CN101668848A - 来自口腔粘膜的多能自体干细胞和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一般来自于胃肠道的固有层以及特别地来自于口腔粘膜的成体干细胞的新的易得的来源，从口腔粘膜的固有层分离多能干细胞的方法，从其得到的细胞和其用途。
Description
发明领域
本发明属于干细胞领域。特别地，本发明提供成体干细胞的易得的来源、从这些来源分离干细胞的方法、从其得到的细胞和其用途。
发明背景
基于干细胞的疗法
再生医学的目的是再生组织和器官因疾病、创伤和衰老而完全或部分丧失的结构和功能(Vats等人，Lancet 366：562-602，2005)。干细胞被认为是任何再生战略的重要组成部分。挑战和动机是寻找把能够再生无功能或丧失的组织和器官的多能干细胞群募集和/或递送至受伤部位的方式。组织固有的干细胞的受限的定位和循环干细胞的相对低的数目对内源干细胞的体内募集是否可具有实际的临床前景提出了严重质疑。
目前对于以再生干细胞为基础的疗法有三种可能的策略：a)刺激受影响的组织固有的干细胞。已鉴定在许多组织中的固有的干细胞(SC)，包括在那些最经常受疾病影响的组织，如心脏、神经、胰脏和肾脏组织；b)将源自循环骨髓的多潜能干细胞募集到受损部位。这些都已鉴定，并发现在急性损伤后数量增加；c)移植离体扩大的(expanded)干细胞。在这方面，挑战是产生可离体扩大而不失去其效力且可安全移植而无不良反应的多能干细胞群。
目前正在研究干细胞的三个主要的任选来源i)胚胎干细胞(ECS)；ii)胎儿干细胞(FSC)；及iii)自体或同种异体的成体(体)干细胞(ASC)。
ESC系是多能和几乎永生的(Thomson等人，Science 282：1145-1147，1998)，但仍远离临床应用，因为其当植入体内时经历转化的趋势、其抗原性(Bradley等人，Nat Rev Immunol 2：859-871，2002；Drucker等人，Trends inBiotechnology.22：136-141，2004)、为它们的维持和扩大和伦理问题而要求小鼠饲养层。
从理论上讲，FSC对于疗法可能是理想的，因为一方面它们可能是充分分化的以致在植入后不进行转化，另一方面它们仍然保留足够的多能特性。由于伦理原因，只有来源于脐带的FSC正在利用。但是，类似于同种异体ASC，脐FSC被认为是同种异体移植，因此它们的使用需要抗原匹配、免疫抑制疗法，并可导致排斥或移植物抗宿主病(Brunstein等人，VoxSanguinis 91：195-205，2006)。
因此，来源于成体的自体多能干细胞群被认为是组织和器官再生的理想群。骨髓为自体成体干细胞的主要来源，且在非常有限的程度上，外周血、脂肪组织、皮肤和肌肉也是自体成体干细胞的来源。这些来源的一个严重的缺点是，衰老和疾病大大降低成体干细胞在骨髓和其它组织中的功能性和可能的可得性(Janzen等人，Nature 28；443(7110)：421-26，2006；RandoTA.Nature 441：1080-1086，2006；Sethe等人，Aging Res Rev 5：91-116，2006.Rao和Mattson，122：713-734，2001)。源自骨髓的多能干细胞另一个相当大的缺点是它们的稀有和繁琐的分离程序(Reyes M等人，Blood 96：2615-2625，2001；DIppolito G等人，Rejuvenation Research 9：10-18，2006)。
衰老及相关疾病减少组织对应激的响应。这已部分地归因于组织特异性干细胞功能性的减少，如减少的自我更新、复位和植入能力所反映的(Janzen等人，Nature 28；443(7110)：421-26，2006)。虽然仍在讨论这些变化的原因，但是它们被认为是老化固有的和/或外遗传因子诸如干细胞龛中的变化所赋予的。
US 2005/0032207披露了为治疗用途而分离、培养和分化肠干细胞的方法。根据这个应用，从组织的肠上皮分离未分化的体肠干细胞，该组织可包括以下中的一部分：胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠(例如升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠)、直肠、肛管、和/或阑尾。
口腔粘膜
口腔粘膜是口腔的粘膜内衬(图1)。它是细胞群和细胞外基质组成的复杂的组织，细胞外基质安置细胞并为细胞附着提供基底。口腔粘膜由外胚层起源的上皮组织和固有层(LP)组成，固有层是外胚层间充质起源的结缔组织(图2)。上皮部分与口腔接触并作为不断被位于基底膜上的单潜能干细胞群更新的屏障起作用，基底膜是将上皮和外胚层间充质部分连接到一起的结构。固有层支持上皮组织，并连接到由口腔粘膜保护的口腔的底层结构。临床观察结果表明，在口腔粘膜中全层切开和切除手术伤口愈合大大快于其它结缔组织中的伤口(Cate RA.Repair and Regeneration ofOral Tissues(口腔组织的修复和再生)，Ten Cate′s Oral Histology，第六版，2003；Stephens等人，J Dent Res.75(6)：1358-1364，1996)，并且类似于早期胎儿哺乳动物组织和许多低等脊椎动物成体组织，口腔粘膜中的伤口通过再生愈合，而不是由瘢痕形成来愈合(Hallock GG.，Plastic ReconstructiveStrgery 75：785-788，1985)。
已披露适于用于干细胞疗法的干细胞可从各种来源获得。Laino等人(J.Cell.Physiol.206，693-701，2005)披露了来源于牙髓(即齿内细胞团(cellmass))的可得的人类成体干细胞源，特别适合用于硬组织工程。美国专利7052907披露并要求保护分离的人类牙髓干细胞的培养物。美国专利申请公布第20060252151号披露从牙髓收集干细胞的方法。
美国专利7015037披露了来源于骨髓的多潜能成体祖细胞的分离，其表征和用途。特别地，多潜能成体祖细胞共表达CD 49c和CD 90，并有约36小时的倍增时间。
美国专利7078230披露了从源自脂肪组织的基质细胞所产生的多能干细胞，以及其用途。特别地，此发明包括已被诱导表达神经元细胞、星形胶质细胞、造血祖细胞或肝细胞中的至少一种表型特征的分离的源自脂肪组织的基质细胞。
PCT公布WO 2004/009758披露了使用原始干细胞中表达但在分化的体细胞类型中不表达的生殖干细胞标志物，从成体来源分离胚胎样干细胞的方法。
PCT公布WO 2003/089631披露了用于繁殖干细胞和/或祖细胞的方法，该干细胞和/或祖细胞可与任选地可从嗅觉器官固有层获得的分离的成体人类组织一起使用。PCT公布WO 2007/020611披露了来自嗅觉器官固有层的成体人类神经干细胞。
因此，本领域中对于鉴定哺乳动物中易得来源的能够产生自体多能干细胞群的干细胞仍有未满足的需求，其中该自体多能干细胞群可以体外扩大而不失去其多能性，并且可以安全地重新移植到受影响的供者以有效实现组织和器官再生。
发明概述
本发明提供了来源于易得来源，即一般地胃肠道的固有层和特别地胃肠道上部的固有层，以及尤其是口腔粘膜的干细胞。因此，本发明提供获得粘膜干细胞的方法、来源于该来源的分离的干细胞、源自粘膜的干细胞的培养物、维持或扩大这些干细胞的方法、以及其治疗用途。
根据本发明，所披露的是：一般而言胃肠道的固有层以及特别地口腔粘膜的固有层含有可易于获得的、维持在培养物中的并用于治疗应用的干细胞。
根据本发明的一方面，披露了从胃肠道获得的粘膜所分离的干细胞。
根据一些实施方案，分离的干细胞来源于胃肠道粘膜的固有层(LP)。
根据一些实施方案，分离的干细胞来源于胃肠道上部。
根据一些实施方案，分离的干细胞来源于选自以下组成的组的区域：口腔、咽、食道、胃和十二指肠。
根据一些实施方案，干细胞来源于胃肠道上部选自口腔、咽和食道组成的组的易于接近的区域。
根据具体的实施方案，干细胞来自口腔粘膜的固有层。
根据另一种实施方案，干细胞是多能的，即能够产生三种胚胎胚层和起源于这些层的细胞谱系、组织和器官。根据一种实施方案，干细胞是多潜能的，即能够形成通常来源于一个胚胎胚层的多种细胞谱系。根据具体的实施方案，干细胞是自体的。
