CN101603075A - 一种基于酵母表面展示的分选酶检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于毕赤酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法，包括下列步骤：A.将目的基因QALPETGEE与linker－eGFP基因融合成QALPETGEE－linker－eGFP；B.构建QALPETGEE－linker－eGFP表达载体的构建；C.表达载体pKFS－QALPETGEE－linker－eGFP转化至毕赤酵母；D.酵母表面蛋白的表达：将阳性转化子分别经过YPD和BGMY液体培养基转接培养，然后在BMMY液体培养基中诱导表达；E.酵母表面蛋白的检测；F.分选酶的表达；G.分选酶活性检。本发明利用酵母表面展示技术，然后用荧光分光光度计和流式细胞仪检测，所用到的物质价格比较低，大大降低了分选酶活性测定的成本，且操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及酶分析技术领域，具体涉及一种基于酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法。
背景技术
分选酶的半胱氨酸转肽酶可将许多革兰氏阳性菌的表面蛋白锚定到细胞壁上的关键酶。Mazmanian等人发现它可以通过肽链N端部分固定在细胞膜上，并能识别表面蛋白C端分选信号所含的保守氨基酸基序LPXTG，从而将表面蛋白锚定到细胞壁上(Staphylococcusaureus sortase，an enzyme that anchors surface proteins to the cellwall.Science，1999，285(5428)：760～763)。而表面蛋白能在病原菌的致病性方面起关键作用，因此分选酶有可能称为降低革兰氏阳性菌致病性的药物靶点。建立高效、便捷的分选酶检测方法，无论在分子生物学还是药物筛选领域都将有重大意义，也必将有很好的市场应用前景。
目前分选酶的检测方法主要有纤连蛋白结合法、荧光淬灭活性检测法和荧光共振能量转移-HPLC检测法(FRET-HPLC)。纤连蛋白结合法通常需要对照菌——获得分选酶缺失突变株的筛选工作量很大，同时通过吸光度的改变反应分选酶的活性，精确性较差，不利于酶学性质的研究。荧光淬灭活性检测法精确性高，操作相对容易，但在进行分选酶抑制剂筛选时，需要大量合成荧光标记多肽底物，成本很高。FRET-HPLC是通过荧光底物裂解，检测荧光强度变化和色谱检测底物浓度变化相结合的方法。这方法进一步提高了精确性，但依然没有解决成本高的问题且操作更复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、操作简单的基于酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于毕赤酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法，包括下列步骤：
A、根据金黄色葡萄球菌分选酶的能识别表面蛋白C端分选信号所含的保守基序LPXTG，以pcDNA6-myc-his-EGFP作为模板，引物为5’-CCCACGCGTATGCAAGCTTTGCCTGAAACTGGTGAAG AAGGAGGAATTGGAATTGCTC-3’和
5’-CGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’，划线部分为底物QALPETGEE基因，将目的基因QALPETGEE与linker-eGFP基因融合成QALPETGEE-linker-eGFP；
B、QALPETGEE-linker-eGFP表达载体的构建：分别对表达载体pKFS和目的基因QALPETGEE-linker-eGFP进行双酶切，构建表达载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP；
C、表达载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP转化至毕赤酵母；
D、酵母表面蛋白的表达：将阳性转化子分别经过YPD和BGMY液体培养基转接培养，然后在BMMY液体培养基中诱导表达；
E、酵母表面蛋白的检测：离心收集菌体，PBS反复洗涤菌体，弃上清，重新悬浮于PBS中；分别用荧光显微镜进行定性观察，用流式细胞仪eGFP进行定量；
F、分选酶的表达：从金黄色葡萄球菌基因组中克隆分选酶(srtA)基因，将分选酶的基因引入pTRX载体中，然后在大肠杆菌BL21中表达pTRX-srtA，通过双酶切、测序鉴定阳性转化子，并在LB液体培养基中用IPTG诱导表达分选酶蛋白；
