CN101631561A

CN101631561A - 移植器官保护剂

Info

Publication number: CN101631561A
Application number: CN200880007755A
Authority: CN
Inventors: 铃木宏志; 齐藤英树
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine NUC
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine NUC
Priority date: 2007-03-09
Filing date: 2008-03-07
Publication date: 2010-01-20
Also published as: CA2680236A1; JPWO2008111503A1; AR065613A1; PE20081879A1; US20100137191A1; JP5763882B2; EP2143439A1; WO2008111503A1; CL2008000701A1; TW200904825A; EP2143439A4

Abstract

本发明涉及以红细胞生成素(EPO)作为有效成分的移植器官保护用组合物、移植器官的生长促进用组合物或移植器官保存用组合物。

Description

移植器官保护剂

技术领域

本发明涉及新型的移植器官保护用组合物，特别是涉及具有移植器官的生长促进效果的组合物。

背景技术

红细胞生成素(下面有时也用EPO表示)，是促进红血球类母细胞分化、增殖的酸性糖蛋白质荷尔蒙，主要由肾脏产生。在生物体的红血球日常性保持中，EPO担负着中心作用，临床上EPO用于贫血的治疗及手术前后的管理。

已知EPO除作为造血因子的作用外，在神经类细胞、心肌细胞、肾尿细管上皮细胞等中具有抑制细胞凋亡及组织保护的作用(PNAS100：4802-4806，2003等)。EPO具有的这2个作用，可以认为是EPO通过2个不同的信号传送路线来产生作用的。当EPO作用于EPO受体的同型二聚体时，通过细胞内的JAK2信号传送路线引起造血作用。另一方面，当EPO作用于EPO受体与commonβ受体(βcR)的杂聚体时，通过细胞内ERK1/2信号传送路线，引起抗细胞凋亡作用(PNAS101：14907-14912，2004)。

近几年来，进行器官移植手术，但在器官移植手术时，从器官提供者(供体)摘取的移植用器官，在血流中断、不能通过血流供氧的状态下(缺血状态)，于移植前保存数分钟～数十小时。因此，当没有适当选择保存温度及保存液等保存条件，或至移植需要长时间时，在通过移植使移植器官内的血流恢复(再灌流时)，移植器官内往往产生基质的或功能性的障碍。

此前作为移植器官保护剂，已知有氨基苯磺酸衍生物(WO2004/022545)、4-三氟甲基嘧啶衍生物(特开2005-350363)、嘌呤衍生物(特开2005-350364)。

但是，并不知道EPO对移植器官的保护效果。另外，也不知道具有生长促进效果的移植器官保护剂。

非专利文献1：PNAS 100：4802-4806，2003

非专利文献2：PNAS 101：14907-14912，2004

专利文献1：WO 2004/022545

专利文献2：特开2005-350363

专利文献3：特开2005-350364

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于提供一种新型的移植器官保护用组合物，特别是提供一种具有移植器官的生长促进效果的组合物。

用于解决课题的手段

本发明人等为了达到上述目的进行悉心研究的结果可见，红细胞生成素具有移植器官保护作用，特别是具有移植器官的生长促进效果，完成本发明。

即，本发明提供下列内容。

(1)移植器官保护用组合物，所述组合物含有红细胞生成素作为有效成分。

(2)移植器官生长促进用组合物，所述组合物含有红细胞生成素作为有效成分。

(3)移植器官保存用组合物，所述组合物含有红细胞生成素作为有效成分。

(4)上述(1)～(3)任何一项所述的组合物，其中，上述红细胞生成素是脱唾液酸(asialo)的红细胞生成素。

(5)从移植时再灌流障碍保护移植器官的方法，其中包括：把含有红细胞生成素作为有效成分的组合物，直接供给移植器官的工序。

(6)促进移植器官在被移植对象上生长的方法，其中包括：把含有红细胞生成素作为有效成分的组合物，直接供给移植器官的工序。

(7)红细胞生成素的用途，其用于制造从移植时再灌流障碍保护移植器官的医疗用组合物。

(8)红细胞生成素的用途，其用于制造促进移植器官在被移植对象上生长的医疗用组合物。

发明效果

如下列实施例所示，本发明的组合物从通过移植时的血液再灌流所产生的障碍保护移植器官，显示在被移植对象上的生长促进效果。本发明的组合物向移植的器官直接供给EPO，能够得到上述效果。特别是供给脱唾液酸EPO，能够确认优良的效果。

