CN101608185A

CN101608185A - 一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因及其应用

Info

Publication number: CN101608185A
Application number: CNA2008100739855A
Authority: CN
Inventors: 杜丽琴; 黄日波; 韦宇拓
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2008-12-16
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2009-12-23

Abstract

一种编码蔗糖磷酸化酶的基因spgx，含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其功能等同变异体。它是通过对一个磷酸蔗糖酶进行DNA分子改造而得到。所述基因所编码的蛋白质具有水解蔗糖生成1－磷酸葡萄糖和果糖的功能，但是缺失了逆向反应，不能把1－磷酸葡萄糖和果糖逆向生成蔗糖。同时也缺失了对各种单糖的转糖苷作用。获得的新的基因可用于构建高效降解利用蔗糖的宿主菌，在蔗糖的降解中具有广泛的用途。

Description

一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因，这个酶的特殊在于缺失蔗糖水解的逆反应，该基因编码的蛋白质可用于蔗糖的降解。

背景技术

蔗糖作为植物中通过光合作用产生的糖类物质，是一种含量丰富的生物质，全球蔗糖的年产量超过了1亿吨。蔗糖是由α-D-葡萄糖和β-D-果糖通过1，2糖苷键组成的二糖，该二糖分解而成的单糖长期以来作为发酵工业中的碳源而被利用，特别是水解发酵产酒精工业的应用。

在自然界中，蔗糖被细菌分解利用主要是经过两个途径，不同的微生物使用不同的途径。一个是PTS途径，如芽孢杆菌属、梭菌属等微生物使用这样的途径；另一个是蔗糖渗透酶途径，如双歧杆菌属，肠膜明串珠菌属等菌使用这个途径。PTS途径通过一个称为phosphoenolpyruvate-dependentphosphotransferase system把蔗糖磷酸化后转运入细胞膜内，磷酸化的蔗糖再被磷酸蔗糖水解酶水解成6-磷酸葡萄糖和果糖。而蔗糖渗透途径通过蔗糖渗透酶把蔗糖运输到细胞内，然后由蔗糖磷酸化酶把蔗糖水解成1-磷酸葡萄糖和果糖，1-磷酸葡萄糖跟着被转化成6-磷酸葡萄糖。6-磷酸葡萄糖和果糖进入微生物的糖酵解发酵途径得到有机醇、氨基酸及生物聚合物等高附加值的化工产品(S.J.Reid，V.R.Abratt.2005.Sucrose utilization in bacteria：geneticorganization and regulation.Appl.Microbiol.Biotechnol.67：312-321)。蔗糖水解酶类(磷酸蔗糖水解酶、蔗糖磷酸化酶等)是降解蔗糖代谢途径的第一个酶，也是微生物蔗糖代谢途径中的关键酶之一，是决定蔗糖发酵时间的最主要的因素之一。因此寻找新的蔗糖水解酶用于构建新的更适合工业化生产各种化工产品的基因工程菌，提高微生物水解蔗糖的转化效率和水解速度，从而缩短发酵生产时间，对于降低直接发酵甘蔗汁生产各种化工产品的生产成本具有十分重要的意义。

蔗糖磷酸化酶属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases)，许多糖基水解酶由一个催化功能域和一个或更多个其它的功能域组成，根据催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶类被划分成不同的家族(families)(Davies G.，Henrissat B.1995.Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases.Structure3：853-859；Henrissat B.，Bairoch A.1996.Updating the sequence-basedclassification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316：695-696)。根据碳水化合物活性酶数据库(http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html)上所列糖基水解酶类的最新清单，目前糖基水解酶类有112个家族。蔗糖磷酸化酶属于糖基水解酶类家族13。糖基水解酶家族13的糖基水解酶属于以“保留”(retaining)作用方式进行水解反应，这样的水解作用方式具有水解作用的逆反应，这个逆反应可以把葡萄糖基转移到受体上形成多糖，这个就是转糖苷作用。

