CN101636494A

CN101636494A - 具有促进核内复制活性的基因

Info

Publication number: CN101636494A
Application number: CN200780052353A
Authority: CN
Inventors: 吉积毅; 松井南; 市川尚齐; 中泽美纪; 川岛美香; 高桥直纪; 赤木千佳; 原博子; 津本裕子
Original assignee: Independent Administrative Institution Physical Chemistry Institute
Current assignee: Independent Administrative Institution Physical Chemistry Institute; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2007-03-28
Filing date: 2007-09-27
Publication date: 2010-01-27
Also published as: EP2348109A1; US8461414B2; JPWO2008120410A1; EP2128251A4; EP2128251A1; WO2008120410A1; BRPI0721515A2; US20100199387A1

Abstract

本发明意图鉴定调节植物中核内复制的基因，以及将所述基因用于育种以增加作物尺寸。本发明提供了编码拟南芥来源的蛋白的基因，所述蛋白具有如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列，其具有促进核内复制的活性，引入该基因由此增加了所述植物中细胞中核DNA含量的转基因植物，以及使用该基因增加整个植物体或其部分的尺寸的方法。

Description

具有促进核内复制活性的基因

技术领域

本发明涉及植物中具有促进核内复制活性的基因，以及引入该基因的转基因植物。

背景技术

核内复制是细胞周期的一种，其中不需要细胞分裂就发生核染色体DNA复制。当核内复制重复时，核DNA成分(即核相)从基础的2C加倍，产生具有加倍的4C或8C核DNA成分的细胞。已知细胞作为对核DNA成分的增加的反应而生长。由于生物体的大小基于构成个体的细胞的数量和大小来确定，认为核内复制是决定生物体大小的机制。

尽管在一些昆虫和哺乳动物组织中观察到核内复制，该特征是植物器官所特有的，并且其可用于区分植物与其他生物体的发育。在植物中，许多器官由不同倍性水平的细胞混合物组成，该特征在下胚轴延长、叶伸展和胚乳发育中尤为显著。这些多倍体细胞通常在多种多细胞生物体中观察到，例如昆虫、哺乳动物和植物(非专利文献1和2)。多倍体细胞通常见于各种发育组织中，与发育相关。因此，认为多倍性是分化的标记(非专利文献3)。

苗的下胚轴延长是由拟南芥(Arabidopsis thaliana)核内复制引起的典型尺寸增加。光照生长苗的细胞含有8C(C是一套单倍染色体)核DNA，而黑暗生长的苗的细胞含有高达16C的核DNA(非专利文献4)。同样已知下胚轴中的多倍性水平受植物激素的控制(非专利文献5)。组成型三重应答1(ctrl)是乙烯信号转导突变体，其中乙烯信号被组成性激活，在不需要外源性乙烯的情况下引起三重应答(Kieber，J.J.，Rothenberg，M.，Roman，G.，Feldmann，K.A.，和Ecker，J.R.，1993，CTR1，a negative regulator of the ethylene response pathway inArabidopsis，encodes a member of the raf family of protein kinases，Cell72，427-441)，ctrl将黑暗生长的苗的下胚轴多倍性水平增加至32C(非专利文献6)。这表明乙烯对下胚轴细胞中的核内复制起正调节作用。

核内复制同样与植物器官的发育有关。毛状体由含有最高达32C的核的单个细胞组成(非专利文献7)。核内复制也在胚乳中观察到，已有一些报道称细胞周期相关基因与胚乳扩张有关(非专利文献8和9)。

因此，核内复制的调节在植物发育和分化中具有重要作用。

迄今为止，已知细胞周期相关的因子控制核内复制，一个代表性的例子是细胞周期蛋白。例如，拟南芥属(Arabidopsis)中，D型细胞周期蛋白基因CYCD3；1在分生组织和发育中的叶特异性表达。当CYCD3；1过表达时，转基因植物的多倍性水平下降，细胞尺寸变小(非专利文献10)。这表明CYCD3；1通过抑制植物组织中的核内复制与细胞增殖有关。同样已报道拟南芥A型细胞周期蛋白基因CYCA2；1在多种细胞中表达，例如保卫细胞(guard cell)(其中基本上无核内复制发生(非专利文献11和12))。当同为A型细胞周期蛋白基因的烟草(Nicotiana tabacum)CYCA3；2在拟南芥属中过表达时，多种组织中的多倍性水平下降(非专利文献13)。同样已报道拟南芥CYCA2；3功能的丧失增加了成熟真叶中的多倍性(非专利文献14)。具体而言，因此A型细胞周期蛋白在调节植物中核内复制方面具有重要作用。

尽管已有一些关于核内复制的研究报告，如上所述，植物中核内复制的主要机制尚未阐明。因此，所述机制的阐明有助于理解植物大小决定机制，从而实现各方面的应用。

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发明内容

因此，本发明的一个目的是鉴定调节植物中核内复制的基因，以及应用该基因进行目标在于作物尺寸增加的育种。

本发明人们进行了集中的研究，以达到上述目的。他们通过流式细胞分析从拟南芥活化标记系筛选了细胞核DNA成分增加的突变体，并分离了一些显性地具有该表型的突变体。在这些突变体中，发现在黑暗生长和光照生长的苗中DNA含量增加。因此，他们将这些突变体指定为显示多倍性水平增加的1-1D(ilp1-1D)。目前，已发现6个突变体系(即ilp1-1D、2-D、3-D、4-D、5-D和7-D)，其中鉴定了引发的基因(causative gene)。在这些突变体系中，随着DNA含量的增加，同样观察到细胞尺寸的增加。下文以ilp1-1D作为分析的例子进行描述。引发的基因(即ILP1基因)通过质粒拯救分离，分析了其结构和功能。结果证实ILP1基因的过表达会导致子叶扩张和苗的延长，ILP1基因编码新的核蛋白，其与哺乳动物GC结合因子(GCF)的C末端区域同源，所述核蛋白作为体内转录抑制物起作用，并且ILP1基因会抑制细胞周期蛋白A2在拟南芥和小鼠中的表达。细胞周期蛋白A2加速了DNA复制后的细胞分裂，因此认为ILP1蛋白抑制了细胞周期蛋白A2基因的表达，从而加速了核内复制，核DNA含量增加。本发明基于该发现得以完成。

具体而言，本发明包括下列发明。

(1)下列(a)至(c)的基因：

(a)一种基因，其包括由如SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11所示核苷酸序列组成的DNA；

(b)一种基因，其包括在严格条件下与由这样的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA，所述核苷酸序列与由如SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11所示核苷酸序列组成的DNA互补，并且所述基因编码具有促进核内复制活性的蛋白；或

(c)一种基因，其包括由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11所示核苷酸序列具有80％或更高同源性的核苷酸序列组成的DNA，并且所述基因编码具有促进核内复制活性的蛋白。

(2)编码下列(d)至(f)的蛋白的基因：

(d)由如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(e)由这样的氨基酸序列组成的蛋白，所述氨基酸序列通过缺失、取代或添加一个或几个氨基酸来源自如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列，并且所述蛋白具有促进核内复制的活性；或

(f)由这样的氨基酸序列组成的蛋白，所述氨基酸序列与SEQID NO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性，并且所述蛋白具有促进核内复制的活性。

(3)下列(d)至(f)的蛋白：

(4)含有根据(1)或(2)的基因的重组载体。

(5)转基因植物，其植物细胞中核DNA含量增加，所述转基因植物中引入了根据(1)或(2)的基因或根据(4)的重组载体。

(6)根据(5)的植物细胞中核DNA含量增加的转基因植物，其中所述植物是植物体、植物器官、植物组织或培养的植物细胞。

(7)一种产生植物细胞中核DNA含量增加的转基因植物的方法，包括将根据(1)或(2)的基因或根据(4)的重组载体引入植物细胞中，以及从所述植物细胞繁殖植物体。

(8)增加整个植物体或其部分的尺寸的方法，其通过在植物体内过表达根据(1)或(2)的基因。

附图简述

图1A显示了野生型(Col-0)和ctrl-1的细胞倍性相对比例。在野生型(Col-0)和ctrl-1突变体中计数了大约5,000个核。

图1B显示了野生型(Col-0)、ctrl-1和Col-0与ctrl-1以3∶7比例混合的混合物中黑暗生长的苗的8C/32C和16C/32C比例。黑色条表示用于突变体筛选的类别。每个倍性测量使用至少20株苗，重复3次测量。误差条表示标准偏差。

图2A显示7天龄黑暗生长的苗的下胚轴细胞倍性水平柱状图。左栏：野生型；右栏：纯合的ilp1-1D；X轴：核倍性；Y轴：细胞数。野生型和ilp1-1D大约计数了5,000个核。

图2B显示黑暗和光照生长野生型和ilp1-1D的每个细胞倍性的相对比例。使用至少20株苗进行倍性分析，分析重复3次。(Hyp.D)：黑暗生长苗的下胚轴细胞；(Hyp.WL)：光照生长苗的下胚轴细胞；和(Cot.WL)：光照生长苗的子叶细胞。野生型和ilp1-1D大约计数了3,000至5,000个核。

图2C显示野生型苗下胚轴较低部分的核的DAPI染色。

图2D显示ilp1-1D下胚轴较低部分的核的DAPI染色。

图2E显示7天龄黑暗生长的野生型苗(左侧2株苗)和ilp1-1D苗(右侧2株苗)的形态学。白色箭头表示下胚轴和根的交点。

图2F显示7天龄黑暗生长的野生型苗和ilp1-1D苗的下胚轴和根的长度。

图2G显示7天龄黑暗生长的野生型苗和ilp1-1D苗的下胚轴直径。

图2H显示黑暗生长的野生型苗下胚轴的横切面。

图2I显示了黑暗生长的ilp1-1D下胚轴的横切面。

图2J显示了7天龄光照生长的野生型苗的子叶。

图2K显示了7天龄光照生长的ilp1-1D的子叶。

图2L显示了7天龄光照生长的野生型和ilp1-1D苗的子叶面积。

(在图2F、2G和2L中，使用至少20株苗进行测量。图2B、2F、2G和2L中的条表示标准偏差。图2C和2D中的条为10μm，图2E、2J和2K中为5mm，图2H和2I中为100μm。Student’s t-检验：图2F、2G和2L中对野生型*0.001＞p)。

图3A显示了ilp1-1D中的T-DNA插入位点。带条的三角形表示ilp1-1D中活化标记T-DNA插入位点。条上的黑线表示RB附近的CaMV 35S增强子的4个拷贝。小的白色和灰色三角分别表示ilp1-1(SALK 030650)和ilp1-2(SALK 135563)的T-DNA插入位点。短箭头表示图3B和6C中实时PCR的引物位置，长箭头表示图4B中半定量RT-PCR的引物位置。

图3B显示了表现AT5g08550(ILP1)在野生型(Col-0)、ilp1-1D和ILP1ox苗中表达的实时PCR分析。相对表达水平：相对于野生型苗，ILP1基因在ilp1-1D和AT5g08550(ILP1)过表达系(#2)(ILP1ox)中的表达水平。误差条表示标准偏差。

图3C显示黑暗生长的野生型(Col-0)和ILP1ox(#2)苗每个细胞倍性的相对比例。在野生型和ILP1ox苗中大约计数了5,000个核。

图3D显示了ILP1蛋白的氨基酸序列。虚线框表示基序1，实线框表示基序2。粗体表示推定的核定位信号(NLS)。

图3E表示ILP1基序1与其同系物的比对。ILP1基序1与其他蛋白的类似区域进行比对，拟南芥(AT5g09210)、人(AAK68721)、小鼠(AAK68725)和人GCF1(AAA35598)。ILP基序1与其同系物间的氨基酸序列同一性和同源性为：拟南芥38％和42％，人27％和48％，小鼠27％和48％，和人GCF128％和52％。

图3F显示ILP1基序2与其同系物的比对。ILP1基序2与其他蛋白的类似区域进行比对，拟南芥(AT5g09210)、人(AAK68721)、小鼠(AAK68725)、果蝇(Drosophila)(AAF54074)、人GCF1(AAA35598)和秀丽隐杆线虫(C.elegans)(NP492341)。所有的比对使用clustalW和Mac Boxshade软件进行。ILP基序2与其同系物间的氨基酸序列同一性和同源性为：拟南芥72％和77％，人27％和45％，小鼠27％和44％，果蝇28％和48％，人GCF 122％和43％，以及秀丽隐杆线虫(C.elegans)25％和44％。

(在图3E和F中，灰色字母表示至少在3个成员中功能性保守的氨基酸残基，而黑色背景的白字母表示所有成员中保守的氨基酸残基)。

图3G显示ILP1:GFP的定位。左栏显示ILP1:GFP的荧光。右栏显示DAPI染色的核图像。三角箭头表示核。试验重复3次。

图3H显示黑暗生长的ILP1-过表达的苗(ILP1ox)主根的延长。误差条表示标准偏差。

图3I显示黑暗生长的ILP1-过表达的苗(ILP1ox)下胚轴的直径。误差条表示标准偏差。

图3J显示光照生长的ILP4-过表达的苗(ILP4ox)的子叶面积。误差条表示标准偏差。

图4A显示黑暗生长的野生型、ilp1-1和ilp1-2苗的形态学。苗生长5天。从左到右的成对苗分别为野生型、ilp1-1、ilp1-1和ilp1-2的杂合子以及ilp1-2。使用ilp-1-1的同基因野生型同胞作为野生型苗。从ilp1-2野生型同胞获得同样的结果。白色三角箭头表示下胚轴和根的交点。

图4B显示用于ILP1表达的半定量RT-PCR。左侧的数目表示PCR循环数。使用ACT2作为对照。

图4C显示3、5和7天龄黑暗生长的野生型、ilp1-1和ilp1-2苗的下胚轴长度。

图4D显示了7天龄光照生长的苗。苗间比对与图4A中相同。白色箭头表示下胚轴和根的交点。

图4E显示了7天龄黑暗或光照生长的野生型、ilp1-1和ilp1-2苗的根的长度(D：黑暗；WL：白光)。

图4F显示了3、5、7天龄黑暗生长野生型、ilp1-1和ilp1-2纯合子的每个细胞倍性的相对比例。在野生型、ilp1-1和ilp1-2中大约计数了3,000个核。

(图4A和4D中显示的条为5mm。图4C和4E中的Student’s t-检验：相对于野生型*0.001＞p)。

图5A显示了用于体内转录测定的构建体。GAL4-ILP1N：GAL4DNA结合结构域(GAL4DB)与ILP1的N末端区域(氨基酸残基1-567)融合；GAL4-ILP1C：GAL4DB与ILP1的C末端区域(氨基酸残基474-908)融合；以及GAL4ILP1Full：GAL4DB与全长的ILP1融合。报告质粒在LUC报告基因的上游含有GAL4结合位点，以及0.2kb的胭脂氨酸合酶启动子(NOS-pro)。参考质粒用于监测通过由组成性CaMV35S启动子控制的GUS表达的转录效率。

图5B显示了烟叶中的体内转录测定。LUC/GUS比例：LUC表达(报告子)使用GUS表达(参照)标准化。误差条表示标准偏差。试验重复5次。

图6A显示了细胞周期相关基因的半定量RT-PCR分析。CYCD3；1、HISH4、CYCA2；1和CYCB1；2分别是G1-、S-、G2-和M-期特异性标记物。使用ACT2作为对照。左侧的数目表示PCR循环的次数。

图6B显示了CYCA2基因家族成员的实时PCR分析。CYCA2家族基因的表达水平用ACT2表达标准化。相对表达水平：每突变体系和ILP1-ox系中相对于野生型的CYCA2基因表达水平。RNA分离自7天龄的黑暗生长的ilp1-1D和ILP1ox的下胚轴(上栏)，以及3天龄的黑暗生长的ilp1-1和ilp1-2的下胚轴(下栏)。误差条表示标准偏差。试验重复4次。

图6C显示了野生型苗(Col-0)中ILP1的实时PCR分析。误差条表示标准偏差。数目表示相对于第8天的ILP1表达水平。试验重复4次。

图6D显示了在4个发育阶段中ilp1-1D和ilp1-2的第一叶中CYCA2基因家族的实时PCR分析。CYCA2基因家族的表达水平用ACT2表达水平标准化。相对表达水平：每突变体系中相对于野生型的CYCA2基因表达水平。在第12天后未检测到CYCA2；1在野生型和ilp1-1D中的表达。

图6E显示了在不同发育阶段中野生型、ilp1-1D和ilp1-2的第一叶的倍性分布型。各倍性分数按照野生型(开环)、ilp1-1D(开口方形)和ilp1-2(闭合三角)作图。使用ilp1-1D的同基因野生型同胞作为野生型苗。从ilp1-2的野生型同胞获得同样的结果。

图7A显示了用于在小鼠NIH3T3细胞中进行体内转录测试的构建体。pcDNA-ECFP-40含有增强的氰荧光蛋白(ECFP)基因，其用作对照，pcDNA-MusILP1-40含有小鼠ILP1cDNA(731aa，AAK68725)。报告子质粒由Ccna2启动子区(转录起始位点的-170至+100bp)与LUC基因融合而成。参考质粒用于通过β-半乳糖苷酶(LacZ)表达监测转录效率。(CMV pro：CMV启动子；BGH pA：牛生长激素多腺苷酸化位点)。

图7B显示了小鼠NIH3T3细胞中的体内转录测试。LUC活性用β-半乳糖苷酶活性标准化(相对LUC活性：相对于ECFP的小鼠ILP1的LUC活性)。在转染后24小时和48小时测定活性。误差条表示标准偏差。试验重复4次。

图8A显示CYCA2；1中的T-DNA插入位点。三角表示cyca2；1-1(SALK_121077)和cyca2；1-2(SALK_136750)的T-DNAs的插入位点。

图8B显示了CYCA2；1的半定量RT-PCR。左侧的数目表示PCR的循环数。

图8C显示黑暗和光照生长野生型、cyca2；1-1和cyca2；1-2纯合子的每个细胞倍性的相对比例。(Hyp.D)：黑暗生长苗的下胚轴细胞；(Hyp.WL)：光照生长苗的下胚轴细胞；和(Cot.WL)：光照生长苗的子叶细胞。使用cyca2；1-1同基因野生型同胞作为野生型苗。从cyca2；1-2野生型同胞获得同样的结果。在野生型、cyca2；1-1和cyca2；1-2中大约计数了3,000个核。误差条表示标准偏差。

