CN101601610A - 一种新型生物抗体医疗装置及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型生物抗体医疗装置及其制备方法。该医疗装置为采用静电吸附和/或微孔物理吸附的原理,在其本体表面直接涂覆和/或固定生物抗体制备而成。在本发明所述医疗装置的制备过程中,不需在本体表面涂覆基质,从而避免了基质带来的炎症等副作用,另外,医疗装置本体表面的生物抗体不仅具有很好的生物活性,并且能够耐受血流以及其他体液长时间的冲刷、保持较稳定的治疗效果与防止再狭窄和晚期血栓的发生。
Description
技术领域
本发明涉及一种医疗装置,具体地,涉及一种主要包括装置本体和生物抗体的医疗装置及其制备方法。
背景技术
自1987年,希格沃特(Sigwart)等首次将血管内金属支架用于冠状动脉以来,为治疗血管堵塞性疾病提供了良好的途径。然而血管支架内再狭窄一直是影响经皮冠状动脉介入治疗(PCI)疗效的主要原因。随着2004年强生Cypher雷帕霉素药物支架和2005年波士顿科学公司的Taxus紫杉醇药物支架的上市,药物洗脱支架将支架内再狭窄率从金属裸支架时代的30%降低到10%以下。因此,药物洗脱支架被认为是继经皮冠状动脉成形术和支架技术之后、心脏介入治疗领域的第3个里程碑。
在药物洗脱支架应用最初的几年中,一系列令人鼓舞的大规模临床实验,如关于RAVEL、SIRIUS和RESEARCH以及TAXUS I和TAXUSII等的临床研究均证实了雷帕霉素和紫杉醇两种细胞分裂抑制药物洗脱支架在冠心病介入治疗中的临床安全性和近、远期疗效。然而随着药物支架研究的深入和应用范围的不断扩大以及积累病例的逐步增加,人们对其使用应更趋理性,对其目前存在的问题也有了清醒的认识。在药物洗脱支架的动物实验中,药物洗脱支架植入后3个月药物完全释放后,出现局部纤维蛋白和炎性细胞聚集和内皮修复不完全,此时内膜增殖的程度和金属裸支架相似,即所谓晚期再狭窄。此外,第一代药物洗脱支架所携带的药物,雷帕霉素、紫杉醇以及它们的类似物在抑制血管平滑肌细胞增殖降低支架内再狭窄的同时,也抑制了血管内皮细胞的增殖,因此延迟了支架表面的内皮化,从而增加了支架血栓的发生。而医学理论认为促进血管内皮的修复,可以减少血栓形成和抑制平滑肌细胞增殖,抑制内膜增生,从而达到降低再狭窄率。更多的临床试验结果表明药物洗脱支架的支架内血栓形成和死亡率相比金属裸支架有显著升高,研究者们认为这是因为药物洗脱支架延迟了支架表面内皮的修复和聚合物基质的长期存在导致过敏和炎症反应造成。
理想的可植入动物体的医疗装置不但应具有良好的生物相容性,而且能促进受伤组织愈合,防止细胞过度增生,加速管腔组织内皮化,防止血栓形成和再狭窄。因此能够促进内皮修复和抑制内膜增殖的不同阶段信号因子成为目前研究的热点之一,包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)、一氧化氮合酶(iNOS,eNOS)、雌激素、17β雌二醇等。这些支架在动物实验阶段大部分都表现了较好的抑制再狭窄和促进内皮修复的结果。其中较为理想的设计理念为内皮祖细胞捕获支架,这种支架通过动员外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)到血管局部加速支架表面内皮的快速修复,抵抗再狭窄发生的同时降低支架血栓的发生。根据这一理念,奥勃斯医学技术股份有限公司(Orbusneich)设计的Genous支架将内皮祖细胞特异性CD34抗体共价固定在R支架的表面,通过抗原抗体特异结合的理论捕获血液循环中的内皮祖细胞以加速内皮愈合以及控制中膜和外膜的增殖。阿昔单抗具有抗血小板活性、抑制中心粒细胞和单核细胞引起的炎症,并具有αvβ3抗体活性能够特异捕获内皮祖细胞(EPC)等特性,Humed公司利用阿昔单抗这些生物特性,将其涂覆在支架表面加速支架表面内皮化的同时具有抗炎和抗血栓活性。还有RGD环肽支架,通过设计出对αvβ3整合素受体更高亲和力的RGD环肽,特异捕获内皮祖细胞加速支架表面内皮修复。但是这些支架在临床实验阶段并没有如动物实验显示的良好结果,可能是因为他们为了固定或者涂覆这些生物抗体均在支架本体设置了一层基质层,而这一层基质诱发的炎症和过敏反应很可能是导致临床实验结果失败的原因之一。
Orbusneich公司申请的中国专利01806680.1提供了一种包涂了基质和与内皮细胞抗原反应的抗体的医疗器械组合物和其制造方法。该专利首先在医疗器械表面涂覆一层由合成材料如聚尿烷、聚L-乳酸等,或天然材料如胶原蛋白、血纤蛋白等,或长约C60-C100的呋仑碳组成的基质,然后通过基质连接物分子将治疗有效量的与内皮细胞抗原反应的抗体共价固定在医疗器械表面,从而促使内皮细胞在所述医疗器械上分化和增殖,所述抗体限定为单克隆抗体。
中国专利申请03803370.4提供了一种医疗装置的各种组成部分和其制作方法。此类医疗装置都用含有抗体、具有刺激内皮生成作用的化合物和小分子物质的生物相容的基质进行包衣。特征在于至少包括一层包衣层,至少一种具有治疗有效量的抗体、抗体片段或其组合,以及至少一种化合物,能够促进在该装置表面的始祖代内皮细胞加速黏附、生长和分化过程,而成为成熟的和功能性内皮细胞的能力,以防止内膜增殖。
中国专利申请200580004068.6阐述一种用于植入到体内血管和管腔结构中的医疗装置,其包括与血液接触的表面和用于将一种或多种药物有控制地释放到毗邻组织中的涂层,所述涂层包含生物可吸收性或不可吸收性的生物相容性基质、一种或多种药物、一种或多种配体,所述配体结合于该医学装置与血液接触表面上的内皮祖细胞膜上的特异性分子。
以上器械或装置的特点是均在装置本体表面涂布了一层基质,利用基质的连接作用把生物抗体或药物涂覆和/或固定在本体上。但本申请发明经研究发现,如果能够直接在装置本体上涂覆和/或固定生物抗体,避免在本体和生物抗体之间设置一层基质,不仅能够充分利用生物抗体在生理环境下发挥促进内皮修复和抑制平滑肌增殖的优势,同时也能避免基质带来的炎症及副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用静电吸附和/或微孔吸附的原理将装置本体和生物抗体结合起来的医疗装置。
本发明的另一目的是提供一种制备所述医疗装置的方法。
本发明的医疗装置没有采用其他的基质成分,可以避免基质有可能带来的炎症及其副作用,使得生物抗体在更接近生理状态环境下发挥促进内皮修复和抑制平滑肌增殖的作用,从而避免再度狭窄或其他病变的发生,改善相关疾病的预后。