蔗糖磷酸化酶催化蔗糖水解成1-磷酸葡萄糖和果糖。这个催化反应是个可逆反应：在有1-磷酸葡萄糖和果糖存在的条件下，蔗糖磷酸化酶催化逆反应消耗1-磷酸葡萄糖和果糖生成蔗糖(E.J.Vandamme，J.V.Loo，L.Machtelinckx，A.D.Laporte.1987.Microbial sucrose phosphorylase：fermentation process，properties，and biotechnical application.Adv.Appl.Micro.12：163-201)。可逆反应的反应结果是，在反应混合物中，蔗糖、1-磷酸葡萄糖和果糖的量形成动态平衡，逆反应的存在使正向反应(蔗糖水解)无法进行完全。而人工缺失逆反应使反应产物无法逆向生成反应底物，从而可以使蔗糖的水解彻底进行。

虽然已有研究报告分析和研究蔗糖磷酸化酶在细菌降解利用蔗糖的过程中所起的重要作用(E.J.Luesink，J.D.Marugg，O.P.Kuipers，W.M.Vos.1999.Characterization of the divergent sacBK and sacAR operons，involved in sucroseutilization by lactococcus lactis.J.Bacterio.181(6)：1924-1926；B.Kullin，V.R.Abratt，S.J.Reid.2006.A functional analysis of the Bifidobacterium longum cscAand scrP genes in sucrose utilization.Appl.Microbiol.Biotechnol.72：975-981)，并且也有研究者研究了不同的蔗糖磷酸化酶水解蔗糖的逆反应-转糖苷作用的作用方式(L.A.Broek，E.L.Boxtel，R.P.Kievit，R.Verhoef，G.Beldman，A.G.Voragen.2004.Physico-chemical and transglucosylation properties of recombinantsucrose phosphorylase from Bifidobacterium adolescentis DSM20083.Appl.Microbiol.Biotechnol.65：219-227)。但是目前所发现的蔗糖磷酸化酶都具有催化1-磷酸葡萄糖和果糖等单糖(如阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖、木糖)进行转糖苷反应的能力，目前也没有发现任何成功的人工缺失蔗糖磷酸化酶逆反应的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因及其应用，所述蔗糖磷酸化酶没有蔗糖水解的逆反应，也没有和各种单糖(阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖、木糖)的转糖苷作用。

本发明通过以下技术方案在到上述目的：

一种编码蔗糖磷酸化酶的基因，所述基因具有SEQ ID NO：1核苷酸序列或其功能等同变异体。

所述功能等同变异体为SEQ ID NO：1的核苷酸序列的突变形式，突变形式包括缺失、无义、插入、错义。

所述的基因所编码的蔗糖磷酸化酶，其具有如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列，由501个氨基酸组成。

一种表达载体，它含有所述的蔗糖磷酸化酶基因。

一种宿主细胞，它含有所述的蔗糖磷酸化酶基因的原核细胞或真核细胞。

所述的蔗糖磷酸化酶在蔗糖降解和对含蔗糖材料处理中的应用。

一种编码蔗糖磷酸化酶的基因spgx(SEQ ID NO：1)，通过分子改造蔗糖磷酸化酶的基因unspase(GenBank序列号FJ472846)而得到，具体是通过在unspase分子上加入一段人工设计的核苷酸序列，改造得到一个新的蔗糖磷酸化酶。

SEQ ID NO：2的蛋白质是基因spgx编码的蔗糖酶产物Spgx，由501个氨基酸组成。

基因spgx在大肠杆菌中表达的重组产物Spgx能降解蔗糖生成1-磷酸葡萄糖和果糖。

本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。

本发明的有益效果和突出的实质性特点在于：

1、通过对一个磷酸蔗糖酶进行DNA分子改造，获得了新的基因。这个新的基因所编码的蛋白质具有水解蔗糖生成1-磷酸葡萄糖和果糖的功能，但是缺失了逆向反应，不能把1-磷酸葡萄糖和果糖逆向生成蔗糖。同时也缺失了对各种单糖的转糖苷作用。获得的新的基因可用于构建高效降解利用蔗糖的宿主菌。

