CN101583716A - Nell肽表达系统 - Google Patents

Nell肽表达系统 Download PDF

Info

Publication number
CN101583716A
CN101583716A CNA2007800426712A CN200780042671A CN101583716A CN 101583716 A CN101583716 A CN 101583716A CN A2007800426712 A CNA2007800426712 A CN A2007800426712A CN 200780042671 A CN200780042671 A CN 200780042671A CN 101583716 A CN101583716 A CN 101583716A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
peptide
nucleic acid
nell1
nell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007800426712A
Other languages
English (en)
Inventor
淦·丁
苏立奇·科罗达
本·吴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN101583716A publication Critical patent/CN101583716A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及NELL肽的制备方法。

Description

NELL肽表达系统
关于在联邦政府资助的研究和开发下所得发明的权利声明
本研究部分地由NEH/NIDR基金号DE9400和CRC/NIH基金号RR00865支持。美国政府在本发明中可享有一定的权利。
与相关申请的相互参考
本申请是2005年8月5日申请的美国申请序列号U.S.Application Serial No.10/544,553(是2004年2月9日申请的PCT/US2004/003808的PCT申请美国国家阶段)和2006年2月16日申请的PCT/US2006/005473的部分连续申请，以上专利申请的内容在此被整体引用和参考。
发明领域
本发明总的涉及表达和纯化NELL肽或相关的药剂的方法。
发明背景
生长因子是指在体内或体外影响特定细胞群的生长和分化的物质，例如肽。
骨形成发生于长骨(软骨内骨形成)和扁骨(膜内骨形成)的发育期。此外骨形成也发生于在成人期持续发生以保持骨骼完整性的骨重建期。最后，骨形成发生于骨修复期，例如在骨折或外科手术时出现骨创伤的时候。人们认为长骨和扁骨的胚胎发育涉及不同的骨形成机制，而认为修复涉及膜内骨形成。
由任一机制引起的骨形成包括由生长因子调节的成骨细胞的活性。成骨细胞来源于骨髓基质细胞库(又称间充质干细胞；MSC)。这些细胞存在于多种组织中，并主要存在于骨髓基质。MSC是多能性的，能分化成多种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞和脂肪细胞。生长因子被认为对影响骨形成的骨原细胞增殖、分化功能和成骨细胞矿化功能产生影响。
自体骨已被用于例如患有颅缝早闭症和裂口移植的患者的骨修复。3,000婴儿中有1名患有颅缝早闭症(CS)，即颅缝过早闭合，因此它是最普遍的人类先天性颅面畸形症之一。过早的缝关闭导致颅双形，需要外科手术矫正。人类CS的过早的缝关闭可通过两种可能不同的过程发生：颅盖过度生长和骨融合。最近，成纤维细胞生长因子2(FGF2)和成纤维细胞生长因子受体1被认为与通过CBFA1-介导的通路的过早的颅缝融合有关(8)。CBFA1的错义突变与锁骨颅骨发育不全(显示为延迟缝关闭)相关。
已有采用自体骨(例如来源于髂嵴或颅盖)进行自体骨移植。这些供体部位具有伴随的病态，包括疼痛、步态障碍、髂嵴供体部位大腿感觉异常、以及感染、神经短缺和颅盖移植物血肿。而且，供体部位具有有限的体积，可能造成延长外科手术时间和住院时间。
目前也有采用异体移植物，也已在动物模型中测试生长因子。例如bFGF已显示能有效地用于骨再生和修复。另一个成骨生长因子家族已被描述作为成骨蛋白(BMP)。具体地，已有证明BMP-2重组蛋白用于下颌骨连续性缺损和裂腭缺损再生，效果等于或优于自体颗粒骨和骨髓。已有研究BMPs和其它成骨因子用于临床应用。然而，使用最小有效剂量BMP的费用是限制其临床应用的因素。
脊柱融合术是通过多个脊柱的椎骨联合在一起以致于它们之间不再发生运动的外科技术。其指征包括：治疗椎骨骨折(折断)、矫正畸形、消除运动引起的疼痛、治疗不稳定性和治疗一些颈间盘突出症。手术包括将骨移植物置入所述椎骨之间，以使得在所述椎骨之间得到牢固的连接。所述方法也可包括补充治疗，包括置入板、螺钉、支架、以及最近的成骨蛋白2和7，以协助骨移植物的稳定和愈合。自体骨移植是一种独立的手术，也具有显著的发病率。
