CN101659702A - 抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用，属于含有抗体的医药配制品，或单克隆抗体的制备。抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体由保藏号CGMCC No.3240的杂交瘤细胞产生。本发明采用乳腺癌细胞MCF－7免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，利用MCF－7细胞进行筛选，然后将得到的阳性克隆组成单克隆抗体库；源自该抗体库的抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，采用免疫沉淀和质谱的方法鉴定其抗原为Calnexin。该抗体与Calnexin蛋白具有特异性结合能力；同时确定了标识该抗体的可变区序列。本发明适用于该分子的免疫组化、免疫荧光、免疫印迹以及免疫沉淀的检测。

Description

抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及含有抗体的医药配制品，或单克隆抗体的制备，具体是一种抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

单克隆抗体库是通过细胞或细胞提取物等混合抗原免疫小鼠，得到针对不同蛋白的各种单克隆抗体的集合。采用此种方法制备单克隆抗体缺点是一次融合制备抗体的工作量大，后期需要抗原鉴定工作、最初很难预测产生何种抗体。优点是一次制备能够产生多种蛋白的单克隆抗体，使得多种蛋白的单抗制备工作一次完成，实现工作程序的高通量；并且由于采用天然蛋白进行免疫，因此产生的抗体特异性好、质量高。

目前，肿瘤研究从癌基因/抑癌基因学说进入分子表达谱的新阶段，发现肿瘤过程中不仅仅是某几个基因发生改变，而是涉及多个信号传导通路的细胞整体协同变化，因此利用单克隆抗体库技术可以直接发现发生改变的蛋白分子，同时获得该分子的特异的单克隆抗体，达到一举两得的目的。

内质网是真核细胞中蛋白质合成和Ca²⁺贮积的主要场所，它能够参与细胞的蛋白质量控制、糖基化修饰、细胞凋亡、蛋白质降解以及钙离子稳态等多种生物学功能，分子伴侣在其中发挥着十分重要的作用。钙联蛋白Calnexin是内质网中的一种跨膜蛋白，它和钙网蛋白Calreticulin以及特异分布在睾丸组织中的同源物Calmegin都属于类凝集素分子伴侣，这类分子伴侣所构成的Calnexin/Calreticulin循环能够专一地识别以N2糖苷键连接的糖蛋白，是真核细胞蛋白折叠和装配的重要监控机制，同时也能调节内质网中的Ca²⁺稳态平衡和Ca²⁺信号传导过程，因此进一步明确该分子在细胞中的作用机制对于诸多细胞生命现象的阐释及某些肿瘤的形成分子机制具有重要的作用。而在研究中用于检测该分子的表达和分布的重要工具之一即为单克隆抗体。

发明内容

本发明针对人Calnexin蛋白在细胞中的作用机制，对于诸多细胞生命现象的阐释及某些肿瘤的形成机制，为细胞生物功能研究、基础医学研究和临床检测，提供了一种通过单克隆抗体库技术获得的抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用。

本发明是按以下技术方案实现的。

一种抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，该抗体特异性识别人Calnexin蛋白，并与Calnexin蛋白具有特异性结合能力，其是由保藏号为：CGMCC No.3240的杂交瘤细胞产生。

述抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，所述Calnexin单克隆抗体的轻链可变区DNA序列如图5所示，所述Calnexin单克隆抗体的重链可变区DNA序列如图6所示；

所述抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，所述Calnexin单克隆抗体亚型鉴定为IgG2b。

一种抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体得制备方法，其是采用乳腺癌细胞MCF-7免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，利用MCF-7细胞进行筛选，然后将得到的阳性克隆构建单克隆抗体库；源自该抗体库的抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，采用免疫沉淀和质谱的方法鉴定其抗原为Calnexin；将此单抗的杂交瘤细胞提取RNA，反转录成cDNA，利用抗体可变区引物进行扩增，得到PCR产物测序鉴定。

一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞产生抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，该杂交瘤细胞的保藏号：CGMCC No.3240。

抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体在制备医学检测制剂中的应用：

a.抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体在制备免疫组化检测制剂中的应用；

b.所述抗体在制备免疫荧光检测制剂中的应用；

c.所述抗体在制备免疫印迹反应检测制剂中的应用；

d.所述抗体在制备免疫沉淀检测制剂中的应用。

应用该抗体进行多种免疫学实验均获得良好效果，表明该抗体能够与Calnexin蛋白具有特异性结合能力，适用于该分子的免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)、免疫印迹(Westernblot)以及免疫沉淀(IP)的检测。将本发明应用到细胞生物功能研究、基础医学研究和临床检测，为该分子的临床与基础研究提供了可靠地检测工具。