图9显示了ilp2-D的表型。

图9A显示了光照生长ilp2-D子叶中的DNA含量。上部表示野生型，下部表示ilp2-D。

图9B显示了光照生长ilp2-D子叶的形态学。上部表示野生型，下部表示ilp2-D。ilp2-D比野生型具有更大的子叶。

图9C显示了光照生长ilp2-D的子叶面积。误差条表示标准偏差。

图9D显示了黑暗生长的ILP2-过表达苗(ILP2ox)的下胚轴中DNA的含量。误差条表示标准偏差。

图9E显示了黑暗生长的ILP2-过表达苗(ILP2ox)的下胚轴直径。误差条表示标准偏差。

图9F显示了黑暗生长的ilp2-D的下胚轴中DNA的含量。上部表示野生型，下部表示ilp2-D。

图9G显示了黑暗生长的ilp2-D的下胚轴中DNA的含量。误差条表示标准偏差。

图9H显示了7天龄黑暗生长的野生型和ilp2-D苗的形态学。

图9I显示了黑暗生长的ilp2-D的下胚轴长度和根长度。误差条表示标准偏差。ilp2-D的根与野生型相比延长。

图9J显示了黑暗生长的ilp2-D的下胚轴直径。误差条表示标准偏差。ilp2-D具有比野生型更厚的下胚轴。

图10显示了ilp3-D的表型。

图10A显示了黑暗生长的ilp3-D的下胚轴中DNA含量。左侧表示野生型，右侧表示ilp3-D。

图10B显示了光照生长ilp3-D的子叶形态学。左侧示野生型，右侧表示ilp3-D。ilp3-D具有比野生型更大的子叶。

图10C显示了光照生长ilp3-D的子叶面积。误差条表示标准偏差。

图10D显示了7天龄黑暗生长的野生型和ilp3-D苗的形态学。

图10E显示了黑暗生长的ilp3-D的下胚轴长度和根长度。误差条表示标准偏差。ilp3-D的根与野生型相比延长。

图10F显示了黑暗生长的ilp3-D的下胚轴直径。误差条表示标准偏差。Ilp3-D具有比野生型更厚的下胚轴。

图11显示了ILP4-过表达苗(ILP4ox)的表型。

图11A显示了黑暗生长的ILP4-过表达苗(ILP4ox)的下胚轴中DNA的含量。误差条表示标准偏差。

图11B显示了光照生长的ILP4-过表达苗(ILP4ox)的子叶面积。误差条表示标准偏差。

图12显示了ilp5-D的表型。

图12A显示了黑暗生长的ilp5-D的下胚轴中DNA含量。误差条表示标准偏差。

图12B显示了黑暗生长的ilp5-D的下胚轴表面(电子显微镜图像)。左侧示野生型，右侧表示ilp5-D。Ilp5-D具有比野生型更厚的下胚轴。

图12C显示了黑暗生长的ILP5-过表达的苗(ILP5ox)下胚轴的DNA含量。

图12D显示了7天龄黑暗生长的野生型和ILP5-过表达苗(ILP5ox)的形态学。

图12E显示了黑暗生长的ILP5-过表达的苗(ILP5ox)的下胚轴长度和根长度。误差条表示标准偏差。ILP5ox的根与野生型相比延长。

图12F显示了黑暗生长的ILP5-过表达的苗(ILP5ox)的下胚轴直径。误差条表示标准偏差。ILP5ox具有比野生型更厚的下胚轴。

图12G显示了光照生长的ILP5-过表达的苗(ILP5ox)的子叶形态学(ILP5ox)。左侧部分表示野生型，右侧部分表示ILP5ox。ILP5ox具有比野生型更大的子叶。

图12H显示了光照生长的ILP5-过表达的苗(ILP5ox)的子叶面积。误差条表示标准偏差。

图13显示了ilp7-D的表型。

图13A显示黑暗生长的ilp7-D的下胚轴DNA含量。误差条表示标准偏差。

图13B显示了ilp7-D营养叶中的毛状体分布。在照片中，上部表示通常的毛状体，下部表示由于分枝增加而变大的毛状体。与野生型相比，分枝数目增加(即毛状体变大)的ilp7-D数增加，误差条表示标准偏差。

图13C显示了黑暗生长的ILP7-过表达的苗(ILP7ox)的下胚轴DNA含量。误差条表示标准偏差。

图13D显示了7天龄黑暗生长的野生型和ILP7-过表达苗(ILP7ox)的形态学。

图13E显示了黑暗生长的ILP7-过表达的苗(ILP7ox)的下胚轴长度和根长度。误差条表示标准偏差。ILP7ox的根与野生型相比延长。

图13F显示了黑暗生长的ILP7-过表达的苗(ILP7ox)的下胚轴直径。误差条表示标准偏差。ILP7ox具有比野生型更厚的下胚轴。

图13G显示了光照生长的ILP7-过表达的苗(ILP7ox)的子叶形态学(ILP7ox)。左侧部分表示野生型，右侧部分表示ILP7ox。ILP7ox具有比野生型更大的子叶。

图13H显示了光照生长的ILP7-过表达的苗(ILP7ox)的子叶面积。误差条表示标准偏差。

本专利申请要求2007年3月28日提交的日本专利申请号2007-085500的优先权，包括其说明书中所公开的部分或所有内容。

下面详细描述本发明。

1.具有促进核内复制活性的基因

本发明的基因可通过经由活化标记和克隆引发基因制备具有活化的转录的植物基因的突变体而获得。

具体而言，感兴趣的基因可通过以下方式获得。

(i)将活化T-DNA标记载体经农杆菌属(Agrobacterium)随机插入拟南芥的基因组中，制备活化标记系。

(ii)从标记系收集的种子生长T₂植物，基于关于预定的表型性状的测试项(例如核DNA含量、下胚轴的厚度和长度、子叶大小和分枝数目及毛状体尺寸)记录表型性状，同时记录其数字图像。

(iii)通过质粒拯救从表型性状明显不同于野生型植物的T₂代突变体基因组中回收含T-DNA的DNA片段，测定其序列。

(iv)将所述DNA片段引入野生型拟南芥植物中检查是否可再现突变体的表型性状。

(v)克隆相应的cDNA。

本文中的术语“T₁代”是指从T₀代转基因植物的种子获得的植物代。“T₁代”是转基因植物的第一代集合体，其可使用相应于所述转基因植物耐受基因的选择试剂(例如抗生素或除草剂)选择。术语“T₂代”是指通过T₁代植物花自花授粉获得的植物代，其预先选作转基因植物。

作为活化T-DNA标记载体，可使用Walden和其他人(Hayashi，H.等，Science，258，1350-1353，1992)开发的pPCVICEn4HPT载体。该载体是二元载体，在RB邻近的CaMV 35S启动子中包含4个串联的增强子(-90至-440)。在包含pPCVICEn4HPT的农杆菌属GV3101(pMP90RK)中转化拟南芥。转化可通过花浸染方法进行，包括将拟南芥的陆生部分浸泡在农杆菌属悬液中进行共培养。

如果获得感兴趣的突变体，克隆能通过转录活化引起突变的基因。克隆优选通过质粒拯救进行。也可以使用尾部PCR、接头PCR等其他技术。具体而言，如下进行质粒拯救：纯化突变体DNA、用不同的限制性酶类处理DNA、通过Southern印迹证实条带大小以及搜索能产生包括插入的T-DNA的大约10-20kb的片段的限制性酶类。随后，DNA用限制性酶类处理，用苯酚和氯仿处理，进行乙醇沉淀，随后在连接酶的帮助下自身连接。将产物通过电穿孔引入感受态细胞(即大肠杆菌(E.coli)DH10B)，在含有氨苄西林的培养基中选择耐受菌株，通过常规技术选择质粒。测定所得质粒中的基因组DNA部分中的含T-DNA的边缘序列，确定T-DNA插入基因组的位置。基于所述位置，从拟南芥基因组数据库(http://www.mips.biochem.mpg.de)中搜索具有增强子序列6kb以内的翻译起始位点的基因。这些基因被用作候选基因以设计特异于所述引入该植物的基因或重组载体的引物，从拟南芥cDNA库中扩增cDNA，随后克隆。将cDNA片段通过农杆菌属引入植物，以检查是否可复制突变体的表型。

可通过常规技术例如Maxam-Gilbert的化学修饰技术或利用M 13噬菌体的双脱氧核苷酸链终止方法测定cDNA的核苷酸序列。一般而言，使用自动核苷酸测序仪(例如ABI373测序仪和310DNA测序仪，Applied Biosystems)进行测序。利用DNA分析软件例如DNASIS(Hitachi Software Engineering Co.，Ltd)分析测定的核苷酸序列，可发现获得DNA链中编码的蛋白编码区域。

通过上述技术，分离并鉴定了AT5g08550(Z010521)(注意括号内的说明为标记系的命名)是具有促进核内复制活性的基因，鉴定的株被指定为ilp 1-1D。ILP 1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ILP 1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。通过上述技术，分离了AT4g22890(Z009804)、AT5g14960(Z036220)、AT5g56790(Z032529)、AT4g15140(Z05228)和AT5g57410(Z058029)，鉴定为具有促进核内复制的活性的基因，这些基因被命名为ILP2、ILP3、ILP4、ILP5和ILP7。ILP2、ILP3、ILP4、ILP5和ILP7的核苷酸序列如SEQ ID NOs：3、5、7、9和11所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NOs：4、6、8、10和12所示。此后，将所述具有促进核内复制的活性的基因共同称为ILP基因。

本发明中使用的ILP基因可以是编码由这样的氨基酸序列组成的蛋白，所述氨基酸序列通过缺失、取代或添加一个或几个氨基酸来源自如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列，条件是该基因具有促进核内复制的活性。

可被缺失、取代或添加的氨基酸残基数指可通过制备突变体蛋白的常规方法、例如位点定向诱变缺失、取代或添加的数目。这种数目优选为1至几个。例如，可从如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列中缺失1至10，以及优选1至5个氨基酸残基；可向如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列添加1至10，以及优选1至5个氨基酸残基；以及如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列中的1至10，以及优选1至5个氨基酸残基被其他氨基酸残基所取代。本文中的术语“突变”主要指通过制备突变体蛋白的常规方法人工引入的突变。其可能类似于自然界已有的突变。

本发明的基因还包括编码由这样的氨基酸序列组成蛋白的基因，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性，并且所述蛋白具有促进核内复制的活性。上述提到的80％或更高的同源性优选指85％或更高的同源性、更优选90％或更高的同源性，以及最优选95％或更高的同源性。可通过FASTA或BLAST搜索确定序列同一性。

本文中使用的术语“核内复制”是指特别的细胞周期，其经历DNA复制而不引起细胞分裂。术语“促进核内复制活性”是指在植物细胞中加速该细胞周期和增加核DNA含量的活性。

当氨基酸“具有促进核内复制活性”时，所述活性基本上等价于具有如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列的蛋白的活性。

本发明的ILP基因可以是包括DNA的基因，所述DNA在严格条件下与下列DNA杂交，所述DNA包括与由如SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11所示的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列，并且所述基因编码具有促进核内复制活性的蛋白。

术语“严格条件”是指形成所谓特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。例如，在所述条件下，由高度同源核酸组成的DNA、即由具有与如SEQ ID NOs：1、3、5、7、9或11所示的核苷酸序列80％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高、最优选95％或更高同源性的核苷酸序列组成的DNA，的互补链杂交，但具有低于前述水平同源性的核酸的互补链则不杂交。更具体的条件如下：钠盐浓度15mM至750mM、优选50mM至750mM、更优选300mM至750mM，温度25℃至70℃、优选50℃至70℃、更优选55℃至65℃，甲酰胺浓度0％至50％、优选20％至50％、更优选35％至45％。此外在严格条件下，在杂交后过滤器通常用15至600mM、优选50至600mM、更优选300至600mM的钠盐浓度洗涤，温度为50℃至70℃、优选55℃至70℃、更优选60℃至65℃。

本领域技术人员可方便的获得该同源基因，参考例如MolecularCloning(Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，10 Skyline Drive Plainview，N.Y.，1989)。同样，上述序列的同源性可通过FASTA或BLAST搜索进行。

本发明中使用的ILP基因可通过PCR扩增作为核酸片段获得，其使用基于核苷酸序列信息设计的引物和cDNA库、基因组DNA库等中获得的核酸作为模板。同样，ILP基因可通过杂交作为核酸片段获得，其使用从文库中获得的核酸作为模板和为ILP基因的一部分的DNA片段作为探针。或者，可通过本领域已知的多种核酸合成技术、例如化学合成合成作为核酸片段的ILP基因。

通过本领域已知的技术，通过修饰编码蛋白的基因，氨基酸可被缺失、添加或取代。可通过常规技术例如Kunkel方法或缺口双链体方法，或其相关的技术向基因中引入突变。例如，可利用位点定向诱变通过诱变试剂盒、例如Mutant-K(Takara)或Mutant-G(Takara)引入突变，或通过Takara LA PCR体外诱变系列试剂盒(Takara)引入突变。

2.重组载体

可通过向适当的载体引入ILP基因(下文可指定为“靶基因”)构建用于植物转化的本发明的重组载体。例如，优选使用可通过农杆菌属将靶基因引入植物中的pBI、pPZP和pSMA载体。pBI二元载体或中间载体是尤其优选的，其实例包括pBI121、pBI101、pBI101.2和pBI101.3。二元载体是穿梭载体，可在大肠杆菌和农杆菌属中复制。当含有二元载体的农杆菌属感染植物时，载体上由LB序列和RB序列组成的边缘序列之间部分的DNA可整合入植物的核DNA。相反，pUC载体可用于直接将基因引入植物中。其实例包括pUC18、pUC19和pUC9载体。也可使用植物病毒载体，例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)、菜豆金色花叶病毒(bean goldenmosaic virus)(BGMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)(TMV)载体。

当使用二元载体质粒时，靶基因插入到二元载体的边缘序列(LB和RB序列)之间，该重组载体随后在大肠杆菌中扩增。随后，将扩增的重组载体通过电穿孔或其他方法引入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101、C58、LBA4404、EHA101、EHA105等或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)LBA1334，，上述提到的农杆菌属用于植物的遗传转导。

除上述方法外，也可使用三元结合方法(Nucleic Acids Research，12：8711，1984)制备含靶基因的农杆菌属以感染植物。具体而言，将包括感兴趣的基因的含质粒的大肠杆菌、含辅助质粒的大肠杆菌(例如pRK2013)和农杆菌属混合，在含有利福平和卡那霉素的培养基中培养。这样可获得感染植物的接合子农杆菌属。

为将靶基因插入载体，例如，可采用这样的方法，所述纯化的DNA用合适的限制性酶切割，随后插入到适当的载体DNA的限制性位点或多克隆位点，用于与载体连接。

靶基因需要以一定的方式整合到载体中，由此展示所述基因的功能。用于二元载体系统的启动子、增强子、终止子或复制起点(例如来源自Ti或Ri质粒的复制起点)、选择标记物基因等可在靶基因上游、内部或下游位点与载体连接。

“启动子”可不来自植物，只要DNA能在植物细胞中起作用，并能在特定植物组织中或特定生长期内诱导表达。其特定的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂氨酸合酶基因启动子(Pnos)、玉米泛素启动子、水稻肌动蛋白启动子和烟草PR蛋白启动子。

增强子的一个例子是用于改善靶基因表达效率的增强子区域，其包括CaMV 35S启动子的上游序列。

可使用任意终止子，只要其可终止由启动子转录的基因转录。其实例包括胭脂氨酸合酶(NOS)基因终止子、章鱼氨酸合酶(OCS)基因终止子和CaMV 35S RNA基因终止子。

选择标记基因的实例包括氨苄西林抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、bialaphos抗性基因和二氢叶酸还原酶基因。

选择标记基因和靶基因可与同一质粒连接，制备如上所述的重组载体。或者，可独立于通过连接靶基因与质粒获得的重组载体制备通过连接选择标记基因与质粒获得的重组载体。当分别制备重组载体时，将两种载体共转染至宿主中。

3.转基因植物及其制备方法

根据本发明的转基因植物可通过向靶植物中引入基因或重组载体制备。在本发明中，“基因引入”是指将靶基因通过例如常规基因工程技术引入宿主植物的细胞，这样所述基因可在其中表达。被引入的基因可整合至宿主植物的基因组DNA中，或保留在外源性载体中。

所述基因或重组载体可通过多种已报道和确立的技术适当引入植物中。其实例包括农杆菌属方法、PEG-磷酸钙方法、电穿孔、脂质体方法、基因枪方法和显微注射。农杆菌属方法可使用原生质体、组织切片或植物本身(in planta方法)。当使用原生质体时，将所述原生质体与具有Ti或Ri质粒的农杆菌属(根癌农杆菌或毛根农杆菌)一起培养，或与原生质球化的农杆菌属融合(原生质球方法)。当使用组织切片时，用农杆菌属感染无菌培养的靶植物叶切片(叶片)或愈伤组织(未分化的培养细胞)。当使用利用种子或植物的in planta方法，即不通过添加植物激素的组织培养进行的方法，可直接将农杆菌属用于水吸收的种子、苗、盆栽植物等。所述植物转化可按照通用手册的说明进行，例如“Experimental protocols of model plants(Newedition)，Shimamoto，K.and Okada，K(e.d.)，From Genetic engineeringto genomic analysis，2001，Shujunsha.”