软骨是一种致密结缔组织。它是由分布在牢固的凝胶状基质中的软骨细胞组成。软骨是无血管的(不包含有血管)，营养素通过所述基质扩散。在关节、胸廓、耳、鼻、咽喉和椎间盘之间均发现有软骨。软骨有三种主要的类型：透明软骨(例如，肋软骨、鼻软骨、气管、支气管和关节软骨)，弹性软骨(例如，外耳、外耳道、部分咽鼓管、会厌以及一些喉软骨)，纤维软骨[例如半月板(例如，腕三角纤维软骨复合体、膝半月板)、椎间盘、颞下颌关节盘、耻骨联合以及一些与骨连接的腱和韧带]。软骨的主要功能之一是提供一可在其上开始发生骨沉积(例如在软骨内骨化期间)的结构。软骨另一个重要的功能是提供光滑面适于具关节骨的活动。例如，关节软骨(大多数显著地发现在膝关节)通常具有的特征是非常低的摩擦力、高耐磨性以及低再生性。多数膝关节的抗压缩特性和载荷承重特性是责任重大的并且，缺乏它，行走将是痛苦而不可能的。然而软骨的另一个重要的功能是提供牢固却灵活的支架(例如，鼻软骨、脊椎盘、气管软骨、膝半月板、支气管软骨)。比方说，软骨(如所述半月板)在关节稳定性、润滑以及力传递方面具有关键作用。在承重载荷下，所述半月板保持股骨在胫骨上的平衡位置并通过增加表面接触区来分配所述压力，从而将平均压力减少两到三倍。因此，所述半月板与所述关节液相互作用，以产生五倍的与冰和冰之间一样光滑的摩擦系数。在另一个实例中，所述椎间盘具有若干重要的功能，包括作为间隔物的功能、作为减震器的功能以及作为运动单元的功能。所述椎间盘的凝胶状中间部分被称为髓核。它含有80-90％的水。所述核的固体部分是II型胶原和非聚集的蛋白聚糖。环绕髓核的外部韧带环被称为纤维环，其液压密封所述核，并允许当所述椎间盘载荷时增加椎间盘内压力(intradiscalpressures)。所述环具有交叉的放射状带，类似于多层子午线轮胎，这使得在正常负重以及没有断裂的情况下扭转应力通过所述环分散。所述椎间盘的功能类似于液压缸。所述环与所述核相互作用。当所述核被施加压力时，所述环纤维起抑制功能以防止所述核膨出或突出。
磨损、损伤或疾病都会损害软骨。随着年龄的增加，人体软骨的水和蛋白质含量随之改变。该变化导致软骨变弱、变更加易碎和变薄。骨关节炎是软骨障碍的常见条件之一，能导致关节活动度受限、骨损伤和持久的疼痛。由于急性压力结合慢性疲劳，骨关节炎直接表现为关节表面磨损，且在极端的例子里，骨头曝露在关节处。在另一实例中，保护的稳定的半月板的减少会导致增加关节松弛的或会导致关节不稳定的异常活动。过度的活动和狭窄的接触区促进早期关节炎变化。在细胞水平上，最初是关节软骨浅层的细胞减少，然后是软骨裂解，接着是变薄和发生侵蚀，最后是下面的原骨突出。已知整体半月板减少后三周开始初期的关节炎变化。然而在另一实例中，由于堆起(stack)椎骨(关节面)的所述椎间盘和所述关节部分地由软骨组成，这些区随着时间过去被磨损(退化性变化)。由于所述内部核脱水，所述椎间盘空间变窄，且过多的环状韧带膨出。随着核脱水的不断增加，所述环状纤维出现裂缝并撕裂。正常软组织张力的减少可使脊髓节段半脱位(例如关节部分脱位)，导致形成骨赘(骨刺)、孔收缩、机械力学不稳定以及疼痛。如果所述环状纤维过度延伸或破裂，使得受压的核质膨出或突出并压迫神经组织，这将会产生疼痛和无力。这就是称为神经挟捏、椎间盘滑脱或椎间盘突出的情况。神经根病指的是在椎骨之间的所述椎间盘损伤引起的神经刺激。力学功能障碍也可引起椎间盘退化和疼痛(例如退行性椎间盘疾病)。例如所述椎间盘可能由于一些创伤而被损伤，从而使得所述椎间盘经受住施加于其的增加的压力的能力过载，并可能会撕裂所述环状纤维的内部或外部部分。当这些撕裂状的纤维经受增加的压力时它们可能成为炎症应答的中心，并可能直接或通过深层椎旁肌代偿保护的痉挛引起疼痛。
目前有若干不同的修复选择对软骨损伤或障碍有效。
在美国骨关节炎是导致老年人群残疾的第二个主要原因。它是退行性障碍，一般开始时较缓和，随着时间增加而增强并磨损。对于那些经历缓和到适度的症状的患者，所述障碍可通过若干非手术治疗法来治疗。已有证明应用支架和药物疗法，例如抗炎药(例如双氯芬酸、布洛芬和萘普生)、COX-2选择性抑制剂、氢化可的松、氨基葡萄糖和硫酸软骨素，可减轻软骨缺陷引起的疼痛和一些能减缓退行过程的要求。
大部分对于关节软骨的手术治疗，除全关节置换术以外，可被分成不同的治疗方法组。以终止炎症和疼痛为目的的消除所述疾病和逐渐损毁的关节的治疗方法包括切除法(软骨切除术)和清创术。另一组治疗方法包括目的是触发软骨产生的一系列磨蚀方法，例如钻孔、轻微骨折手术、软骨成形术和spongialization。磨蚀、钻孔和轻微骨折手术起源于20年前。它们根据于对于骨的软骨下板的血管损伤后软骨组织的自发性修复现象。另一种类型由目前仍属实验性的激光辅助治疗法组成；它们结合切除患病的软骨和软骨整形，并且也诱导软骨增生。另外的治疗方法包括自体软骨移植(例如Genzyme的Carticel疗法)。
