CN101586140A - 一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法，该方法通过三角烧瓶、塑料桶或尼龙袋、水泥池的三步培养法，且每步通过各种理化环境参数，如氮、磷含量，pH值，培养温度，光照强度，光照时间，添加矿盐或卤盐、H2O2和FeCl2及细胞状态等精确调节和控制措施，每一步目标明确，操控合理，使雨生红球藻的营养生长较好，营养生长向非营养生长转化较快，累积虾青素较多，从而提高了培养、转化、累积的效率与稳定性，也有效防止了培养过程中杂藻的污染；由于是开放式的培养，这样一是不需要密闭式光生物反应器，使生产成本大大降低，并且产能明显提高，可以进行较大规模开放培养雨生红球藻生产虾青素。
Description
技术领域
本发明涉及培养雨生红球藻生产虾青素的方法，具体涉及一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)是类胡萝卜素的一种，主要作为鱼类的天然着色剂。具有超强抗氧化能力，具有保护皮肤，提高免疫力，抑制癌症等功能，广泛应用于水产品，化妆品，医药等行业。雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)隶属于绿藻门，绿藻纲，团藻目，雨生红球藻科，雨生红球藻属。雨生红球藻是目前已知的虾青素含量最高的生物，它在胁迫环境累积虾青素，如营养缺失，强光照等，其虾青素含量最高能达到细胞质量的1-4％，是一种极具规模化生产虾青素潜力的藻类。
虾青素的来源主要有4种：虾蟹壳提取、法夫酵母提取、化学合成及雨生红球藻提取。虾蟹类废弃物中虾青素含量低，提取费用高，不适合作为虾青素的大规模来源；酵母类胡萝卜素总量不超过干重的0.08％，且细胞壁厚，不容易提取。用化学方法合成虾青素作为食品添加剂已被美国食品和药品管理局(FDA)批准使用，如德国的BASF公司进行了合成，作为鱼类着色剂。目前市场上出售的绝大部分是化学合成虾青素，不但价格昂贵，还可能存在污染与潜在的危害，而且在生物功效和安全性上不及天然虾青素，因此人们对天然虾青素的兴趣大大提高。
目前用一步法或二步法培养雨生红球藻生产虾青素，一步法如公告号为1181184，公告日为2004年12月22日，名称为一种培养培养雨生红球藻生产虾青素的方法的中国发明专利，就公开了在一个光生物反应器中用成份较复杂的培养基(培养液)完成雨生红球藻的营养生长和雨生红球藻转化(孢子转化)及虾青素的累积过程；二步法如公告号为100453635，公告日为2009年1月21日，名称为大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及方法的中国发明专利，就公开了在连接的二个单元光生物反应器上用培养液分别进行营养生长过程和雨生红球藻转化及虾青素的累积过程，即在营养生长时用较低的水温和较低的光照的光反应器进行，而转化和累积过程在较高的水温、较强的光照的光反应器进行。上述第一种方法公开的培养液的氮含量为5～20mg/L，磷含量为0.5～2mg/L，培养基中氮和磷的含量较高，培养基的配置成份较复杂，生产过程中需要经常排放含氮、磷的废水。上述二类方法都要在密闭式光生物反应器进行，生产虾青素的成本较高，而虾青素的产能较小，年产量很难超过20吨。光生物反应器易造成藻细胞粘连与遮蔽，导致培养期间的透光性下降，管道壁清洗困难等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有生产虾青素的成本较低，产能较大和较大规模培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法，包括下述步骤：