G、分选酶活性检：离心沉淀大肠杆菌BL21，经过TE buffer洗涤菌体、裂解buffer重悬、超声波破碎即得分选酶上清液；培养酵母菌体，离心，用PBS反复洗涤，备用；加入分选酶及在表面展示的分选酶底物反应，通过流式细胞仪和荧光分光光度计检测。
在上述基于毕赤酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法，步骤C所述表达载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP转化至毕赤酵母是将表达载体线性化后，用醋酸锂法转化，使基因整合至毕赤酵母GS115。
YPD液体培养基(1L)：蛋白胨2g，酵母抽提物1g，葡萄糖2g。
BMGY液体培养基(1L)：酵母抽提物1g，蛋白胨2g，YNB 1.34g，磷酸钾缓冲液100mM pH6.0，生物素4×10-5g，甘油1g。
BMMY液体培养基(1L)：酵母抽提物1g，蛋白胨2g，YNB 1.34g，磷酸钾缓冲液100mM pH6.0，生物素4×10-5g，甲醇0.5g。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用酵母表面展示技术，先将分选酶底物基因与eGFP基因融合表达，定位到酵母表面，同时用eGFP作为标记取代合成的荧光标记，通过将分选酶的底物及标记物eGFP展示在酵母表面，根据产生游离的eGFP或者表面eGFP减少的量，进行分选酶检测。利用流式细胞仪和荧光分光光度计进行分选酶检测。本发明利用酵母表面展示技术，然后用荧光分光光度计和流式细胞仪检测，所用到的物质价格比较低，大大降低了分选酶活性测定的成本，且操作简便。
附图说明
图1为检测方法原理示意图；
图2为重组酵母显微图；
A、B为100×光学显微镜；a、b为荧光显微图
A、a为GS115/pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP；B、b为GS115/pKFS。
图3为酵母表面底物与分选酶的相互作用荧光分光光度计检测图；
黑色为酵母表面展示底物未与分选酶作用的荧光分光光度计检测图；
蓝色为酵母表面展示底物与分选酶作用的荧光分光光度计检测图。
图4为重组酵母表面展示eGFP流式细胞仪检测图；
灰色为GS115/pKFS；红色为GS115/pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP。
图5为酵母表面底物与分选酶的相互作用流式细胞仪检测图；
红色为酵母表面展示底物未与分选酶作用的流式细胞仪检测图；
绿色为酵母表面展示底物与分选酶作用的流式细胞仪检测图。
具体实施方式
实施例1
一种基于酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法，它包括下列步骤：
1.根据金黄色葡萄球菌分选酶的能识别表面蛋白C端分选信号所含的保守基序LPXTG，以pcDNA6-myc-his-EGFP作为模板，引物为5’-CCCACGCGTATGCAAGCTTTGCCTGAAACTGGTGAAG AAGGAGGAATTGGAATTGCTC-3’和
5’-CGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’，划线部分为底物QALPETGEE基因，将目的基因QALPETGEE与linker-eGFP基因融合成QALPETGEE-linker-eGFP；
2.QALPETGEE-linker-eGFP表达载体的构建：分别对表达载体pKFS(对pPIC9K进行改造，加上了絮凝素基因，命名为pKFS，可见申请号为200810028631的中国发明专利)和目的基因QALPETGEE-linker-eGFP进行双酶切，构建载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP。然后16℃进行连接反应，转入到E.coliTop10细胞中，进行双酶切和测序验证阳性转化子。
3.表达载体转化至毕赤酵母：SacI酶切将表达载体线性化，用醋酸锂法转化，使基因整合至酵母GS115基因组，将转化子在SD上涂板培养48h，30℃。阳性转化子进行菌落PCR鉴定。
4.酵母表面蛋白的表达：将菌落PCR的阳性转化子，首先在10ml的YPD液体培养集中30℃培养24h，然后以1％的接种量转接到50ml的BMGY培养基中30℃培养24h，将所有的菌体转入已灭菌的50ml离心管中，14℃，8000r/min离心30min除上清(无菌操作)，用5ml的BMMY洗涤，然后全部转入100ml的BMMY液体培养基中，每天添加0.5％(v/v)的甲醇诱导表达。离心收集菌体，PBS洗涤菌体，弃上清，重新悬浮于PBS中。