其它更适用于半月板软骨的疗法包括在重度损伤情况下的早期外科手术和撕裂状结构的缝修复或同种异体移植物半月板移植术。
虽然极大多数具有椎间盘脱出和坐骨神经痛的患者不需手术能痊愈，但是如果手术是表示需要的，治疗方法包括采用椎板切开术切除脱出的椎间盘(在脊髓周围的脊柱骨产生一小洞)、椎板切除术(切除靠近神经组织的骨壁)，通过穿透皮肤的针穿刺技术(经皮椎间盘切除术)、椎间盘溶解方法(化学髓核溶解术)以及其它。对于患有机械性疼痛综合征、对保守疗法无效以及不能自理个人生活的患者，这些问题可通过脊柱融合术、椎间盘内电热凝结术(或瓣膜成形术)、后方动态固定、人工椎间盘技术或采用各种基于分子的治疗(如采用蛋白质、肽、基因治疗或核酸)所产生(deliver)的静态试验性椎间盘再生治疗来处理。虽然已有描述多数方法用于治疗软骨问题，但是清楚的是许多是基于人工的或机械的方法，不能寻求使正常的软骨组织生物学得到修养。因此，需要寻求能刺激软骨形成的方法。
因此，需要组合物和方法在骨发育、障碍或骨创伤时诱导骨形成。
因此，需要组合物和方法诱导软骨形成和再生。
发明概述
本发明涉及用于表达和纯化NELL1和NELL2蛋白质的方法。这些方法包括：
提供一核酸构成物，该核酸构成物在其框架中包含至少一编码至少一NELL肽的核酸及一编码一分泌信号肽的核酸；
用所述核酸构成物转染哺乳动物细胞；和
在适合表达所述NELL肽的条件下培养所述哺乳动物细胞。
在一些实施例，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。所述方法可进一步包括收集从所述细胞系分泌的NELL肽；和基本上纯化所述NELL肽。在一些实施例，所述方法可进一步包括测试所述NELL肽诱导骨形成的活性。
通过这里所描述的表达系统所产生的所述NELL蛋白可单独使用或与其它药剂一起用于骨或软骨形成或再生。在一些实施例，这里描述的所述NELL蛋白可被用于形成在任一期望的剂型中的组合物。一些关于NELL蛋白组合物和剂型的实例已在美国专利号11/392,294和PCT/US2006/005473中进行描述，它们的完整的内容在这里被整合并作为参考。在一些实施例，所述组合物或剂型可包括一载体，例如一可药用载体。在一些实施例，一底物可包括可在近似(proximity)移植中促进骨软骨、椎间盘或其它形式的组织修复的细胞和/或NELL1肽。
在一些实施例，本发明包括在多种临床应用中诱导骨原分化、成骨细胞矿化和/或骨形成的方法。本发明也包括在多种临床应用中诱导软骨形成分化和/或软骨形成矿化的方法。
在一些实施例，本发明可提供一较已知生长因子更强的作用和/或可增强其它生长因子活性的。因此，各种生长因子在临床应用中可采用更低剂量。这至少在临床治疗中更能负担得起这一点上时意义更重大的。而且本发明的优点至少在于，NELL1能增强骨原分化、成骨细胞矿化和骨形成，这可提高单独采用BMPs治疗的临床治愈率和有效性。本发明的优点也在于，NELL1能增强骨原分化和/或成骨细胞矿化，这可提高单独采用BMP治疗的临床治愈率和有效性。
一些实例关于NELL蛋白组合物和剂型已在美国专利号11/392,294和PCT/US2006/005473中进行描述，它们的完整的内容在这里被整合并作为参考。
附图简要说明
图1A-1B表示一制备NELL肽的方法的流程图。
图2A-2B例示一信号肽-NELL1-FLAG核酸构成物。下划线标注的氨基酸序列来源于蜂毒素信号肽。在丙氨酸和脯氨酸之间的键是一由High Five细胞分泌的假定的切割位点。来源于RTVLGFG的残基---是来源于大鼠/人NELL1蛋白的成熟蛋白质。
图3A-3D例示NELL1-FLAG胞外表达的产物。图3A是包含由在无血清培养基中的highfive细胞产生的纯化的NELL1肽(产率：ca.3mg/L培养基)的CBB-染色的UnoQ-洗脱物的SDS-PAGE凝胶；图3B是采用抗-FLAG抗体的Western印迹。图3C是包含由在无血清培养基中的COS7细胞产生的纯化的NELL1肽(产率：＜0.1mg/L培养基)的CBB-染色的UnoQ-洗脱物的SDS-PAGE凝胶。图3D是采用抗-FLAG抗体的Western印迹。
图4A-4C例示由CHO表达系统制备NELL1肽。图4A是描述在该实例中采用的cDNA构成物的核酸序列和三种不同信号肽的氨基酸序列。图4B是在采用抗c-myc琼脂糖的免疫沉淀作用后采用抗c-myc抗体检测从用不同构成物转染而分泌的NELL1的Western印迹。图4C是在采用兔抗-人Nell-1抗体-NHS活化的琼脂糖的免疫沉淀作用后采用抗c-myc或小鼠抗-人NELL1抗体检测分泌NELL1的Western印迹。
发明详述
本发明涉及用于表达和纯化NELL1和NELL2蛋白的方法。所述方法包括：
