CN101618210A - 一种溶葡萄球菌酶局部缓释制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溶葡萄球菌酶缓释制剂及其制备方法和应用。该制剂的组分及重量百分含量包括：溶葡萄球菌酶1－10％，甘露醇1－10％，聚乳酸(PLA)0－90％，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)5－95％。该制剂以溶葡萄球菌酶为杀菌活性成分，通过超临界流体微粒制备技术制得含溶葡萄球菌酶的聚乳酸－羟基乙酸(PLA－PLGA)多聚物微球。该制剂的理化性能好、杀菌效果强，在体外释药速率过程时间可调节，释药过程时间可达三天至三个月，释放速度稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物抗菌缓释制剂，具体的说涉及一种溶葡萄球菌酶缓释制剂。
背景技术
溶葡球菌酶(Lysostaphin)是一种肽链内切酶。该酶可切断细菌细胞壁肽聚糖中的五甘氨酸肽键桥结构，从而达到迅速溶解并杀死细菌的目的。体外药效学研究表明，溶葡球菌酶对多种金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌具有良好的抑杀效果，对化脓性棒状杆菌、链球菌和巴氏杆菌具有较好的抑杀效果。特别是对耐药性金黄色葡萄球菌，MRSA及具有多药抗性的“超级细菌”，溶葡萄球菌酶也同样有很强的杀菌作用，由于其能溶解出于包括生长静止期的细菌，故不容易诱导产生耐药菌株。
已有文献报道体内注射溶葡球菌酶用以治疗金黄色葡萄球菌引起的主动脉心内膜炎及奶牛乳腺炎，可达到清除致病菌的目的。然而，药物动力学研究表明，溶葡球菌酶通过静脉注射后在动物体内分布迅速，代谢速度快，其在血相中的消除半衰期为29分钟。如此短的半衰期意味着需要进行大剂量给药或重复多次给药，对其在临床上的应用不利。
利用生物可降解聚合物，包裹多肽、蛋白质药物制成缓释微球，可调节药物的释放速率，延长给药时间，保护蛋白活性，对生物药物的临床应用具有重要意义。根据不同的临床治疗需要，这些微粒可用于各种口服、注射、埋植等各种给药途径。
传统的药物制备工艺，如相分离法、喷雾干燥法等，容易使蛋白质变性、失活，很难满足生物大分子的药物传递。通过超临界流体微粒制备蛋白及多肽缓释微球具有其它方法无法比拟的优点。
对于极性物质来说，由于它们在CO2中相对溶解度低，通常需要将其溶解于常规使用的溶剂中。Yeo等描述了超临界反溶剂(Supercriticle Anti-Solvent，SAS)过程作为制备微球的技术(Yeo等Macromolecules，1993，26，p6207)。在SAS方法中，CO2流体和溶解含极性溶质的液体溶剂被分别泵入雾化罐中，通过喷嘴后形成细小液滴。在雾化罐中，CO2作为溶质的逆溶剂，溶质的固体微粒形成并被回收到提篮式设计的过滤器中。
在多肽类药物的微粒制备过程中，这些溶剂的选择需要具有以下一些特性：
(1)能与超临界CO2流体完全互溶；(2)不影响多肽的立体结构和活性。美国专利US 6,063,910描述了应用超临界流体技术制备蛋白微粒的过程。在该过程中，蛋白质作为溶质被溶解于90％乙醇溶液后，被泵入超临界CO2流体雾化罐中，形成平均粒径小于5μm的蛋白质微球。
Caliceti等描述了一种通过超临界反溶剂方法制胰岛素-聚乳酸微球的制备方法(Journal of Controlled Release，94(2004)p195)。首先将胰岛素、聚乙二醇1000、聚乳酸分别溶解于二甲亚砜(DMSO)、二氯甲烷溶液中，再将两种溶液等体积混合后被泵入雾化罐，通过SAS法形成胰岛素-聚乙二醇-PLA缓释微球。其中胰岛素的释放速率主要由水溶性聚乙二醇含量所控制。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种具有较长杀菌活性时间的缓释制剂。
本发明需要解决的技术问题之二是提供该缓释制剂的制备方法。
本发明需要解决的另一个技术问题是公开该缓释制剂的应用。
本发明的构思是这样的：
溶葡萄球菌酶(lysostaphin)是一种含锌的金属蛋白酶，它能专一降解革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌)细胞壁肽聚糖层的甘氨酸肽键，从而裂解金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的细胞壁，起到彻底杀死细菌的目的，尤其对耐药性金黄色葡萄球菌等难以根除的致病菌的效果非常好。
聚乳酸类(PLA，PLGA)可生物降解材料是基础的生物医学材料，可作为药物控制释放的载体材料，该类物质降解产物为乳酸和水分子，生物相容性好。
本发明以溶葡萄球菌酶为杀菌活性成分，通过超临界流体微粒制备技术制得含溶葡萄球菌酶的聚乳酸-羟基乙酸(PLA-PLGA)多聚物微球。
本发明的技术方案如下：
所述及的溶葡萄球菌酶缓释制剂包括溶葡萄球菌酶1-10wt％，甘露醇1-10wt％，聚乳酸(PLA)0-90wt％，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)5-95wt％。
