CN101649316A - 一种食品中致病菌pcr核酸模板快速提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，该方法首先将待检测样本置入快速生长液中，快速培养食品中的致病菌，然后用裸磁粒子吸附致病菌，通过煮沸增菌，经磁分离架分离后用快速洗涤液洗涤后，加入高效裂解液，裂解被吸附的菌液，经煮沸、离心后取上清做PCR检测的核酸模板。该方法提取过程安全、简便、省时，与免疫磁珠提取模板的技术路线不同，并且只进行一次6.5h共有模板的提取，便可以根据PCR引物的特异性，同时进行所有致病菌种的检测。解决了按照[SN/T1870－2007]方法提取模板，无法满足现代食品工业生产当天就必须出售的问题。

Description

一种食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。涉及一种食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，该方法适用于以PCR法、定量PCR法、实时PCR法检测，快速提取食品中致病菌。

背景技术

俗话说民以食为天，可见食品与人类生存和健康密切相关。为保证食品的安全卫生、防止有毒有害物质通过食品对人体造成危害是至关重要的。

食品在生产、加工、贮存、运输和销售等各个环节都有受到环境中各种因素的影响和污染的可能，微生物污染尤其常见。

食品中致病菌主要是指以食物为载体，导致人类发生疾病的一大类细菌。(吴清平，范宏英，张菊梅.食源性致病菌免疫及分子检测新技术研究进展[J].食品科学，2005，26(11)：269-273.)包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella spp)、志贺氏菌(Shigellaspp)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes)、肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7(Enterohemorrhagic escherichia coli O157：H7)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio algino lyticus)(食品中致病菌检测方法实时PCR法》行业标准[SN/T 1870-2007])。食品由于受致病菌污染，造成各种食源性疾病，甚至死亡。

在我国食品行业，相关的致病菌检测的传统检验方法有：培养基制备、细菌培养、菌落计数和生化指标的检测。这些方法的优点是：直观且能够得到食品样品中细菌数量和特性等方面的定性及定量结果。不足之处是：耗时费力，获得结果通常需要几天的时间，并且要求所要检测的细菌增殖为可见菌落。而且增加了实验室的工作量。(焦振泉，郭云昌，裴晓燕，刘秀梅.食源性致病菌检测方法研究进展-I.传统检测方法[M].中国食品卫生杂志，2007，19(1)：58-61.)

近年来，DNA杂交、PCR、定量PCR、实时PCR以及基因芯片法(焦振泉，郭云昌，裴晓燕，刘秀梅.食源性致病菌检测方法研究进展-II.分子生物学检测方法[M].中国食品卫生杂志，2007，19(2)：153-157.)等分子生物学的检测方法，克服了传统检测方法的不足，并且具有各自的优势，其中以实时PCR更为便捷和快速。PCR、定量PCR、实时PCR比DNA杂交需要更少的样本量，灵敏度更高；基因芯片法虽然可以同时鉴定多种细菌的混合污染，但是背景干扰比较大、使用两种染料与DNA标记时效果不同、从不同细菌中分离出来的RNA的完整性不同、实验费用高以及结果分析方法的不一致；实时PCR比PCR、定量PCR，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高的优势。

目前，也有使用免疫磁珠提取某种特定细菌的方法再通过实时PCR法结合检测食品中致病菌，虽然此方法特异性高，检测速度快。但是成本较高，通用性差，而且只能针对一种特定菌种进行富集。

我国质量监督检验总局于2007年批准了《食品中致病菌检测方法实时PCR法》行业标准[SN/T 1870-2007]。实时PCR法由于具有高灵敏度，操作简便易学，结果可靠的优点，解决了传统方法费时耗力以及其他分子生物学检测方法易污染，背景干扰大等无法避免的缺点，现已被食品行业广泛使用。

按照[SN/T 1870-2007]标准规定，模板提取步骤包括：样品制备、增菌培养和分离；模板DNA制备等必不可少两部分，其中：

样品制备、增菌培养和分离步骤：需要先称取样品1g加入125ml样品稀释瓶中，再加入9倍预热到45℃灭菌水(1∶10稀释)，37℃培养18h-22h。再移取培养18h-22h的悬液各10ml加入90ml增菌肉汤中，37℃培养18h-22h。此处37℃，18h-22h的两次培养过程不可逾越，也是限制食品工业当天的生产无法出售的重要原因。