提供一核酸构成物，该核酸构成物在其框架中包含至少一编码至少一NELL肽的核酸及一编码一分泌信号肽的核酸；
用所述核酸构成物转染哺乳动物细胞；和
在适合表达所述NELL肽的条件下培养所述哺乳动物细胞。
在一些实施例，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。所述方法可进一步包括收集从所述细胞系分泌的NELL肽；和基本上纯化所述NELL肽。在一些实施例，所述方法可进一步包括测试所述NELL肽诱导骨形成的活性。
通过这里所描述的表达系统所产生的所述NELL蛋白质可单独使用或与其它药剂一起用于骨或软骨形成或再生。在一些实施例，这里描述的所述NELL蛋白可被用于形成在任一期望的剂型中的组合物。在一些实施例，所述组合物或剂型可包括一载体，例如一可药用载体。在一些实施例，一底物可包括可在近似移植中促进骨软骨、椎间盘或其它形式的组织修复的细胞和/或NELL1肽。
在一些实施例，本发明包括在多种临床应用中诱导骨原分化、成骨细胞矿化和/或骨形成的方法。本发明也包括在多种临床应用中诱导软骨形成分化和/或软骨形成矿化的方法。
在一些实施例，本发明可提供一较已知生长因子更强的作用和/或可增强其它生长因子活性。因此，各种生长因子在临床应用中可采用更低剂量。这至少在临床治疗中更能负担得起这一点上时意义更重大的。而且本发明的优点至少在于，NELL1能增强骨原分化、成骨细胞矿化和骨形成，这可提高单独采用BMPs治疗的临床治愈率和有效性。本发明的优点也在于，NELL1能增强骨原分化和/或成骨细胞矿化，这可提高单独采用BMP治疗的临床治愈率和有效性。
一些实例关于NELL蛋白组合物和剂型已在美国专利号11/392,294和PCT/US2006/005473中进行描述，它们的完整的内容在这里被整合并作为参考。
定义
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此处可互相替换使用，指的是氨基酸残基聚合物。所述术语可适用于在其中一个或多个氨基酸残基是天然存在氨基酸以及天然存在氨基酸聚合物相对应的人工化学类似物的氨基酸聚合物。
术语“抗体”可包括修饰的或改变的抗体的各种形式，例如完整的免疫球蛋白、一包含仅轻链和重链可变区的Fv片段、一通过二硫键连接的Fv片段、一包含可变区和部分恒定区的Fab或(Fab)′2片段、一单链抗体等。一抗体可包括完整分子及其片段，例如Fab和F(ab′)2′，和/或可结合一抗原决定簇的单链抗体(例如scFv)。抗体可以是来源于动物(例如小鼠或大鼠)或人类或可以是嵌合体的或人化的。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体(“mAb′s”)，例如对由NELL1或NELL2蛋白编码的多肽特异的单克隆抗体。
术语“捕获剂”是指能特异结合其它分子形成结合复合物(例如抗体-抗原、凝集素-碳水化合物、核酸-核酸、生物素-抗生物素蛋白等)的分子。
术语“特异结合”可涉及一生物分子(例如蛋白质、核酸、抗体等)，指对在异种分子群体(例如蛋白质和其它生物分子)中生物分子的存在的有鉴定作用的结合反应。因此在给定的条件下(例如关于抗体的免疫测定条件或关于核酸的严格杂交条件)，所述特异的配体或抗体可结合其特定的“靶”分子，而与存在于所述样品中的其它分子无明显大量结合。
术语“核酸”或“寡核苷酸”是指以共价键连接在一起的至少两个核苷酸。本发明所述核酸可以是单链或双链，可包含磷酸二酯键，但在一些实例，可包括核酸类似物，所述核酸类似物可具有交替主链，包括例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺酸(omethylphophoroamidite)连接(linkages)，和/或核酸肽主链和连接。核酸类似物可具有正主链和/或非核糖主链。核酸也可包括一个或多个碳环糖。修饰所述磷酸核糖主链可促进增加额外部分(例如标记物)，或增加所述分子在生理环境中的例如稳定性和半衰期。
术语“特异杂交”可以是核酸分子优先地与特定核苷酸序列在严格条件下结合、双向(duplexing)或杂交，所述严格条件包括一探针可优先与其靶序列杂交，以及与其它序列以最小程度杂交的条件。
术语“NELL1 cDNA”如SEQ ID NO：1、3和5所示和“NELL2 cDNA”如SEQ ID NO：7、9、11和13所示。
NELL肽
NELL1是一具有810个aa(氨基酸)的肽，主要分布在骨中。在成人，NELL1在颅面骨高水平表达，在长骨中低水平表达。已检验了其在成骨细胞分化、骨形成和再生中的作用。NELL2是一具有816个aa的肽，分布在神经细胞和脑中。
