CN101608178B

CN101608178B - 融合肝素酶及其编码基因与制备方法

Info

Publication number: CN101608178B
Application number: CN2009100901666A
Authority: CN
Inventors: 邢新会; 叶逢春; 张翀; 蒋培霞
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2029-07-29
Also published as: CN101608178A; WO2011011906A1

Abstract

本发明公开了一种融合肝素酶。该融合肝素酶是如下a)或b)的蛋白：a)序列表中序列1的第8-1015所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白质。上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。本发明产生的三重融合蛋白的酶活通过摇瓶培养可达1214.4IU/L培养基，比酶活可达2.839IU/mg蛋白。本发明可以利用GFP蛋白实现菌体浓度和酶活的快速在线检测。

Description

融合肝素酶及其编码基因与制备方法

技术领域

本发明涉及酶工程和生物催化领域，特别涉及融合肝素酶及其编码基因与制备方法。

背景技术

肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素的多糖裂解酶，在许多种微生物中发现，包括棒杆菌Corynebacterium sp.(高宁国等，肝素酶产生菌的筛选及发酵条件，微生物学报1999 Vol.39：64-67)、鞘胺醇杆菌Sphingobacterium sp.(高宁国等，鞘胺醇杆菌肝素酶的产生，微生物学报2003 Vol.43：813-816)、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis(王忠彦等，肝素酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究，四川大学学报(自然科学版)2002 Vol.39：777-779)、环状芽孢杆菌Bacillus circulans(Yasutaka Tahara et al.，Purificationand characterization of heparinase that degrades both heparin and heparinsulfate from Bacilluscirculans BioSci.Biotechnol.Biochem.2002 Vol.66：1181-1184)、解肝素拟杆菌Prevotella heparinolytica(Kazuyuki Sugahara et al.，Characterization ofheparinase from an oral bacterium Prevotella heparinolytica J.Biochem.1998Vol.123：283-288)、粪便拟杆菌Bacteroides stercoris HJ-15(Dong Hyuu Kim et al.，Purificationand characterization of a novel heparinase from Bacteroides stercorisHJ-15 J.Biochem.2000 Vol.128：323-328)和肝素黄杆菌Flavabacterium heparinum(Sasiekharan，R.1991 Ph.D.Thesis，Havard University)。但是来自肝素黄杆菌的肝素酶是商业化的唯一来源。

肝素酶的研究具有十分重要的意义(Sasiekharan，R.1991 Ph.D.Thesis，Havard University；Sasiekharan，R.et al.，A comparative analysis of the primary sequences and characteristics of heparinase I，II，and III from Flavobacterium heparinum Biochemical and Biophysical Research Communication1996 Vol.229：770-777)：肝素酶是多糖裂解酶的一种，用于研究肝素酶及其底物多糖肝素之间的相互作用有助于阐明多糖裂解酶的作用机制；肝素酶可以用于解析肝素等复杂粘多糖的结构及其生物学功能；肝素酶可以用于解析人体内的凝血和抗凝血机制；肝素酶可以用作临床血液肝素化的去除，防止手术后出血；肝素酶用于PCR反应前血液制品的处理；肝素酶可以用于制备低分子的抗凝血药物低分子量肝素。

来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有三种，分别命名为肝素酶I(EC 4.2.2.7)、II(NO EC code)和III(EC 4.2.2.8)(Robert J.Linhardt et al.，Purificationand characterization of heparin lyases from Flavobacterium heparinum JBC1992 Vol.267：24347-24355)。其中肝素黄杆菌的肝素酶I(HepA)是目前为止研究最充分的肝素酶之一，其在低分子肝素的生产和体外血液循环中肝素的去除上的应用已有报道，具有巨大的市场开发价值。

