CN101626693B - 用于制备血管生成素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于从乳制品中制备富含血管生成素的级分的方法，所述方法包括：使所述乳制品与阳离子交换树脂接触并且用流动相将所述富含血管生成素的级分从阳离子交换树脂上洗脱下来。本发明还提供了利用所述方法生产的富含血管生成素的级分，以及包括这类血管生成素的食品、营养制品和药物。

Description

用于制备血管生成素的方法
技术领域
本发明涉及一种用于从乳制品中制备富含血管生成素的级分的方法，以及涉及这类级分用作食品添加剂、营养制品或者用于制备治疗用组合物的用途。 
背景技术
血管生成素是一种由几类生长型细胞生产的14kDa、非糖基化的多肽，所述细胞包括血管内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、成纤维细胞以及一些肿瘤例如结肠癌、卵巢癌和乳癌。已经从许多来源中分离出了血管生成素，包括正常人血浆、牛血浆、牛乳，以及小鼠血清、兔血清和猪血清。 
血管生成素与胰核糖核酸酶同源并且具有不同的核糖核酸酶活性。该蛋白质能够诱导新的血管生长；然而，尚未确认血管生成素的核糖核酸酶活性在该蛋白所诱导的血管发生中所起的作用。 
正常人血浆中血管生成素的浓度为60-120ng/ml。然而，该蛋白的浓度在患有各种癌症的患者体内会有所升高，并且已知抑制血管生成素可防止人肿瘤生长。 
除作为血管发生的有效刺激剂之外，血管生成素已经被证明具有许多其他活性。这些包括下列能力：移除皮肤缺陷例如色斑、调节免疫应答、保护多形核白细胞免于自发降解和抗全身性细菌和真菌病原体的杀微生物活性。基于已知的血管生成素的生理功能，可以预测该蛋白在药品、膳食食品添加剂和化妆品中的各种应用。 
然而，血管生成素在这类应用中的使用需要一种用于从适合来源以商业规模制备该蛋白的有效方法。本发明的一个优选实施方案的目标为提供这类方法。该方法还可能被包括在一种用于纯化其他乳制品组分(例如乳铁蛋白、乳酸过氧化物酶或生长因子)的现有的方法中作为其一部分。 
本说明书中所引用的所有参考文献——包括任何专利或专利申请——均通过引用的方式纳入本文。应该清楚地理解，尽管本文引用了许多现有技术出版物，但是这种引用并非承认任何这些文献在澳大利亚或在任何其他国家中构成本领域中的公知常识。 
发明内容
第一方面中，本发明提供了一种用于从乳制品中制备富含血管生成素的级分的方法，其中所述方法包括： 
(a)使所述乳制品与阳离子交换树脂接触； 
(b)用0.30-0.38M(1.75-2.25％w/v)氯化钠或等价离子强度的流动相将不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分从所述阳离子交换柱上洗脱下来； 
(c)用流动相将所述富含血管生成素的级分从所述阳离子交换树脂上洗脱下来；和 
(d)收集所述洗脱的富含血管生成素的级分， 
其中在步骤(a)之前或步骤(c)之后所述乳制品没有进行过阳离子交换色谱法处理。 
所述乳制品可包括全乳、脱脂乳、酪乳、乳清或初乳。与所述阳离子交换树脂接触的乳制品的量优选地为约16个柱体积(CV)至约600CV，更优选约16CV至约150CV，并且最优选约68CV。 
优选地，所述不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分是使用含有0.34M氯化钠(2.0％w/v)或具有等价离子强度的流动相洗脱的，并且所述流动相的pH为6.5。 
在所述第一方面的另一个实施方案中，优选在洗脱所述富含血管生成素的级分之前，将所述阳离子交换树脂用低离子强度的缓冲液(＜0.34M的盐或其等价物)或水冲洗以移除所述柱中剩余的乳制品。 