人类NELL1基因在所述启动子区包括至少3个Cbfa1反应元件。Cbfa1特异结合在所述NELL1启动子中的那些反应元件。NELL1表达可受至少在发育期和成年期的前成骨细胞、成骨细胞和肥大软骨细胞中内源性地表达的该转录因子调控。锁骨颅骨发育不全是被认为至少部分地由Cbfa破裂(disruption)导致的发育的颅骨缺损。
NELL1肽是一可由所述NELL1基因或cDNA表达的蛋白质，包括SEQ ID NO：2、4和6所示的序列。所述NELL1肽可包括一保留诱导骨原细胞分化、成骨细胞分化或骨形成的能力的NELL1肽片段。NELL2肽是一可由所述NELL2基因或cDNA表达的蛋白质，包括SEQ IDNO：8、10、12和14所示的序列。所述NELL2肽可包括保留有与全部NELL2肽序列相似的活性的NELL2肽片段。
这里所使用的术语“衍生物”，是指由NELL肽、其结构同等物或其构象同等物衍生的任意化学的或生物学的化合物或材料。例如，所述衍生物可包括任意前药形式、PEGylated形式或能使所述NELL肽更稳定的或具有更亲骨性(osteophilicity)或亲脂性的NELL肽的任意其它形式。在一些实施例，所述衍生物可以是一连接有聚乙二醇(poly(ethylene glycol))的NELL肽、一多聚氨基酸、一具有C1-C20个碳的烃基短链或生物相容的聚合物。在一些实施例，术语“衍生物”可包括一NELL模拟肽。如这里所用的，术语“模拟”是指一在其主链中具有至少一非肽键的肽。肽键是在氨基酸分子的羧基与另一氨基酸分子的氨基之间形成的化学键。
在本领域已有详细记载模拟肽的合成方法。以下描述一关于合成肽包括模拟肽的基本操作的实施例：
在肽合成起始前，所述氨基酸的氨基末端用FMOC(9-氟氨基甲酸甲酯)或其他保护基团保护，并采用一固体载体例如Merrifield树脂(游离氨基)作为引发剂(initiator)。然后，执行步骤(1)至步骤(3)，并重复直到得到期望的肽：(1)采用碳二亚胺法使游离氨基与羧基末端反应，(2)提纯所述氨基酸序列，和(3)在温和的酸性条件下除去保护基团例如所述FMOC保护基团，得到游离氨基。然后所述肽从所述树脂断裂，得到独立的肽或模拟肽。
在一实施例，所述方法包括提供一编码NELL肽(例如NELL1或NELL2肽)且框架中具有编码分泌信号肽的核酸序列的核酸序列。在一实施例，所述分泌信号肽可以是一来源于分泌的蜜蜂蛋白质的分泌信号肽。例如，所述核酸序列可选自下列组包括，但不限于蜂毒素信号序列、果蝇(drosphila)免疫球蛋白结合蛋白质信号序列、马干扰素γ(eIFN-γ)信号肽、蛇磷脂酶A2抑制剂信号肽、人类和/或小鸡溶菌酶信号肽。对于哺乳动物表达系统，也可采用胰蛋白酶原前导序列。
在一实施例，所述方法可包括用一编码NELL肽的核酸构成物转染昆虫细胞系；以及在允许表达和/或分泌所述NELL肽的条件下培养所述昆虫细胞系。例如，所述细胞系可用编码NELL肽的所述核酸构成物瞬时转染或稳定地转染。
NELL肽表达系统
NELL肽可在任意的生物系统表达。例如NELL肽可在细菌系统、酵母系统、植物系统或动物系统表达。
在一些实施例，NELL肽可在本领域技术人员所熟知的无细胞表达系统表达。例如，E coli无细胞蛋白质翻译系统或小麦胚无细胞蛋白质翻译系统。
在一些实施例，NELL肽可在来源于烟草、玉米、稻谷或大豆的转基因植物细胞系统表达。
所述表达系统可包括一载体例如病毒载体或病毒载体、肽载体或一短聚合物分子。
在一些实施例，NELL肽可在昆虫细胞表达。在昆虫系统表达的所述NELL1和NELL2肽是所述蛋白质的功能形式。
COS7细胞可被用于在低水平制备NELL1或NELL2蛋白，例如约10微克每升培养基，但所述表达需要包含血清的培养基。关于所述信号肽，NELL1和NELL2内源性信号肽允许在COS7细胞表达。
在一实施例，本发明包括一采用昆虫细胞系表达功能NELL肽(例如NELL1或NELL2肽)的方法。在一实施例，所述昆虫细胞可以是high five细胞、Sf9和其它Sf细胞。
在一实施例，所述方法可包括提供一编码NELL肽(例如NELL1或NELL2肽)的核酸序列。所述核酸序列可以是编码至少一NELL肽的功能部分的cDNA或基因组DNA。例如，所述核酸序列可以选自下列组包括但不限于人类NELL1(SEQ ID NO：1)、大鼠NELL1(SEQ IDNO：3)、小鼠NELL1(SEQ ID NO：5)、或人类NELL2(SEQ ID NO：7)、大鼠NELL2(SEQ IDNO：9)、小鼠NELL2(SEQ ID NO：11)、小鸡NELL2(SEQ ID NO：13)。所述核酸序列也可包括序列例如具有基本上序列相似性的序列，例如具有与以上所列序列的任意部分至少约75％序列相似性的序列。
所述核酸可进一步包括表达所述编码NELL肽例如NELL1或NELL2肽的核酸序列的表达载体。例如，所述表达载体可以是pIZT/V5-His(Invitrogen)，以及选择性标记也可包括杀稻瘟素(blastcidin)和新霉素。