模板DNA制备步骤：需将制备样品的肉汤取1ml加到1.5ml无菌离心管中，8000r/min离心5min，弃上清液。加入50μlDNA提取液，混匀后，沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清待检。

按照[SN/T 1870-2007]标准规定，从样品制备、增菌培养和分离到模板DNA制备需要24-49h，检测结果往往滞后，已不能满足现代食品工业生产当天就必须出售的要求。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种实用、有效的食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法。采用该方法可以解决[SN/T 1870-2007]提取食品中致病菌PCR核酸模板的操作复杂，培养、增菌时间长且需分离的问题，本发明利用PCR技术，简便、快速提取食品中致病菌，能够满足现代食品工业生产当天就出售的要求。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，其特征在于，该方法首先将待检测样本置入快速生长液中，快速培养食品中的致病菌，然后用裸磁粒子吸附致病菌，通过煮沸增菌，经磁分离架分离后用快速洗涤液洗涤后，加入高效裂解液，裂解被吸附的菌液，经煮沸、离心后取上清做PCR检测的核酸模板。

上述方法具体的步骤是：

1)取待测样本适量，加入适量无菌水，混匀，取其中混匀液20ml，加入100ml的快速生长液中，在37℃条件下，100r/min振荡培养4h，得到培养液；

2)取培养液1ml，加入规格为15ml的无菌离心管中，加无菌生理盐水至10ml，混匀，得到混合溶液；

3)将步骤2)得到的混合溶液中加入100μl的裸磁粒子液，混匀，37℃水浴60min，中间混摇3次，得到混合液；

4)将步骤3)得到的混合液使用磁分离架分离5min，弃上清，加入洗涤液2ml洗3次，每次洗涤时间＞5min，保留沉淀；

5)将步骤4)得到的沉淀中加入裂解液100μl，煮沸20min，离心，取上清做PCR核酸模板。

上述快速生长液的配方为：蛋白胨25g，氯化镁40g牛肉膏8g，磷酸氢二钠10g，氯化钠20g，柠檬酸钠5g，磷酸氢钾3.5g，乳糖5g，葡萄糖1.5g，甘露醇2g，柠檬酸钠5g，去氧胆酸钠0.5g，牛肉膏0.8g，蒸馏水定容1000ml，调pH值至7.2，于121℃下高压灭菌20min，保存于4℃冰箱中备用。

上述裸磁粒子液的主要成份为三氯化铁和二氯化铁，以8∶2比例混合溶于适量蒸馏水中，加入适量的NaOH溶液，使三氯化铁和二氯化铁在蒸馏水中反应生成黑棕色产物，用磁力架回收裸磁粒子，用蒸馏水洗涤至中性备用。

上述高效裂解液的制作方法是，在每10ml超纯水中加入3％的三氯乙酸1ml、0.2％的TritonX-100  450μl、2mol/L的KH₂PO₄ 900μl、0.01mol的甘氨酸80μl、10mg溶菌酶，pH调至7.5，将配制好的高效裂解液置于121℃下高压灭菌20min，置于4℃冰箱中备用。

上述快速洗涤液的配方为：NaCl：8.0g，KCl：0.2g，Na₂HPO₄：1.0g，KH₂PO₄：0.24g，用HCl调节pH值至7.8，加蒸馏水定容至1000ml。

采用本发明的用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，能够把[SN/T 1870-2007]中致病菌培养步骤的时间缩减至4h，增菌步骤时间也缩短为1h。加上水浴、样本处理时间等必需步骤，将食品中致病菌PCR核酸模板提取时间整体缩短至6.5h左右。如果配合使用实时荧光定量PCR仪，则可将全部检测时间缩短至8h左右。完全可以满足现代食品工业生产需要当天出售的要求，实现了技术性飞跃，可大规模推广。