根据具体的实施方案，源自粘膜的干细胞特征在于表达选自以下组成的组的至少一种多能胚胎干细胞标志物：Oct-4、Tra-1-61、Tra 1-81、Tra-2-49、Tra-2-54、SSEA 1-4、Rex1、Nanog、Sox2ABCG2、hTert和Bmi1。
根据更具体的实施方案，源自粘膜的干细胞特征在于表达选自以下组成的组的多个多能胚胎干细胞标志物：Oct-4、Tra-1-61、Tra 1-81、Tra-2-49、Tra-2-54、SSEA1-4、Rex1、Nanog、Sox2ABCG2、hTert和Bmil。
根据具体的实施方案，源自粘膜的干细胞特征在于表达选自以下组成的组的至少一种多潜能间充质干细胞标志物：CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD117、CD146、CD166和Stro1+。
根据更具体的实施方案，源自粘膜的干细胞特征在于表达多个多潜能间充质干细胞标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD117、CD105、CD106、CD146、CD166和Stro1+。
本发明还提供源自口腔粘膜的细胞群，其中所述细胞中的至少80％表达选自以下组成的组的至少一种细胞标志物：Oct-4、Tra-1-61、Tra 1-81、Tra-2-49、Tra-2-54、SSEA 1-4、Rex1、Nanog、Sox2ABCG2、hTert、Bmi1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD117、CD146、CD166和Stro1+。
根据一些实施方案，所述群中的至少80％的细胞表达多个所述细胞标志物。
根据一些实施方案，该细胞是多能的。
根据一些实施方案，多能干细胞能够分化为中胚层起源的细胞谱系并转分化为外胚层和内胚层起源的细胞谱系。
根据一个实施方案，该细胞是多潜能的。
根据具体的实施方案，该细胞群包括未通过分选程序选择的细胞。
根据更具体的实施方案，源自粘膜的干细胞特征在于表达多个多能胚胎和多潜能间充质干细胞特有的标志物。
另一方面，本发明提供从口腔粘膜分离干细胞的方法。
根据具体的实施方案，该方法包括以下步骤：
i.获得来源于口腔粘膜的细胞群；
ii.将(i)中获得的细胞暴露于能够鉴定至少一种特异性干细胞标志物的至少一种探针；
iii.通过分选方法分选细胞；和
iv.分离表达至少一种对干细胞特异的标志物的干细胞。
根据一些实施方案，在步骤(ii)后，从细胞群除去不表达特异性标志物的细胞。
根据一个实施方案，(i)中的细胞群来自来源于口腔粘膜的细胞的培养物或外植块。
根据具体的实施方案，(ii)中的至少一种特异性基因标志物选自以下组成的组：Oct-4、Tra-1-61、Tra1-81、Tra-2-49、Tra-2-54、SSEA1-4、Rex1、Nanog、Sox2ABCG2、hTert、和Bmi1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD117、CD146、CD166和Stro1+。
(ii)中的干细胞标志物可表达在细胞表面，如作为表面蛋白，或表达在细胞内。术语“暴露细胞”包括使细胞接触定向于表面标志物的探针和将探针引入细胞。引入细胞的可包括遗传探针诸如分子信标以及细胞表面标志物。
根据另一种实施方案，(iv)中的分选方法包括荧光激活细胞分选术(FACS)。
根据另一种实施方案，该探针以可检测的示踪剂标记。
本发明还提供包含扩大的来源于GI道上部粘膜的干细胞的培养物或外植块。根据一种实施方案，干细胞来源于固有层。根据另一种实施方案，干细胞来源于口腔粘膜的固有层。可在组织培养物中以未分化状态或以部分分化的状态维持和扩大源自粘膜的多能或多潜能干细胞。根据各种实施方案，这些细胞可被诱导以分化为不同的细胞类型。
本发明还提供来源于GI上部粘膜、优选地来自固有层、更优选地来自口腔粘膜固有层的多潜能和多能干细胞的治疗用途。
根据一种实施方案，分离的多能或多潜能干细胞用于基因疗法。细胞通过合适的基因转移被修饰以校正遗传缺陷或提供在干细胞或其后代中天然缺乏的遗传能力。根据一种实施方案，分离的多能干细胞用于细胞疗法。根据本发明的多能或多潜能干细胞可以允许多能或多潜能干细胞移植到预期组织部位并重构或再生功能缺陷区域的方式施用于患者。
根据另一种实施方案，披露了一种治疗组织疾患或缺陷的方法，该方法包括向需要其的患者施用根据本发明的多能或多潜能的源自粘膜的干细胞，并提供分化所述细胞为表征所述组织的细胞的条件，从而治疗患有需要细胞或组织置换的组织疾患或缺陷的个体。
根据另一种实施方案，披露了一种产生或再生人类组织或器官的方法，该方法包括向需要其的患者施用根据本发明的多能或多潜能的源自粘膜的体干细胞。治疗患有需要细胞或组织置换的疾患的个体的方法包括将至少一种分离的源自粘膜的多潜能或多能干细胞引入个体中与疾患相关的组织，从而治疗患有需要细胞或组织置换的疾患的个体。
根据另一种实施方案，治疗患有需要细胞或组织置换的疾患的个体的方法包括(a)使至少一种源自粘膜的多能或多潜能干细胞经受适于诱导细胞增殖的培养条件，从而获得扩大的干细胞群；(b)使所述扩大的干细胞群经受分化实验方案；和(c)将所述部分或完全分化的干细胞群引入个体中与疾患相关的组织，从而治疗患有需要细胞或组织置换的疾患的个体。
根据又另一种实施方案，治疗患有需要细胞或组织置换的疾患的个体的方法包括(a)使至少一种源自粘膜的多能或多潜能干细胞经受适于诱导细胞增殖的培养条件，从而获得扩大的干细胞群；和(b)将所述扩大的干细胞群引入个体中与疾患相关的组织，从而治疗患有需要细胞或组织置换的疾患的个体。
根据各种实施方案，该疾患或疾病选自以下组成的组：造血疾病或疾患、神经元疾病或疾患、软骨或骨疾病或疾患、肌肉疾病或疾患、韧带疾病或疾患、心脏疾病或疾患、血管疾病或疾患、内皮疾病或疾患、肝脏疾病或疾患、胰脏疾病或疾患、胃肠疾病或疾患、肺部疾病或疾患、泌尿生殖疾病或疾患、腺疾病或疾患、肾上腺疾病或疾患、甲状腺疾病或疾患。根据具体的实施方案，该疾患是遗传疾患。
实质上，以本发明的分离的源自粘膜的细胞可实现现有技术中已知或设想的干细胞的所有用途。这些用途包括诊断、预防和治疗技术。
根据以下给出的详述，本发明进一步的实施方案和适用性的全部范围将变得明显。然而，应理解的是详述和具体的实施例虽然指示本发明的优选实施方案，但仅以示例方式给出，因为对本领域技术人员来说，根据该详述，在本发明主旨和范围内的各种改变和修饰都将变得明显。
附图简述
图1.口腔粘膜的临床图解。黑色箭头表示齿龈组织，其是牙齿和无齿区附近的口腔粘膜的一部分。白色箭头表示内衬粘膜，其是内衬在颊、口腔底部(flour)和唇的口腔部分的口腔粘膜的一部分。
图2.在图1所示的平面所取的颊舌截面的示意组织学图示。Ep-覆盖口腔粘膜固有层的上皮；GOM-齿龈的固有层；AOM内衬粘膜的固有层，在本例中覆盖了颚的牙槽骨-B；En-牙齿的釉质；D-牙齿的牙本质。
图3.左图：在第14天源自单细胞的集落。右图：左图中所示插图的高放大倍数，说明具有低胞质/核比的单细胞。
图4.说明了传代对从齿龈口腔粘膜固有层获得的原代群的集落形成率(CFE)的影响的图。
图5.从口腔粘膜固有层获得的传代4次的培养物的未分选整群中表达的间充质多潜能干细胞标志物的FACS分析实例。该培养物对造血细胞标志物CD45(5C)和CD34(5B)是阴性的，超过95％的细胞对CD29(5A)、CD73(5D)、CD90(5E)和CD105(5F)是阳性的，并且只有34％的细胞对标志物Stro1(5G)是阳性的。
图6.来自齿龈口腔粘膜固有层的源自口腔粘膜的细胞(OMC)的整群，在P1分化为成骨谱系(左图)、软骨形成谱系(中图)和生脂谱系(右图)。左图：由茜素红染色反映的矿化样组织形成；中图：由蛋白聚糖的阿尔新蓝染色证明的micromas的软骨母细胞分化；右图：如甘油三酯液滴的油红染色说明的生脂分化。
图7.在从口腔粘膜固有层获得的传代4-5次的培养物的未分选整群中表达的多能标志物Oct4(7A)和SSEA4(7B)标志物的FACS分析实例。
图8.来自口腔粘膜固有层的传代2次的整群的实例，以抗-Sox2抗体免疫荧光染色(左图)和以DAPI免疫荧光染色以鉴定核(右图)。