另外，可以认为通过作为移植器官的保存用组合物使用，能够在移植后保护移植器官、促进生长。

附图说明

图1为表示移植后卵巢中每0.64mm²的平均卵胞数以及对移植前卵巢的卵胞数的残留率曲线。结果用平均±标准偏差表示。星号表示试验组之间的有显著差异(*：p＜0.05)。

具体实施方式

红细胞生成素

本发明使用的红细胞生成素，可以采用任何一种红细胞生成素，但优选的是高度纯化过的红细胞生成素，更具体的说，有哺乳动物EPO，特别是与人EPO实质上具有同样生物活性的EPO。

本发明使用的红细胞生成素，也可采用任何一种方法制造，例如，可以采用从来自人的提取物精制得到的天然的人EPO(特公平1-38800号公报等)，或通过遗传基因工学的方法，从大肠菌、酵母菌、中国田鼠卵巢细胞(CHO细胞)、C127细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、昆虫细胞等产生的，采用各种方法提取、分离精制的人EPO等。本发明使用的红细胞生成素，通过遗传基因工学的方法制造的EPO是优选的，采用哺乳动物细胞(特别是CHO细胞)制造的EPO是优选的(例如，特公平1-44317号公报，Kenneth Jacobs et al.，Nature，313 806-810(1985)等)。

通过遗传基因组转换方法得到的红细胞生成素，与来自天然的EPO的氨基酸排列相同的红细胞生成素，或通过该氨基酸排列中的1个或多个氨基酸缺失、置换、加成等的红细胞生成素，也可具有与来自天然的EPO同样的生物学活性等的红细胞生成素。氨基酸的缺失、置换、加成等，可采用本领域专业人员公知的方法来进行。例如，本领域专业人员可以采用部位特异的变异诱发法(Gotoh，T.et al.(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.and Smith，M.(1983)Methods Enzymol，100，468-500；Kramer，W.et al.(1984)NucleicAcids Res.12，9441-9456；Kramer，W.and Fritz，H.J.(1987)Methods Enzymol，154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)MethodsEnzymol，85，2763-2766)等，在EPO的氨基酸中导入适当变异，可以制造与EPO功能同等的多肽。另外，氨基酸的变异，在自然界也可产生。一般在取代的氨基酸残基中，在氨基酸侧链性质被保存的另外氨基酸上取代是优选的。例如，作为氨基酸侧链的性质，可以举出疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸及酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱基侧链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内表示任何一种氨基酸的一文字标记)。已知对某种氨基酸排列，通过1个或多个氨基酸残基的缺失、加成及/或其他氨基酸的取代，具有被修饰的氨基酸排列的多肽，其生物学活性被保持，对此已为人们熟知(Mark，D.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.& Smith，M.Nucleic AcidsResearch(1982)10，6487-6500；Wang，A.et al.，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。

还有，作为本发明的红细胞生成素，也可以采用EPO与其他蛋白质的融合蛋白质。在制造融合多肽时，例如，编码EPO的DNA与编码其他蛋白质的DNA，构架一致地进行连结，将其导入呈现载体中，也可由宿主呈现。与本发明的红细胞生成素融合加成的其他蛋白质，未作特别限定。

还有，作为本发明的红细胞生成素，也可采用经过化学修饰的EPO。作为经过化学修饰的EPO的例子，例如，可以举出通过聚乙二醇等进行化学修饰EPO(WO90/12874等)、不带糖链的EPO通过聚乙二醇等的化学修饰的，另外，结合了维生素B12等无机或有机化合物等的EPO等。

另外，作为本发明的红细胞生成素，也可采用EPO衍生物。所谓EPO衍生物，意指EPO分子中的氨基酸被修饰的EPO或EPO分子中的糖链被修饰的EPO。

作为EPO分子中的糖链的修饰，包括糖链的加成、取代、缺失等。作为本发明中优选的糖链的修饰，可以举出EPO分子中的唾液酸(sialic acid)的缺失。

通常，通过重组动物细胞生产的EPO，来自尿的EPO的任何一种，可作为含与糖链结构不同的多样EPO的EPO组合物得到。在EPO组合物中的EPO分子上加成的唾液酸数目，因各个EPO分子而异，通常，1个EPO分子加成11个～15个唾液酸。通过除去这些唾液酸，可以制成脱唾液酸EPO(Asialo EPO)。脱唾液酸时被除去的唾液酸数，未作特别限定，既可除去全部唾液酸，也可除去1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14个唾液酸。本发明中优选的脱唾液酸EPO，在EPO分子上加成的唾液酸数在10个以下，更优选5个以下，特优选2个以下。还有，本发明中使用的唾液酸数目，采用EPO组合物中含有的EPO分子平均数。每个EPO分子的唾液酸平均数，本领域技术人员可采用公知的方法测定(EP 0428267公报等)。