本发明的方法与食品工业现行常用的行业标准[SN/T 1870-2007]提取方法相比较，按照后者提取方法，根据菌种不同，其模板提取时间需要24h～49h左右不等。同时使用本发明方法和国标法提取奶粉中的四种致病菌PCR核酸模板，并且通过实时荧光定量PCR进行验证，结果显示使用两种方法均可检出同一阳性样本。结果具有一致性、可靠性。

附图说明

图1、图2、图3、图4分别图示了几种品牌奶粉中待检测样本中所含的阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌的扩增曲线。

验证实验先按照[SN/T 1870-2007]中的提取模板方法提取一天后，再使用本发明的快速提取模板方法提取，将两种方法得到的奶粉中的核酸模板，同时放入TL988实时荧光定量PCR仪中检测，得出荧光分析结果。附图中“S”曲线即是待测样本中致病菌的扩增曲线。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本发明的用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，包括细菌快速培养、制备裸磁粒子，洗涤液，裂解液四部分。

本发明首先提供了一种细菌快速培养液，用于快速培养食品中致病菌的快速生长，成分为：蛋白胨25g，氯化镁40g 牛肉膏8g，磷酸氢二钠10g，氯化钠20g，柠檬酸钠5g，磷酸氢钾3.5g，乳糖5g，葡萄糖1.5g，甘露醇2g，柠檬酸钠5g，去氧胆酸钠0.5g，牛肉膏0.8g，调pH至7.2，蒸馏水定容1000ml，于121℃下高压灭菌20min，保存于4℃冰箱中备用。

本发明提供了一种自行研发的裸磁粒子，主要用于吸附食品中致病菌。其主要成份为三氯化铁和二氯化铁，以8∶2比例混合溶于适量蒸馏水中，并加入适量的NaOH溶液，使三氯化铁和二氯化铁在蒸馏水中反应生成黑棕色产物，用磁力架回收裸磁粒子，用蒸馏水洗涤至中性备用。

本发明提供了一种快速洗涤液。该快速洗涤液的配方为：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na₂HPO₄1.0g；KH₂PO₄0.24g；用HCl调节pH值至7.8，加蒸馏水定容至1000ml。将配制好的洗涤液放在121℃下高压灭菌20min，保存于4℃冰箱中备用。保存期为三个月左右，若底部有明显沉淀生成，需重新配制。

本发明提供了一种高效裂解液，该高效裂解液用于高效率裂解食品中致病菌，释放核酸。该高效裂解液为每10ml超纯水中含有3％浓度的三氯乙酸1ml和含量为0.2％的TritonX-100 450μl；2mol/L的KH₂PO₄ 900μl；0.01mol的甘氨酸80μl；10mg溶菌酶，pH值调至7.5。将配制好的高效裂解液置于121℃下高压灭菌20min，置于4℃冰箱中备用。保存期三个月左右，若底部有明显沉淀生成，需重新配制。此裂解液具有保持核酸的完整性的效果，具有对食品中革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌通用性。

本发明的裸磁粒子与通常提到的免疫磁珠法不同，两者区别在于，免疫磁珠表面结合了设计好的单克隆抗体，用于特异性吸附某一菌种。其前期抗体制作过程比裸磁粒子复杂，需要专业设计，以及特殊的仪器，因此造价也比裸磁粒子高出几倍。

使用裸磁粒子的技术原理在于：使用裸磁粒子富集所有菌体，培养后根据PCR引物的特异性检测出特定菌体。而使用免疫磁珠进行检测的技术原理在于：先针对待提取的菌种，设计特定抗体，使用免疫磁珠富集待测菌种，培养后检测。因此使用免疫磁珠法检测的方法又被称做磁珠分选法，也是目前文章中通常所指的磁珠法。而使用裸磁粒子提取致病菌模板，解决了免疫磁珠前期制作复杂，造价高，通用性差的问题。并且只进行一次6.5h共有模板的提取，便可以根据PCR引物的特异性，同时进行所有致病菌种的检测。

按照本发明方法得到的提取模板，可以逾越[SN/T 1870-2007]中两次必不可少的培养步骤，有效方便的对食品中致病菌进行6.5h的模板快速提取，可以在生产结束当天就完成一批食品的质量监控，解决了[SN/T1870-2007]标准中对食品质量控制滞后的问题。