5.酵母表面蛋白的检测：14℃，8000r/min离心沉淀，收集菌体，PBS反复洗涤，弃上清，并使重新悬浮于PBS中，取10μl制片，在荧光显微镜下镜检，结果见图2，阴性对照酵母GS115/pKFS在荧光显微镜下不发绿色荧光，而重组酵母GS115/pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP在荧光显微镜下发出较强的绿色荧光。则可说明QALPETGEE-linker-eGFP基因在酵母表面展示成功。
6.分选酶的表达：从金黄色葡萄球菌基因组中克隆分选酶(srtA)基因，将分选酶的基因引入pTRX载体中，然后在BL21中37℃，250r/min表达pTRX-srtA，通过双酶切、测序鉴定阳性转化子，然后在LB液体培养基中用IPTG诱导表达分选酶蛋白。
7.分选酶活性检：4℃，10000r/min离心2min沉淀大肠杆菌菌体BL21，TE buffer反复洗涤离心，用裂解buffer重悬且漩涡振荡混匀，超声波破碎即得分选酶上清液。培养144h的酵母菌体，离心，用PBS反复洗涤，备用。加入分选酶及在表面展示分选酶底物反应，设同样的反应体系但不加分选酶做对照。4℃，11000r/min离心5min取上清用PBS补足3ml用荧光分光光度计检测，结果如图3所示，反应上清游离的eGFP的荧光强度由189.9增加至273.0，说明与分选酶反应后生成了部分游离的eGFP则展示在酵母表面的底物可用于分选酶的活性检测。
实施例2
一种基于酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法，它包括下列步骤：
1.根据金黄色葡萄球菌分选酶的能识别表面蛋白C端分选信号所含的保守基序LPXTG，以pcDNA6-myc-his-EGFP作为模板，引物为5’-CCCACGCGTATGCAAGCTTTGCCTGAAACTGGTGAAG AAGGAGGAATTGGAATTGCTC-3’和
5’-CGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’，划线部分为底物QALPETGEE基因，将目的基因QALPETGEE与linker-eGFP基因融合成QALPETGEE-linker-eGFP；
2.QALPETGEE-linker-eGFP表达载体的构建：分别对表达载体pKFS(对pPIC9K进行改造，加上了絮凝素基因，命名为pKFS，可见申请号为200810028631的中国发明专利)和目的基因QALPETGEE-linker-eGFP进行双酶切，构建载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP。然后16℃进行连接反应，转入到E.coliTop10细胞中，进行双酶切和测序验证阳性转化子。
3.表达载体转化至毕赤酵母：SacI酶切将表达载体线性化，用醋酸锂法转化，使基因整合至酵母GS115基因组，将转化子在SD上涂板培养48h，30℃。阳性转化子进行菌落PCR鉴定。
4.酵母表面蛋白的表达：将菌落PCR的阳性转化子，首先在10ml的YPD液体培养集中30℃培养24h，然后以1％的接种量转接到50ml的BMGY培养基中30℃培养24h，将所有的菌体转入已灭菌的50ml离心管中，14℃，8000r/min离心30min除上清(无菌操作)，用5ml的BMMY洗涤，然后全部转入100ml的BMMY液体培养基中，每天添加0.5％(v/v)的甲醇诱导表达。离心收集菌体，PBS洗涤菌体，弃上清，重新悬浮于PBS中。
5.酵母表面蛋白的检测：14℃，8000r/min离心沉淀，收集菌体，PBS反复洗涤，弃上清，并使重新悬浮于PBS中，取500μl充分混匀，使菌体分开，利用流式细胞仪检测，结果见图4。重组酵母GS115/pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP的绿色荧光强度明显偏移了阴性对照GS115/pKFS的所发出的绿色荧光强度，则可说明QALPETGEE-linker-eGFP基因在酵母表面展示成功。
6.分选酶的表达：从金黄色葡萄球菌基因组中克隆分选酶(srtA)基因，将分选酶的基因引入pTRX载体中，然后在BL21中37℃，250r/min表达pTRX-srtA，通过双酶切、测序鉴定阳性转化子，然后在LB液体培养基中用IPTG诱导表达分选酶蛋白。