图9.各自来源于不同供者的口腔粘膜的三个整群的RT-PCR分析实例，说明多能标志物Sox2、Nanog和Oct4在分子水平上的表达。
图10.在传代2次未分选的源自口腔粘膜的整群的神经分化实例。神经诱导48h后的巢蛋白表达在左图示出。在分化阶段期间神经元核蛋白(Neu-N)的表达描绘在中图。右图显示了相差显微镜检查，其描绘了在分化阶段末尾具有伸长的轴突样突起和几个树突状突起的神经样细胞。
发明详述
本发明的新理念是易于获得的粘膜固有层富含性质不受老化或疾病影响的多能干细胞群，该新理念首次开创了在成体和老年人中获得用于细胞疗法的自体多能干细胞可再生源的机会。
这一新理念由以下支持：临床观察结果表明，在口腔粘膜中全层切开和切除手术伤口愈合大大快于其它结缔组织中的伤口，且类似于早期胎儿哺乳动物组织和低等脊椎动物中许多成体组织，口腔粘膜中的伤口通过再生愈合，而不是由瘢痕形成来愈合。因此，本发明中首次表示，固有层含有能够响应创伤和维持这一部分粘膜的动态平衡的干细胞。本发明披露了这些干细胞的分离、维持和使用，以及来源于上部GI道其它可接近部分的口腔粘膜的干细胞。
本发明是基于以下意外发现：成体口腔粘膜的结缔组织(固有层)富含胎儿样多能自体干细胞群，其大小和多能性或多潜能性很大程度上未受衰老影响，因此在成体和老年人中口腔粘膜是选择用来获得具有治疗潜力的自体干细胞的来源。
现在首次显示，口腔粘膜的整群可以不需费力的纯化即可用作在体内和/或体外条件下能够分化为多种细胞谱系的多潜能干细胞的来源。这一发现对来源于口腔粘膜的细胞群是独特的，并且没有在其它成体组织观察到。
也首次显示，口腔粘膜含有高比例的多能干细胞，如由表达胚胎干细胞特有的标志物的能力证明的。没有发现本领域中已知的其它成体组织含有如此高比例的多能干细胞。因此，本发明提供口腔粘膜作为从成体获得多能干细胞的最好来源。
为了临床使用从实体组织分离干细胞的典型方法包括通过酶促消化或通过外植来从细胞外基质释放细胞；扩大原代整群以获得足够大的群；和从整群分离干细胞。
典型整群含有低比例的干细胞，因此，干细胞的扩大和分离是费力、时间长和通常低效的。
本文首次证实，来源于口腔粘膜固有层的原代整群和扩大的整个细胞群主要由干细胞组成(超过80％)。本文显示，从7个不同的供者口腔粘膜获得的细胞群中高比例(80-90％)的细胞表达间充质干细胞标志物。
因此，本发明首次提供了人类中稳定的、多能干细胞群的易于获得的来源和使用方法，该细胞群的大小和严格性很大程度上不受衰老影响，也可能不受疾病和药理学疗法影响。根据本发明的分离的干细胞群可以体外扩大而不失去其多能性，并且可以安全地重新移植到受影响的供者，以有效地实现组织和器官再生。
在常规培养条件生长的成体未分选的整个细胞群可以转分化成不同的胚胎起源的细胞谱系的这一发现对于来源于口腔粘膜的细胞群是独特的，并且在来源于任何成体组织的培养物中没有观察到。
这些发现由以下发现支持：分化为成骨细胞谱系、软骨母细胞谱系和脂肪细胞谱系的口腔粘膜整群可“按原样”使用而无需进一步纯化，作为在体内和/或体外条件下能够分化为多种细胞谱系的多潜能干细胞(MSC)来源。这一发现对于来源于口腔粘膜的细胞群是独特的，并且没有在从任何成体组织获得的培养物中观察到。总体看来，本申请的结果表明，口腔粘膜是在成体中获得多能干细胞最好的来源，该多能干细胞在体内和/或体外条件下能够分化为中胚层起源的细胞谱系并转分化为外胚层和内胚层起源的细胞谱系。
源自中胚层的细胞谱系的非限制性实例是：成骨细胞、脂肪细胞、软骨母细胞、成肌细胞、成心肌细胞、平滑肌细胞、肉皮细胞、造血细胞、韧带细胞、成纤维细胞。
可以从源自口腔粘膜的多能干细胞获得的外胚层起源的细胞谱系的非限制性实例包括：神经细胞(神经元、星形胶质细胞、室管膜细胞、少突胶质细胞和施旺细胞)、皮肤和口腔衬里的角质化细胞、腺上皮(唾液腺上皮、汗腺上皮)、毛囊上皮细胞、角膜上皮细胞、腺垂体和肾上腺髓质的腺细胞、成釉细胞和来源于胚胎外胚层的任何其它上皮细胞系。可以利用来源于口腔粘膜的多能干细胞或本文提及的产生自源自口腔粘膜的干细胞的外胚层细胞谱系或这些的组合治疗和/或修复或再生的组织和器官的例子是：表皮、口腔粘膜的上皮组成部分、神经组织、角膜、唾液腺、毛发、呼吸上皮和来源于胚胎外胚层的任何其它组织或器官。
内胚层起源的细胞谱系的非限制性实例包括：肝细胞、胆管细胞、胰脏腺泡细胞、β-胰岛细胞(朗格汉斯细胞)、呼吸道的上皮组成部分(如纤毛柱状细胞、杯状细胞、肺泡上皮)、泌尿上皮包括足细胞、胃肠上皮(如壁细胞、主细胞、不同类型的胃和肠腺上皮、肠上皮细胞)，肾上腺皮质、甲状腺和甲状旁腺的内分泌上皮和来源于胚胎内胚层的任何其它细胞谱系。可以利用来源于口腔粘膜的多能干细胞或本文提到的从源自口腔粘膜的干细胞产生的内胚层细胞谱系或这些的组合治疗和/或修复或再生的组织和器官的例子是：肝组织、内分泌胰腺(β-胰岛)、外分泌胰腺、呼吸道(如气管、支气管)、肺实质、尿道、肾脏组织、甲状腺和甲状旁腺实质、胃和肠组织和来源于胚胎内胚层的任何其它组织和器官。
可以利用来源于口腔粘膜的整个细胞群或利用在分化不同阶段产生自整群的细胞谱系治疗和/或修复或再生的组织和器官的非限制性实例包括：骨、软骨(透明和关节的)、血管、韧带、腱、心肌、造血系统、肌肉组织、真皮、心脏瓣膜、肠管间充质部分(如柱、食道、回肠、直肠)、泌尿生殖导管(如尿道、输尿管、膀胱)、牙周组织(如牙槽骨、牙周韧带、牙骨质、齿龈)、牙本质和成体或胎儿生物体的任何组织的任何其它间充质组织或间充质组成部分。
可以利用来源于口腔粘膜的整个细胞群或多能干细胞和/或各种细胞谱系治疗的疾病的非限制性实例包括：一般骨折，特别是椎骨稳定，骨质疏松症、韧带断裂、骨性关节炎、任何自身免疫性起源的关节炎、创伤性关节软骨损伤、心肌梗死、心脏衰竭、二尖瓣或主动脉瓣功能不全、冠状动脉功能不全、糖尿病、肝功能不全或衰竭、回流、大便失禁、小便失禁、肾功能不全或衰竭、肺气肿、帕金森疾病、肌肉萎缩、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化和其它脱髓鞘疾病、重症肌无力、多肌炎、由脑血管疾病导致的脑组织损耗或脑炎或脑脊膜炎、内分泌腺体功能不全和衰竭(例如，甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退、垂体和肾上腺功能低下)、获得性或诱导性造血系统衰竭、牙周疾病以及变性、炎症、增生、感染、恶性疾病，创伤和老化造成的任何其它组织团块和功能的丧失。
根据本发明，来源于口腔粘膜的整个细胞群或多能干细胞和/或各种细胞谱系可以通过转染本领域已知的特定基因而被修饰以模拟这些细胞功能和形态学分化成成熟的组织和器官。这种基因家族的非限制性实例包括：TGFβ、FGF、PDGF、EGF、hedgehog、Arx、Barx、C-Myb、连环蛋白、Dlx、Egr、Gli、Hand、Irx、Islet、Lef、Lhx、Msx、N-myc、Pax、Pdx、Pitx、Runx、Snai、Sox、Wt和本领域已知的其他基因家族。
根据本发明，来源于口腔粘膜的整个细胞群或多能干细胞和/或各种细胞谱系和/或来源于通过转染被修饰的口腔粘膜的整个细胞群或多能干细胞和/或各种细胞谱系可以没有任何载体地或通过载体手段递送于患者。根据本发明可使用的本领域已知的载体的非限制性实例包括：
a.胞外基质组分诸如胶原、糖蛋白、蛋白聚糖、聚糖如透明质酸纤维蛋白，及其它和这些的组合。这些类型的载体可采取凝胶或实体结构的形式，其可以是多孔的，所述孔从纳米到厘米大小不等。
b.天然或合成的磷灰石诸如羟基磷灰石、去蛋白的骨颗粒、冻干的骨颗粒、去矿物质的冻干的骨颗粒、诸如磷酸三钙的磷酸钙盐、硫酸钙、碳酸钙和本领域已知的其它天然和合成的盐和这些的组合。
c.合成有机聚合物如聚乳酸酯、聚富马酸酯、聚乙醇酸酯和本领域已知的其他的合成有机聚合物或其组合。
定义
“干细胞”(SC)是未分化细胞，它可以产生成熟功能细胞的演替。
“胚胎干(ES)细胞”是来源于胚胎胚泡的内细胞团的多能的细胞，从而具有发展为任何器官或组织类型的能力。
“成体干细胞”是来源于生物体组织、器官或血液的干细胞，不包括胚胎的内细胞团。
“多能干细胞”是能够产生三个胚胎胚层和起源于这些层的细胞谱系、组织和器官的干细胞；
“多潜能干细胞”是能够形成一般来源于一个胚胎胚层的多种细胞谱系的干细胞。