肝素酶I通常是从肝素黄杆菌发酵液中提纯获得的，通常需要经过多步的色谱纯化，收率比较低。肝素黄杆菌增长速度慢，肝素酶的生产稳定性差，而且，产肝素酶需要价格昂贵的肝素诱导，增加了酶的成本，因而重组菌生产肝素酶I受到极大的关注，但通常情况下重组肝素酶I极容易形成包涵体，需要复杂的复性过程才能形成活性蛋白。

来自大肠杆菌的天然的麦芽糖结合蛋白MBP能够与麦芽糖特异吸附，参与大肠杆菌对麦芽糖的转运和利用。MBP不但能与amylose结合，实现亲和分离，也能与马铃薯淀粉结合实现亲和分离(廉德君等，一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法，生物化学与生物物理进展1998 Vol.25：283-284；Usha Srinivasan et al.，Aconvenient method for affinity purification of maltose binding proteinfusions Journal of Biotechnology 1998 Vol.62：163-167)，从而可大大降低酶的分离纯化的成本。本研究小组前期利用融合蛋白技术，将MBP与从肝素黄杆菌中克隆得到肝素酶I融合，构建了高效生产可溶性的肝素酶I的基因工程菌株，5L发酵罐生产酶活可达20000IU/L以上(Chen Yin，Xing Xin-hui，Ye Feng-chun，Kuang Ying，LuoMing-fang.Production of MBP-HepA fusion protein in recombinant Escherichia coliby optimization of culture medium，Biochemical Engineering Journal，2007，34：114-121)。该法得到的重组肝素酶I只需进行一步亲和层析就能达到95％的纯化效果。此项工作已申请专利，专利号为200410038098.6。

绿色荧光蛋白GFP，自从1994年Chalfie等(Chalfie M，Tu Y，EuskirchenG，Ward WW，Prasher DC Green fluorescent protein as a marker for geneexpression.Science 1994，263：802-805)首次在大肠杆菌细胞中表达出来后，由于该荧光蛋白稳定、对细胞无毒性、荧光检测简单，而且产荧光不需要底物等特点，已成为在生理学和生物技术的研究和开发中应用最广泛的报告蛋白之一。但是，目前为止GFP在生物学和生物技术中的应用主要侧重于各种定性解析，将其应用于蛋白质生物生产过程的定量监测及过程优化是一个新的领域。Poppenborg等(Poppenborg L，Friehs K，Flaschel E The green fluorescent protein is aversatile reporter for bioprocess monitoring.J.Biotechnol.1997，58：79-88)首次证明了将GFP融合到一亲和靶物上可以实现诸如培养、色谱分离等过程的快速监测。因此，GFP是用于定量快速监测细胞培养、发酵过程优化以及追踪固定化酶使用过程特性的具有极大潜力的工具。本实验室前期利用融合蛋白技术，将GFP与从肝素黄杆菌中克隆得到肝素酶I融合，构建了生产可溶性的肝素酶I的基因工程菌株(ChenYin，Xing Xin-hui，Ye Feng-chun，Kuang Ying.Soluble expression and rapidquantification of GFP-hepA fusion protein in recombinant Escherichia coli，Chinese Journal of Chemical Engineering，2007，15：122-126)。GFP的融合可以利用荧光测量对工程菌浓度及肝素酶I酶活进行快速定量追踪，有利于肝素酶I生产过程的优化和控制，有利于肝素酶的保存和应用过程的快速评价，有利于解析大分子肝素的结构和降解机理。此项工作已申请专利，专利号为200510090872.2。

现有的肝素酶I生产和催化工艺中，缺乏酶生产-分离-应用整个过程的集成方法。因此，肝素酶I的高效可溶表达、分离纯化、固定化、高效催化以及酶活的快速检测等多功能化集成就具有十分重要的意义。融合蛋白技术是实现这一多功能化集成的有效手段之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合肝素酶。