a将滤去杂质的淡水煮沸后冷却，添加含氮和磷的营养盐配制成培养液备用，所述培养液中氮的含量为2～10mg/L，磷的含量为0.1～0.4mg/L。
b在三角烧瓶内装入所述培养液，按雨生红球藻的细胞密度为1000～6000个/毫升，将雨生红球藻接种至三角烧瓶内的培养液中，在培养温度为15℃～25℃，三角烧瓶表面光照强度为1500Lux～3000Lux，每天光照时数为10小时～18小时条件下，静置或摇瓶培养，培养至雨生红球藻细胞密度为5万～10万个/毫升，得到一级营养生长物。
c将步骤b的一级营养生长物移入至白色的塑料桶或尼龙袋中，加入所述培养液，使雨生红球藻的细胞密度为1000～6000个/毫升，在培养温度为20℃～25℃，一级营养生长物表面光照强度为3000Lux～5000Lux，每天光照时数为不少于12小时条件下，第一次充气培养，培养至雨生红球藻细胞密度为10万～25万个/毫升，得到二级营养生长物；
d将步骤c的二级营养生长物移入清洁水泥池中，加入所述培养液，使雨生红球藻的细胞密度为500～3000个/毫升，池内液体深度控制在0.3m～1.0m，池内液体pH值控制在8.6～10.2，培养温度为20℃～25℃，二级营养生长物表面光照强度为不高于5000Lux的自然光照条件下，第二次充气培养，培养7～12天，培养至雨生红球藻细胞密度达到6万～12万个/毫升，得到三级营养生长物。
e在步骤d的三级营养生长物中加入矿盐或卤盐，使三级营养生长物中矿盐或卤盐的重量百分比浓度为0.1％～1.0％，并添加含磷的营养盐，使三级营养生长物中氮与磷的重量比为5，将池内液体深度控制在0.2m～0.8m，池内液体pH值为7.0～9.5，培养温度为20℃～28℃，三级营养生长物表面光照强度为不低于5000Lux的条件下，流水转化培养3～5天，培养至所有雨生红球藻细胞沉至池底，得到孢子态转化物；添加矿盐或卤盐，三级营养生长物的渗透压与电导率迅速升高，使雨生红球藻在短时间内从营养生长转化为非营养生长状态，从自由游动状态转化不能游动状态而下沉到培养液的底部，从无细胞壁到开始形成产生细胞壁；pH值控制在7.0-9.5，可以使孢子态雨生红球藻细胞较好地形成，也有利于虾青素的累积。
f在步骤e的孢子态转化物中加入H2O2，使孢子态转化物中H2O2的重量百分比浓度为0.001％～0.05％，一天后再加入FeCl2和含磷的营养盐，使孢子态转化物中FeCl2的重量百分比浓度为0.005％～0.05％，使氮与磷的重量比为不大于0.25，池内液体深度控制在0.1m～0.5m，培养温度为22℃～30℃，孢子态转化物表面光照强度为不低于5000Lux的条件下，流水累积培养7～15天，培养至所有雨生红球藻细胞呈深红色，得到累积丰富虾青素的雨生红球藻静细胞，经分离收获藻细胞及低温干燥等工序获取富含虾青素的藻细胞；H2O2和FeCl2具有促进虾青素累积，提高雨生红球藻虾青素含量的作用。
培养过程中根据不同的培养要求，氮磷比值逐渐降低，在步骤e时降低至5，磷含量明显增大，有利于雨生红球藻细胞较早进入非营养生长阶段；在步骤f时降低至0.25以下，磷含量更大且超过了氮含量，有利于累积较多和较好虾青素。
流水转化培养和流水累积培养是为了避免部分细胞堆积而形成死角，导致质量下降。
在步骤a中，所述培养液中氮的含量为6mg/L，磷的含量为0.2mg/L，这样培养液中氮磷浓度不是很高，且氮与磷重量比大于25，培养液的氮磷比以大于25较好，以后雨生红球藻各步培养中可以根据需要添加含磷营养盐进行调节。
在步骤c中，所述第一次充气培养为每20～50升塑料桶或尼龙袋中放置一个散气石。
在步骤d中，所述第二次充气培养为所述水泥池设置有充气鼓风机，同时每1平方米～4平方米的池底中放置一个散气石，充气鼓风机为常用的市售得到，按池体大小选取鼓风机型号。