“单潜能干细胞”是产生单个细胞谱系的干细胞。
GI的上部包括口腔、咽、食道、胃和十二指肠的容易接近的区域。
术语“口腔粘膜”是指口腔内衬的粘膜，即：包括齿龈和腭的颊和牙槽嵴，口底和嘴唇的口腔部分。根据本发明的口腔粘膜包括固有层，但不包括上皮部分。
ECS是指胚胎干细胞，FSC是指胎儿干细胞；ASC是指成体(体)干细胞，无论是自体或同种异体的；LP是指固有层；OMC是指源自口腔粘膜的细胞；MSC是指多潜能干细胞。
分离方法
根据本发明的干细胞的分离可根据各种物理特性进行，诸如荧光特性或其他光学特性、磁特性、密度、电特性等。细胞类型可以由多种手段分离，包括荧光激活细胞分选术(FACS)、蛋白-共轭磁珠分离、形态标准、特定基因表达模式(利用RT-PCR)、或特异性抗体染色。
所使用的分离技术包括但不限于，基于物理(密度梯度离心和反流离心淘洗)、细胞表面(凝集素和抗体亲和力)和重要的染色特性(线粒体结合染料rho123和DNA结合染料Hoechst 33342)差异的分离技术。
细胞可基于光散射特性以及他们表达各种细胞表面抗原而挑选。纯化的干细胞具有FACS分析的低的侧向散射和低到中度的前向散射谱。
不同的技术可以用来通过初步除去专门谱系的细胞而分离细胞。单克隆抗体特别有用。该抗体可以附着到固体支持物以允许粗分离。采用的分离技术应最大限度的保留待收集的部分的生存力。
采用的分离技术应最大限度的保留待收集的部分的生存力。不同效果的各种技术可用来获得“相对粗”的分离。这种分离是所存在的总细胞中有多达30％、通常不超过约5％、优选地不超过约1％的不需要的细胞仍保持在待保留的细胞群中。采用的特定技术将取决于分离效率、相关的细胞毒性、施行的容易性和速度、以及先进的设备和/或技术技能的需要。
分离程序可包括用抗体包被的磁珠的磁分离、亲和色谱，连接于单克隆抗体的或与单克隆抗体联合使用的细胞毒性剂，例如补体和细胞毒素，和以附着在固体基质如板的抗体“淘选”，或其他方便的技术。
提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分选器，其可以有不同的复杂程度，例如，多个颜色通道、低角度和钝光散射探测通道、阻抗通道等。
可采用用于阳性选择的其他技术，其允许精确分离，诸如亲和柱，及类似技术。
用于分离的抗体可与标志物共轭，该标志物诸如允许直接分离的磁珠、可以结合于支持物的亲和素或链霉亲和素除去的生物素、可与荧光激活细胞分选器一起使用的荧光染料、或类似物，以允许便于分离特定细胞类型。可采用不过分损害其余细胞的生存力的任何技术。
虽然认为分离的特定顺序对本发明不是关键的，但所表明的顺序是优选的。优选地，细胞最初由粗分离分开，其次是精细分离，使用了与干细胞相关的一种或多种标志物的阳性选择，和与谱系定型细胞相关标志物的阴性选择。
使用干细胞用于诊断和治疗目的
细胞疗法
使用干细胞用于疗法的一个重大挑战是控制生长和分化为每个患者的治疗所需的特定组织类型。本领域已披露实现或促进这种应用类型的方法。以下只是在细胞疗法中使用干细胞的合适的方法的例子。
使用未分化细胞的器官和组织疗法应用
US 2002/197240描述体内诱导组织和/或器官修复而不引发免疫反应的方法。该方法包括将未分化的干细胞移植到患有组织和/或器官损伤的受者。本创新的未分化细胞可以在分离后移植，以在患有组织和/或器官损伤的受者诱导组织和/或修复器官。
US 2004/247574描述通过改善干细胞复位到骨髓而改进干细胞移植中的植入效率的方法。根据本发明的细胞可用于在需要其的人类患者中诱导器官功能、组织重构或再生。细胞以允许它们移植到预期的组织部位并重构或再生功能缺陷区域的方式施用。
使用分化的细胞培养物的器官和组织疗法应用
美国专利第6,087,168号涉及将表皮细胞转分化为可用于细胞疗法和基因疗法的活的神经元。皮肤细胞以神经原性转录因子转染，并培养在含有相应于神经元分化负调节子的反义寡核苷酸的培养基中。
国际专利公布WO 97/32025提出了移入抗药性造血干细胞的方法。移植物中的细胞通过处于干细胞中功能启动子的控制下的药物抗性基因(诸如甲氨蝶呤抗性二氢叶酸还原酶)来增强。将该细胞施用到哺乳动物，然后以相对于非转基因细胞增强转基因细胞植入的药物治疗。
国际专利公布WO 99/19469涉及从猪生长多能胚胎干细胞的方法。将选择性标志物基因插入细胞，从而受到ES细胞中控制或启动子序列调节，如由猪Oct-4启动子示例的。
国际专利公布WO 00/15764涉及胚胎干细胞的繁殖和衍生。该细胞在通过抑制分化的细胞繁殖必不可少的信号转导途径而选择性地抑制ES细胞以外的细胞的繁殖或生存的化合物存在下培养。示例是抑制SHP-2、MEK或ras/MAPK级联的化合物。
本发明的分化的细胞可用于在需要其的人类患者中组织重构或再生。细胞以允许它们移植到预期的组织部位和重构或再生功能缺陷的区域的方式施用。
本发明的分化的细胞也可用于移植疗法。例如，根据待治疗的疾病，神经干细胞可以直接移植到中枢神经系统的实质或鞘内部位(美国专利第5,968,829号)。神经细胞移植的疗效可以在脊髓急性损伤的大鼠模型中评价，如McDonald等人所述(Nat.Med.5，1410，1999)。
在受损组织中形成新血管
US 2005/147597提供在受治疗者的患病的或受损组织中形成新血管的方法，增加向受治疗者的患病的或受损组织的血流的方法，和增加受治疗者的患病的组织中血管生成的方法，这些方法包括：a)从受治疗者分离自体骨髓-单核细胞，和b)将有效量的自体骨髓单核细胞局部地移植到患病的或受损组织，从而在患病的或受损组织中形成新血管。还提供的是通过局部移植有效量的自体骨髓-单核细胞以诱导患病的组织中血管化而治疗这些患病的或损伤组织的方法。
本发明的细胞可用于在需要其的人类患者中组织重构或再生。细胞以允许它们移植到预期的组织部位和在患病的或受损组织中重构或再生新血管的方式局部移植。
用于神经元疾患的细胞疗法应用
US 2006/211109描述了从多能干细胞例如人类胚胎干细胞有效地产生神经祖细胞和分化的神经细胞诸如多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元的改进方法。本发明的神经祖细胞和最终分化的细胞可大量产生，因此可作为在神经学疾患诸如帕金森疾病中细胞替代疗法的极好来源。
本发明的某些神经分化的细胞可被设计为治疗神经系统的急性或慢性损害。例如，兴奋性中毒已经牵涉在多种病况包括癫痫、中风、缺血、亨廷顿疾病、帕金森疾病和阿尔茨海默疾病中。本发明的某些分化的细胞也可适于治疗髓鞘形成障碍性疾患，诸如佩-梅二氏病、多发性硬化、脑白质营养不良、神经炎和神经病。适合用于这些目的的是富集少突胶质细胞或少突胶质细胞前体以促进髓鞘再生的细胞培养物。
用于骨/软骨损伤的细胞疗法应用
EP 1760144描述了软骨和骨修复组合物，该组合物包含一组由扩增手段分化为软骨-成骨谱系的人类间充质干细胞。可在待修复区域中使用植入物而应用该组合物，或可以通过注射悬浮细胞到损伤部位或为了其广泛的分布注射到系统循环而直接应用该组合物。
US 2007/048381描述用于促进哺乳动物中骨、韧带或软骨生长的方法。该方法包括对所述哺乳动物施用包含药理学有效量的zvegf3蛋白联合药物上可接受的递送运载体的组合物。还披露了促进成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞或骨髓干细胞增殖或分化的方法。
为了在需要其的人类患者中组织再生，根据本发明的细胞可以与成骨刺激物一起直接移植，或在体外分化为软骨形成、成骨、生脂和韧带细胞谱系后移植。
用于肝脏疾患的细胞疗法应用
根据本发明制备的肝细胞和肝细胞前体可在动物模型中评价修复肝脏损害的能力。一个这样的例子是腹膜内注射D-半乳糖胺引起的损害(Dabeva等人，Am.J.Pathol.143，1606，1993)。可通过肝脏细胞标志物的免疫组织化学染色、显微镜确定生长组织中是否形成小管结构，以及治疗恢复肝脏特异性蛋白合成的能力而确定治疗效力。尽管受治疗者的肝脏组织在爆发性肝衰竭后再生自身，但是肝脏细胞可由直接施用用于疗法，或作为提供临时肝脏功能的生物辅助设备的一部分用于疗法。
用于心脏疾患的细胞疗法应用
WO 2004/065589和US 2003/031651描述了以更高产量制备用于细胞移植和移植到哺乳动物心脏组织的细胞，以便它可治疗心脏功能不稳定的疾患的方法。