可通过PCR、Southern杂交、Northern杂交、Western印迹或其他方法确认所述基因是否被整合入植物。例如，从转基因植物中制备DNA，设计ILP基因特异性的引物，随后PCR。PCR后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，并且用溴化乙锭、SYBR GREEN溶液等染色，由此检测作为条带的扩增产物。这样可证实转化。或者，可通过PCR检测扩增产物，使用预先用荧光染料等标记的引物。此外，扩增产物可与固相例如微量培养板结合，以通过荧光或酶反应确认扩增产物。此外，可从植物细胞中提取蛋白，使用双向电泳分离蛋白，可检测由ILP基因编码的蛋白条带。这样，被引入到植物细胞中的ILP基因的表达，即所述植物的转化，可以得到确认。随后，可通过Edman降解或其他方法测定所检测的蛋白质的N末端氨基酸序列，以确认氨基酸序列是否与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的N末端氨基酸序列一致，由此进一步验证所述植物细胞的转化。

或者使用多种报告基因，例如β-葡糖苷酸酶(GUS)、萤光素酶(LUC)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)或β-半乳糖苷酶(LacZ)与靶基因的下游区域连接制备载体。使用整合了上述载体的农杆菌属以上文相同的方式转化植物，测定报告基因的表达。以此可证实所述基因整合到植物中。

在本发明中，可使用单子叶植物或双子叶植物进行转化。其实例包括但不限于那些属于十字花科(Brassicaceae)的，例如拟南芥、卷心菜和油菜籽；属于禾本科(Gramineae)的，例如水稻、玉米、大麦和小麦；属于茄科(Solanaceae)的，例如番茄、茄子、土豆和烟草；属于豆科(Leguminosae)的，例如大豆、豌豆和矮菜豆；属于旋花科(Convolvulaceae)的，例如甘薯；属于大戟科(Euphorbiaceae)的，例如Manihot utilissima和属于蔷薇科(Rosaceae)，例如草莓。

在本发明中，转化的植物材料实例包括：植物器官，例如茎、叶、种子、胚、胚珠、子房和苗端；植物组织，例如花药或花粉以及其切片；未分化的愈伤组织；以及培养的植物细胞，例如通过酶加工除去细胞壁制备的原生质体。当使用in planta方法时，也可使用水吸收性种子或完整的植物。

本发明中的转基因植物指完整的植物、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、谷或种子)，植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部或脉管束)，或培养的植物细胞(例如愈伤组织)。

当转化培养的植物细胞时，可通过常规组织培养技术从获得的转化细胞再生器官或个体。本领域技术人员通过已知的从植物细胞中再生植物的常规技术可方便的实施所述操作。例如，可从植物细胞中通过以下方式再生植物。

开始，当使用植物组织或原生质体作为植物材料进行转化时，将其在已灭菌的愈伤组织形成培养基中培养，添加例如无机元素、维他命、碳源、糖类作为能量源，或植物生长调节剂(植物激素例如植物生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯或油菜素类固醇(brassinosteroid))，以形成不定增殖的去分化愈伤组织(此后该步骤称做“愈伤组织诱导”)。将由此形成的愈伤组织转移至含有植物生长调节剂例如植物生长素的新鲜培养基中，随后发生增殖(即传代培养)。

愈伤组织诱导在固体培养基例如琼脂上进行，传代培养在例如液体培养基中进行。这使得两次培养均能有效和大量进行。随后，通过上述传代培养增殖的愈伤组织在适当的条件下培养，以诱导器官再分化(此后称为“再分化诱导”)，最终再生完整的植物。再分化诱导可通过适当确定培养基中每种成分、例如植物生长调节剂如植物生长素和碳源的类型和数量，光、温度和其他条件实施。这种再分化诱导形成不定胚、不定根、不定芽、不定枝等等，其进一步生长成完整的植物。或者，所述项可保持在特定的状态中，其相应于成为完整植物前的条件(例如，被囊的人工种子、干胚或冻干的细胞和组织)。

本发明的转基因植物包括通过引入了感兴趣的基因的植物的有性生殖或无性生殖获得的子代(包括从转基因细胞或愈伤组织再生的植物)，以及子代植物的部分组织或器官(例如种子或原生质体)。本发明的转基因植物可通过从通过引入ILP基因转化的植物获得繁殖材料、例如种子或原生质体，并且栽培或培养所述材料大量产生。

在由此获得的转基因植物中，通过表达ILP基因增加了所述植物细胞中的核DNA含量。由此可实现增大的感兴趣转基因植物的育种。本发明因此提供了一种方法，其包括将ILP基因或其同系基因引入植物中，引发其在植物中的过表达，由此扩大整个植物或其部分。

实施本发明的最佳模式

下文中，通过参考下述的实施例更详细的描述本发明，尽管本发明的技术范围不限于此。

[材料和方法]

下述实施例中采用的材料和方法如下：

(1)植物材料和生长条件

所有的植物在包含10mg/ml蔗糖的GM板中生长，含或不含抗生素(GM，Valvekens，D.，Van Montagu，M.，和Van Lijsebettens，M.，1988，Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation ofArabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection.Proc.Natl.Acad Sci.，U.S.A.，85，5536-5540)。在22℃下，将植物在控温的培养箱中于白光(光照生长子叶15W/m²白光，或光照生长下胚轴5W/m²白光)或完全黑暗下培养。将SALK T-DNA-插入的突变体与Col-0回交两次，随后纯化以供生理学试验。

(2)倍性分析

根据厂商方案，用CyStain UV precise P(Partec GmbH，Münster，Germany)提取核酸并染色。使用倍性分析仪(Partec GmbH，Munster，Germany)进行流式细胞分析。

(3)ILP 1、2、3、4、5和7-过表达转基因系的制备

通过PCR扩增跨越基因全长编码区的cDNA，使用下列引物，从Super Script拟南芥属(Arabidopsis)cDNA文库(Invitrogen，California)中获得。

(用于ILP 1扩增)

ILP1-F：5’-GGGGTACCATGGGAAGTAACCGTCCTAAG-3’(SEQ ID NO：13)

ILP1-R：5’-ACGCGTCGACTCAAACTGCCTCCTTAAGATT-3’(SEQ ID NO：14)

(用于ILP2扩增)

ILP2-F：5’-GGGGTACCGGAAAATGGGTAGCAAGATG-3’(SEQ ID NO：15)

ILP2-R：5’-CGAGCTCAGGGTTTAAGCTTGGCTTCC-3’(SEQ ID NO：16)

(用于ILP3扩增)

ILP3-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGATTCTCTCGCTCTCGC-3’(SEQID NO：17)

ILP3-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTTCTCCCGACCAAACT-3’(SEQ IDNO：18)

(用于ILP4扩增)

ILP4-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAAGCAGAAGGGTTTTAAA-3’(SEQ IDNO：19)

ILP4-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATATTGGATTCATGACAAC-3’(SEQID NO：20)

(用于ILP5扩增)

ILP5-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGTGAATCAAAGAAAGCTA-3’(SEQID NO：21)

ILP5-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAACACACCATTCCATCCCT-3’(SEQID NO：22)

(用于ILP7扩增)

ILP7-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCCGGCGAATGATGCTGAA-3’(SEQID NO：23)

ILP7-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATACTCCCTCAGCTGCCAA-3’(SEQID NO：24)

获得的ILP1和ILP2的cDNA用KpnI和SalI或SacI消化，克隆至yy45载体中(Yamamoto，Y.Y.，Deng，X.W.，and Matsui，M.，2001，CIP4，a new COP1 target，is a nucleus-localized positive regulator ofArabidopsis photomorphogenesis.Plant Cell 13，399-411)作为pPZPY122(Yamamoto，Y.Y.等，同上)的衍生物。

使用上述的引物组通过PCR扩增ILP3、4、5和7的cDNA。在Gateway克隆的BP反应中将扩增的PCR片段克隆至pDONR207载体(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)。在Gateway克隆LR反应中将整合cDNA的pDONR207载体克隆至pBI pBIDAVL-GWR1二元载体中(Nakazawa M，Ichikawa T，Ishikawa A，Kobayashi H，Tsuhara Y，Kawashima M，Suzuki K，Muto S，Matsui M.，Activation tagging，a noveltool to dissect the functions of a gene family.Plant J.2003，34：741-750)。

通过电穿孔将制备的二元载体转染至根癌农杆菌中(GV3101菌株)。在yy45载体的情况下，在补充70μg/ml氯霉素的LB培养基上选择转基因植物。在25μg/ml卡那霉素培养基上选择引入了pBIDAVL-GWR1的农杆菌属。通过花浸染法(Clough，S.J.，和Bent，A.F.，1998，Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana，Plant J.16，735-743)转化拟南芥WT(Col-0)株。在补充了50μg/l卡那霉素和100μg/l三尖杉碱的GM上选择转染有yy45的苗，在含有50μg/l潮霉素的GM和含有100μg/l三尖杉碱的GM上选择引入了pBIDAVL-GWR1的苗。

(4)胞内蛋白的定位

使用下列引物(GFPn-F和GFPn-R)从yy217扩增GFP，用于ILP1:GFP。

(用于GFP扩增)

GFPn-F：5’-TCTAGAGGATCCCCCGGGGGTACCGTCGACATGGCAATGAGTAAAGGAGAA-3’(SEQ IDNO：25)

GFPn-R：5’-CGAGCTCTTATTTGTAAAGTTCATC-3’(SEQ ID NO：26)

GFP片段用XbaI和SacI消化，克隆至yy45中(yy45GFPn)。

使用ILP1-F和ILP-R2-SAL引物(5’-ACGCGTCGACAACTGCCTCCTTAAGATTG-3’：SEQ ID NO：27)从Super Script拟南芥属cDNA文库中克隆ILP1 cDNA，克隆至yy45GFPn的KpnI和SalI位点以制备ILP1:GFP。除去洋葱表皮细胞，置于GM板上。根据供应商方案，将ILP1:GFP构建体加载到金颗粒上(直径：1μm)。使用Biolistic PDS-1000/He系统(BIO-RAD，California)将这些颗粒递送至洋葱表皮细胞。冲击参数设定为600psi的爆破片爆破压(rupture discbursting pressure)和与靶组织9cm的距离。冲击后18和36小时，在BX60显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)下观察GFP荧光。

(5)半定量RT-PCR和实时PCR分析

(5-1)半定量RT-PCR

半定量逆转录PCR(RT-PCR)分析按照已出版文献(Kimura，M.，Yoshizumi，T.，Manabe，K.，Yamamoto，Y.Y.，和Matsui，M.，2001，Arabidopsis transcriptional regulation by light stress via hydrogenperoxide-dependent and-independent pathways，Genes Cells 6，607-617)中所述进行。将种子散布于补充了蔗糖的GM板上，处理平板5天，随后在22℃白光下孵育3天。收获苗，按照已出版文献(Yoshizumi，T.，Nagata，N.，Shimada，H.，和Matsui，M.，1999，An Arabidopsis cellcycle-dependent kinase-related gene，CDC2b，plays a role in regulatingseedling growth in darkness，Plant Cell 11，1883-1896)所述分离总RNA。

当分析细胞周期相关基因的表达时(图6A)，使用现有的引物组扩增基因。用于扩增CYCA2；1、CYCB1；2和CYCD3；1的引物组描述于Richard，C.，Granier，C.，Inzé，D.，和De Veylder，L.，2001，Analysis of cell division parameters and cell cycle gene expression duringthe cultivation of Arabidopsis thaliana cell suspensions，J.Exp.Bot.52，1625-1633。用于扩增HISH4的cDNA的引物组描述于Mariconti，L.，Pellegrini，B.，Cantoni，R.，Stevens，R.，Bergounioux，C.，Cella，R.，和Albani，D.，2002，The E2F family of transcription factors fromArabidopsis thaliana，Novel and conserved components of theretinoblastoma/E2F pathway in plants，J.Biol.Chem.277，9911-9919。用于扩增ACT2 cDNA的引物组描述于Himanen，K.，Boucheron，E.，Vanneste，S.，de Almeida Engler，J.，Inze，D.，和Beeckman，T.，2002，Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation，Plant Cell 14，2339-2351。

使用下列引物组分析插入了CYCA2；1的T-DNA的突变体(即cyca2；1-1和cyca2；1-1)中CYCA2；1的表达(图8B)。使用如SEQ IDNO：13和14所示的引物组分析ilp1-1D和ILP1ox中ILP1的表达(图4B)。

(用于CYCA2；1扩增)

CycA2；1-F：5’-GGACTAGTGAGCTCGCACACTAATGCGAAGAAAG-3’(SEQ ID NO：28)

CycA2；1-R：5’-CCGCTCGAGTCTAGAGCAGATGCATCTAAAGATTC-3’(SEQ ID NO：29)

(5-2)实时PCR分析

按照Mx3000P(STRATAGENE，CA)的方案进行实时PCR。

如前所述，使用TRIzol(Invitrogen，CA)从苗中分离总RNA，使用分离的总RNA作为模板，根据生产商说明，用SuperScript第一链合成系统(Invitrogen，CA)合成第一链cDNA。使用SYBR Green RealtimePCR Master Mix(TOYOBO，Osaka，Japan)通过Mx3000P多重定量PCR系统(STRATAGENE，CA)进行PCR分析。使用下列引物组以检查ILP 1基因(图3B和图6C)和CYCA2基因家族(图6B和图6D)的表达水平。

(用于ILP 1扩增)

ILP1realF：5’-AGCTTGCCAAGAAGGCATTG-3’(SEQ ID NO：30)

ILP1realR：5’-TCATCAACGACGCAGTCAGA-3’(SEQ ID NO：31)

(用于CYCA2；1扩增)

CycA2；1-F：5’-CGCTTCAGCGGTTTTCTTAG-3’(SEQ ID NO：32)

CycA2；1-R：5’-ATCCTCCATTGCAAGTACCG-3’(SEQ ID NO：33)

(用于CYCA2；2扩增)

CycA2；2-F：5’-TGTATGTGTTGGCCGTAATG-3’(SEQ ID NO：34)

CycA2；2-R：5’-TGGTGTCTCTTGCATGCTTA-3’(SEQ ID NO：35)

(用于CYCA2；3扩增)

CycA2；3-F：5’-CTCTATGCCCCTGAAATCCA-3’(SEQ ID NO：36)

CycA2；3-R：5’-ACCTCCACAAGCAATCAAC-3’(SEQ ID NO：37)

(用于CYCA2；4扩增)

CycA2；4-F：5’-CAAAGCCTCCGATCTCAAAG-3’(SEQ ID NO：38)

CycA2；4-R：5’-CTTGTCCGGTAGCTCTCCAG-3’(SEQ ID NO：39)

(用于CYCA1：1扩增)

CycA1；1-F：5’-CGATGACGAAGAAACGAGCA-3’(SEQ ID NO：40)

CycA1；1-R：5’-TGGCATTAACGCAAACACTTG-3’(SEQ ID NO：41)

(用于ACT2扩增)

Act2-F：5’-CTGGATCGGTGGTTCCATTC-3’(SEQ ID NO：42)

Act2-R：5’-CCTGGACCTGCCTCATCATAC-3’(SEQ ID NO：43)

(6)光学显微镜检查

将植物材料于含有20mM二甲胂酸钠的缓冲液中于4℃下在4％低聚甲醛中固定24小时，用乙醇系列脱水，随后包埋于Technovit 7100树脂中(Kulzer and Co.，Wehrheim，Germany)。通过超薄切片机上的玻璃刀切下切片(厚度：2.5μm)，置于盖玻片上，随后干燥。产物用0.1M磷酸盐缓冲生理盐水(pH 7.0)中的1％甲苯胺蓝染色30秒，随后用蒸馏水洗涤10秒。在Olympus IX70显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)下观察样品。

(7)体内转录测试

通过PCR从pMA560扩增NOS启动子的-150至+5的区域(Ma，J.，Przibilla，E.，Hu，J.，Bogorad，L.，和Ptashne，M.，1988，Yeastactivators stimulate plant gene expression.Nature 334，631-633)，使用下列引物：5’-GGG GGA TCC GCG GG T TTC TGG AGT TTA ATG-3’(SEQ ID NO：44)和5’-CCT CTA GAG ACT CTA ATT GGA TAC CGA GG-3’(SEQ ID NO：45)。扩增的片段用BamHI和XbaI消化，克隆至yy76(Yamamoto，Y.Y.，和Deng，X.W.，1998，A new vector set for GAL4-dependent transactivationassay in plants，Plant Biotech.15，217-220)的BamHI/XbaI位点。所得克隆中保留了位于XbaI位点和GUS之间的第二BamHI位点。克隆yy78用BamHI和HindIII消化，克隆至pBIL221的BamHI/HindIII位点(Nakamura，M.，Tsunoda，T.，and Obokata，J.，2002，Photosynthesisnuclear genes generally lack TATA-boxes：a tobacco photosystem I generesponds to light through an initiator，Plant J.29，1-10)以获得yy97。从GM2163(Dam-/Dcm-)系制备yy97质粒用于本测试。为制备效应子质粒，对于GAL-ILP1Full使用ILP1-F和ILP1-R引物，对于GAL4-ILP1N使用ILP1-F和ILP1-No 2-R(5’-GGGGTACCTTAGGATCCGTCACTCTCATCAGTGCT-3’：SEQ ID NO：46)引物，对于GAL4-ILP1C使用ILP1-No 5-F(5’-GCTGTAGAGGATCCATGACAGTTCTAAACAAACAT-3’：SEQ ID NO：47)和ILP1-R引物扩增不同长度的ILP1 cDNA。获得的cDNA用KpnI和SalI消化，并克隆至yy64的KpnI/SalI位点中(Yamamoto，Y.Y.，和Deng，X.W.，1998，A new vector set forGAL4-dependent transactivation assay in plants，Plant Biotech.15，217-220)。以上述方式生物射弹轰击烟草叶(Nicotiana tabacum cvSR1)。使用Lumat LB9507光度计(PerkinElmer，MA)测量萤光素酶活性。

(8)细胞培养和转染

在补充有10％胎牛血清(FBS，Invitrogen，CA)的DMEM培养基(Invitrogen，CA)中培养小鼠NIH3T3细胞。将NIH3T3细胞(约2.0×10⁵细胞)散布在12孔滴定板的各孔中，用于转染。在CO₂培养箱(5％CO₂)中孵育2天后，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，CA)进行转染。转染后24小时和48小时按照生产商方案使用TD-20/20光度计(Promega，WI)测定萤光素酶活性。使用下述引物组从由NIH3T3细胞制备的总RNA中扩增小鼠ILP1基因，通过测序验证所扩增的基因。使用GATE-WAY克隆系统(Invitrogen，CA)将PCR片段克隆至pcDNA-DEST40中。

(用于小鼠ILP1扩增)

小鼠ILP1F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGGACATGGAGAGCGAGAAGG-3’(SEQ ID NO：48)

小鼠ILP1R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATTTTCCTTCAATCAGAGACTT-3’(SEQID NO：49)

[结果]

(实施例1)核内复制突变体的分类

使用黑暗生长的拟南芥属苗，测定下胚轴细胞的倍性水平。为定义筛选条件，使用乙烯信号转导突变体ctrl-1作为阳性对照(Gendreau，E.，Traas，J.，Desnos，T.，Grandjean，O.，Caboche，M.，和Hofte，H.，1997，Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana，PlantPhysiol.114，295-305)。在黑暗生长的ctrl-1下胚轴中，32C峰显著增加。其他倍性峰，包括2C、4C、8C和16C也在ctrl-1中出现，如野生型(Col-0)中一样，但比例不同(图1A)(Gendreau，E.等.，1997，同上所述；Orbovic，V.，H.，and Traas，J.，1999，Gibberellin andethylene control endoreduplication levels in the Arabidopsis thalianahypocotyl，Planta 209，513-516)。在生长板中含有蔗糖的该筛选条件下，在黑暗生长的下胚轴中观察到具有倍性水平高至32C的细胞。