其中所述及的溶葡萄球菌酶可采用上海高科联合生物技术研发有限公司市售的产品。
所述及的甘露醇为市售注射用甘露醇。
所述及的PLA为分子量为30,000至100,000的DL-或D-多聚乳酸。
所述及的PLGA为分子量为30,000至100,000的DL-聚乳酸-聚羟基乙酸聚合物，其中乳酸与羟基乙酸的重量比为9∶1～1∶1。
所述及的溶葡萄球菌酶缓释制剂，其优选配方的组成及重量百分比为溶葡萄球菌酶1-5％，甘露醇1-2％，聚乳酸(PLA)0-90％，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)5-95％。
所述及的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
1、溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA亚微米微球的制备方法，包括如下步骤：
a)配制溶液A：按上述比例称取溶葡萄球菌酶，将其溶解于DMSO中；
b)按上述比例称取PLA和PLGA，将其溶解于二氯甲烷中，加入溶液A中，得到溶液B；
c)将溶液B与超临界CO2流体混合，通过超临界反溶剂过程(SAS)技术制备平均粒径小于10微米的含溶葡萄球菌酶PLA-PLGA药物缓释微球；
d)收集溶葡萄球菌酶PLA-PLGA药物缓释微球。
本发明以溶葡萄球菌酶为杀菌活性成分，通过超临界流体微粒制备技术制得含溶葡球菌酶的含聚乳酸(PLA)和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)多聚物微球。可通过二种途径调节溶葡萄球菌酶的释放速率：1、由于聚乳酸-羟基乙酸在体内的降解速率大于聚乳酸的降解速率，通过增加聚乳酸-羟基乙酸的比例可增加溶葡萄球菌酶的释放速率；2、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中亲水性羟基乙酸比例高，聚合物降解速率快，因此改变乳酸、羟基乙酸在聚合物中的比例可调节溶葡萄球菌酶的释放速率。通过该法制备的溶葡萄球菌酶微球可经由注射或包埋在体内缓慢释放溶葡萄球菌酶，有效杀灭多种耐药性致病菌，避免因使用传统抗生素带来的毒副作用及耐药菌的出现，具有较高的临床意义和应用价值。
本发明公开的溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA亚微米微球缓释制剂具有如下特点：
1、杀菌效果强。该制剂对革兰氏阳性菌尤其是金黄色葡萄球菌，具有很强的杀菌作用。
2、药物缓释能力强。通过调节PLA-PLGA中乳酸和羟基的相对含量的比例，溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA亚微米微球药物在体液中的缓释可控制在3天至三个月。
3、稳定性强。本品在25℃常温保存6个月，生物活性基本没有改变。
附图说明
图1是溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA微球的体外缓释曲线
图2是溶葡萄球菌酶-PLGA微球的体外缓释曲线
具体实施方式
实施例1溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA微球的制备
1、溶葡球菌酶溶液配备：称取10毫克溶葡球菌酶冻干粉，溶解于含有10毫克甘露醇的10毫升二甲亚砜(DMSO)中，配制成1mg/ml的溶葡球菌酶溶液。
2、PLA-PLGA有机溶液的配备：称取0.4克分子量为30,000-50,000的聚乳酸多聚物，0.1克分子量为30,000-50,000的聚乳酸-羟基乙酸(其中乳酸、羟基乙酸比例为75∶25)多聚物，溶解于10毫升二氯甲烷，配制成5％PLA-PLGA溶液。
3、将5％PLA-PLGA溶液逐滴缓慢加入配制好的溶葡球菌酶-DMSO溶液，备用。
4、平衡超临界CO2流体，过程温度37℃、压力13.5MPa，CO2流速为20g/min，泵入上述配制好的溶葡球菌酶溶液，通过超临界反溶剂法制得溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球。
5、经检测溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球平均粒径约为3-15微米。
实施例2溶葡萄球菌酶-PLGA微球的制备
1.溶葡球菌酶溶液配备：称取20毫克溶葡球菌酶冻干粉，溶解于含有10毫克甘露醇的10毫升二甲亚砜(DMSO)中，配制成1mg/ml的溶葡球菌酶溶液。
2.PLGA有机溶液的配备：称取0.5克分子量为30,000-50,000聚乳酸-羟基乙酸(其中乳酸、羟基乙酸比例为50∶50)多聚物，溶解于10毫升二氯甲烷，配制成5％PLGA溶液。
3.将5％PLGA溶液逐滴缓慢加入配制好的溶葡球菌酶-DMSO溶液，备用。
4.平衡超临界CO2流体，过程温度37℃、压力13.5MPa，CO2流速为20g/min，泵入上述配制好的溶葡球菌酶溶液，通过超临界反溶剂法制得溶葡球菌酶-PLGA微球。