进一步，所述核酸序列也可包括编码报告产物以监测基因表达水平的另外的核酸，或采用本领域所熟知的方法编码可视的肽标签以监测肽表达水平的另外的核酸。为了不干扰所述核酸的表达或所述表达的肽产物的功能性，也可选择另外的序列。
在一实施例，本发明可包括用于在昆虫细胞表达NELL肽(例如NELL1和/或NELL2肽)的核酸构成物。所述核酸序列可以是编码至少一NELL肽功能部分的cDNA或基因组DNA。例如，所述核酸序列可选自下列组包括但不限于人类NELL1(SEQ ID NO：1)、大鼠NELL1(SEQID NO：3)、小鼠NELL1(SEQ ID NO：5)、或人类NELL2(SEQ ID NO：7)、大鼠NELL2(SEQ IDNO：9)、小鼠NELL2(SEQ ID NO：11)、小鸡NELL2(SEQ ID NO：13)。所述核酸序列也可包括序列例如那些具有基本上序列相似性的序列，例如具有与以上所列序列的任意部分至少约75％序列相似性的序列。
在一实施例，本发明可包括用于在哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))表达NELL肽(例如NELL1和/或NELL2肽)的核酸构成物。所述核酸序列可以是编码至少一NELL肽功能部分的cDNA或基因组DNA。例如，所述核酸序列可选自下列组包括但不限于人类NELL1(SEQ ID NO：1)、大鼠NELL1(SEQ ID NO：3)、小鼠NELL1(SEQ ID NO：5)、或人类NELL2(SEQ ID NO：7)、大鼠NELL2(SEQ ID NO：9)、小鼠NELL2(SEQ ID NO：11)、小鸡NELL2(SEQ ID NO：13)。所述核酸序列也可包括序列例如那些具有基本上序列相似性的序列，例如具有与以上所列序列的任意部分至少约75％序列相似性的序列。
在一些实施例，对于在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)制备NELL1和/或NELL2肽，所述适于NELL1和/或NELL2的表达系统可包括表达所述内源性信号肽的所述核酸或cDNA。在一些实施例，所述适于NELL1和/或NELL2的表达系统可包括表达NELL2信号肽的所述核酸或cDNA。在表达NELL1肽的系统掺入所述NELL2信号核酸或cDNA，可允许更有效地制备所述NELL1肽。
所述核酸构成物可包括一编码信号肽的核酸序列。所述核酸可包括用于表达所述编码NELL肽的核酸序列的表达载体。所述核酸序列还可包括编码报告产物以监测基因表达水平的另外的核酸，或采用本领域所熟知的方法编码可视的肽标签以监测肽表达水平的另外的核酸。
核酸构成物可包括表达和克隆载体，所述载体应包括一选择基因，又称可选标记，例如编码对用所述载体转化的宿主细胞的存活或生长必需的蛋白质的基因。该基因的存在确保了任意的缺失所述载体的宿主细胞将在生长或繁殖上得不到转化宿主所得到的优势。典型的选择基因编码蛋白质，所述蛋白质为(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)抗性的蛋白质(b)补体营养缺陷型缺陷的蛋白质(complement auxotrophicdeficiencies)。
核酸构成物也可包括由宿主机体识别的可操作连接所述编码NELL的核酸的启动子。启动子是定位于结构基因(通常在约100至1000bp内)的起始密码子上游区的未转译序列，包括诱导型启动子和组成型启动子，在它们的控制下控制核酸的转录和翻译。诱导型启动子是在适应一些培养条件的改变(例如存在或缺失营养素或温度改变)时，在它们的控制下开始增强水平的DNA转录的启动子。目前，已知大量的启动子被多种潜在的宿主细胞识别。
当核酸被放置在与另一个核酸序列有功能关系时，它可被操作连接。例如，编码前序列或分泌引导物的DNA可被操作连接编码一多肽的DNA，如果它被表达作为一参与分泌所述多肽的前蛋白；启动子或增强子可被操作连接一编码序列，如果它影响所述序列的转录；或以一核糖体结合位点可被操作连接一编码序列，如果它处于能促进翻译的位置。
在一实施例中，本发明可包括表达功能性NELL肽的细胞。例如所述细胞可以是CHO细胞。在一实施例，所述细胞可以是用编码NELL肽的核酸构成物转染的细胞。例如所述细胞系可被所述编码NELL肽的核酸构成物瞬时转染或稳定转染。在一实施例，NELL表达核酸(例如cDNA(s))可被克隆如基因表达载体或对转染细胞(例如昆虫细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))感受态的病毒颗粒中。
所述核酸序列也可包括编码NELL肽(例如NELL1或NELL2肽)的核酸序列，在其框架中具有一编码昆虫分泌信号肽的核酸序列。
在一实施例，本发明可包括表达功能性NELL肽并可分泌功能性蛋白质的细胞。