计算ctrl-1和野生型的8C/32C和16C/32C相对比例。为复制杂合子中具有其表型的显性突变的遗传性，以7∶3而不是3∶1的比例的ctrl-1苗与野生型混合。上述相对比例是根据结果计算的。筛选标准设定为8C/32C低于1.0，16C/32C低于2.0(图1B)。这些值被用于分离显性的多倍体突变体。

每个T₂活化标记系使用约20株苗。在本次筛选中，难以分离隐性的突变体，因为隐性突变体仅在四分之一T2种子中出现，在该频率下，倍性水平的任何差异将被掩盖在野生型模式中。为功能获得或显性的突变，突变同胞出现在四分之三的群体中，可通过流式细胞测定监测。使用黑暗生长的苗用于该测定，因为其易于收获，并且条件是可再现的。

从4500个独立的活化标记系中分离得到17个显性突变体(Nakazawa，M.，Ichikawa，T.，Ishikawa，A.，Kobayashi，H.，Tsuhara，Y.，Kawashima，M.，Suzuki，K.，Muto，S.，和Matsui，M.，2003，Activationtagging，a novel tool to dissect the functions of a gene family，Plant J.34，741-750；Ichikawa，T.，Nakazawa，M.，Kawashima，M.，Muto，S.，Gohda，K.，Suzuki，K.，Ishikawa，A.，Kobayashi，H.，Yoshizumi，T.，Tsumoto，Y.，Tsuhara，Y.，Iizumi，H.，Goto，Y.，和Matsui，M.，2003，Sequencedatabase of 1172T-DNA insertion sites in Arabidopsis activation-tagginglines that showed phenotypes in T1 generation，Plant J.36，421-429；http://rarge.gsc.riken.jp/activationtag/top.php)。

这些突变体具有增加数量的倍性细胞，在黑暗生长的苗的下胚轴中与ctrl-1突变体一样显示了高的32C倍性峰。这17个突变体根据下胚轴长度、根长度和光的依赖性分成2组。其被指定为组1和组2(表1)。

表1：两组倍性突变体

	倍性(黑暗，下胚轴)	倍性(光照，子叶)	下胚轴长度(黑暗)	根长度(黑暗)	其他特征
	倍性(黑暗，下胚轴)	倍性(光照，子叶)	下胚轴长度(黑暗)	根长度(黑暗)	其他特征	组1	+	+	-	+	大子叶厚下胚轴
组2	+	-	+	+		组1	+	+	-	+	大子叶厚下胚轴

(+：增加；-：与野生型(Col)相同)

与野生型相比，黑暗和光照生长的苗中属于组1的12个突变体均显示倍性增加。其具有更长的根，但下胚轴长度与野生型基本相同。在组2中，仅黑暗生长的5个突变体具有增加的倍性水平，其与光照条件下野生型的倍性水平基本相同。这表明组2表型是光依赖的，其下胚轴也比黑暗生长的苗长。

(实施例2)显性突变体ilp1-1D的鉴定

表征了属于组1的显性突变体Z010521，其指定为多倍性水平增加的1-1D(ilp1-1D)。上述测定中黑暗生长的苗的下胚轴含有倍性水平高达32C的细胞(图2A)。纯合的ilp1-1D也含有水平高达32C的细胞，但32C峰的比例与黑暗中的野生型(无T-DNA插入的同基因同胞)相比更高(图2A)。在比较每个倍性水平细胞总数时，该结果更为明显(图2B)。在黑暗生长的下胚轴中，与野生型相比，由32C细胞代表的细胞百分比在ilp1-1D中显著增加。在ilp1-1D中，8C/32C和16C/32C的值分别为0.44和1.3，表明该突变体处于指定的筛选类别内。该结果显示在该突变体中，核内复制的程度增加。

用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色黑暗生长的下胚轴，测定增加的核体积。与野生型相比，ilp1-1D苗具有大为增加的核(图2C和图2D)。在光照条件下，野生型下胚轴细胞水平在测试中最高为16C，ilp1-1D的16C细胞代表的细胞百分比上升(图2B)。光照ilp1-1D的子叶同样具有数目增加的16C细胞，如下胚轴细胞一样(图2B)。(实施例3)ilp1-1D表型分析

比较黑暗和光照条件下的ilp1-1D表型与野生型。当在黑暗中生长时，与野生型相比，ilp1-1D纯合系没有显示下胚轴长度上的差异(图2E和图2F)。ilp1-1D下胚轴变得比野生型更厚，而非更长，表明细胞沿水平轴增加其体积(图2G)。制备横切片以检查下胚轴中的细胞。发现ilp1-1D的皮质和内胚层细胞具有增加的直径，导致与野生型相比较厚的下胚轴(图2H和图2I)。皮质和内胚层中含有的细胞数目几乎没有差别。该结果显示ilp1-1D中倍性水平的升高增加了下胚轴细胞的直径，导致细胞体积的增加。

除了这些下胚轴表型外，观察到初生根的长度的增加(图2E和图2F)。

在光照生长的苗中，与野生型相比，ilp1-1D纯合突变体显示了扩大许多的子叶(图2J至图2L)。检查了沿子叶主要和次要轴的细胞数。Ilp1-1D和野生型之间在细胞数方面无显著差异，表明突变体的大子叶尺寸由个体细胞尺寸的增加导致，而非细胞数目的增加导致。成年ilp1-1D植物几乎与野生型一样高。

(实施例4)ILP1基因结构的分析

(1)候选基因的选择

活化T-DNA含有潮霉素抗性基因作为选择标记。检查ilp1-1D杂合植物的T₂子代发现，约70％的该子代具有潮霉素抗性，表明在基因组中只有一个T-DNA。所有潮霉素抗性的植物在T₃代中显示增加的倍性水平。这些结果强烈暗示活化标记的T-DNA负责增加的多倍性表型。通过质粒拯救分离T-DNA侧翼序列。测序后，将T-DNA插入AT5g08560的编码区(图3A)。T-DNA推定的起始密码子与右缘(RB)之间的距离对于AT5g08550为约1kb，对于AT5g08560为约7.4kb(图3A)。通过实时PCR检查AT5g08550在ilp1-1D杂合体和野生型中的表达。结果发现ilp1-1D中的表达是野生型的13倍(图3B)。为检测AT5g08560中的插入是否引起多倍性水平增加，从SALKT-DNA收集物(SALK_095495)中检查T-DNA插入(Alonso，J.M.，Stepanova，A.N.，Leisse，T.J.，Kim，C.J.，Chen，H.，Shinn，P.，Stevenson，D.K.，Zimmerman，J.，Barajas，P.，Cheuk，R，等，2003，Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana，Science301，653-657)。T-DNA在AT5g08560第一个外显子中插入(数据未显示)。所述系没有显示改变的多倍性水平(数据未显示)。基于这些结果，认为AT5g08550是负责活化ilp1-1D表型的基因的候选物。

(2)候选基因AT5g08550的鉴定

为确认这一点，产生过表达在花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子的控制下的由RT-PCR分离的AT5g08550 cDNA的转基因植物。概括ilp1-1D表型的T₂代中，15系有8系显示了显著增加的倍性水平。AT5g08550在这些系中高表达(ILP1ox(#2))(图3B)。检查了纯合系的黑暗生长苗的倍性。结果发现32C峰的相对比例增加，观察到高达64C的细胞(图3C)。未显示多倍性表型的转基因系(#1和#3)与野生型的ILP1表达水平几乎一样。AT5g08550过表达还复制了ilp1-1D的其他表型，例如增大的子叶，厚下胚轴和延长的初生根(图3H至图3J)。然而，与野生型相比，成年植物高度和种子大小几乎没有差别。该结果强烈暗示AT5g08550是ilp1-1D突变相应的基因。AT5g08550被指定为ILP1。

ILP1基因编码908个氨基酸残基的蛋白。为鉴定保守基序，使用BLASTP程序在蛋白质数据库中搜索ILP1同系物。该搜索显示ILP1具有与人和其他物种GC结合因子(GCF)C末端区域的相似性(图3D至图3F)。GCF蛋白首先分离为转录抑制物，其与表皮生长因子受体(EGFR)、β-肌动蛋白和钙依赖蛋白酶基因启动子区域中富含GC的序列相结合(Kageyama，R.，和Pastan，I.，1989，Molecularcloning and characterization of a human DNA binding factor thatrepresses transcription，Cell 59，815-825)。然而，首次报道的GCF cDNA克隆是嵌合基因。所述蛋白的N末端与富含GC的区域结合，其C末端来源自另一个未知功能的cDNA(Reed，A.L.，Yamazaki，H.，Kaufman，J.D.，Rubinstein，Y.，Murphy，B.，和Johnson，A.C.，1998，Molecular cloning and characterization of a transcription regulator withhomology to GC-binding factor，J.Biol.Chem.273，21594-21602；Takimoto，M.，Mao，P.，Wei，G.，Yamazaki，H.，Miura，T.，Johnson，A.C.，和Kuzumaki，N.，1999，Molecular analysis of the GCF gene identifiesrevisions to the cDNA and amino acid sequences，Biochim.Biophys.Acta.1447，125-131)。

为防止混乱，DNA结合区域是指真实的GCF，编码其C末端区域的基因称为CTILP1(用于ILP1的C末端区域)。ILP1与CTILP1具有同源性。CTILP1在小鼠、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和秀丽隐杆线虫(C.elegans)中具有平行进化同源基因(图3E和图3F)。ILP1在拟南芥属基因组中具有平行进化同源基因(AT5g09210)(图3E和图3F)。在ILP1和其他CTILP1蛋白中发现两个保守的基序。基序1位于ILP1的残基371至465处(图3D和图3E)，基序2位于残基571至852处(图3D和图3F)。这两个基序在多种物种的CTILP1中具有良好的保守性。基序2尤其是良好保守性的，但基序1在果蝇属和秀丽隐杆线虫的蛋白中均未发现。CTILP1蛋白的N末端区域未发现有显著的同源性。即便使用3D-PSSM，也未发现这两个基序预测的特征(Kelley，L.A.，MacCallum，R.M.，和Sternberg，M.J.E.，2000，Enhanced genome annotation using structural profiles in the program3D-PSSM，J.Mol.Biol.299，499-520)。

在这两个保守区域中，通过PSORT程序(Nakai，K.，和Horton，P.，1999，PSORT：A program for detecting sorting signals in proteins andpredicting their subcellular localization，Trends Biochem.Sci.24，34-36)发现了推定的核定位信号(NLS)。该序列位于ILP1的残基522至539，富含精氨酸残基，其是典型的二连NLS(图3D)。该推定NLS基序的存在表明ILP1是核蛋白。为证实这一预测，在CaMV 35S启动子的控制下表达ILP1与绿色荧光蛋白(GFP)N末端区域的融合蛋白(ILP1:GFP)。洋葱表皮细胞中的定位通过生物射弹轰击测定。在核内检测到ILP1:GFP融合蛋白，表明ILP1是核蛋白(图3G)。

(实施例5)ILP基因的T-DNA插入突变体的表型

从SALK T-DNA插入系中分离两个T-DNA插入突变体(Alonso，J.M.，Stepanova，A.N.，Leisse，T.J.，Kim，C.J.，Chen，H.，Shinn，P.，Stevenson，D.K.，Zimmerman，J.，Barajas，P.，Cheuk，R，等，2003，Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana，Science301，653-657)。两个突变体在ILP1第五内含子的不同位置具有T-DNA插入(图3A，用小三角表示)。检查了ILP1基因在这两个突变体中的表达。尽管对该区域特异性的引物组(图3A中箭头所示)的确扩增出了PCR产物(数据未显示)，当使用引物组(ILP1-F和ILP1-R)扩增全长时未检测到任何表达(图4B)。这表明这些突变体缺乏全长的转录物，而非具有无效突变。这些纯合的突变体分别被指定为ilp1-1(SALK_030650)和ilp1-2(SALK_135563)。黑暗中，与其野生型同胞相比ilp1-1和ilp1-2具有更短的下胚轴和根(图4A、图4C和图4E)。在光照下，与野生型相比，它们均显示更短的下胚轴和更小的子叶，根的延伸受到抑制(图4D和图4E)。ilp1-1(其中T-DNA插入离第五内含子的剪接受体位点更近)表现出比ilp1-2更严重的形态学表型。为检查这些系的互补性，将ilp1-1和ilp1-2互相杂交。在光照和黑暗下，与野生型相比，F1植物同样显示了更短的下胚轴和根(图4A和图4D)。该结果显示这些系是等位的，ILP1的缺失导致了短下胚轴表型。为说明倍性和ILP1功能之间的关系，检查了黑暗中杂合的ilp1-1和ilp1-2的倍性水平。在ilp1-1和ilp1-2中均观察到3天龄苗下胚轴细胞中32C细胞数目的下降(图4F)。为检查ilp1-1和ilp1-2中下胚轴长度和倍性水平的关系，在不同的苗发育阶段分析这些突变体。在黑暗条件下，与野生型相比，ilp1-1和ilp1-2在所有的发育阶段具有更短的下胚轴(图4C)。然而，抑制后7天，下胚轴细胞下降的倍性水平回复到野生型的水平。这表明下降的倍性水平并非短下胚轴长度的结果。

(实施例6)ILP1作为转录抑制物起作用

已报道首次鉴定的嵌合GCF作为转录抑制物起作用(Kageyama，R.，和Pastan，I.，1989，Molecular cloning and characterization of ahuman DNA binding factor that represses transcription.Cell 59，815-825)。该蛋白(GCF)的N末端部分与GCF2具有同源性，并且具有DNA结合活性(Reed，A.L.，Yamazaki，H.，Kaufman，J.D.，Rubinstein，Y.，Murphy，B.，和Johnson，A.C.，1998，Molecular cloning andcharacterization of a transcription regulator with homology toGC-binding factor，J.Biol.Chem.273，21594-21602)。ILP1与CTILP1具有同源性，但它们未在哺乳动物细胞中详细检查。为了解ILP1的功能，进行体内转录测试(Yamamoto，Y.Y.，和Deng，X.W.，1998，Anew vector set for GAL4-dependent transactivation assay in plants，PlantBiotech.15，217-220)。将ILP1 cDNA融合至GAL4 DNA结合结构域的C末端区域(GAL4-ILP1 Full)。该嵌合质粒通过生物射弹轰击与萤光素酶(LUC)报告质粒一同引入烟叶细胞中，所述报告质粒在启动子区域含有GAL4结合序列(图5A)。从缺乏DNA甲基化酶的大肠杆菌菌株制备报告质粒，以保证其是去甲基化的。当使用GAL4-ILP1 Full时，观察到报告活性的下降(图5B)。ILP1具有两个保守基序。表达ILP1蛋白含有这些基序与核定位信号(NLS)的部分。GAL4-ILP1N是含有GAL4 DNA结合结构域与ILP1的N末端区域(残基1至567)的嵌合体(图5A)。该嵌合体含有基序1和NLS，未显示强表达，如在GAL4-ILP1Full蛋白中观察到的那样(图5B)。然而，当使用含有基序2的ILP1的C末端区域(残基474至908)时，观察到强的多的LUC报告活性抑制(图5A和图5B)。这些结果表明ILP1在体内作为转录抑制物起作用，基序2负责该抑制活性。

(实施例7)通过ILP1调节细胞周期蛋白A2表达

核内复制是细胞周期的一种，从规则的有丝分裂细胞周期转换到该周期可能涉及不同的细胞周期相关基因。因此，检查了在有丝分裂细胞周期特定时期表达的某些细胞周期相关基因。细胞周期蛋白D3；1(CYCD3；1)用作G1-期-特异性基因(Riou-Khamlichi，C.，Menges，M.，Healy，J.M.，和Murray，J.A.H.，2000，Sugar control of the plant cellcycle：differential regulation of Arabidopsis D-type cyclin geneexpression，Mol.Cell Biol.20，4513-4521)；HistonH4(HISH4)用作S期特异性基因(Mariconti，L.，Pellegrini，B.，Cantoni，R.，Stevens，R.，Bergounioux，C.，Cella，R.，和Albani，D.，2002，The E2F family oftranscription factors from Arabidopsis thaliana，Novel and conservedcomponents of the retinoblastoma/E2F pathway in plants，J.Biol.Chem.277，9911-9919)；细胞周期蛋白A2；1(CYCA2；1)用作S/G2期特异性基因；以及细胞周期蛋白B1；2(CYCB1；2)用作G2/M期特异性基因(Shaul，O.，Mironov，V.，Burssens，S.，Van Montagu，M.，and Inze，D.，1996，Two Arabidopsis cyclin promoters mediate distinctivetranscriptional oscillation in synchronized tobacco BY-2 cells，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93，4868-4872)。通过半定量RT-PCR分析这些基因的表达。使用显示增加的倍性水平的ILP1过表达系(ILP1-ox，#2系，图3B)，检查了这些细胞周期相关基因在黑暗生长的苗中的表达。

在野生型(Col-0)和ILP1过表达系(ILPox)中，CYCD3；1、HISH4和CYCB1；2的表达没有区别(图6A)，然而，ILP1过表达系中CYCA2；1的表达与野生型相比显著下降(图6A)。CYCA2；1是一个基因家族的一部分，在拟南芥属基因组中有4个CYCA2成员(Vandepoele，K.，Raes，J.，De Veylder，L.，Rouze，P.，Rombauts，S.，和Inze，D.，2002，Genome-wide analysis of core cell cycle genes inArabidopsis，Plant Cell 14，903-916)。CYCA2基因在ILP1ox和ilp1-1D中的表达通过实时PCR更精确的检测。所有的CYCA2成员均观察到下降的表达(图6B，上栏)。特别的，ILP1ox系中CYCA2；1的表达与野生型相比下降了约40％。对CYCA2基因在ILP1插入突变体中的表达的检查表明ilp1-1和ilp1-2均在基本上所有的CYCA2基因家族成员中表达上升(图6B，下栏)。