在所述第一方面的另一个实施方案中，洗脱所述富含血管生成素的级分的流动相优选地含有0.38-1.5M氯化钠(2.25-8.7％w/v)或具有等价离子强度，更优选含有0.38-0.59M氯化钠(2.25-3.5％w/v)或具有等价离子强度，并且最优选含有0.43M氯化钠(2.5％w/v)或具有等价离子强度。 
在另一个优选的实施方案中，洗脱所述富含血管生成素的级分的流动相pH范围在4.0-9.0之间，优选5.5-7.5，并且最优选6.5。 
所述阳离子交换树脂可包括琼脂糖微球。优选地，所述琼脂糖微球的大小范围为45-900μm，并且更优选90-300μm。 
在一个实施方案中，在所述第一方面的方法的步骤(a)的过程中，所述阳离子交换树脂以约6-90升/升树脂/小时、优选以约6-50升/升树脂/小时并且最优选以约33升/升树脂/小时的流速处理。 
本发明第一方面所述的方法可以为连续法或分批法。优选地，所述方法为连续法。 
在一个实施方案中，所述富含血管生成素的级分的血管生成素含量为至少2％w/w，优选至少10％w/w，更优选至少20％w/w。 
在另一个实施方案中，对所述富含血管生成素的级分进行进一步处理以减少存在于所述组合物中的非血管生成素蛋白和/或盐的量。 
在本发明的第二方面中，提供了一种根据本发明第一方面所述的方法制备的富含血管生成素的级分。 
在本发明的第三方面中，提供了本发明第二方面所述的富含血管生成素的级分在制备食品或营养制品中的用途。在一个优选的实施方案中，所述食品为运动营养品或婴儿食品添加剂。 
在本发明的第四方面中，提供了一种包括本发明第二方面所述的富含血管生成素的级分的食品或营养制品。 
在本发明的第五方面中，提供了一种包括本发明第二方面所述的富含血管生成素的级分和可药用载体的药物组合物。 
在本发明的第六方面中，提供了本发明第二方面所述的富含血管生成素的级分在制备用于治疗或预防疾病的药剂中的用途，所述疾病为由病毒、细菌或真菌以及它们的毒素所引起的疾病或者其中需要刺激血管发生的疾病。 
在本发明的第七方面中，提供了本发明第二方面所述的富含血管生成素的级分作为营养制品的成分的用途，所述营养制品可以靶向会导致人粘膜表面感染的病原体。在一个优选的实施方案中，所述粘膜表面可以鼻、眼、耳、肺、乳房和阴道的那些粘膜表面。 
在本发明的第八方面中，提供了一种靶向会导致人粘膜表面感染的病原体的方法，包括下列步骤：将有效量的本发明第四方面所述的营养制品或本发明第五方面所述的组合物给予受试者。 
在本发明的第九方面中，提供了一种治疗由病毒、细菌或真菌以及它们的毒素所引起的疾病的方法，包括下列步骤：将有效量的本发 明第四方面所述的营养制品或本发明第五方面所述的组合物给予受试者。 
附图说明
图1为对一种利用本发明的方法制备的洗脱的富含血管生成素的级分进行的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 
图2示出了对所述富含血管生成素的级分(图1)的SDS-PAGE分离物进行的凝胶光密度计分析的结果。 
具体实施方式
本发明已经认识到需要一种使得可以以有效方式制备富含血管生成素的级分的方法。因此，本发明的第一方面提供了这样一种方法，即其中使一种乳制品与阳离子交换柱接触，并且使用一种流动相将富含血管生成素的级分从其上洗脱下来。 
使用术语“富含血管生成素”来指所述洗脱级分中存在的所述血管生成素蛋白与总蛋白的比例与进行阳离子交换色谱前所述乳制品中存在的该比例相比有所增加。对于被认为富含血管生成素的级分而言，其血管生成素含量应该为至少2％w/w，优选至少10％w/w，并且更优选至少20％w/w。 
本文所用的术语“级分”是指所述乳制品的一个部分纯化的部分。 
使用术语“有效的”来指与目前用来富集蛋白(包括血管生成素)的方法相比一种价廉且快速的方法。 
适合的乳制品可能会包括全乳、脱脂乳、酪乳、乳清(例如酸或乳酪/凝乳乳清)或乳清衍生物(例如乳清蛋白浓缩物或乳清蛋白分离流出物)，以及初乳。在进行本发明的方法之前所述乳制品没有进行过阳离子交换色谱法处理。 