本发明的生物抗体医疗装置,采用静电吸附和/或微孔物理吸附效应在装置本体表面直接涂覆和/或固定具有治疗有效量的生物抗体,所述的医疗装置包括各种支架、移植片固定膜、移植片固定膜移植物、合成的人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、PFO隔膜封闭装置、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物装置、静脉瓣、血管接合夹、留置式动脉导管、血管护鞘或药物输送口等所有适于采用本发明制备方法进行处理的医疗装置,以及这些装置的组合。
本发明所涉及的医疗装置本体表面直接涂覆和/或固定的生物抗体包括下述一种或多种:肝素,抗血小板膜糖蛋白(GPIIb/IIIa)受体拮抗剂,阿昔单抗(抗血小板凝聚单克隆抗体),一氧化氮合酶(NOS),精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽,血管内皮生长因子(VEGF),成纤维细胞生长因子3(FGF-3),成纤维细胞生长因子4(FGF-4),成纤维细胞生长因子5(FGF-5),成纤维细胞生长因子6(FGF-6),成纤维细胞生长因子7(FGF-7),成纤维细胞生长因子8(FGF-8),成纤维细胞生长因子9(FGF-9),碱性成纤维细胞生长因子,血小板诱导性因子,转化生长因子β1,酸性成纤维细胞生长因子,骨粘连蛋白,促血管生成素1,促血管生成素2,胰岛素样生长因子,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,血小板衍生生长因子AA,血小板衍生生长因子BB,血小板衍生生长因子AB,内皮细胞PAS蛋白1,血小板反应蛋白,增殖蛋白,肝配蛋白-A1,E-选择蛋白,肥胖蛋白,白介素8,甲状腺素以及神经鞘氨醇1-磷酸酯,角蛋白8(Keratin 8),尿激酶前体(Pro-UK),反义寡核核苷酸(如反义C-myc等),抗CD2白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD3白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD4白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD8白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD3R白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD1a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD1b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD5白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD6白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD7白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD9白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD10白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD18白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD19白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD20白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD21白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD22白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD23白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD24白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD37白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD33白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD34白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD35白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD64白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD65白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw65白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD66b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD66e白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD31白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD133白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD89白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw90白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD56白