在步骤e中，所述流水转化培养为采用桨叶轮搅拌器使池内液体流动，桨叶轮转速为30～120转/小时，此时雨生红球藻从营养生长转化为非营养生长转化，细胞运动能力还是较高，需要较好的流动，防止死角形成。
在步骤f中，所述流水累积培养为采用桨叶轮搅拌器使池内液体流动，桨叶轮转速为10～60转/小时，此时为非营养生长即虾青素累积，所以缓缓流动即可。
在步骤e中，所述矿盐或卤盐的重量百分比浓度为0.5％，三级营养生长物的渗透压提高得较快，孢子态雨生红球藻细胞形成较好和较快。
在步骤f中，所述H2O2的重量百分比浓度为0.02％，所述FeCl2的重量百分比浓度为0.02％，氮和磷的重量比为0.2；可以使虾青素累积较高。
与现有技术相比，本发明的优点在于通过三角烧瓶、塑料桶或尼龙袋、水泥池的三步培养法，且是开放式的培养，这样一是不需要密闭式光生物反应器，使生产成本大大降低，也解决了光生物反应器易造成藻细胞粘连与遮蔽，导致培养期间的透光性下降，管道壁清洗困难等问题；并且产量明显提高，雨生红球藻的生长率达到25％，生物量增长快，一般3～5天能够增加一倍；二是本发明的开放式的三步培养法容易扩充产能，三角烧瓶、塑料桶或尼龙袋很便宜采购，建造较大水泥池也容易，符合我国的生产特点与经济效益的要求；三是通过各步骤的各种理化环境参数，如氮、磷含量，pH值，培养温度，光照强度，光照时间，添加矿盐或卤盐、H2O2和FeCl2及细胞状态等精确调节和控制措施，每一步目标明确，操控合理，使雨生红球藻的营养生长较好，营养生长向非营养生长转化较快，累积虾青素较多，从而提高了培养、转化、累积的效率与稳定性，也有效防止了培养过程中杂藻的污染。培养得到冻干红球藻细胞产量高达0.1～0.7g/L，天然虾青素含量可高达细胞干重的0.8-2.2％。因此本发明是一种具有生产虾青素的成本较低，产能较大和较大规模培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
培养液配制：选取清洁淡水、过滤，煮沸，然后冷却，添加含氮和磷的营养盐配制成氮的含量为6mg/L，磷的含量为0.2mg/L的培养液备用。本实施例中培养液中也可以：氮的含量为2mg/L，磷的含量为0.1mg/L；或氮的含量为3mg/L，磷的含量为0.1mg/L；或氮的含量为4mg/L，磷的含量为0.15mg/L；或氮的含量为8mg/L，磷的含量为0.3mg/L；氮的含量为10mg/L，磷的含量为0.4mg/L等；但以氮磷重量比大于25较好。
实施例2
第一步培养：在5000毫升的三角烧瓶内装入3000毫升实施例1的培养液，然后在无菌室接种雨生红球藻至三角烧瓶内的培养液中，使每毫升培养液中雨生红球藻的细胞数1000～6000个，以检测到3000个左右/毫升为好，采用柔和的光照，三角烧瓶表面的光强控制在1500Lux～3000Lux范围，培养温度控制在15℃～25℃，此时以培养温度控制在16℃～20℃度较好，光照时数控制在10小时～18小时静置培养，光照时数以12小时左右较好，培养的雨生红球藻细胞密度达到5万～10万个/毫升，得到一级营养生长物，一级营养生长物中以检测到8万个左右/毫升为好，转入第二步培养。
第二步培养：将一级营养生长物移入至50升白色的塑料桶中，加入实施例1的培养液，使塑料桶中雨生红球藻的细胞密度为1000～6000个/毫升，以检测到3000个左右/毫升为好，在培养温度为20℃～25℃，一级营养生长物表面光照强度为3000Lux～5000Lux，用自然光加适当人工光，每天光照时数为不少于12小时条件下，放置1个散气石充气培养，培养至雨生红球藻细胞密度为10万～25万个/毫升，得到二级营养生长物，二级营养生长物中以检测到18万个左右/毫升为好，转入第三步培养。