杂交瘤由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；

保藏号为：CGMCC No.3240，保藏日期：2009年09月03日，经检测，生物材料存活。

附图说明

图1显示Calnexin Western blot染色；

图2显示Calnexin免疫沉淀及质谱鉴定；

图3显示Calnexin乳腺癌组织免疫组化染色；

图4显示Calnexin免疫荧光染色；

图5是Calnexin轻链可变区的DNA序列

图6是Calnexin重链可变区的DNA序列。

具体实施方式

一、MCF-7细胞单克隆抗体库的制备

(一)材料方法

1.实验材料来源

BALB/c小鼠、MCF-7细胞及小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)由天津肿瘤医院提供。福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂、HAT、HT条件培养基成分购自Invitrigen公司。DMEM培养基、聚乙二醇(PEG)、RPMI 1640培养基购自Hyclone公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠Ig、邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺(DAB)、8-氮鸟嘌呤(8-AG)购自Sigma公司。

2.动物免疫

取1×10⁷MCF-7细胞，离心收集，加入200ul生理盐水反复冻融5次，离心弃上清。于沉淀中加入裂解液(0.05M Tris-HCl pH＝8.0、1％Triton X100)300ul，4℃离心12,000rpm，取上清作为免疫原。

取7～10周龄BALB/c雌性小鼠4只，将100ul MCF-7细胞免疫原与等体积弗氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，腹部皮下多点注射。第1次免疫后第15和29天，分别用100ul免疫原与等体积弗氏不完全佐剂(Sigma)充分混匀后加强免疫，融合前3d由尾静脉强化免疫注射50ul免疫原1次。

3.间接ELISA法检测血清效价

以MCF-7细胞免疫原包被酶标板，设空白对照组，37℃包被过夜。用0.25％BSA 37℃封闭1小时。加入梯度系列稀释的血清，37℃孵育1h，PBS-T洗5次。加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠Ig，37℃孵育1h，PBS-T洗5次。OPD底物显色系统显色2-3分钟，测定OD492值。

4.细胞融合及单克隆抗体库构建

取经加强免疫的BALB/c小鼠1只，放血处死后，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液。取2×10⁷个骨髓瘤细胞(SP2/0)，于37℃水浴中加50％PEG(MW 4000)1ml融合，将融合细胞接种于96孔培养板内，分别采用HAT和HT培养基进行选择性培养。待杂交瘤细胞长至培养孔底面1/3时，用MCF-7免疫原作包被抗原，以ELISA法筛选抗体，选择抗体分泌阳性孔，采用甲基纤维素半固体培养基法，将杂交瘤细胞克隆化，接种于96孔培养板内，取培养上清作抗体检测，阳性者冻存。全部阳性克隆之集合即为单克隆抗体库，留作进一步筛选备用。

(二)实验结果

小鼠免疫三次后，以MCF-7细胞免疫原包被板、尾静脉取血进行效价测定，得其效价为1∶4000。细胞融合后初筛形成96个阳性克隆，每个克隆均经克隆化后冻存。

二、单抗库的筛选及抗原鉴定

(一)材料方法

1.免疫印迹(Western blot)筛选

MCF-7细胞免疫原进行SDS-PAGE电泳，然后进行PVDF膜蛋白转印。用单克隆抗体库中的杂交瘤培养上清分别进行转印膜的杂交反应，化学发光试剂(ECL)显影。取阳性克隆复苏，扩大培养。具体步骤如下：

1.1 MCF-7细胞免疫原中加入等体积的加样缓冲液沸水浴5分钟，进行SDS-PAGE电泳，每个泳道加样20ul，电泳条件为恒流20mA/板，约1.5～2小时。蛋白转印为半干转印，恒流40mA，约1小时。

1.2将膜置于5％脱脂奶粉中，37℃摇动1h。

1.3将膜置于单抗培养上清中，4℃摇动2h过夜。TBS-T漂洗3遍，每次5分钟。

1.4将膜置于羊抗鼠二抗稀释液中(1∶10,000)中，37℃摇动1h。TBS-T漂洗3遍，每次5分钟。

1.5 ECL曝光显影。

2.阳性杂交瘤腹水单克隆抗体的制备

BALB/c小鼠腹腔注射Pristane0.5ml/只，1周后腹腔注射生长良好的阳性杂交瘤细胞10⁷，10天左右，小鼠腹部胀大至其活力极差时，处死小鼠，抽取其腹水，2000转离心去沉淀，收集上清。