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD57白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD94白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD40白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD72白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD77白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD16白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD32白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD63白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD36白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD41白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD42a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD42b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11c白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD29白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD44白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD48白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49c白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49e白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49f白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD50白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD51白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD54白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD58白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD61白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62E白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62L白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62p白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD103白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD105白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD26白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD71白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD95白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD122白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw124白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD126白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD127白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD117白细胞分化抗原抗体及其片段、抗血管内皮生长因子1(VEGF-1)抗体及其片段、抗血管内皮生长因子2(VEGF-2)抗体及其片段、抗CD146(Muc-18)抗体及其片段、抗干细胞抗原(Sca-1)抗体及其片段、抗干细胞因子1(SCF/c-Kti配体)抗体及其片段、抗酪氨酸激酶Tie-2抗体及其片段和抗HAD-DR细胞表面抗原抗体及其抗体片段。
其中抗CD34白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD31白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD133白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD105白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw90白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD117白细胞分化抗原抗体及其片段、抗HLA-DR抗原抗体及其片段、抗血管内皮生长因子1(VEGF-1)抗体及其片段、抗血管内皮生长因子2(VEGF-2)抗体及其片段、抗CD146(Muc-18)抗体及其片段、抗干细胞抗原(Sca-1)抗体及其片段、抗干细胞因子1(SCF/c-Kti配体)抗体及其片段和抗酪氨酸激酶Tie-2抗体及其片段通过识别内皮祖细胞上的特异性抗原或者特异性受体,促进内皮祖细胞在医疗装置本体表面的沉积、分化和增殖,从而促进本体表面内皮化,形成完整内皮,通过完整的内皮屏障抑制血管平滑肌细胞增殖,抑制治疗局部发生再狭窄,同时增强表面的抗血栓能力,减轻炎症和纤维化功能。优选的抗体和抗体片段为抗人CD34生物抗体、抗人CD133生物抗体和抗体片段和对整合素αvβ3相比整合素α5β1受体更高亲和力的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)环肽及其修饰物青霉胺环肽(cyclo-GpenGRGDSPCA)。