除去了唾液酸的EPO(脱唾液酸EPO)，本领域技术人员可采用公知的方法制造，例如，可采用唾液酸酶(Sialidase)等酶，处理EPO等进行制造。唾液酸酶可从市场购买使用(特表2005-507426号、Nobuo Imai et al.，Eur.J.Biochem，194，457-462(1990)等)。

另外，本发明的红细胞生成素，可以是糖链改变体EPO，可以举出EPO的N末端上加成唾液酸的糖链改变体EPO，即NESP(新型红细胞生成素刺激蛋白质：WO85/02610、WO91/05867、WO95/05465等中有记载)等的糖链改变EPO类似体。

EPO分子中的氨基酸修饰，可以举出氨基甲酰基化、生物素化、脒化、乙酰基化、胍化等。

被修饰过的氨基残基，未作特别限定，例如，可以举出赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、色氨酸等。

组合物

本发明的组合物中可根据需要适当添加悬浮剂、溶解辅助剂、稳定剂、等渗剂、保存剂、防吸附剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、无痛化剂、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧剂等。

作为悬浮剂的例子，可以举出甲基纤维素、聚山梨酸酯80、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、西黄蓍胶粉末、羧甲基纤维素钠、聚氧化乙烯山梨糖醇单月桂酸酯等。

作为溶解辅助剂，可以举出聚氧化乙烯固化蓖麻籽油、聚山梨酸酯80、烟酸酰胺、聚氧化乙烯山梨糖醇单月桂酸酯、桧醇、蓖麻籽油脂肪酸乙酯等。

作为稳定剂，可以举出葡聚糖40、甲基纤维素、明胶、亚硫酸钠、偏亚硫酸钠等。

另外，作为稳定剂，也可添加某种氨基酸(例如，特开平10-182481号公报等)。作为稳定剂添加的氨基酸，包括游离的氨基酸、其钠盐、钾盐、盐酸盐等的盐等。氨基酸可1种或2种以上组合添加。作为稳定剂添加的氨基酸，未作特别限定，但作为优选的氨基酸，可以举出亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸。

作为等渗剂，例如，可以举出D-甘露糖醇、山梨糖醇等。

作为保存剂，例如，可以举出对羟基安息香酸甲酯、对羟基安息香酸乙酯、山梨糖酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。

作为防吸附剂，例如，可以举出人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、环氧乙烷·环氧丙烷共聚物、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧化乙烯固化蓖麻籽油、聚乙二醇等。

作为表面活性剂，非离子表面活性剂，例如，可以举出山梨糖醇酐一辛酸酯、山梨糖醇酐一月桂酸酯、山梨糖醇酐一棕榈酸酯等山梨糖醇酐脂肪酸酯；丙三醇一辛酸酯、丙三醇一肉豆蔻酸酯、丙三醇一硬脂酸酯等丙三醇脂肪酸酯；十甘油基一硬脂酸酯、十甘油基二硬脂酸酯、十甘油基一亚油酸酯等聚丙三酵脂肪酸酯；聚氧化乙烯山梨糖醇酐一月桂酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇酐一油酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇酐一硬脂酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇酐一棕榈酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇酐三油酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯等氧化乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯；聚氧化乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇四油酸酯等聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧化乙烯甘油基一硬脂酸酯等聚氧化乙烯甘油硬脂酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇硬脂酸酯；聚氧化乙烯月桂醚等聚氧化乙烯烷基醚；聚氧化乙烯聚氧化丙二醇、聚氧化乙烯聚氧化丙烯丙醚、聚氧化乙烯聚氧化丙烯十六基醚等聚氧化乙烯聚氧化丙烯烷基醚；聚氧化乙烯壬基苯基醚等聚氧化乙烯烷基苯基醚；聚氧化乙烯蓖麻子油、聚氧化乙烯固化蓖麻子油(聚氧化乙烯氢化蓖麻子油)等聚氧化乙烯固化蓖麻子油；聚氧化乙烯山梨糖醇蜂蜡等聚氧化乙烯山梨糖醇蜂蜡衍生物；聚氧化乙烯亚油酸等聚氧化乙烯亚油酸衍生物；聚氧化乙烯硬脂酰胺等聚氧化乙烯脂肪酸酰胺等具有HLB6～18的化合物；阴离子表面活性剂，例如，典型的可以举出十六基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油基硫酸钠等具有碳原子数10～18烷基的烷基硫酸盐；聚氧化乙烯月桂基硫酸钠等的环氧乙烷平均加成摩尔数2～4的烷基碳原子数10～18的聚氧化乙烯烷基醚硫酸盐；月桂基硫代琥珀酸酯钠等烷基碳原子数8～18的烷基硫代琥珀酸酯盐；天然类表面活性剂，例如，卵磷脂、甘油磷脂质；鞘髓磷脂等鞘髓磷脂质；碳原子数12～18脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。在本发明的制剂中，这些表面活性剂可1种或2种以上组合添加。优选的表面活性剂为聚山梨糖酸酯20、40、60或80等聚氧化乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，特优选聚山梨糖酸酯20及80。另外，Poloxamer(PluronicF-68(注册商标)等)为代表的聚氧化乙烯聚氧化丙二醇也是优选的。