本发明提供的融合肝素酶，命名为GFP-MBP-HepA，是如下a)或b)的蛋白：

a)序列表中序列1的第8-1015所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白质。

上述b)的蛋白的氨基酸序列具体可为序列表中序列1所示的氨基酸序列。

上述蛋白的编码基因，命名为gfp-mbp-HepA，也属于本发明的保护范围之内。

上述基因的序列是如下1)或2)或3)的核苷酸序列：

1)序列表中序列2所示的核苷酸序列；

2)在高严谨条件下与序列表中序列2的核苷酸序列杂交且编码上述蛋白的核苷酸序列；

3)与序列表中序列2所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码上述蛋白的核苷酸序列。

序列2中，gfp的编码区是序列2的自5’端第22-735位的碱基；mbp的编码区是序列2的自5’端第778-1878位的碱基；HepA的编码区是序列2的自5’端第1956-3045位的碱基。

所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

含有上述基因的重组载体和转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体是通过以下步骤构建的：

将序列表中序列2的第1位-1878位所示的DNA片段插入质粒pMAL-c2x-HepA的多克隆位点，得到重组载体；

所述质粒pMAL-c2x-HepA是将序列2的第1956-3045位所示的肝素酶I的编码基因插入到质粒pMAL-c2x的BamHI和HindIII酶切位点之间，得到的重组质粒。

含有权利要求上述基因的重组菌也属于本发明的保护范围之内。

上述重组菌是含有上述的重组载体的重组大肠杆菌。

本发明的另一目的在于提供一种生产肝素酶的方法，是将上述的重组菌诱导培养，表达得到肝素酶。

上述诱导培养条件是：0.3-1mM的IPTG，10-30℃诱导培养5-30小时。

摇瓶培养实验证明：本发明产生的融合肝素酶的酶活可达1214.4IU/L培养基，比酶活可达2.839IU/mg蛋白。本发明可以利用GFP蛋白实现菌体浓度和酶活的快速在线检测。因为本发明中酶活与细菌浓度、荧光强度均存在着良好的线性关系，可以利用荧光强度实现培养过程中细菌浓度以及酶活的快速定量。上述结果说明在发酵培养过程中可以通过检测荧光强度以快速获得菌体浓度和肝素酶I的酶活的变化，从而实现高效生产三重融合肝素酶I的培养过程优化和控制。

附图说明

图1为表达载体pMAL-hepA的构建过程示意图。

图2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶I基因电泳图谱。

图3为表达载体phGMH-L3的构建过程示意图。

图4为大肠杆菌TB1/phGMH-L3和TOP10/phGMH-L3工程菌株表达GFP-MBP-HepA的SDS-PAGE电泳分析图。

图5为大肠杆菌TB1/phGMH-L3和TOP10/phGMH-L3工程菌株15度诱导培养21h后菌体浓度、粗酶液酶活及荧光量比较情况示意图。

图6为大肠杆菌TB1/phGMH-L3和TOP10/phGMH-L3工程菌株15度诱导培养21h后粗酶液比酶活及比荧光强度比较情况示意图。

图7为TOP10/phGMH-L3培养过程中细胞浓度(OD₆₀₀)、肝素酶I的酶活(IU/L培养基)和荧光强度(U/L)的变化曲线图。

图8为TOP10/phGMH-L3培养过程中细胞浓度(OD₆₀₀)、荧光强度(U/L)与肝素酶I的酶活(IU/L培养基)的关系曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1.绿色荧光蛋白、麦芽糖结合蛋白和肝素酶I三重融合蛋白的表达

一、三重融合蛋白的表达载体的构建

1、含有麦芽糖结合蛋白和肝素酶I二重融合蛋白编码基因的表达载体pMAL-c2x-HepA的构建

表达载体pMAL-c2x-HepA的构建过程如图1所示，具体过程如下：从肝素黄杆菌(Flavabacterium heparinum)(购买自IAM)的染色体组DNA中扩增肝素酶I基因，所用的引物分别为：

上游引物：5′-GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC-3′(带下划线的碱基为BamHI的酶识别位点)，

下游引物：5′-CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC-3′(带下划线的碱基为HindIII酶识别位点)，扩增后，分别引入BamHI和HindIII酶识别位点。