第三步培养：将二级营养生长物移入至50立方米经灭菌杀毒后的清洁的水泥池中，加入实施例1的培养液，使池中雨生红球藻的细胞密度为500～3000个/毫升，以检测到1200个左右/毫升为好，池内液体深度控制在0.3m～1.0m，液体深度是从高到低让其逐渐下降，池内液体pH值控制在8.6～10.2，培养温度为20℃～25℃，二级营养生长物表面光照强度为不高于5000Lux的自然光照条件下，池底每1平方米～4平方米放置一个散气石，池中连接有充气鼓风机，鼓风机白天开，晚上不开，进行第二次充气培养，培养7～12天，培养至雨生红球藻细胞密度达到6万～12万个/毫升，得到三级营养生长物。一般在三级营养生长物中检测到10万个左右/毫升时，在池中加入矿盐诱导转化，使池内液体中矿盐的重量百分比浓度为0.1％～1.0％，相当于100毫升池内液体中加入矿盐0.1～1.0克，并添加含磷的营养盐，使三级营养生长物中氮与磷的重量比为5，将池内液体深度控制在0.2m～0.8m，液体深度也是从高到低让其逐渐下降，此时池内液体pH值控制在7.0～9.5，培养温度为20℃～28℃，三级营养生长物表面光照强度为不低于5000Lux的条件下，采用桨叶轮搅拌器使池内液体流动，桨叶轮转速为30～120转/小时，桨叶轮转速也是从快到慢逐渐降低，这样流水转化培养3～5天，所有雨生红球藻细胞沉至池底，得到孢子态转化物。此时在池中先加入H2O2，使池内液体中H2O2的重量百分比浓度为0.02％，一天后再加入FeCl2和含磷的营养盐，使池内液体中FeCl2的重量百分比浓度为0.02％，氮与磷的重量比为0.2左右，池内液体深度控制在0.1m～0.5m，培养温度为22℃～30℃，孢子态转化物表面光照强度也为不低于5000Lux的条件下，桨叶轮转速调低为10～60转/小时，桨叶轮转速也是从快到慢逐渐降低，流水累积培养7～15天，培养至所有雨生红球藻细胞呈深红色，得到累积丰富虾青素的雨生红球藻静细胞，过滤分离获得雨生红球藻静细胞，低温冻干，冻干红球藻细胞产量高达0.5g/L，天然虾青素含量可高达细胞干重的1.5％左右。
实施例3
与实施例2基本相同，所不同的只是第二步培养中，用尼龙袋代替塑料桶，第三步培养中用卤盐代替矿盐，池内液体中卤盐的重量百分比浓度为0.3％～0.5％，H2O2的重量百分比浓度为0.002％～0.005％，FeCl2的重量百分比浓度为0.006％～0.008％，氮与磷的重量比为0.1左右。
实施例4
与实施例2基本相同，所不同的只是第三步培养中，池内液体中矿盐的重量百分比浓度为0.6％～0.8％，H2O2的重量百分比浓度为0.008％～0.015％，FeCl2的重量百分比浓度为0.01％～0.015％，氮与磷的重量比为0.05左右。
实施例5
与实施例2基本相同，所不同的只是第三步培养中，池内液体中H2O2的重量百分比浓度为0.03％～0.05％，FeCl2的重量百分比浓度为0.03％～0.05％，氮与磷的重量比为0.01左右。
Claims (8)
1、一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法，其特征在于包括下述步骤：
a将滤去杂质的淡水煮沸后冷却，添加含氮和磷的营养盐配制成培养液备用，所述培养液中氮的含量为2～10mg/L，磷的含量为0.1～0.4mg/L；
b在三角烧瓶内装入所述培养液，按雨生红球藻的细胞密度为1000～6000个/毫升，将雨生红球藻接种至三角烧瓶内的培养液中，在培养温度为15℃～25℃，三角烧瓶表面光照强度为1500Lux～3000Lux，每天光照时数为10小时～18小时条件下，静置或摇瓶培养，培养至雨生红球藻细胞密度为5万～10万个/毫升，得到一级营养生长物；
