CN101591645B

CN101591645B - 一种抗hiv药物的筛选方法

Info

Publication number: CN101591645B
Application number: CN 200810113587
Authority: CN
Inventors: 岑山; 余利岩; 蒋建东; 徐建; 李卓荣; 彭宗根
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2008-05-29
Filing date: 2008-05-29
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2028-05-29
Also published as: CN101591645A

Abstract

本发明公开了一种抗HIV药物的筛选方法，其通过将待测样品添加至表达hA3G与报告基因的融合蛋白以及Vif的细胞，通过考察报告基因编码产物的量，来判断样品对Vif途径的阻断作用，并进一步判断初选的样品是否为蛋白酶体降解途径的抑制剂，从而筛选出抗HIV的药物。本发明的筛选方法选择hA3G作为靶点，解决了病毒高变异导致的耐药性问题，且与目前临床应用的抗HIV-1药物无交叉耐药性。

Description

一种抗HIV药物的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种药物的筛选方法，具体地，涉及抗HIV药物的筛选方法。

背景技术

由人免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的艾滋病是我国重点防治的重大传染性疾病。目前，我国HIV-1感染者已达100万，而且感染人数已经进入快速增长期。艾滋病不仅成为我国严重的卫生健康问题，同时每年造成了上千亿的直接经济损失。据中国卫生部2006年底最新通报，全国历年累计报告艾滋病近二十万例。

目前，艾滋病的防治主要是依靠药物治疗。临床上使用的抗HIV-1的药物主要可分为核苷类和非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、以及新型的跨膜糖蛋白抑制剂四大类。这些药物针对的靶点都是HIV-1的结构蛋白或酶，但由于病毒高变异而产生的耐药性突变，导致药物的作用活性迅速丧失。虽然目前普遍应用的高效抗逆转录病毒治疗(HAART)和联合治疗方法，可以在一定程度上控制病毒的复制，延长患者的生命，但这些治疗方案都面临着疗效间存在极大的个体差异，严重的毒副作用，病毒突变重组所形成的多重耐药，以及高成本等问题。目前，抗艾滋病病毒药物治疗中所面临的问题表明研发针对崭新药物靶点的新型抗艾滋病药物仍然迫在眉睫。

病毒的耐药性是目前艾滋病药物治疗中最亟需解决的问题。HIV-1之所以能够迅速产生针对现有临床应用的抗病毒药物的耐药性，其主要根源在于这些药物所针对的靶点都是病毒本身。而病原病毒天然就具有高变异的特点，在药物的选择压力下，很容易引起病毒的迅速变异从而产生耐药。因此，解决HIV-1的耐药性问题的关键之一在于必须突破传统的“以病原病毒本身为靶”的药物发展模式。

在生物进化的漫长过程中，宿主细胞会形成针对不同病原病毒的防御体系，而病毒也会形成特异性的拮抗机制，以逃避宿主细胞的抑制作用。在不影响宿主生存能力的前提下，特异性地上调宿主天然的抗病毒机制不仅可以有效地抑制病毒的复制，同时也可以明显减小甚至是避免药物对病毒的选择压力，从而降低耐药性突变发生的可能性。因此，“以宿主为靶”的药物发展模式已经成为解决目前抗病毒药物耐药性难题的重要研究策略之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选抗HIV药物的方法，具体地将是一种以APOBEC3G为靶点的抗HIV-1药物筛选方法。

为实现上述目的，本发明首先构建了一种表达hA3G与报告基因的融合蛋白以及Vif的细胞。在这种细胞中VIF蛋白特异性地结合hA3G，并与细胞蛋白Cu15，elongins B和C以及Rbx1相互作用，形成Skp1-cμllin-F-box(SCF)复合物，通过泛素介导的降解途径，导致hA3G报告基因的降解。hA3G的降解可以通过考察报告基因编码产物的量来实现。

这里的报告基因可以是本领域技术人员所熟知的常规报告基因，优选为荧光蛋白基因，例如绿荧光蛋白(GFP)、红荧光蛋白(DsRed2)以及深蓝萤光蛋白(CFP)，更优选为黄荧光蛋白的效果最为优化。可以通过检测细胞的荧光值方便地进行观察。所述细胞为动物细胞。

上述细胞可通过如下方法构建：构建表达hA3G与报告基因融合蛋白的表达载体以及表达Vif的表达载体，将所述表达载体分别或共转染细胞，筛选表达hA3G与报告基因的融合蛋白以及Vif的阳性克隆。其中，所述表达hA3G与报告基因的融合蛋白的表达载体优选为pEYFP-N1-APOBEC3G，所述表达Vif的表达载体优选为pcDNA-hvif质粒。