调查了ILP1在叶发育过程中的表达。随着第一叶的发育，表达逐渐下降。吸涨后20天，其下降至第8天(第一叶处于增殖期)水平的十分之一(Vlieghe，K.，Boudolf，V.，Beemster，G.T.，Maes，S.，Magyar.Z.，Atanassova，A.，de Almeida Engler，J.，De Groodt，R.，Inzé，D.，and De Veylder，L.，2005，The DP-E2F-like gene DEL1 controls theendocycle in Arabidopsis thaliana，Curr.Biol.15，59-63)(图6C)。同样，在叶发育过程中调查了CYCA2基因家族的表达，与野生型进行比较(图6D)。所有的CYCA2基因家族在第8天表现出高表达水平，并且这逐渐下降，与ILP1的情况一样(数据未显示)(Imai，K.K.，Ohashi，Y.，Tsuge，T.，Yoshizumi，T.，Matsui，M.，Oka，A.，和Aoyama，T.，2006，The A-Type Cyclin CYCA2；3 Is a Key Regulator of Ploidy Levels inArabidopsis Endoreduplication，Plant Cell 18，382-396)。在ilp1-1D中，所有CYCA2基因家族成员的表达与野生型相比均下降(图6D，上栏)。然而，在ilp1-2中，所有CYCA2基因家族成员的表达与野生型相比均上升，在第12天观察到CYCA2；3和CYCA2；4的相对高表达(图6D，下栏)。在第12天后未检测到CYCA2；1在野生型、ilp1-1D或ilp1-2中的表达。

在细胞分裂期间直至第8天对叶中倍性水平的观察表明野生型和ilp1-1D之间没有显著差异。然而，当与ilp1-2比较时，观察到2C分数的减少和8C和16C分数的增加。与野生型相比，在第10天后ilp1-1D中的8C和16C分数逐渐增加(图6E)。在第22天，ilp1-1D中16C细胞的分数增加至18％，野生型中为7％(图6E)。在第8天，ilp1-2中的2C分数为60％或更高，未检测到8C和16C分数。然而，在第10天后，ilp1-2中的8C和16C分数同ilp1-1D一样增加(图6E)。

(实施例8)通过小鼠ILP1调节细胞周期蛋白A2基因在哺乳动物细胞中的表达

为了解细胞周期蛋白A2的表达是否在哺乳动物中同样观察到下降，使用NIH3T3细胞进行共转染测试。通过RT-PCR分离小鼠ILP1同系物(AAK68725)的cDNA(图3E和图3F)，克隆至含有细胞巨化病毒(Cytomegalovirus)(CMV)启动子的表达载体中(图7A)。采用脂质转染法将该cDNA与小鼠细胞周期蛋白A2(Ccna2)启动子-LUC报告子共转染至NIH3T3细胞中。使用含有转录起始位点的-177到+100的Ccna2启动子(Huet，X.，Rech，J.，Plet，A.，Vie，A.，和Blanchard，J.M.，1996，Cyclin A expression is under negativetranscriptional control during the cell cycle，Mol.Cell Biol.16，3789-3798)。该区域在小鼠和人的细胞周期蛋白A2启动子间是保守的。使用β-半乳糖苷酶(LacZ)基因作为本次测试的内标。如图7B中所示，用小鼠ILP1基因转染后24小时和48小时，细胞内均观察到报告活性的下降。

(实施例9)CYCA2基因T-DNA插入突变体的表型

在CYCA2家族中，CYCA2；1已被广泛的研究，其基因表达报道是S/G2-期特异性的(Shaul，O.，Mironov，V.，Burssens，S.，VanMontagu，M.，和Inze，D.，1996，Two Arabidopsis cyclin promotersmediate distinctive transcriptional oscillation in synchronized tobaccoBY-2 cells，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93，4868-4872)。为检测CYCA2；1的表达下降是否与核内复制相关，检查了从SALK T-DNA收集物获得的CYCA2；1 T-DNA插入突变体的倍性水平(Alonso，J.M.，Stepanova，A.N.，Leisse，T.J.，Kim，C.J.，Chen，H.，Shinn，P.，Stevenson，D.K.，Zimmerman，J.，Barajas，P.，Cheuk，R，等，2003，Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana，Science301，653-657)。检查了两个独立的T-DNA插入系，在插入系1(cyca2；1-1)中，T-DNA位于第一外显子内(SALK_121077)，在插入系2(cyca2；1-2)中，其位于第四内含子(SALK_136750)(图8A)。RT-PCR分析表明，这两系为无效的(图8B)。与野生型相比，cyca2；1-1和cyca2；1-2纯合系在成年阶段几乎无形态差异。黑暗生长的苗的形态学也与野生型相同。当观察这些T-DNA插入系中的倍性水平时，与野生型相比，在两系中均观察到黑暗生长的下胚轴中32C细胞比例增加(图8C)。在光照生长的苗的下胚轴中，观察到16C细胞水平的增加(图8C)。同样检查了光照生长的子叶细胞中的倍性水平。虽然与野生型相比，子叶的尺寸没有变化，cyca2；1-1和cyca2；1-2中16C分数均增加(图8C)。这些数据表明CYCA2；1表达的缺失诱导了倍性的增加。

(实施例10)其他突变体的鉴定

在其他5个突变体即ilp2-D、3-D、4-D、5-D和7-D中观察到组1的特征，并且在黑暗和光照条件下观察到DNA含量的增加。这些突变体，包括ilp4-D在内，显示了表现出增大的细胞的表型，例如增大的子叶面积，增大的毛状体(其是在拟南芥表面具有3个分枝的毛发)、以及其分枝数增加，根延长和大的下胚轴直径(图9、10、12和13)。在ILP2-、ILP5-和ILP7-过表达的转基因植物中，下胚轴中DNA含量增加，观察到与上述突变体类似的表型(图9、12和13)。在ILP4-过表达的转基因植物(ILP4ox)中，ILP4的表达比ilp4-D更强。在这些转基因植物中，子叶面积增加(图11)。

本文中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过援引整体引入本文。

工业实用性

根据本发明，发现了具有促进植物细胞核内复制和增加核DNA含量的活性的基因。植物体的尺寸通过组成该植物体的细胞数目和其尺寸确定，核DNA含量增加时，植物细胞变大。因此，使用本发明的基因能育种整体或其部分尺寸增加的植物。例如，已知在番茄中发生核内复制，因此，使用所感兴趣的基因可通过育种改善，例如更大番茄的产量。同样，已知谷粒例如水稻或玉米的胚乳细胞随DNA成分增加而发育。这样，感兴趣的基因可用于增加胚乳尺寸。如果使用ILP基因加速核内复制，与物质产量相关的基因也可加倍。这可以提高植物生产的多种有用物质的产量(例如花青苷或黄酮类化合物)。

已知核内复制加速的突变体对紫外线等更为耐受(Hase Y，TrungK.H.，Matsunaga T，Tanaka A，2006，A mutation in the uvi4 genepromotes progression of endo-reduplication and confers increasedtolerance towards ultraviolet B light，Plant J.46：317-326)。这是因为DNA损伤可通过每一细胞基因数量的增加得到补充。作为二级效应，使用ILP基因可育种对能造成DNA损伤的胁迫(例如紫外线)耐受的作物。

序列表

<110>RIKEN

<120>具有促进核内复制活性的基因

<130>PH-3317-PCT

<150>JP2007-085500

<151>2007-03-28

<160>49

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>3066

<212>DNA

<213>拟南芥属

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2727)

<400>1

atg gga agt aac cgt cct aag aat ttc cgg cgg cga ggg gac gac ggc 48

Met Gly Ser Asn Arg Pro Lys Asn Phe Arg Arg Arg Gly Asp Asp Gly

1 5 10 15

ggc gat gaa att gac ggt aaa gtt gct acc ccc tcg tca aaa ccg act 96

Gly Asp Glu Ile Asp Gly Lys Val Ala Thr Pro Ser Ser Lys Pro Thr

20 25 30

tcg act ctt tcc tcc tcg aaa cct aaa aca ctc tca gcc tcg gcc ccg 144

Ser Thr Leu Ser Ser Ser Lys Pro Lys Thr Leu Ser Ala Ser Ala Pro

35 40 45

aag aag aaa ctc cta agt ttc gcc gac gac gag gag gag gaa gaa gat 192

Lys Lys Lys Leu Leu Ser Phe Ala Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp

50 55 60

gga gct ccc cgt gtg acg ata aag cct aag aac ggc aga gac cgt gtc 240

Gly Ala Pro Arg Val Thr Ile Lys Pro Lys Asn Gly Arg Asp Arg Val

65 70 75 80

aaa tcc tct tcc cgt ctc ggc gtt tcg gga tct tct cac aga cac tct 288

Lys Ser Ser Ser Arg Leu Gly Val Ser Gly Ser Ser His Arg His Ser

85 90 95

tca acc aag gaa cgt cgt ccc gct tct tct aac gtg ctt cct cag gcc 336

Ser Thr Lys Glu Arg Arg Pro Ala Ser Ser Asn Val Leu Pro Gln Ala

100 105 110

ggc tct tat tcg aaa gag gcg ctg ctc gag ctc cag aag aac aca cgg 384

Gly Ser Tyr Ser Lys Glu Ala Leu Leu Glu Leu Gln Lys Asn Thr Arg

115 120 125

acg ctt cct tat tct cgc tct agt gcc aat gcc gag ccg aag gta gtg 432

Thr Leu Pro Tyr Ser Arg Ser Ser Ala Asn Ala Glu Pro Lys Val Val

130 135 140

ctt aag ggt tta atc aaa cct ccg cag gat cat gag cag cag agt ctg 480

Leu Lys Gly Leu Ile Lys Pro Pro Gln Asp His Glu Gln Gln Ser Leu

145 150 155 160

aag gat gta gtt aaa cag gtt tcg gat ttg gac ttc gat gag gaa ggg 528

Lys Asp Val Val Lys Gln Val Ser Asp Leu Asp Phe Asp Glu Glu Gly

165 170 175

gaa gaa gag cag cat gaa gat gcg ttt gct gat cag gca gcg att att 576

Glu Glu Glu Gln His Glu Asp Ala Phe Ala Asp Gln Ala Ala Ile Ile

180 185 190

aga gcc aag aaa gag agg atg agg cag tca cgt tca gca ccg gcg cct 624

Arg Ala Lys Lys Glu Arg Met Arg Gln Ser Arg Ser Ala Pro Ala Pro

195 200 205

gat tac ata tca cta gat ggt ggt atc gta aat cat tct gct gtt gaa 672

Asp Tyr Ile Ser Leu Asp Gly Gly Ile Val Asn His Ser Ala Val Glu

210 215 220

gga gtc agc gac gag gat gcg gat ttt cag gga att ttc gtc ggt ccg 720

Gly Val Ser Asp Glu Asp Ala Asp Phe Gln Gly Ile Phe Val Gly Pro

225 230 235 240

aga cct cag aaa gat gat aag aaa ggt gtg ttt gat ttc ggt gat gaa 768

Arg Pro Gln Lys Asp Asp Lys Lys Gly Val Phe Asp Phe Gly Asp Glu

245 250 255

aat cct act gct aaa gaa acc acg aca agt agt att tat gag gat gag 816

Asn Pro Thr Ala Lys Glu Thr Thr Thr Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Glu

260 265 270

gat gaa gaa gat aag ttg tgg gag gag gag caa ttt aag aag ggt att 864

Asp Glu Glu Asp Lys Leu Trp Glu Glu Glu Gln Phe Lys Lys Gly Ile

275 280 285

ggt aaa aga atg gac gaa ggg tcg cat agg act gta act agt aat ggg 912

Gly Lys Arg Met Asp Glu Gly Ser His Arg Thr Val Thr Ser Asn Gly

290 295 300

att ggc gtg cct ttg cat tct aaa cag cag aca ctg cca caa cag caa 960

Ile Gly Val Pro Leu His Ser Lys Gln Gln Thr Leu Pro Gln Gln Gln

305 310 315 320

ccg cag atg tat gct tat cat gcc ggg aca cca atg ccg aat gtt tct 1008

Pro Gln Met Tyr Ala Tyr His Ala Gly Thr Pro Met Pro Asn Val Ser

325 330 335

gtc gct cct acc att ggc cca gct act agt gtt gat aca tta cca atg 1056

Val Ala Pro Thr Ile Gly Pro Ala Thr Ser Val Asp Thr Leu Pro Met

340 345 350

tca caa caa gcc gag ctt gcc aag aag gca ttg aaa gac aat gtt aag 1104

Ser Gln Gln Ala Glu Leu Ala Lys Lys Ala Leu Lys Asp Asn Val Lys

355 360 365

aag ctt aag gaa tct cat gca aaa acg tta tcc tcc ctt acc aag aca 1152

Lys Leu Lys Glu Ser His Ala Lys Thr Leu Ser Ser Leu Thr Lys Thr

370 375 380

gat gag aat ctg act gcg tcg ttg atg agt atc aca gct ctt gaa agt 1200

Asp Glu Asn Leu Thr Ala Ser Leu Met Ser Ile Thr Ala Leu Glu Ser

385 390 395 400

tcg cta tct gca gct gga gat aag tat gtg ttc atg caa aaa ctc aga 1248

Ser Leu Ser Ala Ala Gly Asp Lys Tyr Val Phe Met Gln Lys Leu Arg

405 410 415

gac ttc att tct gtt atc tgt gac ttc atg cag aat aag ggt tca tta 1296

Asp Phe Ile Ser Val Ile Cys Asp Phe Met Gln Asn Lys Gly Ser Leu

420 425 430

att gaa gaa att gaa gat caa atg aag gaa ctt aac gaa aaa cat gct 1344

Ile Glu Glu Ile Glu Asp Gln Met Lys Glu Leu Asn Glu Lys His Ala

435 440 445

tta tct att cta gaa agg aga att gca gat aac aat gat gaa atg ata 1392

Leu Ser Ile Leu Glu Arg Arg Ile Ala Asp Asn Asn Asp Glu Met Ile

450 455 460

gag ttg ggg gcc gca gtg aaa gca gca atg aca gtt cta aac aaa cat 1440

Glu Leu Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala Met Thr Val Leu Asn Lys His

465 470 475 480

gga agc agt agt tca gtg att gct gct gcc aca ggt gct gcg ttg gct 1488

Gly Ser Ser Ser Ser Val Ile Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Leu Ala

485 490 495

gcc tct act tct ata agg cag cag atg aat caa cca gtt aag ctt gat 1536

Ala Ser Thr Ser Ile Arg Gln Gln Met Asn Gln Pro Val Lys Leu Asp

500 505 510

gaa ttt ggc aga gac gaa aat ctg cag aag cgc agg gaa gtg gaa cag 1584

Glu Phe Gly Arg Asp Glu Asn Leu Gln Lys Arg Arg Glu Val Glu Gln

515 520 525

agg gct gca gcc cgg cag aaa agg cga gct cga ttt gaa aat aag cgt 1632

Arg Ala Ala Ala Arg Gln Lys Arg Arg Ala Arg Phe Glu Asn Lys Arg

530 535 540

gca tca gct atg gag gtt gat gga cct tct ctg aaa ata gaa gga gaa 1680

Ala Ser Ala Met Glu Val Asp Gly Pro Ser Leu Lys Ile Glu Gly Glu

545 550 555 560

tca agc act gat gag agt gac act gag act tca gct tat aag gag aca 1728

Ser Ser Thr Asp Glu Ser Asp Thr Glu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Thr

565 570 575

aga gat agc tta ctt cag tgt gct gat aag gtc ttt agt gat gca tct 1776

Arg Asp Ser Leu Leu Gln Cys Ala Asp Lys Val Phe Ser Asp Ala Ser

580 585 590

gag gag tac tcc cag ctt tca aag gtg aag gcg aga ttt gag agg tgg 1824

Glu Glu Tyr Ser Gln Leu Ser Lys Val Lys Ala Arg Phe Glu Arg Trp

595 600 605

aag cga gac tat tca tca act tat cgt gat gct tac atg tct ttg acc 1872

Lys Arg Asp Tyr Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Ala Tyr Met Ser Leu Thr

610 615 620

gtt cct tcc atc ttt tca cct tat gta aga ctg gag ctt ttg aaa tgg 1920

Val Pro Ser Ile Phe Ser Pro Tyr Val Arg Leu Glu Leu Leu Lys Trp

625 630 635 640

gat cct ctt cat caa gat gtg gat ttc ttt gac atg aaa tgg cat ggg 1968

Asp Pro Leu His Gln Asp Val Asp Phe Phe Asp Met Lys Trp His Gly

645 650 655

ttg ctt ttt gat tac ggg aag cca gaa gat ggg gat gat ttt gca cca 2016

Leu Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Pro Glu Asp Gly Asp Asp Phe Ala Pro