对本领域技术人员来说显而易见的是，所述乳制品可以获自任何泌乳动物，例如反刍动物如奶牛、绵羊、水牛、山羊和鹿，非反刍动物包括灵长类(如人)和单胃动物(如猪)。优选地，在本发明的方法中使用源自牛全乳的脱脂乳。 
本发明第一方面所述的方法仅使用一种阳离子交换树脂或柱。可以使用各种类型阳离子交换树脂基质，并且这些在本领域中是已知的。 这些包括：例如任何基于交联的多糖例如交联的琼脂糖(Sepharose)或葡聚糖(Sephadex)的支持物；任何基于纤维素例如纤维和微球(Sephacel，Gibco HB)、颗粒(Gibco HG)或苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(Dowex resin)的支持物；或者任何基于聚丙烯酰胺例如羟基化甲基丙烯酸聚合物(Tosoh HW)的支持物。 
适合的树脂官能团也是本领域技术人员已知的并且包括磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、正磷酸盐/正磷酸例如Whatman P11、磺酸甲酯(S)，羧酸和磺酸(50W)。 
优选地，所选树脂的最小微球直径为45μm，最大直径为900μm。最佳地，微球直径在90μm至300μm之间。 
在一个优选的实施方案中，微球直径范围为45-165μm和100-300μm的SP琼脂糖阳离子交换树脂微球均适用于血管生成素吸附和纯化。 
所述树脂通常被填充在10cm深的柱中；然而，根据所需获得的血管生成素的量，所述柱的深度可在4cm至200cm之间变动。所述柱的直径还会根据用途不同而有所变化。通常，直径范围在0.9cm至200cm，并且最佳直径为62cm。可以使用任何适合的材料(包括不锈钢、塑料或玻璃)来构建所述容纳树脂的柱。 
在所述接触步骤中，乳制品被吸附到阳离子交换柱上时的流速会根据所述方法的规模和所使用乳制品的类型而变化。流速的下限由工业类型用途的成本效益决定，因为在非常低的流速下进行所述方法的成本超出了收益。 
在一个优选的实施方案中，所述乳制品为脱脂乳，并且以6-90升/升树脂/小时(h)的速度(线性流速60-900cm/h)将所述乳制品上样到所述柱上。优选地，所使用的流速范围为6-50升/升树脂/小时(线性流速60-500cm/h)，并且更优选34升/升树脂/小时(线性流速331cm/h)。高流速适用于与树脂接触的乳制品总量受限时的血管生成素纯化。使用上文所述的流速时，已经发现对于血管生成素的最佳分级分离，例如与阳离子交换树脂接触的脱脂乳的量约为16-600个柱(床)体积，优选16-150个柱体积，并且更优选68个柱体积。 
尽管如澳大利亚专利613688中所述，乳制品体积远远超出树脂体积的情况适用于制备其他乳制品例如乳酸过氧化物酶和乳铁蛋白，但 是本发明的发明人已经发现数量级为1000个柱体积的乳制品体积：树脂体积(乳制品升数/升树脂)并不适用于利用本发明方法进行的血管生成素制备。发明人已经发现超过约600个柱体积的乳制品体积：树脂体积会使得几乎没有血管生成素与所述树脂结合，并且回收的血管生成素与原料相比没有富集。因此，在脱脂乳的情况下，本发明优选的上限为约600个柱体积，优选约150个柱体积，并且最优选约68个柱体积。随着乳制品：树脂比例的增加，结合的血管生成素的量以及洗脱的血管生成素的纯度逐渐下降。至于流速，下限由商业因素而非柱相关因素确定。如果所上样的乳制品的体积远少于16个柱体积，则达到了一个临界点，即此时冲洗和洗脱时间超过了可以纯化出足够量的血管生成素以使得该方法在经济上可行的临界点。 
在使乳制品与阳离子交换树脂接触以使得血管生成素得以吸附的过程中，所述来源的pH优选地为约6.5，但是调整pH对于本发明的方法来说不是必需的。 