WO 2006/017567描述了定制来源于多能或多潜能干细胞的心肌细胞的生物活性(如节率性发放速率)，随后移植以体内修改心脏功能(例如，通过修改受者细胞的细胞兴奋性而增加或衰减心率)的方法。
US 2005/031600描述了通过移植间充质干细胞到受损或瘢痕性组织而治疗受损或瘢痕性心肌组织的方法和组合物。
本发明的细胞可用于在需要其的人类患者中治疗心脏疾患。成功的治疗将改善心脏功能，如由收缩压、舒张压和发展压(developed pressure)确定的。还可使用在左前降支动脉的远端部分的固定线圈对心脏损伤建模(Watanabe等人，Cell Transplant.7，239，1998)，且治疗效力可通过组织学及心脏功能评估。本发明中实现的心肌细胞制品可用于疗法以再生心肌和治疗心脏功能不足(美国专利第5,919,449号和WO 99/03973)。
治疗胰腺疾病或疾患的细胞疗法应用
胰腺也是有待使用来源于口腔粘膜的多能干细胞治疗或再生的靶。根据本发明的多能或多潜能干细胞或产生自源自口腔粘膜的干细胞的内胚层细胞谱系可用于治疗或预防内分泌胰腺(β-胰岛)和外分泌胰腺的疾病、疾患或异常状态。
根据一种实施方案，该疾病、疾患或异常状态选自I型或II型糖尿病、胰腺炎、胰脏退化和胰腺癌组成的组。
US 2007/0031384披露了通过向受治疗者施用源自羊水的干细胞而治疗糖尿病的方法。任选地，细胞可分化成胰脏样细胞或至少在施用前被处理以开始随后分化成胰脏样细胞。
US 2005/0032207描述了干细胞分化为胰岛素-产生细胞以便用于自体治疗糖尿病的用途。
基因疗法
基因疗法是指将新遗传信息转移和稳定地插入到细胞以治疗性治疗疾病或疾患。外来基因转移到细胞，其增殖以便扩散新基因到整个细胞群。因此，干细胞或多能祖细胞通常是基因转移的靶，因为他们是产生将有可能表达外来基因的各种后代谱系的增殖细胞。
根据本发明的多能或多潜能干细胞可用在基因疗法以便治疗多种疾病，特别是遗传疾病。与造血细胞相关的遗传疾病可通过遗传修饰自体或同种异体干细胞以纠正遗传缺陷而治疗。例如，包括但不限于β-地中海贫血、镰状细胞贫血、腺苷脱氨酶缺乏症、重组酶缺乏症、重组酶调节基因缺乏症等的疾病，可通过同源或随机重组地引入野生型基因到选定的细胞予以纠正。基因疗法的其它适应症是引入药物抗性基因以使正常的干细胞具有优势并经受化疗期间的选择压力。除了与造血细胞相关的疾病以外的疾病也可以由遗传修饰治疗，其中疾病涉及缺乏特定分泌的产物，包括但不限于，激素、酶、干扰素、生长因子或类似物。通过采用合适的调节起始区，可实现诱导产生缺陷蛋白，使该蛋白的产生将平行于天然产生，即使在不同于通常产生这种蛋白的细胞类型的细胞类型产生。也可以插入核酶、反义或其他信息，以抑制特定基因产物或对疾病的易感性，尤其是嗜血淋巴细胞(hematolymphotropic)的疾病。
或者，人们可能期望从T-细胞的所有组成成分除去T-细胞受体的特定可变区。通过采用同源重组，或阻止表达的反义或核酶序列，特定T-细胞受体的表达可被抑制。对于血液滋养的(hematotrophic)病原体，诸如HIV、HTLV-I和II等，干细胞可被遗传修饰以引入反义序列或核酶，这将阻止该病原体在干细胞或从干细胞分化的细胞中增殖。
任选地，使用本发明方法获得的祖细胞可被操纵以表达所需的基因产物。基因疗法可用于修饰细胞以取代基因产物，以促进组织再生，以治疗疾病，或改善植入到患者后细胞的生存(即预防排斥)。在这个实施方案中，在扩大和分化前转染祖细胞。转染细胞的技术是本领域已知的。
本领域技术人员可以设想将对转染的细胞，或者更间接地对受者患者/动物赋予有利特性的多种基因。取决于实施方案，加入的基因可能最终留在受者细胞及其所有后代中，或可能只是暂时性停留。例如，编码血管生成因子的基因可转染到分离自平滑肌的祖细胞。这种基因将有益于诱导侧支血管形成，由于平滑肌组织再生。在一些情况下，可期望以多于一个基因转染细胞。
在一些例子中，期望有基因产物分泌。在这种实例中，基因产物优选地包含便于蛋白分泌的分泌信号序列。例如，如果期望的基因产物是血管生成蛋白，本领域技术人员可以选择具有天然信号序列的血管生成蛋白，例如VEGF，或可以使用常规遗传操纵来修饰基因产物以含有这种序列(Nabel J.G.等人，Thromb Haemost.70，202-203，1993)。期望的基因可使用多种技术转染到细胞。优选地，使用表达载体将基因转染进入细胞。合适的表达载体包括质粒载体、病毒载体(诸如复制缺陷的逆转录病毒载体、疱疹病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒和慢病毒)和非病毒载体(诸如例如，脂质体、受体配体或电穿孔)。
期望的基因通常连接于其自己的启动子或外来启动子，在任一种实例中启动子介导基因产物的转录。根据启动子在有限的或一般的组织类型中驱动表达的能力，或其促进表达的水平，或其如何响应于加入的化学品、药物或激素而选择启动子。可共转染改变基因表达的其它遗传调节序列。在一些实施方案中，宿主细胞DNA可提供启动子和/或其它的调节序列。含有基因的细胞届时可能通过在毒性化合物存在下培养细胞而选择。靶向哺乳动物细胞中基因的方法是本领域技术人员众所周知的(美国专利第5,830,698；5,789,215；5,721，367和5,612,205号)。
本发明的方法可用于分离和富集能够同源重组并因此经受基因靶向技术的干细胞或祖先细胞。基因疗法的大部分研究都集中在造血干细胞的使用。重组逆转录病毒载体已在实验上被广泛用于转导造血干细胞和祖细胞。被逆转录病毒载体转移后已在小鼠成功表达的基因包括人类次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(Miller，A.，等人Science 255，630，1984)。细菌基因也已以实验模型中细菌性药物抗性基因转移的形式被转移到哺乳动物细胞。通过真核病毒载体转化造血祖细胞为药物抗性已经以基于重组逆转录病毒的载体系统实现(Hock，R.A.和Miller，A.D.Nature 320，275-277，1986；Dick，J.E.，等人Cell 42，71-79，1985；Eglitis，M.，等人，Science 230，1395-1398，1985)。腺相关病毒载体已被成功地用于转导哺乳动物细胞系为新霉素抗性(Tratschin，J.D.等人Mol.Cell.Biol.5，3251，1985)。已研究用在基因转移的其它病毒载体系统包括乳多空病毒和牛痘病毒(Cline，M.J.Pharmac.Ther.29，69-92，1985)。
其他基因转移方法包括显微注射、电穿孔、脂质体、染色体转移和转染技术诸如钙沉淀法转染技术以转移甲氨蝶呤耐药二氢叶酸还原酶(DHFR)或单纯疱疹病毒胸苷激酶基因和人类珠蛋白基因到鼠造血干细胞。证实了DHFR和胸苷激酶基因在干细胞后代中的体内表达(Salser，W.，等人Organization and Expression of Globin Genes(珠蛋白基因的组织和表达)，Alan R.Liss，Inc.，New York，pp.313-334，1981)。
以酶替代疗法为目标还在鼠模型中研究了基因疗法。来自供者小鼠的正常干细胞已被用于重构缺乏β-葡糖醛酸酶的小鼠的造血细胞系统(Yatziv，S.等人J.Lab.Clin.Med.90，792-797，1982)。通过这种方式提供天然基因，且不需要重组干细胞(或基因转移技术)。
冷冻保存
冷冻细胞通常是破坏性的。冷却时，水在细胞内冻结。然后由于细胞膜上的渗透效应，细胞脱水，溶质浓缩，和冰晶形成而发生损伤。因为在细胞外形成冰，所以可用的水被从溶液除去并从细胞提取，导致渗透脱水和溶质浓度提高，最终会破坏细胞。可通过(a)使用冷冻保护剂，(b)控制冻结率，以及(c)在足够低的温度存储以尽量减少降解反应而规避这些有害的影响。