2、本发明所提供的蔗糖磷酸化酶基因，在蔗糖的降解中具有广泛的用途。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作详细描述：

实施例中所用材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系XL1-blue(购自TaKaRa公司)；载体为购自Ihtrivogen公司的表达载体pSE380；购自Stratagene公司的基因突变试剂盒(QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit，目录号200521)；购自Intrivogen公司的NI-NTA蛋白质组氨酸纯化介质；购自TaKaRa、MBI的限制性内切酶、修饰酶和购自Sigma公司的各种糖等试剂。

1)unspase基因的克隆

用正向引物

5’-AGACAATTGATGCACCACCACCACCACCACAAAAATAAGGTTCAGCTTATTGCC-3’(包含一个MunI酶切位点和一个6xHis标签在5’末端)和反向引物，5’-CACAAGCTTCGATGGAGCGCCGGCATCGGC-3’(包含一个HindIII酶切位点在5’端)进行PCR扩增。扩增产物用MunI和HindIII进行双酶切然后连接到pSE380表达载体中。

2)spgx基因的获得

spgx基因是根据unspase基因序列信息进行设计改造。使用正向引物(5’-CGCGGCGAAACCAGCCAGGCCACGCTGACGTTCGAACACTGGATTGAGCTG-3’)和反向引物(5’-GAACGTCAGCGTGGCCTGGCTGGTTTCGCCGCGCCAGCGAAGCCGGATTTG-3’)进行PCR，PCR反应程序：第一步95℃2分钟；第二步进行30个循环，循环为98℃1分钟，46℃50秒，72℃6分钟；第三步72℃10分钟。PCR产物使用1μL Dpn I在37℃酶切一个小时，然后转化XL10-Gold感受态细胞(CaCl₂化学法转化)。转化产物克隆送交大连宝生物公司进行DNA测序分析确定正确的转化子。

3)蔗糖磷酸化酶基因spgx的表达和纯化

将含有质粒pSE-spgx的重组大肠杆菌XL1-Blue菌株接种到20mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养，待OD₆₀₀为0.6时，加入IPTG(终浓度为0.5mmol/L)、D-山梨醇(终浓度为100mmol/L)和甜菜碱(终浓度为2.5mmol/L)，20℃诱导20小时。11000转/分离心3分钟，收集菌体，用4mL裂解缓冲液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0)重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000转/分离心10分钟，取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4mL上清液加入1mL 50％的NI-NTA胶体，在4℃用200转/分摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加1mL冲洗缓冲液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0)到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入洗脱缓冲液(50mmol/LNaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，并用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证。

4)蔗糖磷酸化酶Spgx水解蔗糖酶活的测定和转糖苷酶活的测试

蔗糖磷酸化酶Spgx水解蔗糖反应：取10μL蔗糖磷酸化酶Spgx纯化物，与1％蔗糖溶液(50mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0))在500μL的反应体系中37℃作用1小时。蔗糖磷酸化酶Spgx转糖苷反应测试：取10μL蔗糖磷酸化酶Spgx纯化物加入含有1-磷酸葡萄糖[2％(w/v)]和不同的受体糖(阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖、木糖)[5％(w/v)]的磷酸缓冲液(50mmol/L，pH 7.0)在37℃放置12个小时。反应时间到后，所有反应在100℃加热10分钟。蔗糖的水解能力和转糖苷活性用薄层层析色谱法进行检测，薄层层析是在正丁醇/乙酸/水(2∶1∶1，v/v)的展层体系中进行，层析板用溶解在甲醇中的硫酸(50％(v/v))喷射并在110℃加热10分钟。

序列表

<110>广西大学

<120>一种人工缺失逆反应的蔗糖磷酸化酶的基因及其应用

<160>2

<170>PatentIn Version 3.3

<210>1

<211>1506

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)...(1506)