在洗脱吸附到柱上的血管生成素的过程中，使用了一种由离子强度为0.38-1.5M的缓冲溶液组成的流动相。所述流动相中使用的盐的类型不限并且是本领域中技术人员已知的。例如可以使用任何可溶性无毒缓冲液，例如氯化物、柠檬酸、磷酸、乙酸、硫酸、重碳酸、氢氧化物、咪唑或马来酸的任何可溶性钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或锂盐。还可以使用合成的两性离子缓冲液，例如Trizma、HEPES或tricine。 
当离子强度升高到高于0.6M时血管生成素的纯度下降，因为此时非-血管生成素蛋白开始洗脱，其他蛋白藉此稀释了血管生成素。在一个优选的实施方案中，所述流动相由离子强度为0.38-1.5M(2.25-8.7％w/v)的氯化钠组成，并且更优选地由离子强度为0.38-0.59M(2.25-3.5％w/v)的氯化钠组成。最优选地，使用等价于或低于0.43M氯化钠(2.5％)的离子强度。 
所述流动相的pH范围可较宽，例如4.0-9.0，优选5.5-7.5，并且最优选约6.5。在上限和下限时，蛋白稳定性以及蛋白结合阳离子交换树脂的能力均会受到影响。范围在5.5-7.5之间的pH在没有降低产量的情况下提供了最高的血管生成素纯度。 
所述流动相的体积和流速也是可变的。例如，可以使用由1-20升缓冲溶液/升树脂组成的流动相。优选的范围为1-10升，并且更优选地使用2.5升缓冲溶液/升树脂。优选地，所述流动相的流速为6-90升/升树脂/小时(60-900cm/h)。更优选地，所述流速为6-40(60-400cm/h)，并且最优选地，最佳线性流速为7.5升/升树脂/小时(75cm/h)。 
本发明第一方面所述的方法可以单独用于制备富含血管生成素的级分，或者该方法可以被纳入作为全面(integrated)分级分离方法中的一部分，在所述全面分级分离方法其他所需的乳制品组分被分级分离。例如，在从阳离子交换柱上洗脱所述富含血管生成素的级分之前，可以从所述柱上洗脱不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分。用于洗脱所述乳酸过氧化物酶级分的缓冲液类型以及该缓冲液流速和体积通常与上文所述的用于洗脱所述血管生成素级分的那些相同。然而，该缓冲液的离子强度不同。例如，该缓冲液可以由离子强度为0.3-0.38M(1.75-2.25％w/v)的氯化钠组成，并且最优选地，乳酸过氧化物酶洗脱缓冲液的离子强度等价于0.34M氯化钠(2.0％)。 
此外，一旦已经洗脱了所述乳酸过氧化物酶和血管生成素级分，则可以从所述柱上洗脱乳铁蛋白级分。同样，用于洗脱所述乳铁蛋白级分的缓冲液类型以及该缓冲液流速和体积也通常与上文所述的用于洗脱所述乳酸过氧化物酶和血管生成素级分的那些相同。然而，该缓冲液的离子强度不同。例如，该缓冲液可以由离子强度为0.59-3.0M(3.5-17.4％w/v)的氯化钠组成，更优选地由离子强度为0.68-2.0M(4.0-11.7％w/v)的氯化钠组成，并且最优选地，乳铁蛋白洗脱缓冲液的离子强度等价于1.5M氯化钠(8.75％)。 
在本发明第一方面的另一个实施方案中，在所述用乳制品上样到阳离子交换柱上的步骤后，可以通过用低离子强度缓冲液或用水冲洗所述阳离子交换柱来移除柱中的任何未结合蛋白。如果使用缓冲液，则该缓冲液的离子强度通常低于0.34M，并且优选地低于0.05M。适合的缓冲液、它们的pH和体积与上文所述的用于洗脱所述乳酸过氧化物酶、血管生成素和乳铁蛋白级分的那些相同。然而，所述冲洗缓冲液流速优选地为15升/升树脂/小时(147cm/h)。 
可以对利用本发明的方法制备的富含血管生成素的级分进行进一步处理以移除非血管生成素蛋白和/或移除盐。人们认为对于标准化的食品或营养制品的生产以及对于治疗剂的制备来说，这很重要。这些步骤可以下列方法来实现：膜过滤、理想地超滤，或本领域中已知的等价方法，例如透析、电透析、分子筛色谱、固相萃取、纳米过滤或其他已知方法。保留富含血管生成素的渗余物，并且弃去渗透物。 