660 665 670

gat gat act gat gcc aac ctt gtc cct gag cta gta gaa aag gtt gca 2064

Asp Asp Thr Asp Ala Asn Leu Val Pro Glu Leu Val Glu Lys Val Ala

675 680 685

att cca att ttg cac cat cag ata gtt cgt tgc tgg gat ata ctt agc 2112

Ile Pro Ile Leu His His Gln Ile Val Arg Cys Trp Asp Ile Leu Ser

690 695 700

acc cgg gag aca aga aat gct gtt gct gct aca agc ttg gtg aca aat 2160

Thr Arg Glu Thr Arg Asn Ala Val Ala Ala Thr Ser Leu Val Thr Asn

705 710 715 720

tat gtt tct gct tcg agt gag gcc tta gca gaa cta ttt gct gct att 2208

Tyr Val Ser Ala Ser Ser Glu Ala Leu Ala Glu Leu Phe Ala Ala Ile

725 730 735

cgt gct cgc ctt gtt gaa gcc att gca gct att agt gtt ccg aca tgg 2256

Arg Ala Arg Leu Val Glu Ala Ile Ala Ala Ile Ser Val Pro Thr Trp

740 745 750

gat cct ctg gta ttg aag gct gta cct aat act cca caa gtt gcc gca 2304

Asp Pro Leu Val Leu Lys Ala Val Pro Asn Thr Pro Gln Val Ala Ala

755 760 765

tat agg ttt ggg aca tca gtc cgt ctt atg aga aat ata tgt atg tgg 2352

Tyr Arg Phe Gly Thr Ser Val Arg Leu Met Arg Asn Ile Cys Met Trp

770 775 780

aaa gac atc ctg gcg ctt cca gtg ttg gag aac ttg gct ctt agt gac 2400

Lys Asp Ile Leu Ala Leu Pro Val Leu Glu Asn Leu Ala Leu Ser Asp

785 790 795 800

ctt ttg ttt gga aaa gtt cta ccc cat gtc aga agc att gca tca aat 2448

Leu Leu Phe Gly Lys Val Leu Pro His Val Arg Ser Ile Ala Ser Asn

805 810 815

atc cat gat gct gtg aca aga act gaa aga atc gtt gct tct ttg tct 2496

Ile His Asp Ala Val Thr Arg Thr Glu Arg Ile Val Ala Ser Leu Ser

820 825 830

gga gtg tgg aca gga cca agc gtc aca cga acc cac agt cgt ccg ctg 2544

Gly Val Trp Thr Gly Pro Ser Val Thr Arg Thr His Ser Arg Pro Leu

835 840 845

caa cct ctt gtg gat tgt act ctg aca ctt aga aga att ctc gag aaa 2592

Gln Pro Leu Val Asp Cys Thr Leu Thr Leu Arg Arg Ile Leu Glu Lys

850 855 860

agg ctt ggc tca gga ctg gac gat gcg gaa acc act ggt ctc gcc cgc 2640

Arg Leu Gly Ser Gly Leu Asp Asp Ala Glu Thr Thr Gly Leu Ala Arg

865 870 875 880

aga tta aag aga ata cta gtc gag ctc cat gaa cat gac cac gcc agg 2688

Arg Leu Lys Arg Ile Leu Val Glu Leu His Glu His Asp His Ala Arg

885 890 895

gaa att gtc aga aca ttc aat ctt aag gag gca gtt tga ccaaaagttt 2737

Glu Ile Val Arg Thr Phe Asn Leu Lys Glu Ala Val

900 905

attgatggga aactggaaag tcaacacaga aatctttagc ctcaggttat caggctcacc 2797

tttcgggctg taccagcaaa ggctcatcga tttcaacatc gaggattaca agattttccc 2857

taggattatt aggctagcac caaaaccttc cggaatccat tttcagacac agaagagttt 2917

tagtactttg gcttaatgta agtgtaacct cttgtggttg tagaaaacct tataataaat 2977

ataagctaaa gtatctcgag tcttttattt ttccctttat atctgtatga gtttagattt 3037

agcaaagaca atattatttc tatgaatat 3066

<210>2

<211>908

<212>PRT

<213>拟南芥属

<400>2

Met Gly Ser Asn Arg Pro Lys Asn Phe Arg Arg Arg Gly Asp Asp Gly

1 5 10 15

Gly Asp Glu Ile Asp Gly Lys Val Ala Thr Pro Ser Ser Lys Pro Thr

20 25 30

Ser Thr Leu Ser Ser Ser Lys Pro Lys Thr Leu Ser Ala Ser Ala Pro

35 40 45

Lys Lys Lys Leu Leu Ser Phe Ala Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp

50 55 60

Gly Ala Pro Arg Val Thr Ile Lys Pro Lys Asn Gly Arg Asp Arg Val

65 70 75 80

Lys Ser Ser Ser Arg Leu Gly Val Ser Gly Ser Ser His Arg His Ser

85 90 95

Ser Thr Lys Glu Arg Arg Pro Ala Ser Ser Asn Val Leu Pro Gln Ala

100 105 110

Gly Ser Tyr Ser Lys Glu Ala Leu Leu Glu Leu Gin Lys Asn Thr Arg

115 120 125

Thr Leu Pro Tyr SerArg Ser Ser Ala Asn Ala Glu Pro Lys Val Val

130 1351 40

Leu Lys Gly Leu Ile Lys Pro Pro Gln Asp His Glu Gln Gln Ser Leu

145 150 155 160

Lys Asp Val Val Lys Gln Val Ser Asp Leu Asp Phe Asp Glu Glu Gly

165 170 175

Glu Glu Glu Gln His Glu Asp Ala Phe Ala Asp Gln Ala Ala Ile Ile

180 185 190

Arg Ala Lys Lys Glu Arg Met Arg Gln Ser Arg Ser Ala Pro Ala Pro

195 200 205

Asp Tyr Ile Ser Leu Asp Gly Gly Ile Val Asn His Ser Ala Val Glu

210 215 220

Gly Val Ser Asp Glu Asp Ala Asp Phe Gln Gly Ile Phe Val Gly Pro

225 230 235 240

Arg Pro Gln Lys Asp Asp Lys Lys Gly Val Phe Asp Phe Gly Asp Glu

245 250 255

Asn Pro Thr Ala Lys Glu Thr Thr Thr Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Glu

260 265 270

Asp Glu Glu Asp Lys Leu Trp Glu Glu Glu Gln Phe Lys Lys Gly Ile

275 280 285

Gly Lys Arg Met Asp Glu Gly Ser His Arg Thr Val Thr Ser Asn Gly

290 295 300

Ile Gly Val Pro Leu His Ser Lys Gln Gln Thr Leu Pro Gln Gln Gln

305 310 315 320

Pro Gln Met Tyr Ala Tyr His Ala Gly Thr Pro Met Pro Asn Val Ser

325 330 335

Val Ala Pro Thr Ile Gly Pro Ala Thr Ser Val Asp Thr Leu Pro Met

340 345 350

Ser Gln Gln Ala Glu Leu Ala Lys Lys Ala Leu Lys Asp Asn Val Lys

355 360 365

Lys Leu Lys Glu Ser His Ala Lys Thr Leu Ser Ser Leu Thr Lys Thr

370 375 380

Asp Glu Asn Leu Thr Ala Ser Leu Met Ser Ile Thr Ala Leu Glu Ser

385 390 395 400

Ser Leu Ser Ala Ala Gly Asp Lys Tyr Val Phe Met Gln Lys Leu Arg

405 410 415

Asp Phe Ile Ser Val Ile Cys Asp Phe Met Gln Asn Lys Gly Ser Leu

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Ile Glu Glu Ile Glu Asp Gln Met Lys Glu Leu Asn Glu Lys His Ala

435 440 445

Leu Ser Ile Leu Glu Arg Arg Ile Ala Asp Asn Asn Asp Glu Met Ile

450 455 460

Glu Leu Gly Ala Ala Val Lys Ala Ala Met Thr Val Leu Asn Lys His

465 470 475 480

Gly Ser Ser Ser Ser Val Ile Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Leu Ala

485 490 495

Ala Ser Thr Ser Ile Arg Gln Gln Met Asn Gln Pro Val Lys Leu Asp

500 505 510

Glu Phe Gly Arg Asp Glu Asn Leu Gln Lys Arg Arg Glu Val Glu Gln

515 520 525

Arg Ala Ala Ala Arg Gln Lys Arg Arg Ala Arg Phe Glu Asn Lys Arg

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Ser Ser Thr Asp Glu Ser Asp Thr Glu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Thr

565 570 575

Arg Asp Ser Leu Leu Gln Cys Ala Asp Lys Val Phe Ser Asp Ala Ser

580 585 590

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595 600 605

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Val Pro Ser Ile Phe Ser Pro Tyr Val Arg Leu Glu Leu Leu Lys Trp

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Asp Pro Leu His Gln Asp Val Asp Phe Phe Asp Met Lys Trp His Gly

645 650 655

Leu Leu Phe Asp Tyr Gly Lys Pro Glu Asp Gly Asp Asp Phe Ala Pro

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Asp Asp Thr Asp Ala Asn Leu Val Pro Glu Leu Val Glu Lys Val Ala

675 680 685

Ile Pro Ile Leu His His Gln Ile Val Arg Cys Trp Asp Ile Leu Ser

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Thr Arg Glu Thr Arg Asn Ala Val Ala Ala Thr Ser Leu Val Thr Asn

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Tyr Val Ser Ala Ser Ser Glu Ala Leu Ala Glu Leu Phe Ala Ala Ile

725 730 735

Arg Ala Arg Leu Val Glu Ala Ile Ala Ala Ile Ser Val Pro Thr Trp

740 745 750

Asp Pro Leu Val Leu Lys Ala Val Pro Asn Thr Pro Gln Val Ala Ala

755 760 765

Tyr Arg Phe Gly Thr Ser Val Arg Leu Met Arg Asn Ile Cys Met Trp

770 775 780

Lys Asp Ile Leu Ala Leu Pro Val Leu Glu Asn Leu Ala Leu Ser Asp

785 790 795 800

Leu Leu Phe Gly Lys Val Leu Pro His Val Arg Ser Ile Ala Ser Asn

805 810 815

Ile His Asp Ala Val Thr Arg Thr Glu Arg Ile Val Ala Ser Leu Ser

820 825 830

Gly Val Trp Thr Gly Pro Ser Val Thr Arg Thr His Ser Arg Pro Leu

835 840 845

Gln Pro Leu Val Asp Cys Thr Leu Thr Leu Arg Arg Ile Leu Glu Lys

850 855 860

Arg Leu Gly Ser Gly Leu Asp Asp Ala Glu Thr Thr Gly Leu Ala Arg

865 870 875 880

Arg Leu Lys Arg Ile Leu Val Glu Leu His Glu His Asp His Ala Arg

885 890 895

Glu Ile Val Arg Thr Phe Asn Leu Lys Glu Ala Val

900 905

<210>3

<211>1328

<212>DNA

<213>拟南芥属

<220>

<221>CDS

<222>(66)..(1040)

<400>3

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ggaaa atg ggt agc aag atg ttg ttt agt ttg aca agt cct cga ctt ttc 110

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1 5 10 15

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20 25 30

tcg ccg tct tcg agg act caa tgg act cag ctc agc cct gga aaa tcg 206

Ser Pro Ser Ser Arg Thr Gln Trp Thr Gln Leu Ser Pro Gly Lys Ser

35 40 45

att tct ttg aga aga aga gtc ttc ttg ttg cct gct aaa gcc aca aca 254

Ile Ser Leu Arg Arg Arg Val Phe Leu Leu Pro Ala Lys Ala Thr Thr

50 55 60

gag caa tca ggt cca gta gga gga gac aac gtc gat agc aat gtt ttg 302

Glu Gln Ser Gly Pro Val Gly Gly Asp Asn Val Asp Ser Asn Val Leu

65 70 75

ccc tat tgt agc atc aac aag gct gag aag aaa aca att ggt gaa atg 350

Pro Tyr Cys Ser Ile Asn Lys Ala Glu Lys Lys Thr Ile Gly Glu Met

80 85 90 95

gaa caa gag ttt ctc caa gcg ttg caa tct ttc tat tat gat ggc aaa 398

Glu Gln Glu Phe Leu Gln Ala Leu Gln Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys

100 105 110

gcg atc atg tct aat gaa gat ttt gat aac ctt aaa gaa gag tta atg 446

Ala Ile Met Ser Asn Glu Asp Phe Asp Asn Leu Lys Glu Glu Leu Met

115 120 125

tgg gaa gga agc agt gtt gtg atg cta agt tcc gat gaa caa aga ttc 494

Trp Glu Gly Ser Ser Val Val Met Leu Ser Ser Asp Glu Gln Arg Phe

130 135 140

ttg gaa gct tcc atg gct tat gtt tct gga aat cca atc ttg aat gat 542

Leu Glu Ala Ser Met Ala Tyr Val Ser Gly Asn Pro Ile Leu Asn Asp

145 150 155

gaa gaa tat gat aag ctc aaa ctc aaa cta aag att gat ggt agc gac 590

Glu Glu Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Ile Asp Gly Ser Asp

160 165 170 175

att gtg agc gag ggt cca aga tgc agt ctc cgt agt aaa aag gtg tat 638

Ile Val Ser Glu Gly Pro Arg Cys Ser Leu Arg Ser Lys Lys Val Tyr

180 185 190

agt gat ctc gct gta gat tat ttc aaa atg tta ttg ttg aat gtt cca 686

Ser Asp Leu Ala Val Asp Tyr Phe Lys Met Leu Leu Leu Asn Val Pro

195 200 205

gca acc gtt gtt gct ctc gga ctc ttt ttc ttc ctg gac gac att aca 734

Ala Thr Val Val Ala Leu Gly Leu Phe Phe Phe Leu Asp Asp Ile Thr

210 215 220

ggt ttt gag atc aca tac atc atg gag ctt cca gaa cca tac agt ttc 782

Gly Phe Glu Ile Thr Tyr Ile Met Glu Leu Pro Glu Pro Tyr Ser Phe

225 230 235

ata ttc act tgg ttc gct gct gtg cct gtg att gta tat ctg gct tta 830

Ile Phe Thr Trp Phe Ala Ala Val Pro Val Ile Val Tyr Leu Ala Leu

240 245 250 255

tca atc acc aaa ttg atc atc aag gac ttc ttg atc ttg aag ggt cct 878

Ser Ile Thr Lys Leu Ile Ile Lys Asp Phe Leu Ile Leu Lys Gly Pro

260 265 270

tgt ccg aat tgt gga acg gaa aac acc tcc ttc ttt gga aca att ctg 926

Cys Pro Asn Cys Gly Thr Glu Asn Thr Ser Phe Phe Gly Thr Ile Leu

275 280 285

tca atc tcc agc ggc ggc aaa acc aac act gtc aaa tgc acc aac tgc 974

Ser Ile Ser Ser Gly Gly Lys Thr Asn Thr Val Lys Cys Thr Asn Cys

290 295 300

gga acc gcg atg gtg tat gac tcg ggt tct agg ttg atc aca ttg cca 1022

Gly Thr Ala Met Val Tyr Asp Ser Gly Ser Arg Leu Ile Thr Leu Pro

305 310 315

gaa gga agc caa gct taa accctgtgag ctagatgaag atgggaaaag 1070

Glu Gly Ser Gln Ala

320

aagaatgggt tttgtcagaa gcaaaataga ttcgaagtta aatgtatatg taagatcttc 1130

catgttagct ctctctcctt cacatgtttt ctgatttgta agtattgtgt gtaagcaata 1190

agagatatat aatatgagca cttcttcatc tacctttgta gataaaaata taatcattac 1250

tatagttaaa tcaaattgta tacatgaaag accaaattcg aatttaaaat gtttatttcg 1310

acaaaaaaaa aaaaaaaa 1328

<210>4

<211>324

<212>PRT

<213>拟南芥属

<400>4

Met Gly Ser Lys Met Leu Phe Ser Leu Thr Ser Pro Arg Leu Phe Ser

1 5 10 15

Ala Val Ser Arg Lys Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Ser Pro Pro Ser

20 25 30

Pro Ser Ser Arg Thr Gln Trp Thr Gln Leu Ser Pro Gly Lys Ser Ile

35 40 45

Ser Leu Arg Arg Arg Val Phe Leu Leu Pro Ala Lys Ala Thr Thr Glu

50 55 60

Gln Ser Gly Pro Val Gly Gly Asp Asn Val Asp Ser Asn Val Leu Pro

65 70 75 80

Tyr Cys Ser Ile Asn Lys Ala Glu Lys Lys Thr Ile Gly Glu Met Glu

85 90 95

Gln Glu Phe Leu Gln Ala Leu Gln Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys Ala

100 105 110

Ile Met Ser Asn Glu Asp Phe Asp Asn Leu Lys Glu Glu Leu Met Trp

115 120 125

Glu Gly Ser Ser Val Val Met Leu Ser Ser Asp Glu Gln Arg Phe Leu

130 135 140

Glu Ala Ser Met Ala Tyr Val Ser Gly Asn Pro Ile Leu Asn Asp Glu

145 150 155 160

Glu Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Ile Asp Gly Ser Asp Ile

165 170 175

Val Ser Glu Gly Pro Arg Cys Ser Leu Arg Ser Lys Lys Val Tyr Ser

180 185 190

Asp Leu Ala Val Asp Tyr Phe Lys Met Leu Leu Leu Asn Val Pro Ala

195 200 205

Thr Val Val Ala Leu Gly Leu Phe Phe Phe Leu Asp Asp Ile Thr Gly

210 215 220

Phe Glu Ile Thr Tyr Ile Met Glu Leu Pro Glu Pro Tyr Ser Phe Ile

225 230 235 240

Phe Thr Trp Phe Ala Ala Val Pro Val Ile Val Tyr Leu Ala Leu Ser

245 250 255

Ile Thr Lys Leu Ile Ile Lys Asp Phe Leu Ile Leu Lys Gly Pro Cys

260 265 270

Pro Asn Cys Gly Thr Glu Asn Thr Ser Phe Phe Gly Thr Ile Leu Ser

275 280 285

Ile Ser Ser Gly Gly Lys Thr Asn Thr Val Lys Cys Thr Asn Cys Gly

290 295 300

Thr Ala Met Val Tyr Asp Ser Gly Ser Arg Leu Ile Thr Leu Pro Glu

305 310 315 320

Gly Ser Gln Ala

<210>5

<211>1119

<212>DNA

<213>拟南芥属

<220>

<221>CDS

<222>(19)..(1098)