作为含硫还原剂，例如，可以举出N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酰基均半胱氨酸、硫辛酸、硫代二乙二醇、硫代乙醇胺、硫代丙三醇、硫代山梨糖醇、硫代乙二醇酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、碳原子数1～7个的硫代链烷酸等具有氢硫基的含硫还原剂等。

作为抗氧剂，例如，可以举出刺桐酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四醋酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。

另外，也可以含有氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠等无机盐；柠檬酸钠、柠檬酸钾、醋酸钠等有机酸盐等通常添加的成分。

在本发明的含红细胞生成素的组合物中，有效成分的含量，考虑移植器官的状态及大小、患者(移植者、被移植者)的症状、体重、年龄及性别等来决定各有效成分。通常，10～1000U/kg体重，优选100～600U/kg体重左右。

本发明的含红细胞生成素的组合物，对被移植者(受主)，在移植手术中及/或手术前后供给被移植者，优选的是通过直接供给器官，可以得到本发明的效果。关于供给，从移植者(宿主)摘出的器官，也可在移植前直接与该组合物接触进行供给，如下列实施例所述，也可吸入海绵等后供给。另外，移植前也可作为保存液使用。作为保存液添加物，例如，可以采用生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、柠檬酸缓冲液等生理允许的缓冲液及等渗化液。此前，作为移植用器官保存液，可以并用临床使用的Euro-Collins液及UW液等。

实施例

实施例1：冷冻融解的狗卵巢在异种移植时的EPO及脱唾液酸EPO的给予效果

(1)目的

当冷冻融解的狗卵巢，异种移植至NOD-SCID鼠卵巢囊内时，狗卵巢的生长确认为高频率，但有报告说，移植后在血管再生前，原始卵胞的70％已死亡，而在狗同种移植试验中，观察到狗卵巢的原始卵胞及其他卵胞，比移植前的卵巢有减少的倾向。

在这里，对EPO及脱唾液酸EPO的局部供给、移植后的狗卵巢的原始卵胞减少的抑制效果进行探讨。

(2)材料及方法

把4月龄的狗卵巢进行冷冻融解，移植至NOD-SCID鼠卵巢囊内。冷冻融解操作，按照Migishima等的方法(Migishima F et al.，BiolReprod 2003Mar；68(3)：881-7)进行，卵巢移植按照Ishijima等的方法(Ishijima T et al.，J Reprod Dev.2006Apr；52(2)：293-9)进行。

(2.1)冷冻操作

把狗卵巢组织切成1.0mm-1.5mm的方形，浸渍在室温下的1MDMSO中约60秒后，与5μl的1M DMSO一起放入深冷试管内，在冰上冷却5分钟。添加预先于冰上冷却过的95μl的DAP 213后，于冰上冷却5分钟，浸渍在液氮中。

