CN101671293A

CN101671293A - 蚕沙总生物碱中的α-糖苷酶抑制剂化合物及其应用

Info

Publication number: CN101671293A
Application number: CN200910070770A
Authority: CN
Inventors: 朱元元; 白钢; 亓晖
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2009-10-12
Filing date: 2009-10-12
Publication date: 2010-03-17
Anticipated expiration: 2029-10-12
Also published as: CN101671293B

Abstract

本发明从蚕沙总生物碱中分离得到(2R，4R)－二羟基－5(R)羟甲基哌啶(新化合物)及1－脱氧野尻霉素(DNJ)。经酶学测定此两个生物碱对α－糖苷酶有一定抑制活性。可将其应用于制备治疗糖尿病、肥胖症等疾病的药物中。

Description

蚕沙总生物碱中的α-糖苷酶抑制剂化合物及其应用

【技术领域】：

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种蚕沙总生物碱中具有α-糖苷酶抑制活性的生物碱单体，以及将其应用于制备治疗糖尿病等疾病的药物中。

【背景技术】：

糖尿病是由胰岛素分泌不足和/或胰岛素作用受损引起的一组以高血糖为特征的代谢性疾病。其表现为血液及尿液中葡萄糖浓度异常升高，血糖、尿糖过高时可出现典型的“三多一少”症状，即多饮、多尿、多食及体重减轻，且伴有疲乏无力。糖尿病一般分为I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠糖尿病等几种类型。II型糖尿病不仅可以引起微血管并发症，如周围神经病变、眼部病变、糖尿病肾病等，而且也可以引起严重的大血管并发症，如心肌梗死、中风、下肢血管阻塞性病变等。这些并发症危害极大，降低了人们的生活质量，给人们带来了沉重的经济负担。因此治疗糖尿病、控制糖尿病并发症的发生和发展已显得越来越重要。

流行病学的研究表明，空腹血糖水平与餐后血糖水平这两大血糖指标中，餐后血糖水平尤为重要，它是葡萄糖耐受受损(IGT)的病人发展为II型糖尿病的重要因素。而且，餐后血糖水平是引起糖尿病人大血管并发症和微血管并发症的重要因素，而这些并发症是引起糖尿病死亡率增大的一个主要原因。所以，严格控制餐后血糖对糖尿病的防治具有非常重要的意义，而能够显著降低餐后血糖水平的抗糖尿病药物具有很大的应用价值。

食物中的碳水化合物绝大部分是淀粉。与膳食一起进食后，α-淀粉酶抑制剂可与淀粉竞争而与唾液和胰液中的α-淀粉酶结合，占据酶上淀粉结合位点，使淀粉的消化受阻。未被消化的碳水化合物被运送至小肠中下段及结肠，从而碳水化合物的消化吸收发生在整段小肠中，延缓和延长了餐后单糖(葡萄糖)的吸收，餐后血糖的增高被显著减小。

蚕沙作为传统中药，又称晚蚕沙、蚕屎、马鸣肝、晚蚕矢、二蚕沙等，为蚕蛾科昆虫家蚕蛾(Bombyx mon L.)幼虫的干燥粪便。干燥的蚕沙呈圆柱型小粒，微有青草气，色黑，坚实，均匀。蚕砂性燥，无毒，燥能胜风去湿，故蚕沙主治风湿之病，因此临床上具有祛风除湿、活血定痛之功能，治风湿痹痛、风疹瘙痒、头风头痛、皮肤不仁、关节不遂、急剧吐泄转筋、腰脚冷涌、烂弦风眼等症。此外，蚕沙还含有单宁和维生素C，在医药上用作收敛剂，对腹泻、鼻血、牙龈出血及痔出血等均有良好的疗效；蚕沙中的果胶活性高于其他植物性果胶(如苹果果胶、柑橘果胶等)，对各种致病菌有较强抑制和杀灭作用，能防治肠道失常症，对便秘有显著的疗效。

经风干后的蚕沙中除含有9.9％的水份，90.1％的干物质(粗蛋白13.6％，粗脂肪3.7％，粗纤维12.5％，无氮浸出物48.7％，灰份12.6％)外，还含有丰富的营养物质，其中铜、铁、磷、锌及其他微量元素含量均较高；含有18种氨基酸，包括人体必需的8种，另外还含有丰富的叶绿素及其衍生物、β-胡萝卜素、植物醇、低甲氧基果胶以及黄酮类化合物。