本发明筛选抗HIV药物的方法包括如下步骤：

(1)添加待测样品至上述的细胞；检测细胞报告基因表达产物量的变化，选择能使报告基因表达产物量上升的样品；

(2)从步骤1)选择的样品中选择非蛋白酶体降解通路阻断的样品。

其中，所述步骤(2)选择非蛋白酶体降解通道阻断样品的方法，可以参照Ausseil等(Ausseil F，Samson A，Aussagues Y，Vandenberghe I，Creancier L，Pouny I，Kruczynski A，Massiot G，Bailly C.High-throughput bioluminescence screening of ubiquitin-proteasome pathway inhibitors from chemical and natural sources.J Biomol Screen.2007，12(1)：106-16)提供的方法或Rickardson等(Rickardson L，

M，Larsson R，

H.Image-based screening for the identification of novel proteasome inhibitors.J Biomol Screen.2007，12(2)：203-10.)提供的方法进行。也可通过如下方法考察样品是否为蛋白酶体降解途径抑制剂：将步骤(1)选择的样品添加至表达P53与报告基因的融合蛋白以及E4orf6的细胞，通过与照比较，选择报告基因编码产物量相对较低的样品。其中，所述表达P53与报告基因融合蛋白以及E4orf6的细胞通过如下方法构建：构建表达P53蛋白与报告基因的融合蛋白的表达载体以及表达E4orf6的表达载体，将构建的表达载体分别或共转染细胞，并筛选阳性克隆；其中所述细胞为动物细胞，优选为293T细胞；所述报告基因优选为荧光蛋白，更优选为黄荧光蛋白；所述表达P53与报告基因的融合蛋白的表达载体优选为pEYFP-N1-P53；所述表达E4orf6的表达载体优选为E4orf6-myc。

人APOBEC3G(human protein apoliprotein B mRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide-like-3G，hA3G)可以有效地抑制HIV-1的复制，其是在人淋巴细胞中表达的一种RNA/DNA编辑酶，属于APOBEC蛋白超家族的成员。人的APOBEC蛋白超家族至少有10个成员，其同源蛋白包括AID、APOBEC 1、APOBEC2和APOBEC3A-G，多数具有编辑核酸的功能，可以使mRNA上的胞嘧啶残基脱氨形成尿嘧啶，或单链DNA上的脱氧胞嘧啶残基脱氨形成脱氧尿嘧啶。hA3G不仅可以高效抑制包含HIV-1在内的各种逆转录病毒的复制，而且对非逆转录病毒如乙肝病毒也有很好的灭活效果，因此成为宿主抵御病毒感染的固有免疫系统的一个重要组成。

HIV-1病毒编码的VIF蛋白可以特异性地结合hA3G，并与细胞蛋白Cul5，elongins B和C以及Rbx1相互作用，形成Skp1-cullin-F-box(SCF)复合物，通过泛素介导的降解途径，导致hA3G的降解，从而阻断了宿主细胞hA3G抗病毒系统对HIV-1病毒复制的抑制作用。鉴于人体内表达hA3G的细胞和组织主要是HIV-1的靶细胞(外周血单核细胞、T-淋巴细胞、单核巨噬细胞)，如果能特异而有效地阻断VIF介导的降解途径，宿主细胞就可以利用自身编码的hA3G抑制HIV-1的复制。

根据HIV-1病毒蛋白Vif介导的hA3G的降解作用机制，建立以Vif介导的降解hA3G为靶点的抗HIV-1药物高通量筛选方法：在细胞内共表达HIV-1的Vif和融合了黄色荧光蛋白(yellow fluorescentprotein(YFP))的hA3G，Vif对hA3G的降解将造成融合在hA3G上的YFP的降解，从而导致胞内荧光强度(530nm)的下降。通过测定荧光强度的变化，可以定量分析筛选样品对Vif降解hA3G的影响。

HIV-1病毒蛋白Vif介导的hA3G的降解作用抑制剂的筛选方法：构建表达hA3G与YFP的融合蛋白的pEYFP-N1-APOBEC3G以及表达野生型的Vif的pcDNA-hvif质粒。

将这两个质粒分别或共转染细胞。转染后，添加样品至转染后的细胞，检测细胞荧光值的变化。

若样品对该方法有效，即阻止Vif对APOBEC3G-YFP融合蛋白降解作用，则荧光值升高。若样品对该方法无效，即vif降解APOBEC3G-YFP融合蛋白，则荧光值降低。