如果选择超滤，则膜大小范围优选地为0.15-10kDa NMWCO，并且最优选5kDa NMWCO。 
由于血管生成素参与许多生理功能，因此使用本发明方法制备该蛋白提供了一种该蛋白的理想且经济的来源，所述蛋白随后可以针对这些功能使用。例如，所述纯化的蛋白可以用于制备食品或营养制品。常见的食品包括运动营养品粉剂或婴儿食品添加剂，所述运动营养品粉剂在食用后可提高运动成绩。 
本文所用的术语“营养制品”是指分离或纯化自食品(在本文的情况下为乳制品)的可食用产品，它被证明在口服时具有生理学益处或者可以预防或减轻急性或慢性疾病或损伤。因此，所述营养制品可以为单独的或者与可使用食品或饮品混合的膳食制品或添加剂形式。所述营养制品可以对心血管疾病、克隆氏病或涉及无法自愈性(non-healing)创伤例如溃疡的病症有积极的临床效果。 
所述营养制品组合物可以为可溶性粉剂、液体或即饮制剂形式。或者，所述营养制品组合物可以为固体形式，例如即食棒或早餐谷物形式。还可以存在各种香料、纤维、增甜剂或其他添加剂。 
所述营养制品优选地具有可接受的感官特性(例如可接受的气味、味道和口感)，并且还可以包括选自维生素A、B1、B2、B3、B5、B6、B11、B12、生物素、C、D、E、H和K以及钙、镁、钾、锌和铁中的至少一种的维生素和/或矿物质。 
可以通过经鼻胃管、空肠管或者通过使受试者饮用或食用所述组合物来将其给予所述受试者。 
所述营养制品组合物可以按照常规方法制备；例如，可以通过将所述蛋白与其他添加剂混合在一起来制备所述组合物。如果使用的话，所述混合物中可以包括乳化剂。此时可以加入额外的维生素和矿物质，但是通常稍后加入以避免热降解。 
如果需要生产粉状营养制剂组合物，则可以将粉状形式的所述蛋白与额外组分混合。所述粉剂含湿量应该低于约5重量％。然后可以混入水——优选已经进行过反渗透处理的水——以形成液体混合物。 
如果所述营养制品组合物是以即食液体形式提供的，则可以将其加热以降少细菌载量。如果需要生产液体的营养制品组合物，则优选地将所述液体混合物无菌地填充到适合的容器中。可以使用本领域中的常规技术进行所述容器的无菌填充。具有适合用于进行无菌填充性质的装置可通过购买获得。 
利用本发明的方法制备的富含血管生成素的级分还可以被配制为适合用于给予受试者的药物组合物。 
优选地，所述组合物还包括一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。这类组合物可以包括：缓冲液例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖；甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂例如EDTA；佐剂和防腐剂。本发明的组合物可以被配制用于静脉内给药、局部给药或口服给药。 
可以以一种适用于所要治疗和/或预防的疾病的方式将这类组合物给予受试者。给药量和给药频率将由下述因素决定，所述因素如受试者的身体状况以及受试者疾病的类型和/或严重程度。还可以通过临床试验来确定适合的剂量。有效量的组合物可以由医师在考虑到受试者在年龄、体重、疾病严重程度、身体状况方面的个体差异、给药途径以及任何与受试者治疗相关的其他因素的情况下确定。“有效量”的所述组合物实质上是足以达到所需治疗效果的量。 
在另一个方面中，本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的方法。这类治疗方法包括给予受试者有效量的上文所述的营养制品或药物组合物。优选地，这类疾病包括那些由病毒、细菌或真菌以及它们的毒素所引起的疾病。然而，由于血管生成素在血管发生中起作用，因此还可以使用本发明的含有血管生成素的组合物来治疗需要刺激血管发生的疾病。这些疾病包括冠心病、中风、缺血性肢体病和创伤愈合延迟。 