PCR扩增的反应体系为：50ng模板DNA，100pmol每种引物，1×扩增缓冲液(北京天为生物技术有限公司)，200μmol/L每种dNTP，1单位高保Pfu酶；扩增程序为：95摄氏度变性5分钟，50-60(51、53、55、57或59℃)摄氏度引物退火45秒，72摄氏度引物延伸90秒，30个循环后，72摄氏度延伸5分钟结束反应。该PCR结果如图2所示，表明扩增得到1.1kb的肝素酶I基因片段。测序表明，该片段具有自序列表中序列2的5′端第1956位-3045位核苷酸序列。图2中，泳道2-6分别为引物退火温度为51、53、55、57或59℃扩增结果，泳道1为分子量marker(条带大小依次为15kb、10kb、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、750bp)，箭头所指处为1.1kb目标片段。

将上述得到的PCR产物用BamHI和HindIII双酶切后，分别插入到购自美国New England Biolabs公司的pMAL-c2x载体的BamHI和HindIII酶识别位点之间，得到pMAL-c2x重组载体，将pMAL-c2x重组载体转化大肠杆菌JM109，以5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3’和5’CTTAAAGCTTTTACTATCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’为引物，通过菌落PCR筛选转化子，提取可得到1.1kbPCR产物的转化子中的pMAL-c2x重组载体，分别通过BamHI和HindIII双酶切验证。将通过BamHI和HindIII双酶切得到1.1kb片段的质粒进行测序，将含有具有序列表中序列2的5′端第1956位-3045位的核苷酸序列的肝素酶I融合蛋白编码基因的pMal-c2x重组载体命名为pMAL-c2x-HepA。在pMAL-c2x-HepA中，HepA基因与lacZα基因之间有两个连续的终止密码TAGTAA，从而能够有效地终止蛋白翻译不会表达lacZα蛋白。

2、三重融合蛋白表达载体phGMH的构建

根据三重融合蛋白中连接绿色荧光蛋白与麦芽糖结合蛋白的氨基酸残基序列不同，我们构建了phGMH表达载体，命名为phGMH-L3。phGMH-L3中连接GFP与MBP的氨基酸残基序列为S₃N₁₀I，构建过程如图3所示。具体过程如下：

phGMH-L3的构建过程：

以质粒pSG1729(从Bacillus Genetic Stock Center获得)为模板，用上游引物5′CGAGCACTTCACGAACAAGGACCATAGCATATTAATCATCATCATCATCATCATATGAGTAAAGGAGAAG 3′(带下划线的碱基为AseI酶识别位点)和下游引物5′GATCCCATTAATGTTGTTGTTATTGTTATTGTTGTTGTTGTTCGAGCTCGATTTGTATAGTTCATCCAT 3′(带下划线的碱基为AseI酶识别位点)扩增带有组氨酸标记His₆的绿色荧光蛋白基因his-gfp，两端均引入AseI酶识别位点。

PCR扩增的反应体系为：50ng模板DNA，100pmol每种引物，2×TransTaq HighFidelity(HiFi)PCR SuperMix II；扩增程序为：95摄氏度变性5分钟，60℃退火45秒，72摄氏度引物延伸90秒，30个循环后，72摄氏度延伸10分钟结束反应。测序表明，his-gfp具有SEQ ID №：2中5′端第1-735位核苷酸序列。

将上述得到的PCR产物his-gfp用Ase I酶切后，与pMAL-c2x-HepA经NdeI(酶切位点为CATATG)单酶切后的大片断用T4DNA连接酶，得到重组载体，将将其转化大肠杆菌DH5α。筛选出重组质粒经酶切鉴定并通过序列测定确认(美国Invitrogen公司)。将含有三重融合蛋白的编码基因(如序列表中序列2所示)的重组载体命名为phGMH-L3。其中，gfp的编码区是序列2的自5’端第22-735位的碱基；mbp的编码区是序列2的自5’端第778-1878位的碱基；HepA的编码区是序列2的自5’端第1956-3045位的碱基。