以下是发明人给出的实施例，需要说明的是，这些实施例是一些较佳的例子，本发明不限于这些实施例。

实施例1：

本实施例以检测奶粉A中是否含有阪崎肠杆菌为例，同时使用本发明的提取方法和国标法提取奶粉样本中PCR模板，再使用实时荧光定量PCR仪验证两种方法提取模板的检测结果是否具有一致性。

A、采用本发明的用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，快速提取阪崎肠杆菌PCR模板步骤：

1)取样本奶粉10g，加入90ml无菌水，混匀。取其中混匀液20ml，加入到100ml细菌快速培养液中，37℃条件下，100r/min振荡培养4h，得到培养液；

2)取培养液1ml(共取四份，其他三份做以下三种菌的模板待检)，加入15ml的无菌离心管中，再加入无菌生理盐水至10ml，混匀，得到混合溶液；

3)将步骤2)得到的混合溶液中加入100μl的裸磁粒子液，混匀，37℃水浴60min，中间混摇3次，得到混合液；

4)将步骤3)得到的混合液使用磁分离架分离5min，弃上清，加入洗涤液2ml洗3次(每次洗涤时间＞5min)；保留沉淀；

5)将步骤4)得到的沉淀中加入裂解液100μl，煮沸20min，离心，取上清做PCR核酸模板。同时做阴性及阳性对照管。

按照以上步骤操作，提取PCR核酸模板时间总耗费6小时35分钟。

B、按进出口检验检疫行业标准[SN1632.3-2005]规定的方法提取阪崎肠杆菌模板步骤为：

1)称取样品1g加入125ml样品稀释瓶中，再加入9倍预热到45℃灭菌水(1∶10稀释)，37℃培养18h-22h。再移取培养18h-22h的悬液各10ml加入90ml增菌肉汤中，37℃再培养18h-22h。

2)将制备样品的肉汤取1ml加到1.5ml无菌离心管中，8000r/min离心5min，弃上清液。加入50μlDNA提取液，混匀后，沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清待检。

按照以上步骤操作，提取模板时间总耗费44小时20分钟。

实施例2：

本实施例以检测奶粉B中是否含有金黄色葡萄球菌为例，同时使用本发明所述的快速提取方法和国标法提取奶粉样本中PCR模板，再使用实时荧光定量PCR仪验证两种方法提取模板的检测结果是否具有一致性。

A、采用本发明的快速提取PCR模板步骤：取实施例1中已制备好PCR核酸模板1ml。

B、以国标法[GB/T 4789.10-2003]提取金黄色葡萄球菌模板步骤：

1)按无菌操作取检样25g，加入225ml灭菌生理盐水，吸取5ml上述悬液，接种于7.5％氯化钠肉汤50ml的培养基内，37℃培养24h，转种血平板和Baird-Parker平板，37℃培养24h。

2)参考[SN1632.3-2005]提取阪崎肠杆菌模板步骤2)。按照以上步骤操作，提取模板时间总耗费48小时40分钟。

实施例3：

本实施例以检测奶粉C中是否含有志贺氏菌为例，同时使用本发明所述的快速提取方法和国标法提取奶粉样本中PCR模板，再使用实时荧光定量PCR仪验证两种方法提取模板的检测结果是否具有一致性。

A、采用本发明的快速提取PCR模板步骤：取实施例1中已制备好PCR核酸模板1ml。

B、国标法[GB/T 4789.5-2003]提取志贺氏菌模板步骤：

1)以无菌操作取检样25ml，加入装有225ml GN增菌液的广口瓶内，37℃培养6h-8h。取增菌液划线接种于HE琼脂平板及麦康凯琼脂平板，37℃培养18h-24h。

2)参考国标法提取阪崎肠杆菌模板步骤2。按照以上步骤操作，提取模板时间总耗费24小时25分钟。

实施例4：

本实施例以检测奶粉D中是否含有沙门氏菌为例，同时使用本发明所述快速提取方法和国标法提取奶粉样本中PCR模板，再使用实时荧光定量PCR仪验证两种方法提取模板的检测结果是否具有一致性。