<400>5

acccacccca cccaggtt atg gat tct ctc gct ctc gct ccc cag gtt tac 51

Met Asp Ser Leu Ala Leu Ala Pro Gln Val Tyr

1 5 10

agc cgc aag gac aaa tct ctc ggc gtt ctt gtc gcc aat ttc ttg aca 99

Ser Arg Lys Asp Lys Ser Leu Gly Val Leu Val Ala Asn Phe Leu Thr

15 20 25

ctg tat aat cgt ccc gat gtt gat cta ttt ggg ctc gat gat gcc gcc 147

Leu Tyr Asn Arg Pro Asp Val Asp Leu Phe Gly Leu Asp Asp Ala Ala

30 35 40

gcg aaa tta gga gtt gaa cgt cgg cgt att tat gat gtg gtc aat ata 195

Ala Lys Leu Gly Val Glu Arg Arg Arg Ile Tyr Asp Val Val Asn Ile

45 50 55

ttg gag agt att ggg ctt gtt gca aga agt ggg aag aat cag tat tcg 243

Leu Glu Ser Ile Gly Leu Val Ala Arg Ser Gly Lys Asn Gln Tyr Ser

60 65 70 75

tgg aaa ggt ttt gga gct gtt cct cgt gct cta tct gaa ctc aaa gaa 291

Trp Lys Gly Phe Gly Ala Val Pro Arg Ala Leu Ser Glu Leu Lys Glu

80 85 90

gag gga atg aaa gag aag ttt gcg atc gtc cct ttt gtg gcc aag tca 339

Glu Gly Met Lys Glu Lys Phe Ala Ile Val Pro Phe Val Ala Lys Ser

95 100 105

gag atg gtc gtt tat gag aaa gaa gga gaa gaa tct ttc atg tta tct 387

Glu Met Val Val Tyr Glu Lys Glu Gly Glu Glu Ser Phe Met Leu Ser

110 115 120

cct gat gat caa gag ttc tca cca tct ccc aga cct gac aac agg aag 435

Pro Asp Asp Gln Glu Phe Ser Pro Ser Pro Arg Pro Asp Asn Arg Lys

125 130 135

gag aga act ctc tgg cta ctt gca cag aac ttt gtg aag ctg ttt tta 483

Glu Arg Thr Leu Trp Leu Leu Ala Gln Asn Phe Val Lys Leu Phe Leu

140 145 150 155

tgc tct gat gat gat ctg gta aca ttt gat agc gct aca aaa gca ttg 531

Cys Ser Asp Asp Asp Leu Val Thr Phe Asp Ser Ala Thr Lys Ala Leu

160 165 170

ctg aat gag tct cag gat atg aat atg aga aag aaa gtt aga cgc ctt 579

Leu Asn Glu Ser Gln Asp Met Asn Met Arg Lys Lys Val Arg Arg Leu

175 180 185

tac gac att gca aat gtg ttt tcc tca atg aag cta atc gag aag act 627

Tyr Asp Ile Ala Asn Val Phe Ser Ser Met Lys Leu Ile Glu Lys Thr

190 195 200

cat gtc cca gag act aag aag ccg gca tat agg tgg ttg gga tct aaa 675

His Val Pro Glu Thr Lys Lys Pro Ala Tyr Arg Trp Leu Gly Ser Lys

205 210 215

acc ata ttt gaa aac aga ttc att gat ggt tct gca agc tta tgt gat 723

Thr Ile Phe Glu Asn Arg Phe Ile Asp Gly Ser Ala Ser Leu Cys Asp

220 225 230 235

cgt aat gtg cct aaa aag cgg gca ttt ggg acc gaa ctc aca aac gtt 771

Arg Asn Val Pro Lys Lys Arg Ala Phe Gly Thr Glu Leu Thr Asn Val

240 245 250

aac gca aag aga aac aaa tca ggt tgt tct aaa gaa gac agc aag cgt 819

Asn Ala Lys Arg Asn Lys Ser Gly Cys Ser Lys Glu Asp Ser Lys Arg

255 260 265

aat gga aat caa aac aca agc att gtt atc aag caa gaa caa tgt gat 867

Asn Gly Asn Gln Asn Thr Ser Ile Val Ile Lys Gln Glu Gln Cys Asp

270 275 280

gat gtg aaa ccg gac gtg aag aat ttt gcc tct gga tca tcc act cct 915

Asp Val Lys Pro Asp Val Lys Asn Phe Ala Ser Gly Ser Ser Thr Pro

285 290 295

gca ggc act tct gag agt aac gat atg gga aac aac att agg cca aga 963

Ala Gly Thr Ser Glu Ser Asn Asp Met Gly Asn Asn Ile Arg Pro Arg

300 305 310 315

ggt aga ctt gga gtt atc gaa gcc ctt tct act ctt tac caa cca tca 1011

Gly Arg Leu Gly Val Ile Glu Ala Leu Ser Thr Leu Tyr Gln Pro Ser

320 325 330

tat tgc aat cct gag tta ctt ggt ctt ttt gcg cat tac aac gag aca 1059

Tyr Cys Asn Pro Glu Leu Leu Gly Leu Phe Ala His Tyr Asn Glu Thr

335 340 345

ttt agg tca tat caa gaa gag ttt ggt cgg gag aaa tga cttaatcatc 1108

Phe Arg Ser Tyr Gln Glu Glu Phe Gly Arg Glu Lys

350 355

aggtagatta a 1119

<210>6

<211>359

<212>PRT

<213>拟南芥属

<400>6

Met Asp Ser Leu Ala Leu Ala Pro Gln Val Tyr Ser Arg Lys Asp Lys

1 5 10 15

Ser Leu Gly Val Leu Val Ala Asn Phe Leu Thr Leu Tyr Asn Arg Pro

20 25 30

Asp Val Asp Leu Phe Gly Leu Asp Asp Ala Ala Ala Lys Leu Gly Val

35 40 45

Glu Arg Arg Arg Ile Tyr Asp Val Val Asn Ile Leu Glu Ser Ile Gly

50 55 60

Leu Val Ala Arg Ser Gly Lys Asn Gln Tyr Ser Trp Lys Gly Phe Gly

65 70 75 80

Ala Val Pro Arg Ala Leu Ser Glu Leu Lys Glu Glu Gly Met Lys Glu

85 90 95

Lys Phe Ala Ile Val Pro Phe Val Ala Lys Ser Glu Met Val Val Tyr

100 105 110

Glu Lys Glu Gly Glu Glu Ser Phe Met Leu Ser Pro Asp Asp Gln Glu

115 120 125

Phe Ser Pro Ser Pro Arg Pro Asp Asn Arg Lys Glu Arg Thr Leu Trp

130 135 140

Leu Leu Ala Gln Asn Phe Val Lys Leu Phe Leu Cys Ser Asp Asp Asp

145 150 155 160

Leu Val Thr Phe Asp Ser Ala Thr Lys Ala Leu Leu Asn Glu Ser Gln

165 170 175

Asp Met Asn Met Arg Lys Lys Val Arg Arg Leu Tyr Asp Ile Ala Asn

180 185 190

Val Phe Ser Ser Met Lys Leu Ile Glu Lys Thr His Val Pro Glu Thr

195 200 205

Lys Lys Pro Ala Tyr Arg Trp Leu Gly Ser Lys Thr Ile Phe Glu Asn

210 215 220

Arg Phe Ile Asp Gly Ser Ala Ser Leu Cys Asp Arg Asn Val Pro Lys

225 230 235 240

Lys Arg Ala Phe Gly Thr Glu Leu Thr Asn Val Asn Ala Lys Arg Asn

245 250 255

Lys Ser Gly Cys Ser Lys Glu Asp Ser Lys Arg Asn Gly Asn Gln Asn

260 265 270

Thr Ser Ile Val Ile Lys Gln Glu Gln Cys Asp Asp Val Lys Pro Asp

275 280 285

Val Lys Asn Phe Ala Ser Gly Ser Ser Thr Pro Ala Gly Thr Ser Glu

290 295 300

Ser Asn Asp Met Gly Asn Asn Ile Arg Pro Arg Gly Arg Leu Gly Val

305 310 315 320

Ile Glu Ala Leu Ser Thr Leu Tyr Gln Pro Ser Tyr Cys Asn Pro Glu

325 330 335

Leu Leu Gly Leu Phe Ala His Tyr Asn Glu Thr Phe Arg Ser Tyr Gln

340 345 350

Glu Glu Phe Gly Arg Glu Lys

355

<210>7

<211>2010

<212>DNA

<213>拟南芥属

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2010)

<400>7

atg aag cag aag ggt ttt aaa gag aga ggt gtt gta gtg ggg aag aaa 48

Met Lys Gln Lys Gly Phe Lys Glu Arg Gly Val Val Val Gly Lys Lys

1 5 10 15

gta atg gtt gct gtt aga gct tca aag gag atc cca aaa gca gct ctt 96

Val Met Val Ala Val Arg Ala Ser Lys Glu Ile Pro Lys Ala Ala Leu

20 25 30

tta tgg act tta act cat gtt gtt caa cct gga gat cga att aga ctt 144

Leu Trp Thr Leu Thr His Val Val Gln Pro Gly Asp Arg Ile Arg Leu

35 40 45

ctt gtt gtt gtt cct tct aat tac aca agt aaa aag att tgg gga ttt 192

Leu Val Val Val Pro Ser Asn Tyr Thr Ser Lys Lys Ile Trp Gly Phe

50 55 60

tcg agg ttc act agt gac tgt gca tca ggt tat gga aga ttt ctt gct 240

Ser Arg Phe Thr Ser Asp Cys Ala Ser Gly Tyr Gly Arg Phe Leu Ala

65 70 75 80

gga acg aat tcg gat agg aaa gat gat att cat gag tca tgt tct cag 288

Gly Thr Asn Ser Asp Arg Lys Asp Asp Ile His Glu Ser Cys Ser Gln

85 90 95

atg atg ttt cag tta cac aat gtt tat gat gca gag aag ata aat gtc 336

Met Met Phe Gln Leu His Asn Val Tyr Asp Ala Glu Lys Ile Asn Val

100 105 110

aga atc aaa att gtt ttt gct tca ctt gat gga gtt att gct gct gaa 384

Arg Ile Lys Ile Val Phe Ala Ser Leu Asp Gly Val Ile Ala Ala Glu

115 120 125

gct aag aaa tcc aac tca aac tgg gtg att tta gac agg gga ctg aag 432

Ala Lys Lys Ser Asn Ser Asn Trp Val Ile Leu Asp Arg Gly Leu Lys

130 135 140

tat gag aag aaa tgc tgt att gag caa ttg gag tgc aat ctt gta gta 480

Tyr Glu Lys Lys Cys Cys Ile Glu Gln Leu Glu Cys Asn Leu Val Val

145 150 155 160

atc aag aag tca cag cca aag gtt ctt cgt ctc aat ttg gtg aaa aat 528

Ile Lys Lys Ser Gln Pro Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Val Lys Asn

165 170 175

gca gat aca gag cat cca gaa gct ata tca agg tta gct tca aag tct 576

Ala Asp Thr Glu His Pro Glu Ala Ile Ser Arg Leu Ala Ser Lys Ser

180 185 190

gtc gag tct cgg aga agc tca aga act gga aaa aag ttg agg gaa ccg 624

Val Glu Ser Arg Arg Ser Ser Arg Thr Gly Lys Lys Leu Arg Glu Pro

195 200 205

ttt gtg act cca gct agc agt cca gac caa gaa gtt tct tca cat act 672

Phe Val Thr Pro Ala Ser Ser Pro Asp Gln Glu Val Ser Ser His Thr

210 215 220

gat ata ggg act tca tca ata tct agc tct gat gct gga gcc tca ccg 720

Asp Ile Gly Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser Pro

225 230 235 240

ttt tta gct tct cga gtc ttt gag ggt ctc aag aaa gag aat ttg tgg 768

Phe Leu Ala Ser Arg Val Phe Glu Gly Leu Lys Lys Glu Asn Leu Trp

245 250 255

gtc aat gat gga agc aag agt ttc ttt gaa tcc gat tct gac tcg gat 816

Val Asn Asp Gly Ser Lys Ser Phe Phe Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp

260 265 270

ggt gaa aag tgg agt cct tta tca atg gca tcc tca tct tct cat cct 864

Gly Glu Lys Trp Ser Pro Leu Ser Met Ala Ser Ser Ser Ser His Pro

275 280 285

gtg aca aca gct gat ctt ctg agt cct agt ggg gat tta tcg aaa gct 912

Val Thr Thr Ala Asp Leu Leu Ser Pro Ser Gly Asp Leu Ser Lys Ala

290 295 300

cat acc gaa act ccg aga aaa tca aga ttt gcg gtt ctt agg ctc gct 960

His Thr Glu Thr Pro Arg Lys Ser Arg Phe Ala Val Leu Arg Leu Ala

305 310 315 320

tta tcg agg aaa gaa cct gaa gca gga aag gaa ata cgt aaa cct gat 1008

Leu Ser Arg Lys Glu Pro Glu Ala Gly Lys Glu Ile Arg Lys Pro Asp

325 330 335

tca tgc tta aac aaa agc gtg agg gaa gtg gtt tct tta tct aga aag 1056

Ser Cys Leu Asn Lys Ser Val Arg Glu Val Val Ser Leu Ser Arg Lys

340 345 350

cca gct cct gga ccg cct cca cta tgt act ata tgt caa cac aag gca 1104

Pro Ala Pro Gly Pro Pro Pro Leu Cys Thr Ile Cys Gln His Lys Ala

355 360 365

cct aaa ttt gga aac cct cca aga tgg ttc act tac agc gaa ctg gag 1152

Pro Lys Phe Gly Asn Pro Pro Arg Trp Phe Thr Tyr Ser Glu Leu Glu

370 375 380

acc gca aca aaa ggt ttt tct aaa ggg agt ttc ttg gct gaa ggt ggt 1200

Thr Ala Thr Lys Gly Phe Ser Lys Gly Ser Phe Leu Ala Glu Gly Gly

385 390 395 400

ttt ggt tcg gtt cac cta gga act tta cca gat ggt caa att att gct 1248

Phe Gly Ser Val His Leu Gly Thr Leu Pro Asp Gly Gln Ile Ile Ala

405 410 415

gtc aaa caa tat aaa att gct agt aca caa gga gac cga gaa ttc tgc 1296

Val Lys Gln Tyr Lys Ile Ala Ser Thr Gln Gly Asp Arg Glu Phe Cys

420 425 430

tct gaa gtt gaa gtc ttg agc tgt gca cag cat cga aat gtt gtt atg 1344

Ser Glu Val Glu Val Leu Ser Cys Ala Gln His Arg Asn Val Val Met

435 440 445

ctt att ggg cta tgt gtt gag gat ggg aaa aga ttg ctt gtt tat gag 1392

Leu Ile Gly Leu Cys Val Glu Asp Gly Lys Arg Leu Leu Val Tyr Glu

450 455 460

tat atc tgc aat gga tca ttg cat tct cat ctt tat ggt atg ggg aga 1440

Tyr Ile Cys Asn Gly Ser Leu His Ser His Leu Tyr Gly Met Gly Arg

465 470 475 480

gag cca ttg gga tgg tca gca cga caa aag att gcg gta gga gca gct 1488

Glu Pro Leu Gly Trp Ser Ala Arg Gln Lys Ile Ala Val Gly Ala Ala

485 490 495

cgt ggg ttg aga tac ctt cat gaa gaa tgc aga gtc ggt tgc atc gtg 1536

Arg Gly Leu Arg Tyr Leu His Glu Glu Cys Arg Val Gly Cys Ile Val

500 505 510

cat agg gat atg cgt cct aac aat att ctc ctc act cat gat ttt gag 1584

His Arg Asp Met Arg Pro Asn Asn Ile Leu Leu Thr His Asp Phe Glu

515 520 525

cct ttg gtt gga gat ttc gga cta gcg aga tgg caa cca gaa gga gat 1632

Pro Leu Val Gly Asp Phe Gly Leu Ala Arg Trp Gln Pro Glu Gly Asp

530 535 540

aaa gga gtg gaa acc cga gtg att gga act ttc ggg tac ttg gca cct 1680

Lys Gly Val Glu Thr Arg Val Ile Gly Thr Phe Gly Tyr Leu Ala Pro

545 550 555 560

gaa tac gca caa agc gga cag att aca gag aaa gca gat gtt tac tca 1728

Glu Tyr Ala Gln Ser Gly Gln Ile Thr Glu Lys Ala Asp Val Tyr Ser

565 570 575

ttt ggg gta gtc tta gtt gag ctt atc aca gga aga aaa gct atg gac 1776

Phe Gly Val Val Leu Val Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys Ala Met Asp

580 585 590

ata aaa cgt cct aaa ggt caa caa tgt ctc acc gaa tgg gca aga cca 1824

Ile Lys Arg Pro Lys Gly Gln Gln Cys Leu Thr Glu Trp Ala Arg Pro

595 600 605

ttg ttg cag aaa caa gcc att aac gaa ctt ctt gat ccg cgt cta atg 1872

Leu Leu Gln Lys Gln Ala Ile Asn Glu Leu Leu Asp Pro Arg Leu Met

610 615 620

aat tgc tac tgt gag caa gaa gtt tat tgt atg gca cta tgt gct tac 1920

Asn Cys Tyr Cys Glu Gln Glu Val Tyr Cys Met Ala Leu Cys Ala Tyr

625 630 635 640

ctc tgc att cgc cgt gac cct aac tca agg cca cga atg tct cag gtg 1968

Leu Cys Ile Arg Arg Asp Pro Asn Ser Arg Pro Arg Met Ser Gln Val

645 650 655

ttg cgg atg tta gaa gga gac gtt gtc atg aat cca ata tag 2010

Leu Arg Met Leu Glu Gly Asp Val Val Met Asn Pro Ile

660 665

<210>8

<211>669

<212>PRT

<213>拟南芥属

<400>8

Met Lys Gln Lys Gly Phe Lys Glu Arg Gly Val Val Val Gly Lys Lys

1 5 10 15

Val Met Val Ala Val Arg Ala Ser Lys Glu Ile Pro Lys Ala Ala Leu

20 25 30

Leu Trp Thr Leu Thr His Val Val Gln Pro Gly Asp Arg Ile Arg Leu

35 40 45

Leu Val Val Val Pro Ser Asn Tyr Thr Ser Lys Lys Ile Trp Gly Phe

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ser Asp Cys Ala Ser Gly Tyr Gly Arg Phe Leu Ala

65 70 75 80

Gly Thr Asn Ser Asp Arg Lys Asp Asp Ile His Glu Ser Cys Ser Gln

85 90 95

Met Met Phe Gln Leu His Asn Val Tyr Asp Ala Glu Lys Ile Asn Val

100 105 110

Arg Ile Lys Ile Val Phe Ala Ser Leu Asp Gly Val Ile Ala Ala Glu

115 120 125

Ala Lys Lys Ser Asn Ser Asn Trp Val Ile Leu Asp Arg Gly Leu Lys

130 135 140

Tyr Glu Lys Lys Cys Cys Ile Glu Gln Leu Glu Cys Asn Leu Val Val

145 150 155 160

Ile Lys Lys Ser Gln Pro Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Val Lys Asn

165 170 175

Ala Asp Thr Glu His Pro Glu Ala Ile Ser Arg Leu Ala Ser Lys Ser

180 185 190

Val Glu Ser Arg Arg Ser Ser Arg Thr Gly Lys Lys Leu Arg Glu Pro

195 200 205

Phe Val Thr Pro Ala Ser Ser Pro Asp Gln Glu Val Ser Ser His Thr

210 215 220

Asp Ile Gly Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser Pro

225 230 235 240

Phe Leu Ala Ser Arg Val Phe Glu Gly Leu Lys Lys Glu Asn Leu Trp

245 250 255

Val Asn Asp Gly Ser Lys Ser Phe Phe Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp

260 265 270

Gly Glu Lys Trp Ser Pro Leu Ser Met Ala Ser Ser Ser Ser His Pro

275 280 285

Val Thr Thr Ala Asp Leu Leu Ser Pro Ser Gly Asp Leu Ser Lys Ala

290 295 300

His Thr Glu Thr Pro Arg Lys Ser Arg Phe Ala Val Leu Arg Leu Ala

305 310 315 320

Leu Ser Arg Lys Glu Pro Glu Ala Gly Lys Glu Ile Arg Lys Pro Asp

325 330 335

Ser Cys Leu Asn Lys Ser Val Arg Glu Val Val Ser Leu Ser Arg Lys

340 345 350

Pro Ala Pro Gly Pro Pro Pro Leu Cys Thr Ile Cys Gln His Lys Ala

355 360 365

Pro Lys Phe Gly Asn Pro Pro Arg Trp Phe Thr Tyr Ser Glu Leu Glu

370 375 380

Thr Ala Thr Lys Gly Phe Ser Lys Gly Ser Phe Leu Ala Glu Gly Gly

385 390 395 400

Phe Gly Ser Val His Leu Gly Thr Leu Pro Asp Gly Gln Ile Ile Ala

405 410 415

Val Lys Gln Tyr Lys Ile Ala Ser Thr Gln Gly Asp Arg Glu Phe Cys

420 425 430

Ser Glu Val Glu Val Leu Ser Cys Ala Gln His Arg Asn Val Val Met

435 440 445

Leu Ile Gly Leu Cys Val Glu Asp Gly Lys Arg Leu Leu Val Tyr Glu

450 455 460

Tyr Ile Cys Asn Gly Ser Leu His Ser His Leu Tyr Gly Met Gly Arg

465 470 475 480

Glu Pro Leu Gly Trp Ser Ala Arg Gln Lys Ile Ala Val Gly Ala Ala

485 490 495

Arg Gly Leu Arg Tyr Leu His Glu Glu Cys Arg Val Gly Cys Ile Val

500 505 510

His Arg Asp Met Arg Pro Asn Asn Ile Leu Leu Thr His Asp Phe Glu

515 520 525

Pro Leu Val Gly Asp Phe Gly Leu Ala Arg Trp Gln Pro Glu Gly Asp

530 535 540

Lys Gly Val Glu Thr Arg Val Ile Gly Thr Phe Gly Tyr Leu Ala Pro

545 550 555 560

Glu Tyr Ala Gln Ser Gly Gln Ile Thr Glu Lys Ala Asp Val Tyr Ser

565 570 575

Phe Gly Val Val Leu Val Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys Ala Met Asp

580 585 590

Ile Lys Arg Pro Lys Gly Gln Gln Cys Leu Thr Glu Trp Ala Arg Pro

595 600 605

Leu Leu Gln Lys Gln Ala Ile Asn Glu Leu Leu Asp Pro Arg Leu Met

610 615 620

Asn Cys Tyr Cys Glu Gln Glu Val Tyr Cys Met Ala Leu Cys Ala Tyr

625 630 635 640

Leu Cys Ile Arg Arg Asp Pro Asn Ser Arg Pro Arg Met Ser Gln Val

645 650 655

Leu Arg Met Leu Glu Gly Asp Val Val Met Asn Pro Ile

660 665

<210>9

<211>417

<212>DNA

<213>拟南芥属

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(417)

<400>9

atg gtg aat caa aga aag cta caa gaa gaa gaa gag gaa aag gag aat 48

Met Val Asn Gln Arg Lys Leu Gln Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Asn

1 5 10 15

tat cct ctc att aca acc aaa gta gtt gag tat ttg cag cca gta atg 96

Tyr Pro Leu Ile Thr Thr Lys Val Val Glu Tyr Leu Gln Pro Val Met

20 25 30

tgt cga gag ctt ctc tgc aaa ttt cca gat aac tct gct ttt gga ttc 144

Cys Arg Glu Leu Leu Cys Lys Phe Pro Asp Asn Ser Ala Phe Gly Phe

35 40 45

gac tac tca cag agc tct ctt tgg tct cct ctc ttg cct cga aat tac 192

Asp Tyr Ser Gln Ser Ser Leu Trp Ser Pro Leu Leu Pro Arg Asn Tyr

50 55 60

gcc agt cct tca gat cta gac tcc gac agt tgc gtt tgt cgg aat ctt 240

Ala Ser Pro Ser Asp Leu Asp Ser Asp Ser Cys Val Cys Arg Asn Leu

65 70 75 80

aag cta agg gag ttt caa gta ggc aag aag aag aag atg aag atg atg 288

Lys Leu Arg Glu Phe Gln Val Gly Lys Lys Lys Lys Met Lys Met Met

85 90 95

tca atg aag aag aac aag aag aag agt aaa tta ctg aaa cta gac ata 336

Ser Met Lys Lys Asn Lys Lys Lys Ser Lys Leu Leu Lys Leu Asp Ile

100 105 110

cct tca atg aag aat gat gat tct tcc cct aaa att ggc tgt ttt ccc 384

Pro Ser Met Lys Asn Asp Asp Ser Ser Pro Lys Ile Gly Cys Phe Pro

115 120 125

tct ccc tac cca agg gat gga atg gtg tgt taa 417

Ser Pro Tyr Pro Arg Asp Gly Met Val Cys

130 135

<210>10

<211>138

<212>PRT

<213>拟南芥属

<400>10

Met Val Asn Gln Arg Lys Leu Gln Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Asn

1 5 10 15

Tyr Pro Leu Ile Thr Thr Lys Val Val Glu Tyr Leu Gln Pro Val Met

20 25 30

Cys Arg Glu Leu Leu Cys Lys Phe Pro Asp Asn Ser Ala Phe Gly Phe

35 40 45

Asp Tyr Ser Gln Ser Ser Leu Trp Ser Pro Leu Leu Pro Arg Asn Tyr

50 55 60

Ala Ser Pro Ser Asp Leu Asp Ser Asp Ser Cys Val Cys Arg Asn Leu

65 70 75 80

Lys Leu Arg Glu Phe Gln Val Gly Lys Lys Lys Lys Met Lys Met Met

85 90 95

Ser Met Lys Lys Asn Lys Lys Lys Ser Lys Leu Leu Lys Leu Asp Ile

100 105 110

Pro Ser Met Lys Asn Asp Asp Ser Ser Pro Lys Ile Gly Cys Phe Pro

115 120 125

Ser Pro Tyr Pro Arg Asp Gly Met Val Cys

130 135

<210>11

<211>1497

<212>DNA

<213>拟南芥属

<220>

<221>CDS

<222>(178)..(1299)

<400>11

ttttcgctct tctccagaaa cattccgttt cagatatttt tgatttttga atttgttttc 60

gctctctctc tctctctgct tagattagat ctgttcctgt gaattgattc tctgtttcat 120

cgtttgctca cgccgccgtt ttcgccggag gtggaagctc tcatcgccgt ttcgaaa 177

atg ccg gcg aat gat gct gaa tac gat ctc aaa gtt tta tct caa tct 225

Met Pro Ala Asn Asp Ala Glu Tyr Asp Leu Lys Val Leu Ser Gln Ser

1 5 10 15

gcg tca gca ggg gat tac aca ttt gcg aat gag gat aac ttg gag cat 273

Ala Ser Ala Gly Asp Tyr Thr Phe Ala Asn Glu Asp Asn Leu Glu His

20 25 30

tgt acg aag tat ttg aat cag acg atg gtt aca ttt gga ttt ccc gcc 321

Cys Thr Lys Tyr Leu Asn Gln Thr Met Val Thr Phe Gly Phe Pro Ala

35 40 45

tcg ctc gat ctc ttt tcg aat gat cct gtt tct ata tca agg acc tgc 369

Ser Leu Asp Leu Phe Ser Asn Asp Pro Val Ser Ile Ser Arg Thr Cys

50 55 60

aat tgt atg tac tcg ttg ctg cag cag cga caa cgt gat ata gag ttt 417

Asn Cys Met Tyr Ser Leu Leu Gln Gln Arg Gln Arg Asp Ile Glu Phe

65 70 75 80

aga gaa tct gct aat gag ctg aga cag aga cag caa tcg gat ata gct 465

Arg Glu Ser Ala Asn Glu Leu Arg Gln Arg Gln Gln Ser Asp Ile Ala

85 90 95

aga ctt gaa gct aaa gtt gag agg ctt gaa gcg cta ctc caa cag aag 513

Arg Leu Glu Ala Lys Val Glu Arg Leu Glu Ala Leu Leu Gln Gln Lys

100 105 110

gac aga gaa att gca aca att acc aga acc gaa gcc aaa aac act gca 561

Asp Arg Glu Ile Ala Thr Ile Thr Arg Thr Glu Ala Lys Asn Thr Ala

115 120 125

gct ttg aag tct cag att gaa aag tta cag cag gag agg gat gaa ttc 609

Ala Leu Lys Ser Gln Ile Glu Lys Leu Gln Gln Glu Arg Asp Glu Phe

130 135 140

caa agg atg gtg att ggt aac cag caa gtg aag gct caa cag ata cac 657

Gln Arg Met Val Ile Gly Asn Gln Gln Val Lys Ala Gln Gln Ile His

145 150 155 160

gaa atg aag aaa aag gag aag gat tac att aag ttg cag gaa cgg ctg 705

Glu Met Lys Lys Lys Glu Lys Asp Tyr Ile Lys Leu Gln Glu Arg Leu

165 170 175

aat caa gtg tta atg gag aaa aag aaa gaa tca aga tct gga atg gag 753

Asn Gln Val Leu Met Glu Lys Lys Lys Glu Ser Arg Ser Gly Met Glu

180 185 190

att atg aat ttg cta cag aaa gaa ggg agg caa cgt ggt acc tgg aat 801

Ile Met Asn Leu Leu Gln Lys Glu Gly Arg Gln Arg Gly Thr Trp Asn

195 200 205

ggc aag aag act gat acc gac ttc tat aaa aag ata gtg gat gcg tac 849

Gly Lys Lys Thr Asp Thr Asp Phe Tyr Lys Lys Ile Val Asp Ala Tyr

210 215 220

gaa gcg aaa aat caa gaa ttg atg gct gag aac act agt cta aga gca 897

Glu Ala Lys Asn Gln Glu Leu Met Ala Glu Asn Thr Ser Leu Arg Ala

225 230 235 240

tta ctt cga tcc atg cag aca gat atg cgt gat ttc tta aat gct cca 945

Leu Leu Arg Ser Met Gln Thr Asp Met Arg Asp Phe Leu Asn Ala Pro

245 250 255

aat ggg tca gct aca ttg gct gga agt gag aaa cgt gag gct gat cct 993

Asn Gly Ser Ala Thr Leu Ala Gly Ser Glu Lys Arg Glu Ala Asp Pro

260 265 270

tca caa tct cca ctg ggt ggg aag acg gac gtg ttt gat cta cct tac 1041

Ser Gln Ser Pro Leu Gly Gly Lys Thr Asp Val Phe Asp Leu Pro Tyr

275 280 285

cgg atg gct aga ggt caa ata gaa gaa agt ttg cgt act aag atg gct 1089

Arg Met Ala Arg Gly Gln Ile Glu Glu Ser Leu Arg Thr Lys Met Ala

290 295 300

tcc ata aag gaa agc atg gtc cag tta caa gat gca cct aaa aga gca 1137

Ser Ile Lys Glu Ser Met Val Gln Leu Gln Asp Ala Pro Lys Arg Ala

305 310 315 320

tct gtt aca tct gaa gca aca gag aga gag ctt gaa ctc gaa gct cag 1185

Ser Val Thr Ser Glu Ala Thr Glu Arg Glu Leu Glu Leu Glu Ala Gln

325 330 335

ctt gtc gag gca aga agc ata atc caa gaa cag gag tcc ata atg tcg 1233

Leu Val Glu Ala Arg Ser Ile Ile Gln Glu Gln Glu Ser Ile Met Ser

340 345 350

aaa cat ctc cca aaa tca gag cag cga agg gaa tct gta gct tcg ttg 1281

Lys His Leu Pro Lys Ser Glu Gln Arg Arg Glu Ser Val Ala Ser Leu

355 360 365

gca gct gag gga gta tga aaatgtctag gagctcaaaa tcagtggatc 1329

Ala Ala Glu Gly Val

370

caagttgcta aaagagactt gtcgcaaaat gtagtcgtag tactgtattc actaccacca 1389

aaactctcct tggatatcta agtgatgtat attcaacttt tagttgtgac aaatcagaga 1449

tcttttatcc ttttgggata tcataatctt attatatggt tgtctaac 1497

<210>12

<211>373

<212>PRT

<213>拟南芥属

<400>12

Met Pro Ala Asn Asp Ala Glu Tyr Asp Leu Lys Val Leu Ser Gln Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Gly Asp Tyr Thr Phe Ala Asn Glu Asp Asn Leu Glu His

20 25 30

Cys Thr Lys Tyr Leu Asn Gln Thr Met Val Thr Phe Gly Phe Pro Ala

35 40 45

Ser Leu Asp Leu Phe Ser Asn Asp Pro Val Ser Ile Ser Arg Thr Cys

50 55 60

Asn Cys Met Tyr Ser Leu Leu Gln Gln Arg Gln Arg Asp Ile Glu Phe

65 70 75 80

Arg Glu Ser Ala Asn Glu Leu Arg Gln Arg Gln Gln Ser Asp Ile Ala

85 90 95

Arg Leu Glu Ala Lys Val Glu Arg Leu Glu Ala Leu Leu Gln Gln Lys

100 105 110

Asp Arg Glu Ile Ala Thr Ile Thr Arg Thr Glu Ala Lys Asn Thr Ala

115 120 125

Ala Leu Lys Ser Gln Ile Glu Lys Leu Gln Gln Glu Arg Asp Glu Phe

130 135 140

Gln Arg Met Val Ile Gly Asn Gln Gln Val Lys Ala Gln Gln Ile His

145 150 155 160

Glu Met Lys Lys Lys Glu Lys Asp Tyr Ile Lys Leu Gln Glu Arg Leu

165 170 175

Asn Gln Val Leu Met Glu Lys Lys Lys Glu Ser Arg Ser Gly Met Glu

180 185 190

Ile Met Asn Leu Leu Gln Lys Glu Gly Arg Gln Arg Gly Thr Trp Asn

195 200 205

Gly Lys Lys Thr Asp Thr Asp Phe Tyr Lys Lys Ile Val Asp Ala Tyr

210 215 220

Glu Ala Lys Asn Gln Glu Leu Met Ala Glu Asn Thr Ser Leu Arg Ala

225 230 235 240

Leu Leu Arg Ser Met Gln Thr Asp Met Arg Asp Phe Leu Asn Ala Pro

245 250 255

Asn Gly Ser Ala Thr Leu Ala Gly Ser Glu Lys Arg Glu Ala Asp Pro

260 265 270

Ser Gln Ser Pro Leu Gly Gly Lys Thr Asp Val Phe Asp Leu Pro Tyr

275 280 285

Arg Met Ala Arg Gly Gln Ile Glu Glu Ser Leu Arg Thr Lys Met Ala

290 295 300

Ser Ile Lys Glu Ser Met Val Gln Leu Gln Asp Ala Pro Lys Arg Ala

305 310 315 320

Ser Val Thr Ser Glu Ala Thr Glu Arg Glu Leu Glu Leu Glu Ala Gln

325 330 335

Leu Val Glu Ala Arg Ser Ile Ile Gln Glu Gln Glu Ser Ile Met Ser

340 345 350

Lys His Leu Pro Lys Ser Glu Gln Arg Arg Glu Ser Val Ala Ser Leu

355 360 365

Ala Ala Glu Gly Val

370

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>13

ggggtaccat gggaagtaac cgtcctaag 29

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>14

acgcgtcgac tcaaactgcc tccttaagat t 31

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

ggggtaccgg aaaatgggta gcaagatg 28

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

cgagctcagg gtttaagctt ggcttcc 27

<210>17

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggattct ctcgctctcg c 51

<210>18

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta tttctcccga ccaaact 47

<210>19

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgaagcag aagggtttta aa 52

<210>20

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctatattgga ttcatgacaa c 51

<210>21

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>21

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catggtgaat caaagaaagc ta 52

<210>22

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>22

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ttaacacacc attccatccc t 51

<210>23

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>23

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt catgccggcg aatgatgctg aa 52

<210>24

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>24

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcatactccc tcagctgcca a 51

<210>25

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>25

tctagaggat cccccggggg taccgtcgac atggcaatga gtaaaggaga a 51

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>26

cgagctctta tttgtaaagt tcatc 25

<210>27

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>27

acgcgtcgac aactgcctcc ttaagattg 29

<210>28

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>28

ggactagtga gctcgcacac taatgcgaag aaag 34

<210>29

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>29

ccgctcgagt ctagagcaga tgcatctaaa gattc 35

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>30

agcttgccaa gaaggcattg 20

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>31

tcatcaacga cgcagtcaga 20

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>32

cgcttcagcg gttttcttag 20

<210>33

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>33

atcctccatt gcaagtaccg 20

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>34

tgtatgtgtt ggccgtaatg 20

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>35

tggtgtctct tgcatgctta 20

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>36

ctctatgccc ctgaaatcca 20

<210>37

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>37

acctccacaa gcaatcaac 19

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>38

caaagcctcc gatctcaaag 20

<210>39

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>39

cttgtccggt agctctccag 20

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>40

cgatgacgaa gaaacgagca 20

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>41

tggcattaac gcaaacactt g 21

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>42

ctggatcggt ggttccattc 20

<210>43

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>43

cctggacctg cctcatcata c 21

<210>44

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>44

gggggatccg cgggtttctg gagtttaatg 30

<210>45

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>45

cctctagaga ctctaattgg ataccgagg 29

<210>46

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>46

ggggtacctt aggatccgtc actctcatca gtgct 35

<210>47

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>47

gctctagagg atccatgaca gttctaaaca aacat 35

<210>48

<211>59

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>48

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgccaccatg gacatggaga gcgagaagg 59

<210>49

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>49

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctattttcct tcaatcagag actt 54

Claims

1.下列(a)至(c)的基因：

(c)一种基因，其包括由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11所示核苷酸序列具有80％或更高的同源性的核苷酸序列组成的DNA，并且所述基因编码具有促进核内复制活性的蛋白。

2.编码下列(d)至(f)的蛋白的基因：

(f)由这样的氨基酸序列组成的蛋白，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：2、4、6、8、10或12所示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性，并且所述蛋白具有促进核内复制的活性。

3.下列(d)至(f)的蛋白：

4.含有根据权利要求1或2的基因的重组载体。

5.转基因植物，其植物细胞中核DNA含量增加，所述转基因植物中引入了根据权利要求1或2的基因或根据权利要求4的重组载体。

6.根据权利要求5的植物细胞中核DNA含量增加的转基因植物，其中所述植物是植物体、植物器官、植物组织或培养的植物细胞。

7.产生植物细胞中核DNA含量增加的转基因植物的方法，包括将根据权利要求1或2的基因或根据权利要求4的重组载体引入植物细胞，以及从所述植物细胞繁殖植物体。

8.增加整个植物体或其部分的尺寸的方法，其通过在植物体内过表达根据权利要求1或2的基因。