7.分选酶活性检：4℃，10000r/min离心2min沉淀大肠杆菌菌体BL21，TE buffer反复洗涤离心，用裂解buffer重悬且漩涡振荡混匀，超声波破碎即得分选酶上清液。培养144h的酵母菌体，离心，用PBS反复洗涤，备用。加入分选酶及在表面展示分选酶底物反应，设同样的反应体系但不加分选酶做对照。4℃，11000r/min离心5min取沉淀用PBS重新溶解通过流式细胞仪检测，结果如图5所示，经分选酶作用后的eGFP荧光强度较未与分选酶反应的eGFP荧光强度弱，说明经分选酶作用后，有部分的eGFP蛋白脱落，则展示在酵母表面的底物可用于分选酶的活性检测。
一种基于酵母表面展示的分选酶检测的方法
SEQUENCE LISTING
<110>华南理工大学
<120>一种基于酵母表面展示的分选酶检测的方法
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cccacgcgta tgcaagcttt gcctgaaact ggtgaagaag gaggaattgg aattgctc 58
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cgcgaattct tacttgtaca gctcgtccat g 31
Claims (3)
1、一种基于毕赤酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法，其特征在于包括下列步骤：
A、根据金黄色葡萄球菌分选酶的能识别表面蛋白C端分选信号所含的保守基序LPXTG，以pcDNA6-myc-his-EGFP作为模板，引物为5’-CCCACGCGTATGCAAGCTTTGCCTGAAACTGGTGAAGAAGGAGGAATTGGAATTGCTC-3’和5’-CGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’，划线部分为底物QALPETGEE基因，将目的基因QALPETGEE与linker-eGFP基因融合成QALPETGEE-linker-eGFP；
B、QALPETGEE-linker-eGFP表达载体的构建：分别对表达载体pKFS和目的基因QALPETGEE-linker-eGFP进行双酶切，构建表达载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP；
C、表达载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP转化至毕赤酵母；
D、酵母表面蛋白的表达：将阳性转化子分别经过YPD和BGMY液体培养基转接培养，然后在BMMY液体培养基中诱导表达；
E、酵母表面蛋白的检测：离心收集菌体，PBS反复洗涤菌体，弃上清，重新悬浮于PBS中；分别用荧光显微镜进行定性观察，用流式细胞仪eGFP进行定量；
F、分选酶的表达：从金黄色葡萄球菌基因组中克隆分选酶基因，将分选酶的基因引入pTRX载体中，然后在大肠杆菌BL21中表达pTRX-srtA，通过双酶切、测序鉴定阳性转化子，并在LB液体培养基中用IPTG诱导表达分选酶蛋白；
G、分选酶活性检：离心沉淀大肠杆菌BL21，经过TE buffer洗涤菌体、裂解buffer重悬、超声波破碎即得分选酶上清液；培养酵母菌体，离心，用PBS反复洗涤，备用；加入分选酶及在表面展示的分选酶底物反应，通过流式细胞仪和荧光分光光度计检测。
2、如权利要求1所述的基于毕赤酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法，其特征在于，步骤C所述表达载体pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP转化至毕赤酵母是将表达载体线性化后，用醋酸锂法转化，使基因整合至毕赤酵母GS115。
3、如权利要求1所述的基于毕赤酵母表面展示分选酶底物的分选酶检测方法，其特征在于：
YPD液体培养基：每升液体培养基中含有蛋白胨2g，酵母抽提物1g，葡萄糖2g；
BMGY液体培养基：每升液体培养基中含有酵母抽提物1g，蛋白胨2g，YNB1.34g，磷酸钾缓冲液100mM pH6.0，生物素4×10-5g，甘油1g；
BMMY液体培养基：每升液体培养基中含有酵母抽提物1g，蛋白胨2g，YNB1.34g，磷酸钾缓冲液100mM pH6.0，生物素4×10-5g，甲醇0.5mL。
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2009
- 2009-06-26 CN CNA200910040618XA patent/CN101603075A/zh active Pending
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