<223>

<400>1

atgaaaaata aggttcagct tattgcctat gtcgaccgta tttccggagg aggtttccgc 60

aagctccatg cgccattaac agggccgctg gcggaaattt tcggaggagc gcatcttctg 120

ccgtttttca ctcccatcga tggtgcggat gccggattcg atcccagcga tcacacgcag 180

gtggatccac gtcttggaac ctgggacgat gtccgcattc tgggcggcgc aatcgaactg 240

gtcgcggatc tgattgtgaa tcatgtttcc tcatcatctc cgcagtttat cgattattcg 300

aagaagggga gcgattccct gtatgcgggg atgtttctaa cctatgaccg tgtttttccc 360

gagggcgcgc gcgaggcgga cattctgagg atttaccggc cgcgtcccac gcttcctttc 420

agtcctgtaa cgctgtcgtc gagagaaaga aagttattat ggactacgtt taatccggag 480

caggtggaca tcgatgtccg ccatccggaa gcggaagcgt atctgcattc gattctcaaa 540

aaatttcagg cggcgggaat cagaatgata cggctggacg ctgtcgggta tgcgatcaag 600

aaaccgggcg ccagctgttt catgattccg gaaaccttcg acttcatcgc cgaactgacc 660

gaaaaagccc gcgcattggg aatagaagtt ttagttgaaa ttcacagcca ttacaggaag 720

cagatcgaaa tcgcccgcca ggtggactgg gtctacgatt ttgccttgcc gccgctggtg 780

ttgcacgctc tttttgcctc cgatcctcat cctttggcgc aatggctttc catcagtccc 840

cgcaacgcgg tgacagttct tgacacgcac gacggcatcg gcgtgatcga tgtgggcgcc 900

gatgcggagg ggaatcccgg acttctgtct ccggccgcta tcgacagcct ggtcgagacg 960

attcactcca gaagccaggg acagagccgg gaggcgaccg gcgcggccgc caataatctg 1020

gatctttatc aggtgaactg caccttcctg gacgcgcttg gagggagaga gcccgattat 1080

ctgatcgccc gcgccctcca gttttttgcg ccgggaattc cgcaggtcta ttatgtcggc 1140

ctcctgggag gaaccaatga catggacctt ctcggccgga gcggagtcgg ccgggacatc 1200

aaccgccatt attacacgga tgctgaaatc gatgcggcgc tggcgcgccc tctggtgcgg 1260

acgctgatcg cgttgattcg gcttcggaat acgcacccgg cattcgctgg ggagtttgat 1320

gtgtcggttc ctgctgcaac gcaaatccgg cttcgctggc gcggcgaaac cagccaggcc 1380

acgctgacgt tcgaacactg gattgagctg catgtggact tgtccattcc aaaggcttcc 1440

ataacgggta caggcattca tcctataact attccaggcg ccgccgatgc cggcgctcca 1500

tcgtga 1506

<210>2

<211>501

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Ala Tyr Val Asp Arg Ile Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Phe Arg Lys Leu His Ala Pro Leu Thr Gly Pro Leu

16 20 25 30

Ala Glu Ile Phe Gly Gly Ala His Leu Leu Pro Phe Phe Thr Pro

31 35 40 45

Ile Asp Gly Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ser Asp His Thr Gln