二、三重融合蛋白的表达

1、诱导表达

提取步骤一中含有phGMH-L3的大肠杆菌DH5α中的质粒，按照常规方法转化大肠杆菌TB1和TOP10，经过氨苄青霉素筛选和利用步骤一中2提供的引物进行菌落PCR鉴定，得到含有phGMH-L3的大肠杆菌TB1和TOP10，即TB1/phGMH-L3和TOP10/phGMH-L3作为表达GFP-MBP-HepA的工程菌。

以质粒pMAL-c2x转化大肠杆菌TB1和TOP10，得到空载体对照TB 1/pMAL-c2x和TOP 10/pMAL-c2x。

以下操作对上面的工程菌平行进行。

将空载体对照和工程菌分别在LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)37℃培养至OD₆₀₀约为0.600附近后，加入终浓度为0.3mM IPTG 15℃进行诱导培养21h。10000rpm，8min离心收集菌体并用20mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)洗涤两次，重悬至OD₆₀₀约为8.000附近，取样40μl做细胞全蛋白组分SDS-PAGE电泳。将上面OD₆₀₀约为8.00重悬液进行超声破碎(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇3秒的处理198次)，12000rpm，30min取上清液40μl做可溶蛋白组分SDS-PAGE电泳。结果如图4所示，图4中3个M均为marker(从上而下分子量依次均为120kDa、100kDa、65kDa、50kDa)，C1为空载体对照TOP10/pMAL-c2x全蛋白组分；C2为空载体对照TB1/pMAL-c2x的全蛋白组分；S9、S10分别为大肠杆菌TB1(phGMHS-L3)的全蛋白组分和可溶蛋白组分；S11、S12分别为大肠杆菌TOP10(phGMHS-L3)的全蛋白组分和可溶蛋白组分。

结果表明：空载体对照菌株TB1/pMAL-c2x和TOP10/pMAL-c2x诱导培养后无荧光无酶活，其它工程菌均表达出了可溶性的GFP-MBP-HepA三重融合蛋白，其中大肠杆菌TOP10中的表达效果均要优于大肠杆菌TB1。并且经过测序，TB1/phGMH-L3、TOP10/phGMH-L3表达出的蛋白的氨基酸序列如序列表序列1所示。并且该融合蛋白的GFP的氨基酸序列如序列1的自氨基端第8-245位所示；该融合蛋白的MBP的氨基酸序列如序列1的自氨基端第260-626所示；该融合蛋白的HepA的氨基酸序列如序列1的自氨基端第653-1015所示。

2、酶活及荧光强度检测分析

粗酶液即为上面步骤中超声破碎后离心所得的上清液。酶活力(单位为IU/L)的检测采用232nm的光吸收法，1IU的酶活的定义为30℃每分钟产生1μmol不饱和键的反应效力。取肝素底物溶液0.5ml(25g/L肝素，40mM NaCl，3.5mM CaCl₂，17mM Tris-HCl，pH 7.4)，加入步骤3中所得的粗酶液，其它体积以Tris缓冲液补充，最终的反应液体积为1.5ml，测单位时间内在232nm的吸光度变化ΔA₂₃₂。消光系数∈＝3800M^-1。比酶活(单位为IU/mg蛋白)的定义为酶活力与粗酶液蛋白浓度(单位为mg/L)的比值。蛋白浓度监测采用常规的Bradford法。荧光强度(单位为U/L)检测采用荧光分光光度计HITACHI F-2500，激发波长为488nm，检测吸收波长为512nm。比荧光强度定义为荧光强度与粗酶液蛋白浓度(单位为mg/L)的比值。