3.免疫沉淀(IP)鉴定抗原

取1ul小鼠腹水与10ul蛋白A/G混合，4℃孵育1小时，离心去上清；于沉淀中加入MCF-7细胞免疫原1ml，4℃孵育摇动过夜，离心去上清；将沉淀中加入加样缓冲液20ul，沸水浴10分钟，上样SDS-PAGE电泳。将沉淀的蛋白条带切下，进行质谱鉴定。

4.Calnexin单抗的免疫学反应

采用已鉴定的Calnexin腹水单抗进行各项免疫学反应测试：

4.1免疫沉淀(具体方法见方法3)

4.2 Western blot(具体方法见方法1)

4.3免疫组化(IHC)

1)乳腺癌切片放入67℃温箱中干烤24小时。

2)常规二甲苯脱蜡2次，每次20分钟，梯度乙醇至水后PBS洗两次，每次10分钟。

3)在3％H2O2中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶。

4)浸入pH＝8.0的EDTA抗原修复液中，用微波行抗原修复。使抗原修复液快速升温至92-98℃后维持此温度范围持续20分钟。

5)冷却，置于抗原修复液中自然冷却，时间不少于20分钟。

6)PBS液浸泡3次，每次5分钟。

7)用正常动物血清50μl封闭10min，倾去多余血清，不洗。

8)轻甩掉血清，滴加Calnexin腹水单抗稀释液(1∶100)，放入4℃孵育过夜，取出切片入PBS中浸洗3次，每次5分钟。

9)滴加免疫组化染色试剂盒中PV6002(北京中山)二抗工作液，后放入37℃温箱中孵育20分钟。

10)PBS液浸泡3次，每次5分钟。

11)二氨基联苯胺(diamminobenzidine，DAB)染色：每1ml蒸馏水分别依次加入1滴A，B，C液，混匀后滴加在切片上，镜下监测显色过程，适时终止反应。

12)苏木素复染，中性树胶封片。

4.4免疫荧光(IF)

载玻片泡酸，清洗，干烤消毒，备用。取MCF-7细胞加入少量培养基，混匀，从中吸出100ul点于载玻片上，置于无菌的平皿中37℃，培养8小时后，各片补充100ul培养基，过夜。将载玻片从平皿中取出，浸泡于0.9％生理盐水中，洗净血清。置于冷甲醇中固定20分钟。将玻片置于3％H2O2溶液中，浸泡15分钟，去除内源性过氧化物酶。每片点1滴正常羊血清，37℃温浴20分钟。应用Calnexin腹水单抗稀释液(1∶100)，4℃过夜。PBS漂洗3遍，加AlexaFluor488标记羊抗鼠Ig(分子探针公司)，37℃孵育15分钟，常规封片，荧光显微镜观察。

5.抗体亚型鉴定

以羊抗鼠Ig包被酶标板，，37℃包被过夜。用0.25％BSA 37℃封闭1h。加入Calnexin杂交瘤培养上清，37℃孵育1h，PBS-T洗5次。分别加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA，37℃孵育1h，PBS-T洗5次。OPD底物显色系统显色5-10min，测定OD492值。

(二)实验结果

1、用单克隆抗体库中的抗体上清分别进行MCF-7细胞免疫原转印膜的杂交反应，化学发光试剂(ECL)显影。能够发生western blot反应的单抗有30株，选取其中一株阳性克隆细胞(如图1)进行复苏，扩大培养，大量制备小鼠腹水。

2、利用小鼠腹水进行免疫沉淀，沉淀抗原进行质谱鉴定为Calnexin(如图2)，免疫沉淀显示改单抗特异性强，无其他非特异蛋白沉淀，质谱鉴定结果单一；与之相吻合，Western blot同样显示杂交蛋白信号单一，特异性强(如图1)，结果证明该抗体能够作为免疫沉淀及western blot的检测制剂进行应用。

3、Calnexin单克隆抗体的免疫组化染色，可见乳腺癌细胞明显着色，定位于胞浆，在细胞核周围浓集，与内质网定位一致(如图3)，并且说明改单抗适用于组织的免疫学染色，结果证明该抗体能够作为免疫组化染色的检测制剂进行应用。

4、Calnexin单克隆抗体的免疫荧光染色显示：胞浆着色，细胞核周围浓集，与内质网定位一致(如图4)，结果证明该抗体能够作为免疫荧光的检测制剂进行应用。

5、Calnexin单克隆抗体亚型鉴定为IgG2b。

三、Calnexin单克隆抗体可变区序列的鉴定

(一)实验材料

Expression Module(recombinant phage antibody system)购自PHARMACIA BIOTECH，M-MulV逆转录酶、Taq DNA聚合酶购自Takara。