46 50 55 60

Val Asp Pro Arg Leu Gly Thr Trp Asp Asp Val Arg Ile Leu Gly

61 65 70 75

Gly Ala Ile Glu Leu Val Ala Asp Leu Ile Val Asn His Val Ser

76 80 85 90

Ser Ser Ser Pro Gln Phe Ile Asp Tyr Ser Lys Lys Gly Ser Asp

91 95 100 105

Ser Leu Tyr Ala Gly Met Phe Leu Thr Tyr Asp Arg Val Phe Pro

106 110 115 120

Glu Gly Ala Arg Glu Ala Asp Ile Leu Arg Ile Tyr Arg Pro Arg

121 125 130 135

Pro Thr Leu Pro Phe Ser Pro Val Thr Leu Ser Ser Arg Glu Arg

136 140 145 150

Lys Leu Leu Trp Thr Thr Phe Asn Pro Glu Gln Val Asp Ile Asp

151 155 160 165

Val Arg His Pro Glu Ala Glu Ala Tyr Leu His Ser Ile Leu Lys

166 170 175 180

Lys Phe Gln Ala Ala Gly Ile Arg Met Ile Arg Leu Asp Ala Val

181 185 190 195

Gly Tyr Ala Ile Lys Lys Pro Gly Ala Ser Cys Phe Met Ile Pro

196 200 205 210

Glu Thr Phe Asp Phe Ile Ala Glu Leu Thr Glu Lys Ala Arg Ala

211 215 220 225

Leu Gly Ile Glu Val Leu Val Glu Ile His Ser His Tyr Arg Lys

226 230 235 240

Gln Ile Glu Ile Ala Arg Gln Val Asp Trp Val Tyr Asp Phe Ala

241 245 250 255

Leu Pro Pro Leu Val Leu His Ala Leu Phe Ala Ser Asp Pro His

256 260 265 270

Pro Leu Ala Gln Trp Leu Ser Ile Ser Pro Arg Asn Ala Val Thr

271 275 280 285

Val Leu Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Val Gly Ala

286 290 295 300

Asp Ala Glu Gly Asn Pro Gly Leu Leu Ser Pro Ala Ala Ile Asp

301 305 310 315

Ser Leu Val Glu Thr Ile His Ser Arg Ser Gln Gly Gln Ser Arg

316 320 325 330

Glu Ala Thr Gly Ala Ala Ala Asn Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val

330 335 340 345

Asn Cys Thr Phe Leu Asp Ala Leu Gly Gly Arg Glu Pro Asp Tyr

346 350 355 360

Leu Ile Ala Arg Ala Leu Gln Phe Phe Ala Pro Gly Ile Pro Gln

361 365 370 375

Val Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Gly Gly Thr Asn Asp Met Asp Leu

376 380 385 390

Leu Gly Arg Ser Gly Val Gly Arg Asp Ile Asn Arg His Tyr Tyr

391 395 400 405

Thr Asp Ala Glu Ile Asp Ala Ala Leu Ala Arg Pro Leu Val Arg

406 410 415 420

Thr Leu Ile Ala Leu Ile Arg Leu Arg Asn Thr His Pro Ala Phe

421 425 430 435

Ala Gly Glu Phe Asp Val Ser Val Pro Ala Ala Thr Gln Ile Arg

436 440 445 450

Leu Arg Trp Arg Gly Glu Thr Ser Gln Ala Thr Leu Thr Phe Glu

451 455 460 465

His Trp Ile Glu Leu His Val Asp Leu Ser Ile Pro Lys Ala Ser

466 470 475 480

Ile Thr Gly Thr Gly Ile His Pro Ile Thr Ile Pro Gly Ala Ala

481 485 490 495

Asp Ala Gly Ala Pro Ser

496 500

Claims

1、一种编码蔗糖磷酸化酶的基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID NO：1核苷酸序列或其功能等同变异体。

2、根据权利要求1所述的一种编码蔗糖磷酸化酶的基因，其特征在于，所述功能等同变异体为SEQ ID NO：1的核苷酸序列的突变形式，突变形式包括缺失、无义、插入、错义。

3、根据权利要求1所述的基因所编码的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，其具有如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列，由501个氨基酸组成。

4、一种表达载体，其特征在于：它含有权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶基因。

5、一种宿主细胞，其特征在于：它含有权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶基因的原核细胞或真核细胞。

6、权利要求3所述的蔗糖磷酸化酶在蔗糖降解和对含蔗糖材料处理中的应用。