15℃诱导培养空载体对照和工程菌21h后，OD₆₀₀、酶活、荧光强度结果如图5所示，比酶活和比荧光强度结果如图6所示，其中空载体对照诱导培养后无荧光无酶活未在图上显示，大肠杆菌TOP10/phGMH-L3的粗酶液和比酶活很高，酶活可达517.2IU/L培养基，比酶活可达2.839IU/mg蛋白，比荧光强度可达0.858IU/mg蛋白。

实施例2.三重融合蛋白肝素酶酶活的荧光定量追踪

根据实施例1的结果，我们选取大肠杆菌TOP10/phGMH-L3进行了三重融合蛋白肝素酶酶活的荧光定量追踪实验。用含100μg/ml氨苄青霉素的M9YE培养基(17.1g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3.0g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl；1.0g/L NH₄Cl，12.5g/L酵母提取物，12g/L葡萄糖)对TOP10/phGMH-L3进行培养，在37℃培养大约3.5小时(至OD₆₀₀为0.735)后，加入终浓度为0.3mM的IPTG，并将培养温度改为15℃进行诱导培养。之后每隔2小时，取2ml菌液分别测其细胞浓度(OD₆₀₀)、肝素酶I的酶活和荧光强度(荧光分光光度计HITACHI F-2500)，直至诱导培养30小时。

肝素酶I的酶活是按照实施例1步骤二中的步骤2的方法测定，结果表明肝素酶I的酶活随着诱导时间的延长，表达量逐渐增加。荧光强度的测定分为两种方式：方式1是直接利用菌液测定荧光强度值，方式2是将菌液离心后用相同体积的20mM的Tris缓冲液(pH7.4)重悬，用实施例1中步骤二中的步骤1的方法超声破碎后离心去上清来测定荧光强度值。

培养过程的细胞浓度(OD₆₀₀)、肝素酶I的酶活(IU/L培养基)和荧光强度(RFU)的变化如图7所示，最高酶活可达1214.4IU/L培养基。随着诱导时间的增加，细胞浓度、酶活和荧光量均增加，但由于细胞散射的影响，方式1所测得的荧光强度偏小，且细胞浓度越大，偏差越大。此时可通过方式2来准确测量荧光量。

为进一步研究利用GFP蛋白实现菌体浓度和酶活的快速在线检测，我们研究了酶活与OD₆₀₀、荧光强度的关系，结果如图8所示。结果表明，酶活与细菌浓度、荧光强度均存在着良好的线性关系，可以利用荧光强度实现培养过程中细菌浓度以及酶活的快速定量。上述结果说明在发酵培养过程中可以通过检测荧光强度以快速获得菌体浓度和肝素酶I的酶活的变化，从而实现高效生产三重融合肝素酶I的培养过程优化和控制。

序列表

<110>清华大学

<120>融合肝素酶及其编码基因

<130>CGGNARL92435

<160>2

<210>1

<211>1015

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

Met His His His His His His Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr

1 5 10 15

Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His

20 25 30

Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys

35 40 45

Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp

50 55 60

Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg

65 70 75 80

Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro

85 90 95

Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn

100 105 110

Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn

115 120 125

Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu

130 135 140

Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met

145 150 155 160

Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His

165 170 175

Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Ser Pro Asp Asn His Tyr Leu

195 200 205

Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His

210 215 220

Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met

225 230 235 240

Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn

245 250 255

Asn Asn Ile Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn

260 265 270

Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu

275 280 285

Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu

290 295 300

Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile

305 310 315 320

Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu

325 330 335

Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe

340 345 350

Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile

355 360 365

Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn

370 375 380

Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys

385 390 395 400

Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe

405 410 415

Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu

420 425 430

Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala

435 440 445

Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met

450 455 460

Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly

465 470 475 480

Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp

485 490 495

Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly

500 505 510

Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala

515 520 525

Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu

530 535 540

Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly

545 550 555 560

Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg

565 570 575

Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn

580 585 590

Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile

595 600 605

Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala

610 615 620

Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn

625 630 635 640

Leu Gly Ile Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Gly Ser Gln Gln Lys Lys