本说明书通篇中，除非上下文中另外要求，否则术语“包括”或其同义词如“包含”或“含有”均应被理解为是指包括所述要素或整数或者要素群或整数群，但不排除任何其他的要素或整数或者要素群或整数群。 
还必须注意到，除非上下文中另外明确指出，否则本说明书中使 用的单数形式“a(一)”、“an(一个)”和“the(该)”包括复数方面。 
对本领域技术人员来说显而易见的是，虽然为了清楚性和便于理解，本发明已经进行了相当详细地描述，但是在不偏离本说明书中所公开的发明概念的范围的情况下，可以对本文所述的实施方案和方法进行各种变化和改变。 
现在参照下述实施例对本发明进行进一步详述。除非另外说明，否则提供这些实施例的目的仅在于举例说明，而并非意在进行限制。因此，本发明包括由于本文所提供的教导而变得显而易见的任何及所有变化。 
实施例1：用于从脱脂乳制备富含血管生成素的级分的方法 
用SP Sepharose Big Beads(GE Healthcare)填充10cm深的柱使得该柱的总床体积为29.7升。以331cm/h的线性流速(34升脱脂乳/升树脂/小时)将脱脂牛奶流上样到该柱上，持续2小时直至所上样的脱脂乳体积为填充到该柱中的树脂体积的68倍。 
通过以147cm/h的线性流速(15升缓冲液/升树脂/小时)即0.25CV/分钟在10分钟期间加入2.5个柱体积(CV)的水来移除该柱中剩余的乳。 
通过用2.5CV的含等价于2.0％(0.34M)NaCl的钠离子且pH为6.5的缓冲液，以75cm/h的线性流速(7.5升阳离子缓冲液/升树脂/小时)即0.125CV/分钟在20分钟期间将不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分从所述柱上洗脱下来。将起始的0.5升阳离子缓冲溶液/升树脂排入到排液装置，并且收集接下来的2.5升阳离子缓冲溶液/升树脂作为不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分(包括与下一缓冲液施加时间重叠的时间即透过时间里的0.5升阳离子缓冲溶液/升树脂)。 
然后通过用2.5CV的含等价于2.5％w/v(0.43M)NaCl的钠离子且pH为6.5的缓冲液，以75cm/h的线性流速(7.5升阳离子缓冲液/升树脂/小时)即0.125CV/分钟在20分钟期间将富含血管生成素的级分从所述柱上洗脱下来。将起始的0.5升阳离子缓冲溶液/升树脂排入排液装置，并且收集接下来的2.5升阳离子缓冲溶液/升树脂作为富含血管生成素的级分(包括与下一缓冲液的施加时间重叠的时间里的0.5升阳离子缓冲溶液/升树脂)。 
最后，通过用2.5CV的含等价于8.75％w/v(1.5M)NaCl的钠离子且pH为6.5的缓冲液，以75cm/h的线性流速(7.5升阳离子缓冲液/升树脂/小时)即0.125CV/分钟在20分钟期间将乳铁蛋白级分从所述柱上洗脱下来。将起始的0.5升阳离子缓冲溶液/升树脂排入排液装置，并且收集接下来的2.5升阳离子缓冲溶液/升树脂作为乳铁蛋白级分。 
将所收集的富含血管生成素的级分超滤(NMWCO 5 kDa)以浓缩并降低盐含量。将所得的浓缩物冷冻干燥并且在室温下贮藏备用。 
利用SDS-PAGE分析所述富含血管生成素的级分的血管生成素含量(图1)，发现所述级分含有57％(蛋白水平)的低分子量(14kDa)蛋白(图2)，利用MALDI-TOF/TOF MS确认该蛋白为血管生成素(结果未示出)。 
对本领域技术人员来说显而易见的是，这种血管生成素制备方法可基于商业目的扩大规模。 

Claims (29)

1.一种用于从乳制品中制备富含血管生成素的级分的方法，其中所述方法包括：
(a)使所述乳制品与阳离子交换树脂接触；