操纵、冷冻保存和长期储存造血干细胞，特别是来自骨髓或外周血的造血干细胞的注意事项和程序是本领域已知的。一些方法由Gorin，N.C.综述于Clinics In Haematology(临床血液学)15，19-48，1986。可获得和设想使用其它的活细胞冷冻保存方法或其修改(如冷金属镜技术；美国专利第4,199,022号；美国专利第3,753,357号；美国专利第4,559,298号)。美国专利第6,310,195号披露了基于使用特异性蛋白，保存多能祖细胞以及全能祖细胞的方法。美国专利第5,873,254号披露多梯度定向冷却和加暖生物样品的设备和方法。这种方法以及本领域已知用于冷冻保存的其它方法和设备可与根据本发明的细胞一起使用。
可使用的冷冻保护剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、i-赤藓醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨醇，i-肌醇、D-乳糖、氯化胆碱、氨基酸、甲醇、乙酰胺、单乙酸甘油酯和无机盐。
冷冻细胞优选地迅速融化(例如在维持在37-41℃的水浴中)和融化后立即冷冻。特别是，含有冻结的细胞的小瓶可浸入温水浴中达其颈部；轻轻旋转将确保细胞悬浮物随着融化而混合并增加从温水至内部冰块的热量转移。一旦冰完全融化，小瓶可立即放置在冰上。
干细胞的体外培养
任选程序(冷冻保存前或后)是体外扩大干细胞。不过，应当小心以确保体外生长不会导致以多潜能干细胞为代价产生分化的后代细胞，多潜能干细胞对于重构是治疗上需要的。已经针对脐带血或骨髓细胞的体外生长描述了各种实验方案，并且设想可采用这种程序或其修改(Dexter，T.M.等人J.Cell.Physiol.91，335，1977；Witlock，CA.和Witte，O.N.Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.79，3608-3612，1982)。
WO 2006/085482描述离体扩增造血干细胞的技术。通过使用扩增的造血干细胞或不同组织中每一种的干细胞，可对患有多种顽固性血液疾病或多种器官疾病的患者进行移植疗法和基因疗法。
也可单独或联合地测试用于刺激体外增殖的各种因子，包括但不限于白介素-3(IL-3)、粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF)、IL-1(促红细胞生成素-1)、IL-4(B细胞生长因子)、IL-6。
细胞扩大
本发明还包括获得高度富集干细胞的细胞组合物的方法。该方法包括在适于产生干细胞的条件下孵育上述组合物。从而获得包含原始干细胞和/或产生的干细胞的组合物。这种组合物在重构人类造血系统和研究如上述的造血细胞的各种参数中具有实用性。
本发明还包括使用源自粘膜的干细胞的方法。由于细胞是首次用于实验的，它们可用于完全重构免疫妥协的宿主，诸如被辐照的宿主或经受化疗的宿主；或作为特定谱系的细胞来源，通过提供其成熟、增殖和分化为一个或多个选定谱系，通过采用多种因子，包括但不限于促红细胞生成素、集落刺激因子如GM-CSF、G-CSF或M-CSF、白介素如IL-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8等，或类似物，或与变化定型为特定谱系的干细胞相关的基质细胞，或与其增殖、成熟和分化相关的基质细胞。干细胞也可用于分离和评价与造血细胞分化和成熟有关的因子。因此，干细胞可用在测定以确定培养基诸如条件培养基的活性，评价流体的细胞生长活性，参与贡献特定谱系，或类似用处。
下面的实施例是为了说明如何制备和使用本发明的化合物和方法，绝不应被解释为限制。虽然本发明现在将结合其具体实施方案描述，但是很显然的是，许多修改和变化对本领域技术人员将是明显的。因此，它旨在涵盖属于所附权利要求书的主旨和宽范围的所有此类的修改和变化。
实施例
一般方法
源自口腔粘膜的细胞(OMC)的产生：附着齿龈和内衬粘膜的固有层作为OMC的来源。这样做的理论根据是，临床观察结果和科学的数据指出两种类型的LP作为分离源自口腔粘膜的干细胞的潜在来源。OMC是通过培养齿龈或内衬粘膜外植块或经由连续酶促消化活组织检查样品而从这些外植块释放的细胞而产生，如McCulloch等人描述的(J Periodont Res22：41-49，1986)。培养在补充有1-20％血清和包含青霉素(100μg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)和fungison(0.3μg/ml)的抗生素溶液的低葡萄糖DMEM(LGDMEM)中进行。这种培养基本文称为“扩大培养基”。另外，为产生MSC，将培养物生长在补充有10-20％的血清的正常DMEM或高葡萄糖DMEM中。
荧光激活细胞分选术(FACS)：对于染色细胞内分子，将细胞固定在1.5％的多聚甲醛10分钟，以0.5ml冷缓冲溶液(DPBS，0.5％BSA、0.02％叠氮化钠，pH 7.4)洗涤2次，以0.1％Triton X-100透化10min，离心，悬浮于100μl冷缓冲溶液(DPBS，0.5％BSA、0.02％叠氮化钠，pH 7.4)，以特异性共轭抗体染色30min，以冷缓冲溶液冲洗两次，并用1ml PBS重悬。对于间接染色，在二抗染色前，细胞用1ml冷缓冲溶液冲洗一次。对于细胞表面标志物染色，省略Triton X-100。以FACS扫描器(BD Bioscience)进行分析或分选。
免疫荧光(IF)：细胞培养在8孔Labtek室(8-wells Labtek chambers)。对于染色细胞内分子，将细胞在冷4％多聚甲醛中固定10min，PBS洗涤2次并以0.1％Triton X-100透化10min。对于细胞表面标志物染色，省略Triton X-100步骤。根据制造商的说明进行与一抗和二抗的孵育和封闭。以DAPI染色核。
RT-PCR：根据制造商的说明使用RNA纯化试剂盒(Zotal)提取总RNA并用分光光度法定量。以0.5μg RNA使用cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)进行反转录和扩增。对于RT-PCR分析，加入1μl cDNA到0.5μM 5’和3’引物和25μl高保真DNA聚合酶(FINNZYME)。在GeneAmp 9600热循环仪(Perkin-Elmer)进行扩增25-30个循环。在98℃初始变性10秒后使用FINNZYME计算工具确定Tm。通过在1.5％琼脂糖凝胶中电泳来按尺寸分离PCR产物(10μl小份)。使用密度计(Bio-Rad)通过电子放射自显影使得扩增反应的产物可见。
用于评价外胚层分化的具体实验方案
神经元分化：对于神经诱导，将在DMEM-高葡萄糖(DMEM-HG)、含有100U/ml青霉素和1mg/ml链霉素的20％FBS中的源自口腔粘膜的整群的细胞以低密度铺板到8孔Labtek板，维持48小时。随后，通过将细胞暴露于DMEM-HG、1mM b-巯基乙醇(bME)、10ng/ml NT-32天来诱导定型。通过将细胞经受DMEM-HG中的NT-3(10ng/ml)、NGF(10ng/ml)和BDNF(50ng/ml)10天而诱导分化。
用于评价中胚层分化的具体实验方案
成骨分化：对于成骨分化，将源自口腔粘膜的整群的细胞在由αMEM组成、补充有15％FCS、10-7M地塞米松、10μMβ-磷酸甘油和50mg/ml维生素C的成骨分化培养基生长4周。
软骨形成分化：对于软骨形成分化，将源自口腔粘膜的整群的细胞重悬于包括DMEM高-葡萄糖、100nM Dex、10ng/ml TGF-β3、50μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯、100μg/ml丙酮酸钠、40μg/ml脯氨酸和ITS-plus(终浓度：6.25μg/ml牛胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白、6.25μg/ml亚硒酸、5.33μg/ml亚油酸和1.25mg/ml牛血清白蛋白)的无血清的软骨形成培养基；将250,000个细胞的小份悬浮于0.5ml软骨形成培养基并在15ml锥形聚丙烯离心管(Costar)之间分配。将细胞以600g离心5分钟并留在管底。松开盖，在95％空气、5％CO2的100％湿润大气以37℃孵育各管达4周。
脂肪细胞分化：对于脂肪细胞分化，将源自口腔粘膜的整群以由α-MEM、10％FBS、0.5mM氢化可的松、0.5mM异丁甲基黄嘌呤和60mM吲哚美辛组成的脂肪细胞分化培养基处理5周。