645 650 655

Ser Gly Asn Ile Pro Tyr Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Lys

660 665 670

Gln Ser Glu Ile Ile Asp Asn Lys Trp Val Ala Val Gly Ile Asn Lys

675 680 685

Pro Tyr Ala Leu Gln Tyr Asp Asp Lys Leu Arg Phe Asn Gly Lys Pro

690 695 700

Ser Tyr Arg Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser Leu Glu Gly Tyr

705 710 715 720

Ala Ala Gly Glu Thr Lys Gly Arg Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Tyr Ala

725 730 735

Thr Thr Asn Asp Phe Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val Tyr Gln Asn Ala

740 745 750

Gln Lys Leu Lys Thr Val Tyr His Tyr Gly Lys Gly Ile Cys Glu Gln

755 760 765

Gly Ser Ser Arg Ser Tyr Thr Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Phe

770 775 780

Pro Asp Asn Ala Thr Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Ala Pro Ser

785 790 795 800

Arg Thr Leu Val Ala Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys Thr Leu Ser Ile

805 810 815

Glu Glu Phe Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe Lys Lys Asn Ile

820 825 830

Ala His Asp Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Tyr

835 840 845

Val Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gln Gly Gly Tyr Pro

850 855 860

Pro Leu Ala Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Lys Ala Asn

865 870 875 880

Ser Asp Arg Gln Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn

885 890 895

Pro Glu Asn Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr

900 905 910

Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gln Phe Pro Lys Asp Cys

915 920 925

Trp Ile Thr Phe Asp ValAla Ile Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys Glu