通过上述筛选，可以快速筛选能够抑制hA3G降解的活性样品(发酵样品或化合物)，但仍然无法确定该样品是特异性干扰Vif介导的hA3G的降解作用，还是通过阻断蛋白酶体降解通路来实现对hA3G的保护。

为了确定阳性样品是否为Vif降解hA3G的特异性抑制剂，根据E4orf6对P53的蛋白酶体降解机制，利用类似的荧光发光检测方法，采用排除蛋白酶体降解通路阻断剂的复筛方法进行检测。

与Vif降解hA3G类似，腺病毒早期基因蛋白E4orf6可以结合p53，通过Cul5介导的多泛素化，特异性地降解P53。虽然这两个降解作用可以各自特异性地识别底物(hA3G和p53)，但都利用相同的蛋白酶体降解途径来降解底物。因此，如果活性样品可以同时阻断这两个降解反应，则表明其作用靶点很可能位于蛋白酶体降解途径中。

复筛即非蛋白酶体降解通路阻断剂的筛选如下：

构建E4orf6-P53质粒和P53与YFP融合蛋白的表达载体Vif-APOBEC3G质粒；

这两个质粒分别转染细胞，转染后，添加样品至转染后的细胞，检测细胞荧光值的变化；

在复筛中，构建了P53与报告基因YFP融合蛋白的表达载体，与Myc-E4orf6同时转染进细胞，检测细胞荧光值的变化。若样品对该方法有效，即能阻止E4orf6通过泛素化蛋白酶体途径降解P53，荧光值较高，则该样品属于我们排除的对象。若样品对该方法无效，而在Vif-APOBEC3G筛选方法上有效，则说明样品能特异地抑制Vif对hA3的降解作用。

复筛方法的流程：

(1)Vif-APOBEC3G筛选方法的流程

①细胞培养

取细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃旧培养基，用消化液消化。待细胞变圆，弃消化液，立即加入培养基，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底且使之分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，取细胞悬液接种于培养皿，用于进行细胞转染。

②细胞转染

a、培养基混合用于转染的质粒，然后轻轻混匀。

b、培养基加入转染试剂，温室孵育。

c、将含有转染质粒和转染试剂的培养基轻轻混匀，室温孵育后，加到细胞培养上清中。

③细胞分盘

转染后，培养一段时间。然后吸去旧的培养基，用消化液消化，弃消化液，立即加入培养基，轻轻吹打，使细胞分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，接种。

④样品制备

化合物样品：取纯品化合物溶到DMSO中，加水倍比稀释，取稀释液作用于细胞体系。

发酵液样品：菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有发酵培养基的瓶中，摇床培养。取发酵液用丙酮抽提，挥干后，用DMSO溶解。取溶液加水倍比稀释，再取稀释液作用于细胞体系。

用DMSO溶解MG132。MG132可以阻断蛋白酶体降解通路，抑制Vif对hA3G的降解，作为阳性化合物。

⑤样品活性检测

A、阳性组和空白对照组：加入DMSO于细胞培养上清中。

B、实验组：又分为三组

阴性对照组：加DMSO于细胞培养上清中，该组反映Vif对APOBEC3G的降解程度。

阳性药对照组：加MG132于细胞体系中。该组反映蛋白酶体抑制剂MG132对vif降解APOBEC3G的抑制程度。

样品实验组：加要筛选的样品于细胞体系中，该组反映筛选样品对vif降解APOBEC3G的抑制程度。

在细胞培养上清中加入一定浓度的检测样品。继续培养后，吸去旧的培养基，用磷酸缓冲液(PBS)吹打细胞，直至细胞完全脱离。

将细胞悬液转移到黑板中，检测荧光强度，激发波长为485nm，检测波长为520nm。测量两次取平均值。

⑥检测结果的分析

测定的荧光强度减去空白对照组的数值作为各组YFP荧光强度数值。

相对荧光强度＝实验组荧光强度/阳性组荧光强度×100％

降解抑制率＝(样品实验组-阴性对照组)/(阳性组-阴性对照组)×100％

(2)、E4orf6-P53筛选方法的流程

该流程与Vif-APOBEC3G筛选方法的流程相同。

(3)、比较检测结果，筛选具有特异地抑制Vif对hA3的降解作用的样品。

选择hA3G作为靶点，不仅可以解决病毒高变异导致的耐药性问题，而且与目前临床应用的抗HIV-1药物无交叉耐药性。同时作为宿主内源性的抗病毒宿主因子，还将具有低毒副作用的优点。