[发明内容]：

本发明目的是提供蚕沙总生物碱中具有对α-糖苷酶抑制活性的物质，并将其应用于制备预防、治疗糖尿病等疾病的药物中。

本发明提供的新化合物为：(2R，4R)-二羟基-5(R)羟甲基哌啶，具有如下结构式：

该化合物易溶于水、甲醇、乙醇，微溶于丙酮，难溶于非极性有机溶媒。

该化合物具有α-糖苷酶抑制作用，其结构特征为：

(c＝6.02×10^-5，H₂O微量管测定)；¹H-NMP(D₂O，300MHz)δ：1.53(1H，ddt，J＝14.0，11.4，4.5Hz，H-3ax)，2.02(1H，dddd，J＝14.0，5.0，2.4Hz，H-3eq)，2.91(1H，m，H-1ax)，2.98(1H，m，H-2)，3.24(1H，ddd，J＝13.1，4.5，2.4Hz，H-1eq)，3.28(1H，t，J＝10.4Hz，H-5)，3.54(1H，ddd，J＝11.4，9.1，4.8Hz，H-4)，3.74(2H，m，H-6)。¹³C-NMR(D₂O，300MHz)δ：28.7(C-3)，42.0(C-1)，57.8(C-6)，60.2(C-2)，69.7(C-5)，7.06(C-4)。

该化合物由蚕砂总生物碱中分离纯化获得。

具体制备方法是；采用HPLC法对蚕砂总生物碱进行分离纯化，色谱条件为：阳离子交换检测柱：Hypersil SCX(250mm×4.0mm，5μm)；流动相为乙腈∶水＝90∶10v/v-60∶40v/v；流速为0.6mL/min；-2.0mL/min；蒸发光散射检测；柱温40℃；进样量50-100μL；收集多次实验保留时间为28.5分钟的色谱峰所对应的物质，蒸干流动相，得到分离纯化样品即为1-脱氧野尻霉素(DNJ)；收集多次实验保留时间为35.9分钟的色谱峰所对应的物质，蒸干流动相，得到分离纯化样品即为(2R，4R)-二羟基-5(R)羟甲基哌啶。

本发明提供的新的化合物(2R，4R)-二羟基-5(R)羟甲基哌啶，可应用于制备治疗糖尿病、肥胖症疾病的药物中。也可以与1-脱氧野尻霉素(DNJ)一起应用于制备治疗糖尿病、肥胖症疾病的药物中。

本发明的优点和积极效果：

本发明将蚕砂总生物碱中具有对α-糖苷酶抑制活性的物质基础给予解析，使中药蚕砂治疗糖尿病、肥胖症疾病的有效成分得到了明确，为科学、安全使用提供了依据；同时也为该品种药物走出国门为治疗更多的糖尿病、肥胖症患者提供了物质基础。

[附图说明]：

图1是蚕砂总生物碱的HPLC图；

图2是(2R，4R)一二羟基-5(R)羟基哌啶m/z148(M)+ESI-MS质谱图；

图3是(2R，4R)一二羟基-5(R)羟基哌啶¹H NMR谱图；

图4是(2R，4R)一二羟基-5(R)羟基哌啶¹³C NMR谱图；

图5是(2R，4R)一二羟基-5(R)羟基哌啶TOCSY NMR谱图；

图6是蚕砂生物碱对α-糖苷酶的抑制曲线。

[具体实施方式]：

本发明实施例中包括：蚕砂总生物碱中具有α-糖苷酶抑制活性物质的分离纯化，结构鉴定，及生物学活性。

实施例1：蚕砂总生物碱的提取

蚕砂总生物碱提取物的制备：取蚕砂1.2kg，加去离子水6L，调pH3.0，40～50℃保温3小时，过滤。滤渣同法再提取两次，合并三次滤液，减压浓缩至约2.4L，加无水乙醇3L，混匀，静置过夜。离心，取上清液过001×7型阳离子交换树脂，以50％(v/v)乙醇和去离子水依次洗尽不吸附的杂质，采用0.5-1.0mol/L氨水溶液洗脱，收集α-糖苷酶抑制活性检测阳性部分，减压蒸去氨水，再经吸附脱色，无水乙醇洗脱，减压蒸干后，得蚕砂总生物碱提取物3.2g。

实施例2：蚕砂总生物碱提取物中具有对α-糖苷酶抑制活性物质的分离纯化

采用HPLC法对实施例1中得到的蚕砂总生物碱提取物进行分离纯化，色谱条件为：阳离子交换检测柱：Hypersil SCX(250mm×4.0mm，5μm)；流动相为乙腈∶水(90∶10v/v-60∶40v/v)；流速为0.6mL/min；-2.0mL/min；蒸发光散射检测；柱温40℃；进样量50-100μL；收集多次实验保留时间为：28.5分钟的色谱峰所对应的物质，蒸干流动相，得到分离纯化样品即为1-脱氧野尻霉素(DNJ)；收集多次实验保留时间为：35.9分钟的色谱峰所对应的物质，蒸干流动相，得到分离纯化样品即为(2R，4R)-二羟基-5(R)羟甲基哌啶。