A)采用本发明的快速提取PCR模板步骤：取实施例1中已制备好PCR核酸模板1ml。。

B)按照国标法[GB/T 4789.4-2003]提取沙门氏菌模板步骤：

1)按无菌操作取检样25ml，加入装有225ml缓冲蛋白胨水的500ml广口瓶内，吸取10ml上述悬液，接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液内，42℃培养18h-24h，37℃培养18h-24h。

2)参考国标法提取阪崎肠杆菌模板步骤2)。按照以上步骤操作，提取模板时间总耗费42小时30分钟。

使用TL988实时荧光定量PCR对以上方法所提模板进行检测：反应体系、反应步骤、质控标准、结果判定均参照[SN/T 1870-2007]中实时PCR部分。结果分析：

Ct值是实时荧光定量PCR的一个重要概念，C表示循环数，T表示阈值。它的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在40个循环数内，如果样本曲线均呈显著“S”型，且Ct值小于35，则判定为阳性样本，说明食品中有此项被检测的致病菌。如果样本呈直线，Ct值等于0，则判定为阴性样本，说明食品中没有此项被检测的致病菌。

如果同时使用本发明方法和国标法提取模板，经过实时荧光定量PCR检验，可以得到具有一致性的结果，证明本发明的用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法可行，且优于[SN/T 1807-2007]中提到的致病菌模板提取方法。

上述实施例选择阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌四种菌作为食品中致病菌示例，其中，选择阪崎肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌作为革兰氏阴性菌的代表，选择金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌的代表。证明了本发明方法的试剂对于食品中其他致病菌也具有通用性。

1、阪崎肠杆菌：

如图1所示，奶粉A中阪崎肠杆菌扩增曲线：样本曲线均呈显著“S”型，指数期呈明显增长。

其中，B8，B9孔位放置空白对照，B10，B11孔位放置阴性对照，Ct值均为0，图上显示为直线，均无扩增；

B12孔位放置阳性对照，Ct值为24.28；

B13，B14，B15孔位放置样本，均使用本发明的方法提取奶粉A中的阪崎肠杆菌模板，Ct值分别为24.32，25.65，24.26；检出阳性。

B16，B17孔位放置样本，均使用进出口检验检疫行业标准[SN1632.3-2005]提取奶粉A中的阪崎肠杆菌模板，Ct值分别为22.19，24.01；检出阳性。

由此可见，使用本发明方法提取样本模板与按照[SN1632.3-2005]提取模板，均可检出样本阪崎肠杆菌阳性。因此使用本发明的用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法所提取的样本模板，结果可靠。