本发明所述医疗装置还可以涂覆和/或固定下述一种或多种治疗基因及其基因片段:一氧化氮合酶(NOS)基因、角蛋白8(Keratin 8)基因、血管内皮生长因子(VEGF)基因、表皮生长因子(EGF)基因、PTEN基因(一种同肿瘤抑制基因)、尿激酶前体(Pro-UK)基因或反义寡核核苷酸。
在本发明所述医疗装置的制备中,可以:
(1)采用腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化方法或其结合在装置本体表面制备微孔,利用表面的微孔涂覆和/或固定生物抗体;
(2)采用电化学抛光、阳极极化、腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化方法或这些方法结合,使本体表面带上较多的正电荷,利用多数生物抗体在溶液中带负电的特性,通过静电吸附效应在装置本体表面涂覆和/或固定生物抗体。
(3)采用静电喷涂技术,在装置本体表面喷涂和/或固定生物抗体时,通过外加电场使表面带上更多的正电,生物抗体带上更多的负电,利用静电喷涂工艺增加生物抗体在医疗装置表面涂覆和/或固定的量。
(4)利用上述(1)、(2)、(3)三种方法的两两组合或者同时利用这三种方法在医疗装置本体表面涂覆和/或固定生物抗体。
本发明的微孔制备按照本公司的专利200710122811.9中提出的工艺步骤,采用腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化方法或这些方法的结合在医疗装置本体表面,如316L不锈钢金属裸支架表面,制备形成多孔表面,表面孔洞大小均一,呈多晶相结构,孔洞的大小为1nm~500μm。
本发明使装置本体表面带上正电荷的技术,可以采用电化学抛光、腐蚀和阳极氧化方法使表面带上正电荷;为了进一步增加本体表面的正电荷,也可将待处理装置放置在溶液中接在阳极,对其进行阳极极化,使本体表面在溶液中带上较多的正电荷,利用表面正电荷吸附生物抗体。
本发明使用的静电喷涂技术可采用该领域公知技术,在医疗装置和喷嘴之间设置静电发生器,使从喷嘴中喷出的生物抗体电性更负,从而利用静电吸附的原理在装置本体表面涂覆和/或固定更多的生物抗体。
本发明参考本公司专利200710107643.0中提到的对装置表面抗体活性和牢固度检测方法,并进一步优化,对生物抗体装置性质和静电吸附效应以及静电喷涂技术在装置本体表面涂覆和/或固定生物抗体的方法进行了比较全面评价,并优选出较佳制备生物抗体医疗装置的方法。
不同的生物抗体(包括载体治疗基因)在装置本体表面涂覆和/或固定的量要求不同,如果单纯采用微孔物理吸附、静电吸附效应和静电喷涂技术中的一种即可满足,则生物抗体医疗装置的制备只需要采用其中的一种方式,反之,则可同时联合这三种方法,以增加生物抗体在装置表面的涂覆和/或固定量,保证生物抗体医疗装置的有效性。
本发明所述的在医疗装置本体表面涂覆和/或固定生物抗体的方法,同样适合于在装置表面涂覆和/或固定治疗基因,载体治疗基因选自通过细胞、病毒、质粒、高分子材料及其他载体介导的基因。
本发明生物抗体医疗装置的制备方法,优选同时利用装置本体表面微孔和正电性,通过微孔对生物抗体的物理吸附和/或电荷的静电吸附效应在装置本体表面涂覆和/或固定生物抗体,具体制备方法主要包括以下步骤:(1)装置本体表面的预处理;(2)制备微孔a、b;(3)装置本体表面的后处理;(4)涂覆生物抗体;(5)装置表面生物抗体活性和牢固度的检测。
(1)医疗装置本体表面的预处理:利用超声波对装置本体表面清洗清除杂质。如选用不锈钢裸支架,使用浓度为99.5%的丙酮分析纯溶液,或浓度为75%的医用乙醇溶剂,利用频率为28~100khz超声波清洗支架本体材料,清洗5-15min,去除本体材料表面的杂质,将清洗后的本体材料放置在干燥机中,温度设定在30~40℃,干燥30~60min后取出备用。
(2)制备微孔a、b:该步骤包括采用酸溶液腐蚀致孔方法或者阳极氧化方法在装置本体上直接制备单尺寸的纳米级微孔;或者先采用酸溶液腐蚀致孔方法在装置本体上直接制备单尺寸的纳米级微孔,再采用阳极氧化或微弧氧化、微弧氮化相结合的方法制备多尺寸的纳米级复合孔洞;
制备微孔a是将装置本体浸泡在0~100℃温度的腐蚀液中,所述腐蚀液优选浓度为1~38%的盐酸,或含有1~38%的盐酸混合1~98%的硫酸成分的盐酸混酸溶液,或浓度为1~30%的氢氟酸,或上述三种酸溶液的任意浓度比例混合后的混酸溶液,腐蚀时间控制在1min~480h后形成单尺寸孔洞。
制备微孔b是将装置本体作为阳极与脉冲电源的正极连接,钛、镁、铝、铁、锌、铜、金、银、铂金属及其合金制成的金属片作为阴极与脉冲电源的负极连接,将装置本体与阴极金属片同时置于盐酸溶液中,电解液优选浓度为1~38%的盐酸,或1~98%的硫酸溶液,电流设定为0.01~30A,频率为25~3000赫兹,时间为1~20min,在装置本体表面制备单尺寸或复合结构的孔洞。
(3)装置本体表面的后处理:将上述处理好的装置本体材料先使用浓度为99.5%的丙酮分析纯溶液,再经蒸馏水利用频率为28~100khz超声波清洗本体材料5-15min;最后将清洗后的本体材料放置在干燥机中,温度设定在30~40℃,干燥30~60min后取出备用;或用蒸馏水配制浓度为1~38%的盐酸溶液,将本体材料浸泡在配好的溶液中,放置在恒温箱中,温度设定在20℃左右,放置30min~48h取出;
(4)涂覆生物抗体:将表面带正电并有微孔的医疗装置浸没在含有生物抗体的溶液中,并将装置本体作为阳极与电源的正极连接,惰性金属接在电源的负极,通过调节生物抗体缓冲液的pH值使生物抗体在缓冲溶液中带上负电,同时给予装置外加正向电压(0~1000V),从而通过正负电荷相吸的静电吸附效应和装置表面孔洞的物理吸附双重作用固定生物抗体。