930 935 940

Ala Asn Thr Ile Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr Tyr

945 950 955 960

Thr Lys Asn Lys Lys Pro Gln Lys Ala His Ile Val Asn Gln Gln Glu

965 970 975

Ile Leu Ile Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly

980 985 990

Ile Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu Ser

995 1000 1005

Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Arg

1010 1015

<210>2

<211>3051

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>2

atgcaccacc accaccacca catgagtaaa ggagaagaac ttttcactgg agttgtccca 60

attcttgttg aattagatgg tgacgttaat gggcacaaat tttctgtcag tggagagggt 120

gaaggtgatg caacatacgg aaaacttacc cttaaattta tttgcactac tggaaaacta 180

cctgttccat ggccaacact tgtcactact ctgacttatg gtgttcaatg cttttcaaga 240

tacccagatc atatgaaaca gcatgacttt ttcaagagtg ccatgcccga aggttatgta 300

caggaaagaa ctatattttt caaagatgac gggaactaca agacacgtgc tgaagtcaag 360

tttgaaggtg atacccttgt taatagaatc gagttaaaag gtattgattt taaagaagat 420

ggaaacattc ttggacacaa attggaatac aactataact cacacaatgt atacattatg 480

gcagacaaac aaaagaatgg aatcaaagtt aacttcaaaa ttagacacaa cattgaagat 540

ggaagcgttc aactagcaga ccattatcaa caaaatactc caattggcga tggccctgtc 600

ctttcaccag acaaccatta cctgtccaca caatctgccc tttcgaaaga tcccaacgaa 660

aagagagacc acatggtcct tcttgagttt gtaacagctg ctgggattac acatggcatg 720

gatgaactat acaaatcgag ctcgaacaac aacaacaata acaataacaa caacattatg 780

aaaatcgaag aaggtaaact ggtaatctgg attaacggcg ataaaggcta taacggtctc 840

gctgaagtcg gtaagaaatt cgagaaagat accggaatta aagtcaccgt tgagcatccg 900

gataaactgg aagagaaatt cccacaggtt gcggcaactg gcgatggccc tgacattatc 960

ttctgggcac acgaccgctt tggtggctac gctcaatctg gcctgttggc tgaaatcacc 1020

ccggacaaag cgttccagga caagctgtat ccgtttacct gggatgccgt acgttacaac 1080

ggcaagctga ttgcttaccc gatcgctgtt gaagcgttat cgctgattta taacaaagat 1140

ctgctgccga acccgccaaa aacctgggaa gagatcccgg cgctggataa agaactgaaa 1200

gcgaaaggta agagcgcgct gatgttcaac ctgcaagaac cgtacttcac ctggccgctg 1260

attgctgctg acgggggtta tgcgttcaag tatgaaaacg gcaagtacga cattaaagac 1320

gtgggcgtgg ataacgctgg cgcgaaagcg ggtctgacct tcctggttga cctgattaaa 1380

aacaaacaca tgaatgcaga caccgattac tccatcgcag aagctgcctt taataaaggc 1440

gaaacagcga tgaccatcaa cggcccgtgg gcatggtcca acatcgacac cagcaaagtg 1500

aattatggtg taacggtact gccgaccttc aagggtcaac catccaaacc gttcgttggc 1560

gtgctgagcg caggtattaa cgccgccagt ccgaacaaag agctggcaaa agagttcctc 1620

gaaaactatc tgctgactga tgaaggtctg gaagcggtta ataaagacaa accgctgggt 1680

gccgtagcgc tgaagtctta cgaggaagag ttggcgaaag atccacgtat tgccgccact 1740

atggaaaacg cccagaaagg tgaaatcatg ccgaacatcc cgcagatgtc cgctttctgg 1800

tatgccgtgc gtactgcggt gatcaacgcc gccagcggtc gtcagactgt cgatgaagcc 1860

ctgaaagacg cgcagactaa ttcgagctcg aacaacaaca acaataacaa taacaacaac 1920

ctcgggatcg agggaaggat ttcagaattc ggatcccagc aaaaaaaatc cggtaacatc 1980

ccttaccggg taaatgtgca ggccgacagt gctaagcaga gcgagattat tgacaacaaa 2040

tgggtggcag taggcatcaa taaaccttat gcattacaat atgacgataa actgcgcttt 2100

aatggaaaac catcctatcg ctttgagctt aaagccgaag acaattcgct tgaaggttat 2160

gctgcaggag aaacaaaggg ccgtatagaa ttgtcgtaca gctatgcaac caccaatgat 2220

tttaagaaat ttcccccaag cgtataccaa aatgcgcaaa agctaaaaac cgtttatcat 2280

tacggcaaag ggatttgtga acaggggagc tcccgcagct ataccttttc agtgtacata 2340

ccctcctcct tccccgacaa tgcgactact atttttgccc aatggcatgg tgcacccagc 2400

agaacgcttg tagctacacc agagggagaa attaaaacac tgagcataga agagtttttg 2460

gccttatacg accgcatgat cttcaaaaaa aatatcgccc atgataaagt tgaaaaaaaa 2520

gataaggacg gaaaaattac ttatgtagcc ggaaagccaa atggctggaa ggtagaacaa 2580

ggtggttatc caccgctggc ctttggtttt tctaaagggt atttttacat caaggcaaac 2640

tccgaccggc agtggcttac cgacaaagcc gaccgtaaca atgccaatcc cgagaatagt 2700

gaagtaatga agccctattc ctcggaatac aaaacttcta ccattgccta taaaatgccc 2760

tttgcccagt tccctaaaga ttgctggatt acttttgatg tcgccataga ctggacgaaa 2820

tatggaaaag aggccaatac aattttgaaa cccggtaagc tggatgtgat gatgacttat 2880

accaagaata agaaaccaca aaaagcgcat atcgtaaacc agcaggaaat cctgatcgga 2940

cgtaacgatg acgatggcta ttacttcaaa tttggaattt acagggtcgg taacagcacg 3000

gtcccggtta cttataacct gagcgggtac agcgaaactg ccagatagta a 3051

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列1的第8-1015所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

5.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是通过以下步骤构建的：

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是含有权利要求5或6所述的重组载体的重组大肠杆菌。

9.一种生产肝素酶的方法，是将权利要求7或8所述的重组菌诱导培养，表达得到肝素酶。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述诱导培养条件是：0.3-1mM的IPTG，10-30℃诱导培养5-30小时。