c将步骤b的一级营养生长物移入至白色的塑料桶或尼龙袋中，加入所述培养液，使雨生红球藻的细胞密度为1000～6000个/毫升，在培养温度为20℃～25℃，一级营养生长物表面光照强度为3000Lux～5000Lux，每天光照时数为不少于12小时条件下，第一次充气培养，培养至雨生红球藻细胞密度为10万～25万个/毫升，得到二级营养生长物；
d将步骤c的二级营养生长物移入清洁水泥池中，加入所述培养液，使雨生红球藻的细胞密度为500～3000个/毫升，池内液体深度控制在0.3m～1.0m，池内液体pH值控制在8.6～10.2，培养温度为20℃～25℃，二级营养生长物表面光照强度为不高于5000Lux的自然光照条件下，第二次充气培养，培养7～12天，培养至雨生红球藻细胞密度达到6万～12万个/毫升，得到三级营养生长物；
e在步骤d的三级营养生长物中加入矿盐或卤盐，使三级营养生长物中矿盐或卤盐的重量百分比浓度为0.1％～1.0％，并添加含磷的营养盐，使三级营养生长物中氮与磷的重量比为5，将池内液体深度控制在0.2m～0.8m，池内液体pH值为7.0～9.5，培养温度为20℃～28℃，三级营养生长物表面光照强度为不低于5000Lux的条件下，流水转化培养3～5天，培养至所有雨生红球藻细胞沉至池底，得到孢子态转化物；
f在步骤e的孢子态转化物中加入H2O2，使孢子态转化物中H2O2的重量百分比浓度为0.001％～0.05％，一天后再加入FeCl2和含磷的营养盐，使孢子态转化物中FeCl2的重量百分比浓度为0.005％～0.05％，氮与磷的重量比为不大于0.25，池内液体深度控制在0.1m～0.5m，培养温度为22℃～30℃，孢子态转化物表面光照强度为不低于5000Lux的条件下，流水累积培养7～15天，培养至所有雨生红球藻细胞呈深红色，得到累积丰富虾青素的雨生红球藻静细胞。
2、如权利要求1所述的一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法，其特征在于在步骤a中，所述培养液中氮的含量为6mg/L，磷的含量为0.2mg/L。
3、如权利要求1所述的一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法，其特征在于在步骤c中，所述第一次充气培养为每20～50升塑料桶或尼龙袋中放置一个散气石。
4、如权利要求1所述的一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法，其特征在于在步骤d中，所述第二次充气培养为所述水泥池设置有充气鼓风机，同时每1平方米～4平方米的池底中放置一个散气石。
5、如权利要求1所述的一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法，其特征在于在步骤e中，所述流水转化培养为采用桨叶轮搅拌器使池内液体流动，桨叶轮转速为30～120转/小时。
6、如权利要求1所述的一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法，其特征在于在步骤f中，所述流水累积培养为采用桨叶轮搅拌器使池内液体流动，桨叶轮转速为10～60转/小时。
7、如权利要求1所述的一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法，其特征在于在步骤e中，所述矿盐或卤盐的重量百分比浓度为0.5％。
8、如权利要求1所述的一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法，其特征在于在步骤f中，所述H2O2的重量百分比浓度为0.02％，所述FeCl2的重量百分比浓度为0.02％，氮与磷的重量比为0.2。
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