(二)实验步骤

参见PHARMACIA BIOTECH(27-9401-01)试剂盒说明书

Calnexin单克隆抗体杂交瘤细胞的培养→提取总RNA→反转录成cDNA→用轻链、重链引物(试剂盒提供)扩增轻链DNA和重链DNA。

1、Calnexin杂交瘤细胞总RNA的制备：1×10⁷的Calnexin杂交瘤细胞加入TRIZOL 1ml充分裂解。加入0.2ml氯仿，充分混匀15秒，4℃、12000×g离心15分钟。取上层水相置于新管中，加入0.5ml异丙醇静置10分钟，12000×g、4℃离心10分钟。弃上清，以75％乙醇洗涤、涡旋，7500×g、4℃离心5分钟，洗涤2次。加入20μl无RNA酶水，取4.5μl用于检测RNA完整性，2μl用于RNA的浓度和纯度测定，其余-70℃保存，用于cDNA第一链合成。

2、RNA 65℃加热10分钟，冰上迅速冷却，2分钟内开始第一链cDNA反应。

mRNA 5μl，无RNA酶水15μl，Primed First-Strand Mix 11μl，DTT Slution 1μl，M-MulV逆转录酶1μl，总体积33μl，37℃孵育1小时。

3、轻链PGR：First-strand reaction 33μl，Light Primer Mix 2μl，无菌水64μl，总体积99μl。重链PGR：First-strand reaction 33μl，Heavy Primer1 2μl，HeavyPrimer2 2μl，无菌水62μl，总体积99μl。95℃加热5分钟。向每个反应中各加入TaqDNA聚合酶2μl，混匀，在0.2ml薄壁管中各分成2管，启动程序1(30个循环：94℃1分钟；55℃2分钟；72℃2分钟)。电泳割胶纯化，目的条带转移至微旋柱内，置于1.5mlEppendorf管中，740×g离心2分钟，洗脱物即为纯化的轻链和重链DNA，送奥科公司测序。

(三)实验结果

1、编码Calnexin单抗的轻链可变区DNA序列333bp，序列为：

GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACCGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGA。

2、编码Calnexin单抗的重链可变区DNA序列347bp，序列为：

AGGTGCAAGCTGCAGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTGTTGGATTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATATATTAGTAGCGGTGGTGATTACACCTACTATCCAGACACTATGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACGCCCTGTATTTGCAAATGAAGAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAAAAACTGGGACCGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCCTCAA。

SEQUENCE LISTING

<110>天津医科大学附属肿瘤医院

<120>抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用

<130>小鼠

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>333

<212>DNA

<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221>轻链可变区

<222>(1)..(333)

<223>

<400>1

gacattgagc tcacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc    60

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcaccggaac    120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct    180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat    240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt    300

tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gga                                 333

<221>重链可变区

<222>(1)..(347)

<223>

<400>1

aggtgcaagc tgcaggagtc agggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc    60

tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt agctatgaca tgtgttggat tcgccagact    120

ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcatat attagtagcg gtggtgatta cacctactat    180

ccagacacta tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cgccctgtat    240

ttgcaaatga agagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagaaaaact    300

gggaccgctt actggggcca agggaccacg gtcaccgtct ccctcaa                  347

Claims (6)

1.一种抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，其特征是：该抗体特异性识别人Calnexin蛋白，并与Calnexin蛋白具有特异性结合能力，其是由保藏号为：CGMCCNo.3240的杂交瘤细胞产生。

2.如权利要求1所述抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，其特征是所述Calnexin单克隆抗体的轻链可变区DNA序列如图5所示，所述Calnexin单克隆抗体的重链可变区DNA序列如图6所示；

3.如权利要求1所述抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，其特征是Calnexin单克隆抗体亚型鉴定为IgG2b。

4.如权利要求1所述抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征是：

采用乳腺癌细胞MCF-7免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，利用MCF-7细胞进行筛选，然后将得到的阳性克隆构建单克隆抗体库；源自该抗体库的抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，采用免疫沉淀和质谱的方法鉴定其抗原为Calnexin；将此单抗的杂交瘤细胞提取RNA，反转录成cDNA，利用抗体可变区引物进行扩增，得到PCR产物测序鉴定。

5.一种杂交瘤细胞，其特征是：所述杂交瘤细胞产生抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体，该杂交瘤细胞的保藏号：CGMCC No.3240。

6.如权利要求1所述抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体在制备医学检测制剂中的应用：

a.抗人Calnexin蛋白的单克隆抗体在制备免疫组化检测制剂中的应用；

b.所述抗体在制备免疫荧光检测制剂中的应用；

c.所述抗体在制备免疫印迹反应检测制剂中的应用；

d.所述抗体在制备免疫沉淀检测制剂中的应用。

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