取对照品溶液逐级稀释后注入气相色谱仪，测得最低检测限均为2μg/ml。

实施例11：气相色谱-质谱法确证

以DB-1(30m，0.25mm×0.25um)毛细管柱为气相色谱柱，分流模式，分流比为5∶1。进样口温度为：260℃，氦气流速为8.5ml/min；恒压模式，柱温在80℃保持2分钟后以5℃/min的速度上升至140℃，再以30℃/min的速度上升至240℃，保持2分钟。电离方式为电子轰击(EI)；电子能量70eV；扫描范围50～150u。

对照品溶液的TIC图如图12，其中从左至右依次为邻苯二胺、对苯二胺和间苯二胺；邻苯二胺、对苯二胺和间苯二胺的二级质谱图和质谱库检索图如图13～18；其中，图13是邻苯二胺二级质谱图；图14是邻苯二胺谱库检索图；图15是对苯二胺二级质谱图；图16是对苯二胺谱库检索图；图17是间苯二胺二级质谱图；图18是间苯二胺谱库检索图。样品21的TIC图如图19，图20～23分别是样品21的二级质谱图和谱库检索图(样品21的相关信息见表7所示)：其中，图20是样品21保留时间10.149min峰的二级质谱图；图21是样品21保留时间10.149min峰的谱库检索图；图22是样品21保留时间10.896min峰的二级质谱图；图22是样品21保留时间10.896min峰的谱库检索图。

实施例12：将本发明的方法与自拟方法GC法以及确证方法GC/MS进行比较验证

由于法定方法(《化妆品卫生规范》2007年版“氧化型染发剂中染料”检测标准采用HPLC测定，检测限较高，且有个别样品对苯二胺峰与样品中其他物质同时出峰，故自拟了检测标准(GC法)及确证方法(GC-MS法)，并进行方法学验证。

用上述方法对市售50种染发剂及1种国家专项抽验阳性品种进行快速测定，并与法定方法(《化妆品卫生规范》2007年版“氧化型染发剂中染料”检测标准)、自拟标准(GC法)及确证方法(GC/MS法)对比。

其中，样品6(阴性)和样品22(阳性)的实验结果如图24所示。左边为样品6，右边为样品22，右下角滤纸为样品22空白的颜色。

其51个样品的测定结果与自拟方法GC法以及确证方法GC/MS的检测结果具有较高的吻合度，见表7所示：

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，其特征在于，包括乙酸乙酯、稀盐酸、次氯酸钙饱和溶液、定性滤纸、吸管或注射器和标准比色卡，所述乙酸乙酯用于溶散待测样品并提取待测成分，所述稀盐酸用于萃取待测成分并去除复杂基质干扰，所述次氯酸钙饱和溶液用于与待测成分反应而显色，所述定性滤纸作为显色载体用于扩散、分离待测的系列成分并可排除溶液背景颜色的干扰，标准比色卡用于对所显现颜色进行比对，半定量判断所测定成分含量及限度。

2.根据权利要求1所述的苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，其特征在于，所述定性滤纸的直径为4.0-4.5cm。

3.根据权利要求1所述的苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，其特征在于，所述待测样品包括液体制剂、粉末、软膏或乳膏剂。

4.根据权利要求1所述的苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，其特征在于，所述标准比色卡可半定量判断苯二胺类物质是否超过限用范围的最高浓度为6％的质量百分比浓度。

5.根据权利要求1所述的苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，其特征在于，所述苯二胺类物质包括邻苯二胺类、间苯二胺类和对苯二胺类。

6.根据权利要求5所述的苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，其特征在于，所述邻苯二胺类和间苯二胺类的最低检测限为0.01％的质量百分比浓度。

7.根据权利要求5所述的苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，其特征在于，所述对苯二胺类的最低检测限为0.05％的质量百分比浓度。

8.根据权利要求1所述的苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，其特征在于，还包括反应板，所述反应板为白色。

9.根据权利要求8所述的苯二胺类物质的快速半定量检测试剂盒，其特征在于，所述反应板用于承载定性滤纸，帮助判断颜色并防止反应液体流失。