(b)用0.30-0.38M氯化钠或等价离子强度的流动相将不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分从所述阳离子交换柱上洗脱下来；
(c)用流动相将所述富含血管生成素的级分从所述阳离子交换树脂上洗脱下来；和
(d)收集所述洗脱的富含血管生成素的级分，
其中在步骤(a)之前所述乳制品没有进行过阳离子交换色谱法处理。
2.权利要求1所述的方法，其中所述乳制品选自全乳、脱脂乳或酪乳。
3.权利要求1或2所述的方法，其中与所述阳离子交换树脂接触的乳制品的量为16个柱体积至600个柱体积。
4.权利要求1或2所述的方法，其中与所述阳离子交换树脂接触的乳制品的量为16个柱体积至150个柱体积。
5.权利要求1或2所述的方法，其中与所述阳离子交换树脂接触的乳制品的量为68个柱体积。
6.权利要求1所述的方法，其中洗脱所述不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分的流动相含有0.34M氯化钠或具有等价离子强度，并且所述流动相的pH为6.5。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中在洗脱所述富含血管生成素的级分之前，将所述阳离子交换树脂用<0.34M的氯化钠或其等价物的缓冲液或水冲洗以移除所述柱中剩余的乳制品。
8.权利要求1或2的方法，其中洗脱所述富含血管生成素的级分的流动相含有0.38-1.5M氯化钠或具有等价离子强度。
9.权利要求1或2的方法，其中洗脱所述富含血管生成素的级分的流动相含有0.38-0.59M氯化钠或具有等价离子强度。
10.权利要求1或2的方法，其中洗脱所述富含血管生成素的级分的流动相含有0.43M氯化钠或具有等价离子强度。
11.权利要求1或2的方法，其中洗脱所述富含血管生成素的级分的流动相pH范围在4.0-9.0之间。
12.权利要求1或2的方法，其中洗脱所述富含血管生成素的级分的流动相pH范围在5.5-7.5之间。
13.权利要求1或2的方法，其中洗脱所述富含血管生成素的级分的流动相pH为6.5。
14.权利要求1或2的方法，其中所述阳离子交换树脂包括琼脂糖微球。
15.权利要求14所述的方法，其中所述琼脂糖微球的大小范围为45-900μm。
16.权利要求14的方法，其中所述琼脂糖微球的大小范围为90-300μm。
17.权利要求1或2的方法，其中在步骤(a)中，所述阳离子交换树脂以6-90升/升树脂/小时的流速处理。
18.权利要求17所述的方法，其中所述接触流速范围为6-50升/升树脂/小时。
19.权利要求17的方法，其中所述接触流速为33升/升树脂/小时。
20.权利要求1或2的方法，其中所述方法为连续法或分批法。
21.权利要求1或2的方法，其中所述富含血管生成素的级分的血管生成素含量为至少2%w/w。
22.权利要求1或2的方法，其中对所述富含血管生成素的级分进行进一步处理以减少存在于所述组合物中的非血管生成素蛋白和/或盐的量。
23.一种利用权利要求1-22任一项所述的方法获得的富含血管生成素的级分。
24.权利要求23所述的富含血管生成素的级分在制备食品或营养制品中的用途。
25.一种包含权利要求23所述的富含血管生成素的级分的食品或营养制品。
26.权利要求24所述的用途，其中所述食品为运动营养品或婴儿食品添加剂。
27.权利要求25的食品或营养制品，其中所述食品为运动营养品或婴儿食品添加剂。
28.一种包括权利要求23所述的富含血管生成素的级分和可药用载体的药物组合物。
29.权利要求23所述的富含血管生成素的级分在制备用于治疗或预防疾病的药剂中的用途，所述疾病为由病毒、细菌或真菌以及它们的毒素所引起的疾病或者其中需要刺激血管发生的疾病。
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