(5)装置表面生物抗体活性和牢固度的检测:首先采用各种生物抗体相对应的特异性活性检测方法对装置表面的生物抗体活性进行评价;然后将涂覆有生物抗体的医疗装置放置在人工血管模拟装置中冲刷,以评价生物抗体在装置本体表面的牢固度。
与现有技术相比,本发明所涉及医疗装置具有以下几个优点:
(1)传统类似医疗装置必须在装置本体表面涂覆一层基质,利用这层基质的共价或者非共价结合生物抗体。本发明摒弃了这一缺点,从而避免了基质可能引起的炎症和副作用;
(2)本医疗装置采用了静电吸附和/或微孔物理吸附效应在本体表面涂覆和/或固定生物抗体,这种方法不仅很好保持了生物抗体在医疗装置本体表面保持较强活性,并且具有很高的牢固度,能够耐受血流及其他体液的长时间冲击。
附图说明
图1带有微孔的金属支架本体电镜扫描图。
图2扫描电镜下观察制备好的CD34抗体支架本体表面附着着大量CD34抗体。
图3 CD34抗体支架制备过程中,支架本体表面电位变化示意图。
图4倒置显微镜下,观察CD34抗体支架捕获CD34+细胞的能力,可见支架表面附着大量CD34+细胞。
图5荧光显微镜下,观察CD34抗体支架捕获DAPI核染后的CD34+细胞的能力。5a为CD34抗体支架,表面有大量呈现蓝色荧光的CD34+细胞;5b为金属裸支架,表面几乎没有蓝色荧光。
图6不同支架植入后28天猪冠状动脉组织形态学照片,上行均为放大40倍,下行均为放大400倍。6a上、下均为金属裸支架切片,6b上、下均为CD34抗体支架,6c上、下均为雷帕霉素药物支架。
图7不同支架植入后7天、14天、28天猪冠状动脉内皮化程度扫描电镜照片。上行为植入后7天,中间行为植入后14天,下行为植入后28天。7a上、中、下均为金属裸支架照片,7b上、中、下均为CD34抗体支架照片,7c上、中、下均为雷帕霉素药物支架照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1 带有微孔的裸支架的制备
将316L不锈钢血管支架经切割、去渣、抛光,放置在浓度为75%的医用酒精中,在频率100khz的超声波清洗10分钟,温度设定在40℃,干燥40分钟后取出。
然后将支架放置在15%的盐酸腐蚀12小时后,将支架本体作为阳极与脉冲电源的正极连接,钛金属片作为阴极与脉冲电源的负极连接,将支架本体与阴极金属片同时置于为15%的盐酸电流设定为1A,频率为500赫兹,时间为15分钟,在316L金属裸支架本体表面制备孔洞,并使支架表面带上正电。如图1所示,电镜扫描下,可见金属支架本体表面有明显的微孔。
实施例2 CD34抗体支架的制备及吸附机理研究
将小鼠抗人CD34单克隆抗体制备成5mg/ml的碳酸盐或磷酸盐缓冲液,然后将如实施例1所制备的316L金属裸支架放入配制好的缓冲液中,温育1h后取出,4℃长期保存。扫描电镜下可见316L金属支架表面吸附了大量CD34抗体,如图2所示。
检测如实施例1所制备的316L金属支架涂覆CD34抗体前后支架表面的电位表明,随着抗体涂覆量的增加,支架表面电位更负。(见附图3)这说明CD34抗体涂覆过程中,除了微孔的物理吸附作用外,还存在较强的静电吸附效应。
实施例3 CD34抗体支架表面抗体的有效性验证
(1)CD34抗体支架捕获CD34+细胞的实验研究
将CD34抗体支架放置在CD34+细胞悬液中,37℃温育1小时后,取出用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗5分钟后,于倒置显微镜下观察CD34抗体支架捕获CD34+细胞情况。如附图4所示,CD34抗体支架边缘均有CD34+细胞吸附,表明该支架具有很好的生物活性。
用DAPI核染后的CD34+细胞代替上述实验中的未染色CD34+细胞,其余条件和步骤不变,采用荧光显微镜观察CD34抗体支架捕获CD34+细胞的情况。如附图5a所示,CD34抗体支架表面有大量蓝色荧光;而如附图5b所示,金属裸支架表面几乎没有蓝色荧光,说明CD34抗体支架吸附有一层CD34+细胞,具有很好的生物活性。
以上结果表明CD34抗体支架能够有效地吸附CD34+细胞,具有良好的生物活性。
(2)CD34抗体支架表面CD34抗体牢固度的检验
将CD34抗体支架放置在冠脉血流模拟冲刷装置中,按照专利:一种在医疗器械表面固定抗体的方法中支架表面抗体含量的检测方法检测,结果表明CD34抗体支架至少能够耐受冠脉血流冲刷24h而支架表面抗体含量没有明显变化。
以上研究表明,CD34抗体支架具有在血流中捕获CD34+的内皮祖细胞(EPC)的能力,其表面CD34抗体不仅能够具有良好的捕获EPC的能力,而且能够耐受动脉血流的长期冲刷,说明支架表面CD34抗体具有较高的牢固度。
实施例4 CD34抗体支架植入猪冠状动脉的实验研究
将如实施例2所述制备好的CD34抗体支架手术随机植入猪冠状动脉的前降支(LAD)、回旋支(LCX)和右冠状动脉(RCA),并以金属裸支架和雷帕霉素药物支架作为对照。在植入后的7天、14天和28天对各组动物分别行冠状动脉造影(QCA),并处死相应动物进行组织形态学观察和电镜观察。
QCA和组织形态学结果表明,手术后28天,植入CD34抗体支架(附图6b)的动物管腔丢失和新生内膜面积相比裸支架(附图6a)显著减少,其效果与雷帕霉素药物支架(附图6c)大致相当。
电镜观察结果表明,抗体支架(附图7b)相比药物支架(附图7c)、裸支架(附图7a)内皮化速度更快,植入手术后7天抗体支架组动物内皮化即已完全(附图7b上)。
通过上述实验证明,CD34抗体支架抑制动物冠状动脉再狭窄能力与雷帕霉素药物支架相当,但是其内皮化速度更快,从而能降低支架植入晚期血栓的发生率。
Claims (9)
1、一种医疗装置,其为通过在本体表面直接涂覆和/或固定生物抗体制备而成。
2、如权利要求1所述的医疗装置,其特征在于,装置本体与生物抗体是利用静电吸附和/或微孔吸附而结合。