附图说明

图1为实施例2中构建的表达质粒pEYFP-N1-APOBEC3G；

图2为实施例2中构建的表达质粒pcDNA-Vif；

图3为实施例6中构建的表达质粒pEYFP-N1-p53；

图4为实施例6中构建的表达质粒E4orf6-myc。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1 细胞培养

取293T细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃旧培养基，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化。待细胞变圆，弃消化液，立即加入含10％FBS(购自Biological industries)的高糖DMEM培养基(HyClone)，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底且使之分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，用培养基将细胞浓度调整为2.2×10⁵个/ml，取15ml细胞悬液接种于10cm培养皿，12小时后(细胞丰度约为70％)用于细胞转染。

实施例2 构建表达载体

应用PCR扩增hA3G的全基因(GeneID：60489)。模板为人cDNA，所用引物：上游引物5′-GCC AGA ATT CAA GGA TGA AGCCTC ACT TCA G，下游引物5′-TAG AAG CTC GAG GTT TTC CTGATT CTG GAG AAT GG，

反应体系：

反应条件：98℃5min；94℃/1min，55℃/1min，72℃/1min，共30个循环；72℃10min。

扩增产物经验证后，插入到真核细胞表达载体pEYFP-N1(Clontech)的多克隆位点(Xho1和EcoR1)，得到质粒pEYFP-N1-APOBEC3G。pEYFP-N1-APOBEC3G表达hA3G和YFP的融合蛋白。

从野生型的HIV-1毒株pSVC21.BH10(NIH AIDS Research&Reference Reagent Program)中通过PCR扩增全长的Vif基因(GeneID：326389)。所用引物：

上游引物5′-TAG AAG GAA TTC ATG GAA AAC AGA TGC

下游引物5′-TAG AAG CTC GAG CTA GTG TCC ATT CAT反应体系：

PCR产物经验证后插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)的多克隆区(EcoR1和Xho1)，构建形成pcDNA-Vif.。

实施例3 细胞转染

转染步骤按Lipofectamine 2000(Invitrogene)的说明书进行。具体操作如下：用1.5ml高糖DMEM培养基混合用于转染的质粒，然后轻轻混匀。阳性组：共转染12μg pEYFP-N1-APOBEC3G和12μg对照空载体pcDNA3.1，实验组：共转染12μg pEYFP-N1-APOBEC3G和12μg pcDNA-hvif；空白对照组：转染24μg对照空载体pcDNA3.1。

用1.5ml高糖DMEM培养基稀释60μl Lipofectamine 2000。室温孵育5分钟，将含有转染质粒和Lipofectamine 2000的培养基轻轻混匀(总体积为3ml)，室温孵育20分钟后，加到10cm培养皿的细胞培养上清中。

转染后，37℃，5％的CO₂培养10h。然后吸去旧的培养基，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化，弃消化液，立即加入含10％FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打，使细胞分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，用培养基将细胞浓度调整为2.2×10⁵个/ml，96孔板每孔接种150μl细胞悬液。

实施例4 样品制备

化合物样品：10mg纯品化合物溶到1mlDMSO中，取10μl加10μl水倍比稀释，取1.5μl作用于150μl细胞体系，使其终浓度为50μg/ml.

发酵液样品：菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃、190转/分旋转摇床培养4天。取10ml发酵液用10ml的丙酮抽提，挥干后，用1ml的DMSO溶解。取10μl加10μl水倍比稀释，取1.5μl作用于150μl细胞体系。

MG132(购自Merck Calbiochem)：1mg用5ml的DMSO溶解，MG132的浓度为0.4205mM。MG132可以阻断蛋白酶体降解通路，抑制Vif对hA3G的降解，在本筛选模型里作为阳性化合物。

实施例5 样品活性检测

培养26小时后，按以下分组进行操作。

阳性组和空白对照组：加入1.5μl 50％DMSO于细胞培养上清中。

实验组分为三组，阴性对照组：加入1.5μl 50％DMSO于细胞培养上清中，该组反映Vif对APOBEC3G的降解程度。

阳性药对照组：加0.713μl的0.4205mM MG132于150μl的细胞体系中，使MG132的终浓度为2uM。该组反映蛋白酶体抑制剂MG132对vif降解APOBEC3G的抑制程度。