在一实施例，本发明可包括一包含NELL肽(例如NELL1或NELL2肽)的多肽(氨基酸序列)，并可包括分泌信号肽。
例如，所述NELL肽的氨基酸序列可选自下列组包括但不限于人类NELL1(SEQ IDNO：2)、大鼠NELL1(SEQ ID NO：4)、小鼠NELL1(SEQ ID NO：6)、或人类NELL2(SEQ IDNO：8)、大鼠NELL2(SEQ ID NO：10)、小鼠NELL2(SEQ ID NO：12)、小鸡NELL2(SEQ ID NO：14)。所述氨基酸序列也可包括序列例如具有基本上序列相似性的序列，例如具有与以上所列序列的任意部分至少约75％序列相似性的序列，或包含与NELL1肽相似的活性结合区域。
肽的纯化
在一些实施例，本发明包括根据标准肽纯化方法提纯在培养基分泌的NELL1和/或NELL2肽的方法，包括但不限于下述的那些方法。
所述方法也可包括收集分泌的NELL肽和/或纯化NELL肽以利用。可用多种功能性或表达测定法来测试肽产物的活性。例如在任意测定法中，如果NELL肽对一给定参数的影响显著高于控制物质，所述NELL肽可被认为对影响所述测量的参数是起作用的。
在一实施例，可以检测是否选择的细胞表达选择的核酸序列以表达和/或分泌NELL肽。在一实施例，可检测NELL肽的存在、含量或和/或活性。
在一实施例，采用任意多种本领域技术人员已熟知的方法检测和定量NELL肽。这些方法可包括生化分析方法，例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、快速扩散色谱等，或各种免疫方法，例如液体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISAs)、免疫荧光测定法、western印迹等。
在一实施例，western印迹(免疫印迹)分析可被用于检测和定量在一选择样品中NELL肽的存在。该技术可包括用基于分子量的凝胶电泳分离样品蛋白质，将所述分离的蛋白质转移到一合适的固体载体(例如硝化纤维素滤膜、尼龙过滤器或衍生的尼龙过滤器)，并将所述样品与所述特异结合靶肽的抗体一起孵化。
本发明所述的测定法科根据本领域技术人员熟知的标准方法评分(像阳性或阴性或靶多肽的量)。评分的具体方法取决于测定的形式和标记的选择。例如，Western印迹试验可通过观察酶标记产生的有色产物来评分。在正确分子量位置上，存在清晰可见的有色带或斑点可被评分为阳性结果，而缺失清晰可见的斑点或带可被评分为阴性结果。所述带或斑点的强度可提供靶多肽浓度的定量测定。
实施例
制备并纯化重组蛋白质的方法已为本领域技术人员所熟知，且已有一些商业公司提供制备蛋白质服务。下列实施例是用于举例说明，但不限制保护本发明。大体上表达宿主可以是：细菌、酵母和真菌、哺乳动物细胞、植物、转基因动物(例如山羊奶)或它也可以是无细胞表达系统(例如那些基于小麦胚或E.coli提取物的表达系统)。一般而言，表达元件可以是原核的、酵母、哺乳动物的和植物启动子或病毒启动子。蛋白表达策略可以是：细胞内的或细胞外的、融合蛋白及显示策略(display strategies)。重组蛋白质的后处理可包括：采集、溶胞、过滤、超滤、沉淀和/或其他包括蛋白质捕获、纯化、精细纯化和优化的蛋白质处理/纯化方法。
实施例1.NELL肽的表达
将cDNA片段连接到所述表达载体PiZT/V5-His(3.4kb)(EcoRV位点，Invitrogen)，并包括一蜂毒素信号肽、所述成熟大鼠NELL1的BamHI-EcoRI cDNA片段和FLAG标记序列。图2A-2B描述了本发明所用的所述cDNA构成物的核酸序列，以及相应的预期的肽序列。
所述High five细胞(BTI-TN-5B1-4)适应于无血清培养基，用所述NELL1肽表达载体转染细胞。用zeocin处理细胞以选择仅表达所述NELL1FLAG构成物的细胞群。存活的细胞群被证实是稳定的转化体。收集细胞外培养基，并测试NELL1肽的存在。纯化NELL1肽并用于下述功能性测定。
图2A显示为包含纯化的NELL1肽的CBB-染色的UnoQ-洗脱物的SDS-PAGE凝胶。如这里所述将所述培养基加样到UnoQ柱(Bio-Rad)上。图2B显示采用抗-FLAG抗体的Western印迹，所述Western印迹描述参照蛋白质梯度的NELL1-FLAG表达。肽：140kDa(细胞内前体)、130kDa(成熟形式；90kDa肽)、400kDa(分泌形式、同型三聚体)。在上述实施例中，所述表达系统的产率为约3mg NELL1肽/L培养基。
相对于其它根本不表达或不分泌肽的表达系统(例如细菌表达，包括酵母)或肽的产率极低的表达系统(例如E.coli融合肽系统、CHO-dhfr细胞，＞10mcg/L)，所述系统(哺乳动物和昆虫细胞)的产率在生产大量功能蛋白质上是惊人的及实质上更为有效的。