(2.2)融解操作

从液氮中取管试管，弃去试管内液氮，于室温放置60秒。添加加温至37℃的900μl的0.25M的蔗糖，快速地轻轻地进行移液，用PBI洗涤5次。

另外，把摘取的狗卵巢的一部分作为移植前卵巢，用10％福尔马林固定。

(2.3)移植方法

鼠(n＝9)，向腹腔内注射戊巴比妥钠进行麻醉后，切开背面，取出卵巢。从卵巢侧部的脂肪进刀，把卵巢囊内的鼠卵巢，为了确保移植后的向狗卵巢的血流，切除以使残留的一部分，向其中(卵巢囊内)放入冷冻融解的狗卵巢。此时，把止血用的海绵(下面为体组织吸收性明胶)吸入了EPO(n＝3)及脱唾液酸EPO(n＝3)400U/kg的材料放入卵巢囊内。另外，用生理盐水作为对照，浸渍同等量的体组织吸收性明胶，放入卵巢囊内。

4周后，取出卵巢，用10％福尔马林固定，与移植前卵巢一起进行HE染色。

(2.4)制作切片及卵胞检索

卵胞的分类，按照Oktay等(Oktay K et al.，Biol Reprod.1995Aug；53(2)：295-301)的分类，对卵子(卵母细胞)的实质进行确认，要点如下。

原始卵胞(Primordial)，是卵母细胞部分地或完全地被覆扁平的前颗粒膜细胞；初始1次细胞(Early primary)是前颗粒膜细胞的至少一部分形成圆柱状(巨大)；1次细胞(Primary)，全部颗粒膜细胞变大，由1层颗粒膜细胞构成；初始2次细胞(Transitional)由1层～2层圆柱状颗粒膜细胞被覆；2次卵胞(Preantral)，由2层以上颗粒膜细胞被覆，无卵胞腔的状态；胞状卵胞(Antralfollicle)，由2层以上颗粒膜细胞被覆，伴随着卵胞腔的状态。

(2.4.1)移植前的卵巢组织

随机选择10个组织，对该10个组织进行卵胞计数。选择的各组织的最初卵胞多的直径900μm的圆中每0.64mm²视野的卵胞(共计10个视野)。以此作为移植前卵胞数。

(2.4.2)移植卵巢组织

对1组织(1块)分步骤制成5张切片。此时，切片与切片的间隔为40μm～50μm。该1切片中，计数最初卵胞多的直径900μm的圆中每0.64mm²视野的卵胞(共计5个视野)。

(3)结果

所得到的结果示于表1及图1。

[表1]

使用的狗卵巢：miniaturedachshund 4月龄未发情

使用的鼠：NOD-SCID鼠11周龄n＝9

☆上段：0.64mm²视野中的平均卵胞数

下段：相对移植前卵巢的卵胞数的残留率(％)

移植前卵巢中每0.64mm²的原始卵胞数平均14.8个，而移植后4周的未处理组为0.3个，EPO组为0.4个，以及脱唾液酸EPO组为3.9个，特别是脱唾液酸EPO组的残留率(27％)与未处理组(2.3％)相比，是有显著差异地高值。

另外，对初期一次卵胞来说，未处理组的残留率为10.1％，而EPO组的残留率为15.2％，脱唾液酸EPO组为157.6％。特别是脱唾液酸EPO组，明确表明在原始卵胞的一部分向初期一次卵胞成长。另外，一次卵胞、初期二次卵胞的残留率，特别是脱唾液酸EPO组与未处理组相比确认有高的倾向。

从以上的结果可以判断，供给EPO，特别是供给脱唾液酸EPO，对移植器官组织的生长是有效的。

Claims

1.移植器官保护用组合物，所述组合物含有红细胞生成素作为有效成分。

2.移植器官的生长促进用组合物，所述组合物含有红细胞生成素作为有效成分。

3.移植器官保存用组合物，所述组合物含有红细胞生成素作为有效成分。

4.按照权利要求1～3的任何一项所述的组合物，其中，上述红细胞生成素为脱唾液酸的红细胞生成素。

5.从移植时再灌流障碍保护移植器官的方法，其中包括：把含有红细胞生成素作为有效成分的组合物直接供给移植器官的工序。

6.促进移植器官在被移植对象上生长的方法，其中包括：把含有红细胞生成素作为有效成分的组合物直接供给移植器官的工序。

7.红细胞生成素的用途，其用于从移植时再灌流障碍保护移植器官的医疗用组合物。

8.红细胞生成素的用途，其用于制造促进移植器官在被移植对象上生长的医疗用组合物。