实施例3：(2R，4R)一二羟基-5(R)羟甲基哌啶、1-脱氧野尻霉素(DNJ)的结构

(2R，4R)一二羟基-5(R)羟甲基哌啶：

(c＝6.02×10^-5，H₂O微量管测定)；¹H-NMR(D₂O，300MHz)δ：1.53(1H，ddt，J＝14.0，11.4，4.5Hz，H-3ax)，2.02(1H，dddd，J＝14.0，5.0，2.4Hz，H-3eq)，2.91(1H，m，H-1ax)，2.98(1H，m，H-2)，3.24(1H，ddd，J＝13.1，4.5，2.4Hz，H-1eq)，3.28(1H，t，J＝10.4Hz，H-5)，3.54(1H，ddd，J＝11.4，9.1，4.8Hz，H-4)，3.74(2H，m，H-6)。¹³C-NMR(D₂O，300MHz)δ：28.7(C-3)，42.0(C-1)，57.8(C-6)，60.2(C-2)，69.7(C-5)，7.06(C-4)。

1-脱氧野尻霉素(DNJ)：

ESI-MS m/z：164[M+H]+；1H-NMR(D2O，300MHz)δ：3.86-3.63(3H，m，2H-6；H-3)，3.52-3.36(3H，m，H-2；H-4；H-1e)，3.09(1H，dd，H-1a)，2.86(1H，t，H-5)；13C-NMR(D2O，300MHz)δ：76.2(C-3)，67.7(C-4)，66.9(C-2)，59.9(C-6)，57.7(C-5)，45.8(C-1)。以上数据与1-脱氧野尻霉素(DNJ)标准品及其文献值相符^[1]，确认该化合物为1-脱氧野尻霉素(DNJ)。

实施例4：蚕砂生物碱在酶学水平上对α-糖苷酶活性的抑制作用

①测定原理：葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的含量(GOD-PAP法)

葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOD)的作用下，首先被氧化成葡萄糖酸和H₂O₂，H₂O₂催化过氧化物酶(POD)将4-氨基安替比林和酚合成红色的醌亚胺，醌亚胺在490nm处有最大吸收，吸光度与葡萄糖浓度成正比。

②操作方法

以血糖液体试剂盒(GOD-PAP法)测定溶液中葡萄糖的含量，按试剂盒的说明配制工作液，按下表在酶标板中加入各试剂。

分别混合均匀，37℃保温10-15min，于490nm处测定相对试剂空白的吸光度。

③α-糖苷酶抑制曲线的测定

取10倍系列稀释的DNJ标准品溶液、蚕砂总生物碱样品溶液、新化合物(2R，4R)一二羟基-5(R)羟基哌啶溶液、阿卡波糖溶液200μL(样品浓度均为10mg/mL)，分别加入α-糖苷酶(6IU/mLα-Glucosidase，in 20mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，pH7.0，containing150mmol/L NaCl，1％BSA)100μL，37℃水浴15min，再加10mg/mL麦芽糖溶液100μL，混匀，37℃反应20min。沸水浴2min终止反应，冷却后用葡萄糖体外诊断试剂盒测定葡萄糖生成量。以样品浓度为横坐标，490nm吸光度为纵坐标作图绘制α-糖苷酶的抑制曲线。结果见图6。

④α-糖苷酶抑制剂活性的评价

根据α-糖苷酶的抑制曲线，结果如图6所示，蚕砂总生物碱、新化合物、1-脱氧野尻霉素(DNJ)标准品、阿卡波糖呈现出相平行的α-糖苷酶抑制效果，其中蚕砂总生物碱、1-脱氧野尻霉素(DNJ)标准品与阿卡波糖抑制α-糖苷酶效果相当，而新化合物(2R，4R)一二羟基-5(R)羟基哌啶(单体)抑制α-糖苷酶效果低于蚕砂总生物碱一个数量级。

参考文献

[1]Asano N，Tomioka E，Kizu H，etal.Sugars with nitrogen in the ring isolated from theleaves of Morus bombycis[J].Carbohydr Res，1994，253：235～245

Claims

1、一种化合物(2R，4R)-二羟基-5(R)羟甲基哌啶，具有如下结构式：

2、如权利要求1所述的化合物，该化合物具有α-糖苷酶抑制作用。

3、如权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于该化合物由蚕沙总生物碱中分离纯化获得。

4、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用HPLC法对蚕砂总生物碱进行分离纯化，色谱条件为：阳离子交换检测柱：Hypersil SCX；流动相为乙腈∶水＝90∶10v/v-60∶40v/v；流速为0.6mL/min；-2.0mL/min；蒸发光散射检测；柱温40℃；进样量50-100μL；收集多次实验保留时间为28.5分钟的色谱峰所对应的物质，蒸干流动相，得到分离纯化样品即为1-脱氧野尻霉素；收集多次实验保留时间为35.9分钟的色谱峰所对应的物质，蒸干流动相，得到分离纯化样品即为(2R，4R)-二羟基-5(R)羟甲基哌啶。

5、如权利要求1所述化合物的应用，用于制备治疗糖尿病、肥胖症疾病的药物中。

6、如权利要求5所述的应用，其特征在于，与1-脱氧野尻霉素一起应用于制备治疗糖尿病、肥胖症疾病的药物中。