2、金黄色葡萄球菌：

如图2所示，奶粉B中金黄色葡萄球菌扩增曲线：样本曲线均呈显著“S”型，指数期呈明显增长。

其中A2孔位放置空白对照，A3，A4孔位放置阴性对照，Ct值均为0，图上显示为直线，均无扩增；

A5，A6孔位放置阳性对照，Ct值为17.19，17.24；

A9，A10孔位放置样本，均使用本发明方法提取奶粉B中的金黄色葡萄球菌模板，Ct值分别为17.48，18.78；

A7，A8孔位放置样本，均使用国标法[GB/T 4789.10-2003]提取奶粉B中的金黄色葡萄球菌模板，Ct值分别为17.32，17.42；

由此可见，使用本发明的方法提取样本模板与国标法提取方法，均检出样本金黄色葡萄球菌阳性。因此使用本发明的方法提取样本模板，结果可靠。

3、志贺氏菌：

如图3所示，奶粉C中志贺氏菌扩增曲线：样本曲线均呈显著“S”型，指数期呈明显增长。

其中，A2，A3孔位放置空白对照，A4，A5孔位放置阴性对照，Ct值均为0，图上显示为直线，均无扩增；

A6，A7孔位放置阳性对照，Ct值为14.70，16.09；

A10，A11孔位放置样本，均使用本发明的方法提取奶粉C中的志贺氏菌模板，Ct值分别为16.52，16.55；

A8，A9孔位放置样本，均使用国标法[GB/T 4789.5-2003]提取奶粉C中的志贺氏菌模板，Ct值分别为16.35，16.47；

由此可见，使用本发明方法提取样本模板与国标法提取方法，均检出样本志贺氏菌阳性，因此使用本发明方法提取样本模板，结果可靠。

4、沙门氏菌：

如图4所示，奶粉D中沙门氏菌扩增曲线：样本曲线均呈显著“S”型，指数期呈明显增长。

其中A2孔位放置空白对照，A3孔位放置阴性对照，Ct值均为0，图上显示为直线，均无扩增；

A6孔位放置阳性对照，Ct值为13.7；A4，A5孔位放置样本，均使用本发明方法提取奶粉D中的沙门氏菌模板，Ct值分别为14.46，14.53；

A7，A8孔位放置样本，均使用国标法[GB/T 4789.4-2003]提取奶粉D中的沙门氏菌模板，Ct值为14.05。

由此可见，使用本发明方法提取样本模板与国标法提取方法，均检出样本沙门氏菌阳性，因此本发明方法提取PCR核酸模板，结果可靠。

通过以上验证，证明了采用本发明的方法对于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取是可行的，且具有通用性和普遍性意义。

综上所述，本发明的用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法与[SN/T 1870-2007]标准中关于提取食品中致病菌PCR核酸模板方法相比，具有以下优点：

1.使用自行研制的细菌快速生长液，具有通用性，可同时增菌所有致病菌。将致病菌培养时间缩短至4h。

2.只进行一次6.5h共有模板的提取，便可以根据PCR引物的特异性，同时进行所有致病菌种的检测。

3.将食品中致病菌PCR核酸模板的提取中增菌步骤时间大幅缩减，只需1h，即可增菌至所需检测量。

4.使用自行研究的高效裸磁粒子，吸附食品中致病菌；配合使用自行研究的高效裂解液，提高了用于PCR检测的初始模板量。

Claims (6)

1、一种用于食品中致病菌PCR核酸模板快速提取方法，其特征在于，该方法首先将待检测样本置入快速生长液中，快速培养食品中的致病菌，然后用裸磁粒子吸附致病菌，通过煮沸增菌，经磁分离架分离后用快速洗涤液洗涤后，加入高效裂解液，裂解被吸附的菌液，经煮沸、离心后取上清做PCR检测的核酸模板。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法具体的步骤是：

1)取待测样本适量，加入适量无菌水，混匀，取其中混匀液20ml，加入100ml的快速生长液中，在37℃条件下，100r/min振荡培养4h，得到培养液；

2)取培养液1ml，加入规格为15ml的无菌离心管中，加无菌生理盐水至10ml，混匀，得到混合溶液；

3)将步骤2)得到的混合溶液中加入100μl的裸磁粒子液，混匀，37℃水浴60min，中间混摇3次，得到混合液；

4)将步骤3)得到的混合液使用磁分离架分离5min，弃上清，加入洗涤液2ml洗3次，每次洗涤时间＞5min，保留沉淀；

5)将步骤4)得到的沉淀中加入裂解液100μl，煮沸20min，离心，取上清做PCR核酸模板。

3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的快速生长液的配方为：蛋白胨25g，氯化镁40g，牛肉膏8g，磷酸氢二钠10g，氯化钠20g，柠檬酸钠5g，磷酸氢钾3.5g，乳糖5g，葡萄糖1.5g，甘露醇2g，柠檬酸钠5g，去氧胆酸钠0.5g，牛肉膏0.8g，蒸馏水定容1000ml，调pH至7.2，于121℃下高压灭菌20min，保存于4℃冰箱中备用。

4、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的裸磁粒子液的主要成份为三氯化铁和二氯化铁，以8∶2比例混合溶于适量蒸馏水中，加入适量的NaOH溶液，使三氯化铁和二氯化铁在蒸馏水中反应生成黑棕色产物，用磁力架回收裸磁粒子，用蒸馏水洗涤至中性备用。

5、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高效裂解液为每10ml超纯水中含有3％浓度的三氯乙酸1ml、含量为0.2％的TritonX-100450μl、2mol/L的KH₂PO₄ 900μl、0.01mol的甘氨酸80μl、10mg溶菌酶，pH为7.5。

6、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的快速洗涤液的配方为：NaCl：8.0g，KCl：0.2g，Na₂HPO₄：1.0g，KH₂PO₄：0.24g，用HCl调节pH值至7.8，加蒸馏水定容至1000ml。

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