用于评价内胚层分化的具体实验方案
β-胰岛细胞分化：β-胰岛细胞分化通过将DMEM-HG(DMEM-高葡萄糖)、10-20％血清中的OMC铺板、维持24h而诱导。随后，以DMEM-HG+20％血清+10-20ng/ml bFGF代替该培养基24h。对于内胚层的说明，培养基以由DMEMHG、1％DMSO、100mM丁羟茴醚(BHA)和10nM/lexendin-4组成的培养基代替24-48小时。之后，内胚层定型通过将该培养物暴露于补充有11.1mM/l葡萄糖、10-20％血清、10mM/l Hepes、1.0mM/l丙酮酸钠、10-30ng/ml b-FGF、10-30ng/ml EGF和10nM/l exendin-4的RPMI 3-6天而诱导。胰岛样分化将通过将细胞暴露于RPMI+2.5mM/l葡萄糖、10mM/l Hepes、10mM/l烟酰胺、100pM/l HGF、10nM/l exendin-4和2.0nM/l激活素-A 3-15天而诱导。将通过在蛋白和mRNA水平表达胰岛素和胰高血糖素以及牵涉在β-细胞发育中的转录因子Beta2/NeuroD、Nkx6.1和Isll鉴定β-胰岛细胞分化。β-胰岛分化的替代方案描述于本领域，如例如描述于D′Amour等人(Nature Biotechnologty 24(11)：1392-1401，2006)。
肝分化.对于肝分化，使用De Coppi等人(Nature Biotechnology 25，100-106)的修改的实验方案。肝分化通过播种OMC/cm2到Matrigel或层粘连蛋白和纤连蛋白包被的塑料板上并生长到半-融合密度而诱导。随后对培养基补充10-20％血清、300mM硫代甘油(monothioglycerol)、10-30ng/mlHGF、10ng/ml制瘤素M、10-7M地塞米松、100ng/ml FGF4、1x ITS(胰岛素、转铁蛋白、硒)。1-3周后收集细胞并铺板到2层胶原或纤维蛋白胶之间，并在分化培养基中再维持30-60天。
实施例1-集落生成性确定
本领域中评价组织中可能的干细胞群的大小的常见方法是测量可从特定组织获得的细胞群体外衍生的源自一个细胞的生长克隆的数目。为了评价原代口腔粘膜细胞培养物(OMC)中集落生成细胞的一般频率，将细胞以一个细胞/cm2的克隆密度铺板并确定集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)。集落-形成效率(CFE)即能够形成包含超过100个细胞的集落的集落生成细胞的发生率是百分之八。相比于源自骨髓和其它结缔组织的MSC此前公布的值(Reyes M等人，Blood 96：2615-2625，2001；D’Ippolito G等人，Rejuvenation Research 9：10-18，2006)，这是实质上更高的值(2-10倍)。这些集落的细胞是小的，具有低的胞质/核比，如图3所示。有趣的是，来自齿龈固有层的外植块成功地继续产生具有相等生长能力的原代培养物的连续的若干代，说明这些外植块含有具有高的自身更新能力的SC群。将P1培养物和之后每3次传代以1个细胞/cm2的密度铺板并在铺板后12天对集落数目计数。来源于齿龈固有层的群和来自13次传代的培养物的CFE在P1是8.75％，在P7达到峰值31％，并在P13下降到14.5％(图4)。这些结果显示至少达13次传代或40群倍增并未大大减少具有自身更新能力的细胞的百分比，说明原代齿龈群富集SC。
实施例2-OMC多潜能性的确定
为了确定多样性，检查分化为各种组织的各种细胞系的整群的大小和潜能。群中干细胞比例越高，该整群分化为大量细胞系的倾向越高。在这种试验中发现，对比于其它非源自骨髓的间充质整群(如真皮成纤维细胞)，来自齿龈口腔粘膜固有层的OMC-原代整群分化为成骨细胞、软骨母细胞和脂肪细胞谱系，如以下证实的：i.矿化样组织的茜素红染色(左图)、ii证实micromas的软骨母细胞分化的蛋白聚糖的阿尔新蓝染色(中图)、和iii.代表生脂(adypogeic)分化的甘油三酯液滴的油红染色(图6，右图)。结果证实绝大多数的OMC培养物整细胞群由多潜能干细胞组成。
为了评价整OMC群中多潜能间充质干细胞的比例，将生长在仅由低葡萄糖DMEM组成并补充有10％胎牛血清的扩大培养基和规则培养烧瓶或盘中的4-5次传代的细胞以针对已知是MSC特有的标志物的抗体染色并通过FACS评价染色细胞数目。获得的结果概述于表1和图5，并显示：
1.从所有5个所测供者获得的培养物中超过95％的细胞对CD29、CD73、CD105是阳性的(图5中的A、D和F)。
2.从所有5个所测供者获得的培养物中超过97％的细胞对CD90是阳性的(图5中的E)。
3.所有细胞对造血干细胞标志物CD34和45是阴性的(图5中的B和C)。
4.仅34％的细胞对Stro1(G)是阳性的，Stro1是与来源于基质骨髓细胞的干细胞和祖细胞相关的标志物。
表1.特定细胞标志物的表达百分比
| 标志物 | 供者数目 | 平均％ | SDEV |
| CD105 | 8 | 97.05 | 1.19 |
| CD29 | 8 | 96.36 | 1.36 |
| CD73 | 8 | 95.29 | 7.62 |
| CD90 | 5 | 98.37 | 0.88 |
| CD106 | 5 | 34.23 | 5.45 |
| CD166 | 5 | 98.92 | 0.76 |
| CD117 | 5 | 17.58 | 7.86 |
| CD34 | 5 | 0.00 | |
| CD45 | 5 | 0.00 | |
| STRO-1 | 7 | 32.25 | 12.89 |
| SSEA4 | 8 | 75.04 | 13.52 |
| Oct-04 | 7 | 74.38 | 13.71 |
| Tra1-60 | 8 | 0.00 |
| Tra1-81 | 8 | 0.00 | |
| Tra2-49 | 4 | 31.94 | 8.65 |
| Tra2-54 | 4 | 27.78 | 9.61 |
这些结果证实，在规则培养条件下培养物中产生的绝大多数未分选的OMC整群展示多潜能间充质干细胞的标志物，且因此它们被认为是推定的多潜能间充质干细胞。现有技术中，对于在来自除了口腔粘膜以外的组织的培养物中不经任何分选或任何选择程序产生的任何其它细胞整群从未报道过该新发现。
实施例3-细胞的多能性的确定
多能性是指细胞群分化为成体生物体的任何细胞谱系的能力。该特性通常归因于胚胎干细胞(ESC)。ESC特征为许多表面标志物，诸如：SSEA3、SSEA4、Tra-1-61、Tra-1-81、Tra-2-49、Tra-2-54和核标志物诸如POU5F1/Oct-4、Nanog、Sox 2和少数其它标志物。
在从若干个供者获得的整培养物中评价这些标志物中的一些在蛋白和信息水平的表达。通过流式细胞计量术(FACS)和通过间接免疫荧光评价在蛋白水平的表达。在信息水平以RT-PCR评价表达。
结果概述于表1并示意于图7-9。图7证实从口腔粘膜固有层获得的培养物在传代4-5次的未分选的整群中表达的多能标志物Oct4(A)和SSEA4(B)的FACS分析实例。图8显示以抗-Sox2抗体免疫荧光染色(左图)和以DAPI免疫荧光染色以鉴定核(右图)的传代2次的整群的实例。左图和右图的比较显示，绝大多数的细胞对Sox2是阳性的，且染色局限于核。结果表示：
·从所有测试供者获得的培养物中超过60％的细胞表达SSEA4、POUF51、Nanog和Sox；
·从测试的供者获得的培养物中10-25％之间的细胞表达Tra-2-54和Tra-2-49；
·Tra-1-61和Tra-1-81仅在一个供者中表达。
在一个具体的实验中，测试这些标志物中的一部分在蛋白水平的表达直到传代16次，其与30群倍增相当。结果表示表达模式实际上保持未变。
多能干细胞的其它特性是其分化为胚胎起源不同于源组织的胚胎起源的细胞谱系的能力。口腔粘膜的固有层是间充质组织。为了进一步测试整(未分选的)OMC培养物的多能性，评价了它们在合适的培养条件下分化为神经元细胞的能力。