5.经检测溶葡球菌酶-PLGA微球平均粒径约为3-15微米。
实施例3溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球的体外缓释曲线
称取5mg实施例1制备的微粒，置于10ml的PBS缓冲溶液(pH7.4)中，密封，4℃恒温恒速(100r·min-1)振荡。分别在三个月内内定时取缓冲液，检测溶葡球菌酶酶活性，计算溶葡球菌酶累积释放百分率。缓释溶葡球菌酶微球的体外释药结果如图1所示：
该结果显示，溶葡球菌酶在体外释药过程时间长达三个月，释放速度较为稳定，可在维持溶葡球菌酶的稳定长效释放。
实施例4溶葡球菌酶-PLGA微球的体外缓释曲线
称取5mg实施例2制备的微粒，置于10ml的PBS缓冲溶液(pH7.4)中，密封，4℃恒温恒速(100r·min-1)振荡。一周内定时取缓冲液，检测溶葡球菌酶酶活性，计算溶葡球菌酶累积释放百分率。缓释溶葡球菌酶微球的体外释药结果如图2所示：
该结果显示，溶葡球菌酶在体外释药过程时间约为一周，释放速度较为稳定。
实施例5溶葡萄球菌酶微球稳定性试验
1、将实施例1制备的溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球在25℃存放6个月。
2、于不同存放时间，称取5mg溶葡萄球菌酶-PLA-PLGA微球置于100ml的PBS缓冲溶液(pH7.4)中，密封，4℃恒温恒速振荡24小时，通过0.22μm滤膜过滤，取100μl缓冲液，检测溶葡球菌酶酶活性，结果如表1所示，溶葡球菌酶-PLA-PLGA微球在25℃存放6个月后酶活性没有发生变化。
表1、溶葡萄球菌酶微球稳定性
| 时间(天) | 0 | 30 | 60 | 90 | 180 |
| 溶葡球菌酶酶活(u/mg微球) | 48.7 | 47.3 | 49.1 | 50.2 | 45.9 |
| SD | 7.5 | 8.1 | 5.9 | 6.3 | 8.9 |
Claims (7)
1.一种溶葡萄球菌酶缓释制剂，其特征在于，组分及重量百分含量包括：溶葡萄球菌酶1-10％，甘露醇1-10％，聚乳酸(PLA)0-90％，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)5-95％。
2.根据权利要求1所述的溶葡萄球菌酶缓释制剂，其特征在于，所述的聚乳酸(PLA)为分子量为30,000-100,000的DL-或D-多聚乳酸。
3.根据权利要求1所述的溶葡萄球菌酶缓释制剂，其特征在于，所述及的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)为分子量为30,000-100,000的DL-聚乳酸-聚羟基乙酸聚合物。
4.根据权利要求3所述的溶葡萄球菌酶缓释制剂，其特征在于，所述及的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)中乳酸与羟基乙酸的重量比为9∶1～1∶1。
5.根据权利要求1所述的溶葡萄球菌酶缓释制剂，其特征在于，优选的组分及重量百分含量包括：溶葡萄球菌酶1-5％，甘露醇1-2％，聚乳酸(PLA)0-90％，聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)5-95％。
6.根据权利要求1-5任一所述的溶葡萄球菌酶缓释制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)配制溶液A：按上述比例称取溶葡萄球菌酶，将其溶解于DMSO中；
b)按上述比例称取PLA和PLGA，将其溶解于二氯甲烷中，加入溶液A中，得到溶液B；
c)将溶液B与超临界CO2流体混合，通过超临界反溶剂过程(SAS)技术制备平均粒径小于10微米的含溶葡萄球菌酶PLA-PLGA药物缓释微球；
d)收集溶葡萄球菌酶PLA-PLGA药物缓释微球。
7.根据权利要求1-5任一所述的溶葡萄球菌酶缓释制剂的应用，其特征在于，溶葡萄球菌酶缓释微粒采用注射或体内包埋的方式给药。
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| CN200810043584A CN101618210A (zh) | 2008-06-30 | 2008-06-30 | 一种溶葡萄球菌酶局部缓释制剂及其制备方法和应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN102552166A (zh) * | 2012-01-09 | 2012-07-11 | 北京化工大学 | 一种溶菌酶/聚(α-氰基丙烯酸异丁酯)载药微球的制备方法 |
| CN105943506A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-09-21 | 山东省药学科学院 | 一种可吸收自致孔注射用微球及其制备方法 |
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