3、如权利要求2所述的医疗装置,其特征在于,所述生物抗体选自下述的一种或多种:肝素,抗血小板膜糖蛋白(GPIIb/IIIa)受体拮抗剂,阿昔单抗(抗血小板凝聚单克隆抗体),一氧化氮合酶(NOS),精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽,血管内皮生长因子(VEGF),成纤维细胞生长因子3(FGF-3),成纤维细胞生长因子4(FGF-4),成纤维细胞生长因子5(FGF-5),成纤维细胞生长因子6(FGF-6),成纤维细胞生长因子7(FGF-7),成纤维细胞生长因子8(FGF-8),成纤维细胞生长因子9(FGF-9),碱性成纤维细胞生长因子,血小板诱导性因子,转化生长因子β1,酸性成纤维细胞生长因子,骨粘连蛋白,促血管生成素1,促血管生成素2,胰岛素样生长因子,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,血小板衍生生长因子AA,血小板衍生生长因子BB,血小板衍生生长因子AB,内皮细胞PAS蛋白1,血小板反应蛋白,增殖蛋白,肝配蛋白-A1,E-选择蛋白,肥胖蛋白,白介素8,甲状腺素以及神经鞘氨醇1-磷酸酯,角蛋白8(Keratin 8),尿激酶前体(Pro-UK),反义寡核核苷酸,抗CD2白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD3白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD4白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD8白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD3R白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD1a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD1b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD5白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD6白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD7白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD9白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD10白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD18白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD19白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD20白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD21白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD22白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD23白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD24白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD37白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD33白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD34白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD35白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD64白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD65白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw65白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD66b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD66e白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD31白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD133白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD89白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw90白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD56白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD57白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD94白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD40白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD72白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD77白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD16白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD32白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD63白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD36白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD41白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD42a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD42b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD11c白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD29白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD44白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD48白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49a白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49b白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49c白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49e白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD49f白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD50白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD51白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD54白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD58白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD61白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62E白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62L白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD62p白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD103白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD105白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD26白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD71白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD95白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD122白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CDw124白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD126白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD127白细胞分化抗原抗体及其片段、抗CD117白细胞分化抗原抗体及其片段、抗血管内皮生长因子1(VEGF-1)抗体及其片段、抗血管内皮生长因子2(VEGF-2)抗体及其片段、抗CD146(Muc-18)抗体及其片段、抗干细胞抗原(Sca-1)抗体及其片段、抗干细胞因子1(SCF/c-Kti配体)抗体及其片段、抗酪氨酸激酶Tie-2抗体及其片段和抗HAD-DR细胞表面抗原抗体及其抗体片段。
4、如权利要求1、2或3所述的医疗装置,其特征在于,还可以涂覆和/或固定下述的治疗基因或其片段:一氧化氮合酶(NOS)基因、角蛋白8(Keratin 8)基因、血管内皮生长因子(VEGF)基因、表皮生长因子(EGF)基因、PTEN基因(一种同肿瘤抑制基因)、尿激酶前体(Pro-UK)基因或其反义寡核核苷酸。
5、如权利要求1、2或3所述的医疗装置,其特征在于,所述装置本体包括各种支架、移植片固定膜、移植片固定膜移植物、合成的人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、PFO隔膜封闭装置、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物装置、静脉瓣、血管接合夹、留置式动脉导管或血管护鞘或药物输送口。
6、一种制备如权利要求1-5任一项所述医疗装置的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)采用腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化方法或其结合,在装置本体表面制备形成微孔;
(2)采用电化学抛光、阳极极化、腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化方法或其结合,使装置本体表面带正电;
(3)涂覆和固定生物抗体。
7、根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于使装置本体表面带上正电荷,既可以采用电化学抛光、腐蚀和阳极氧化方法使表面带上稳定的正电荷;也可将装置本体放置在溶液中,将待处理装置接在阳极,对其进行阳极极化使之带上较多的正电荷。
8、根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,可采用蘸涂、浸涂、雾化喷涂或静电喷涂来涂覆和/或固定生物抗体。
9、根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,使用静电喷涂时在装置本体表面和喷嘴之间设置静电发生器。
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