首先，在未刺激的培养物中在蛋白和信息水平确定巢蛋白的表达，巢蛋白是神经系统和胰脏组织早期祖先的标志物(Zelevzki H.等人，Diabetes50：521-533，2001)。免疫荧光表示该标志物在大多数细胞中的表达，见图8。该发现被RT-PCR在信息水平证实，见图9。其次，培养物维持在由所述各成分组成的神经元分化培养基并根据上述实验方案维持。图10示意OMC细胞逐步分化为神经元细胞，如在形态学水平由形成神经元样细胞和在细胞水平由逐步表达典型神经元样标志物所证明的。
实施例4.供者衰老对OMC多能性的影响：
口腔粘膜活组织检查样品以及骨髓抽吸物从年龄匹配的供者获得，如有可能来自同一供者。在获自以下年龄组的培养物中评价OMC和BMSC多能性：18-25、35-45和65岁以后。如上述地检查以下参数：P1和后来传代的培养物中的OMC大小、在SP和整群中表达原始标志物的细胞频率、其集落生成能力、总群倍增、平均倍增时间和多能性，这根据将在Aim 2获得的数据确定。为了进一步测试衰老对OMC的影响，通过实时RT-PCR在信息水平评价细胞周期基因p21和p27、细胞更新基因HoxB4和HoxA9和凋亡基因Bcl-2、Bad和Fas。源自LP的整个群和年龄匹配的BMSC作为对照。评价来自各年龄组的至少4个供者的活组织检查样品。
具体实施方案的上述描述充分揭示了本发明的一般性质，以至于其他人可以利用现有知识来容易地修改和/或修订这种具体的实施方案以便用于各种应用，而不必过度实验且不偏离一般概念，因此，这种修改和修订应该并且意为包含在披露的实施方案的等价物的含义和范围内。应理解本文所用的用语或术语是为了描述而不是限制。实现披露的各种功能的手段、材料和步骤可采取多种替代形式而不偏离本发明。
Claims (31)
1.一种分离的多能或多潜能干细胞，其来源于胃肠道粘膜的固有层。
2.根据权利要求1所述的干细胞，其来源于胃肠道上部。
3.根据权利要求2所述的干细胞，其来源于选自以下组成的组的区域：口腔、咽、食道、胃和十二指肠。
4.根据权利要求2所述的干细胞，其来源于口腔、咽或食道。
5.根据权利要求2所述的干细胞，其来源于口腔。
6.根据权利要求1所述的干细胞，其来源于口腔粘膜的固有层。
7.根据权利要求1-6任一项所述的干细胞，其特征在于表达选自以下组成的组的至少一种细胞标志物：Oct-4、Tra-1-61、Tra1-81、Tra-2-49、Tra-2-54、SSEA1-4、Rex1、Nanog、Sox2 ABCG2、hTert、Bmi1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD117、CD146、CD166和Stro1+。
8.根据权利要求7所述的干细胞，其中所述细胞特征在于表达多个标志物Oct-4、Tra-1-61、Tra1-81、SSEA1-4、Rex1、Nanog、Sox2 ABCG2、hTert、Bmi1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD117、CD146、CD166和Stro1+。
9.一种细胞群，其包含源自口腔粘膜的细胞，其中所述细胞中的至少80％表达选自以下组成的组的至少一种细胞标志物：Oct-4、Tra-1-61、Tra1-81、Tra-2-49、Tra-2-54、SSEA1-4、Rex1、Nanog、Sox2 ABCG2、hTert、Bmi1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD146、CD166和Stro1+。
10.根据权利要求9所述的细胞群，其中所述细胞中的至少80％表达选自以下组成的组的多个标志物：Oct-4、Tra-1-61、Tra1-81、Tra-2-49、Tra-2-54、SSEA1-4、Rex1、Nanog、Sox2 ABCG2、hTert、Bmi1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD146、CD166和Stro1+。
11.根据权利要求9所述的细胞群，其中所述细胞未经过分选程序。
12.根据权利要求9所述的细胞群，其中所述细胞中的至少60％表达多能特性。
13.根据权利要求9所述的细胞群，其中所述细胞中的至少80％表达多潜能特性。
14.一种从胃肠道粘膜固有层分离干细胞的方法，其包括以下步骤：
i.获得来源于胃肠道粘膜的细胞群；
ii将(i)中获得的细胞暴露于能够鉴定至少一种特异性标志物的至少一种探针；
iii.通过分选方法分选细胞；和
iv.分离表达对干细胞特异的至少一种标志物的干细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其在步骤(ii)后还包括除去不表达特异性标志物的细胞。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞群来源于胃肠道上部。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞群来源于口腔。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞群来源于口腔粘膜的固有层。
19.根据权利要求14所述的方法，其中(i)中的所述细胞群是来源于胃肠道的细胞的培养物或是来源于胃肠道的细胞的外植块。
20.根据权利要求14所述的方法，其中(i)中的所述细胞群是通过酶促消化而获得的培养物或是来源于胃肠道的细胞的外植块。
21.根据权利要求14所述的方法，其中(ii)中的所述至少一种特异性基因标志物选自以下组成的组：Oct-4、Tra-1-61、Tra1-81、Tra-2-49、Tra-2-54、SSEA1-4、Rex1、Nanog、Sox2 ABCG2、hTert、Bmi1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD146、CD166和Stro1+。
22.根据权利要求14所述的方法，其中(iv)中的所述分选方法包括荧光激活细胞分选术(FACS)。
23.根据权利要求14所述的方法，其中所述探针以可检测的示踪剂标记。
24.一种培养物或外植块，其包含根据权利要求1所述的分离的干细胞。
25.一种治疗疾患或疾病的方法，其包括向需要其的患者施用根据权利要求1-8任一项所述的多潜能或多能干细胞并提供使所述细胞分化为表征所述组织的细胞的条件，从而治疗患有组织疾患或疾病的个体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述疾患或疾病选自以下组成的组：造血疾病或疾患、神经元疾病或疾患、软骨或骨疾病或疾患、肌肉疾病或疾患、韧带疾病或疾患、心脏疾病或疾患、血管疾病或疾患、内皮疾病或疾患、肝脏疾病或疾患、胰脏疾病或疾患、胃肠疾病或疾患、肺部疾病或疾患、泌尿生殖疾病或疾患、腺疾病或疾患、肾上腺疾病或疾患、甲状腺疾病或疾患。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述疾患是遗传疾患。
28.一种治疗患有需要细胞或组织置换的疾患或疾病的个体的方法，其包括将至少一种根据权利要求1-8任一项所述的分离的体多潜能或多能干细胞引入个体中与疾患相关的组织，从而治疗患有需要细胞或组织置换的疾患的个体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述疾患或疾病选自以下组成的组：造血疾病或疾患、神经元疾病或疾患、软骨或骨疾病或疾患、肌肉疾病或疾患、韧带疾病或疾患、心脏疾病或疾患、血管疾病或疾患、内皮疾病或疾患、肝脏疾病或疾患、胰脏疾病或疾患、胃肠疾病或疾患、肺部疾病或疾患、泌尿生殖疾病或疾患、腺疾病或疾患、肾上腺疾病或疾患、甲状腺疾病或疾患。根据具体实施方案，所述疾患是遗传疾患。
30.一种治疗患有需要细胞或组织置换的疾患或疾病的个体的方法，其包括(a)使至少一种根据权利要求1-8任一项所述的多能或多潜能干细胞经受适于诱导细胞增殖的培养条件，从而获得扩大的干细胞群；和(b)将所述扩大的干细胞群引入个体中与疾患相关的组织，从而治疗患有需要细胞或组织置换的疾患的个体。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述疾患是遗传疾患。
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