样品实验组：加药筛选的样品1.5μl于150μl的细胞体系中。该组反映筛选样品对vif降解APOBEC3G的抑制程度在96孔板的细胞培养上清中(每孔)加入1.5μl一定浓度的检测样品。继续培养12小时后，吸去旧的培养基，每孔用100μl磷酸缓冲液(PBS)吹打细胞，直至细胞完全脱离。

将细胞悬液转移到黑板中，BMG公司的Polarstar荧光检测仪检测各孔荧光强度，激发波长为485nm，发射波长为520nm，Gain值为70。测量两次取平均值。

相对荧光强度＝实验组荧光强度/阳性组荧光强度×100％

实施例6 E4orf6-P53筛选方法

应用PCR扩增p53的全基因。以Clontech公司的pCMV-P53(GeneID：631922)为模板，所用引物：上游引物：5′GTACTCGAGATGGAGGAGCCG 3′；下游引物：5′GGAATTCGGTCTGAGTCAGGC 3′

反应体系：

反应条件：98℃/10sec，68℃/2min，共30个循环

扩增产物经验证后，插入到真核细胞表达载体pEYFP-N1(Clontech)的多克隆位点(Xho1和EcoR1)，得到质粒pEYFP-N1-p53。pEYFP-N1-p53则表达p53和YFP的融合蛋白。以腺病毒(ATCC VR-5^TM)应用PCR扩增腺病毒E4orf6全基因(GeneID：2958467)，所用引物：上游引物5′-CTT CAG GAT CCA TGA CTA CGTCCG GCG-3’，下游引物5′-GAA GTG AAT TCC TAC ATG GGG GTAGAG TCA TAA3’，

反应体系：

反应条件：94℃5min；94℃/1min，55℃/1min，72℃/1min，共30个循环；72℃10min。

扩增产物经验证后，插入到到真核细胞表达载体pcDNA3(Invitrogen)的多克隆区3’和Xba1，构建形成E4orf6-myc。

该筛选方法除转染质粒的量不同外，其余的和Vif-APOBEC3G筛选方法一样。实验组：共转染E4orf6-myc和pEYFP-N1-P53的质量为2∶1，E4orf6是Lipofectamine 2000说明书推荐的量。阳性组：转染的P53的量是Lipofectamine 2000说明书推荐量的一半。

筛选结果为，从组合化学库、微生物次级代谢产物库以及天然产物库中共筛选7000个样品，其中1200个化合物，5800个发酵液样品，初筛阳性率176/7000＝2.51％，复筛阳性率64/7000＝0.9％。活性化合物两个为IMB-26和IMB-35。抑制率分别51.1％，52.3％。

序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>一种抗HIV药物的筛选方法

<130>

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gccagaattc aaggatgaag cctcacttca g 31

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tagaagctcg aggttttcct gattctggag aatgg 35

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tagaaggaat tcat ggaaaa cagat gc 27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tagaagctcg agctagtgtc cattcat 27

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gtactcgaga tggaggagcc g 21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggaattcggt ctgagtcagg c 21

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cttcaggatc catgactacg tccggcg 27

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gaagtgaatt cctacatggg ggtagagtca taa 33

Claims

1.一种抗HIV药物的筛选方法，其包括如下步骤：

（1）制备共表达hA3G与报告基因的融合蛋白以及Vif的细胞，该细胞含有表达载体pEYFP-N1-APOBEC3G和表达载体pcDNA-hvif；在表达hA3G与报告基因的融合蛋白以及Vif的细胞中VIF蛋白特异性地结合hA3G，并与细胞蛋白Cu15，elongins B和C以及Rbx1相互作用，形成Skp1-cμllin-F-box(SCF)复合物，通过泛素介导的降解途径，导致hA3G报告基因的降解；

（2）添加待测样品至步骤1所述的细胞；

检测细胞报告基因表达产物量的变化，选择能使报告基因表达产物量上升的样品；

（3）从步骤（2）选择的样品中选择非蛋白酶体降解通路阻断的样品，其方法是：将步骤（2）选择的样品添加至表达P53与报告基因的融合蛋白以及E4orf6的细胞，通过与对照比较，选择报告基因编码产物量相对较低的样品；所述表达P53与报告基因融合蛋白以及E4orf6的细胞通过如下方法构建：构建表达P53蛋白与黄荧光蛋白的融合蛋白的表达载体以及表达E4orf6的表达载体，将构建的表达载体共转染293T细胞，并筛选阳性克隆；所述表达P53与黄荧光蛋白的融合蛋白的表达载体为pEYFP-N1-P53；所述表达E4orf6的表达载体为E4orf6-myc。