重组大鼠NELL1蛋白的表达和纯化。为了用昆虫细胞生产所述C-末端FLAG标记的NELL1肽，通过将所述与一来源于所述pTB701-NELL1-FLC质粒(Kuroda，BBRC)的FLAG表位序列融合的大鼠NELL1 cDNA插入到昆虫表达载体pIZT/V5-His(Invitrogen)中，构建一pIZT-NELL1-FLC质粒。此外，采用PCR方法将NELL来源的分泌信号序列替换为蜜蜂蜂毒素信号序列。High Five细胞是从Invitrogen购买，并在High Five无血清培养基(Invitrogen)中培养。用所述pIZT-NELL1-FLC质粒经FuGene6(Roche)转染入High Five细胞。在转染后48小时，用400mg/ml Zeocin(Invitrogen)选择细胞。每3至4天更换选择培养基，直到建立稳定表达细胞系。采用免疫沉淀法和Western印迹分析证实NELL1分泌。发现High five细胞在所述培养基中表达NELL1肽(140-kDa)。
通过采用UNO Q-1柱(Bio-Rad)的阴离子交换层析从Zeocin-抗性High Five细胞的培养基中提纯所述重组大鼠NELL1-FLC肽。NELL1-FLC肽用500mM NaCl洗脱。
为了用COS7细胞生产所述C-末端FLAG-标记的NELL1肽，通过将所述来源于pTB701-NELL1-FLC质粒的与一FLAG表位序列连接的大鼠NELL1 cDNA，插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)，从而构建pcDNA3.1-NELL 1-FLC质粒。采用电穿孔方法，以及通过采用内源性NELL信号肽质粒将所述pcDNA3.1-NELL 1-FLC转染COS7细胞。在转染48小时后，培养基接受免疫沉淀法和Western印迹分析来检测NELL1肽。
图3C显示为包含NELL1-FLAG的CBB-染色的UnoQ-洗脱物的SDS-PAGE凝胶。这些表达研究显示COS细胞不表达功能性NELL肽，不修饰NELL的N末端(例如包括信号序列)以增加分泌效率。图3D显示描述NELL1-FLAG表达的采用抗-FLAG抗体的Western印迹。
重组大鼠NELL2蛋白的表达和纯化。为了用昆虫细胞生产所述C-末端FLAG-标记的NELL2肽，通过将所述来源于pTB701-NELL2-FLC质粒的与一FLAG表位序列融合的大鼠NELL2 cDNA，插入昆虫表达载体pIZT/V5-His(Invitrogen)，从而构建pIZT-NELL1-FLC质粒。High Five细胞购自Invitrogen，并在High Five无血清培养基(Invitrogen)中培养。通过将pIZT-NELL1-FLC质粒经FuGene6(Roche)转染入High Five细胞。转染后48小时，细胞用400mg/ml的Zeocin(Invitrogen)进行选择。每3-4天更换选择性培养基，直到建立稳定表达的细胞系。采用免疫沉淀和Western印迹分析证实在培养基中的NELL2表达。发现High five细胞在所述培养基中表达NELL2肽(140-kDa)。
通过采用UNO Q-1柱(Bio-Rad)的阴离子交换层析从Zeocin-抗性High Five细胞的培养基中提纯所述重组大鼠NELL2-FLC肽。NELL2-FLC肽用500mM NaCl洗脱。
实施例2.在哺乳动物系统中NELL1的表达
在本发明中为了通过非-病毒DNA生产而制备rhNELL1而采用的哺乳动物表达系统包括，但不限于这些列于表1中的常用的稳定的悬浮系统。相对详细的方案包括载体设计、宿主细胞系培养、转染和选择稳定的细胞系以及纯化在HEK293和CHO系统中的rhNELL-1，并将在下面进行描述，但是是为本领域技术人员所熟知的。
表1.生产rhNELL-1的哺乳动物表达系统
DHFR：二氢叶酸还原酶(diydrofolate reductase)；MTX：甲氨蝶呤(methotrxate)；GS：谷氨酰胺合成酶 MSX：甲硫氨酸砜亚胺
A.CHO系统#1
载体设计：将cDNA片段连接入所述表达载体p3XFlag-CMV(Sigma)。得到的表达构成物，pCMV-rhNell-1-3Xflag，包括前胰蛋白酶原前导序列、成熟人类NELL1编码区的cDNA片段以及在c-末端的3X标记(3Xflag)序列。
宿主细胞系：CHO-K1是粘附细胞系，可适于在无血清培养基中悬浮培养。构成物pCMV-rhNell-1-3Xflag可用lipofectamin(Invitrogen)或磷酸钙处理而被转染。通过向所述细胞培养基中加入G418(400-600ug/ml)维持约2周来选择稳定细胞系。通过有限稀释进一步筛选稳定转化细胞，用于具有高产率生产rhNELL1的单克隆(single clones)。所述被选择的稳定细胞系可用于生产rhNell-1的实验室或工业放大生物反应器。
纯化操作：包含培养基的rhNELL1肽或细胞溶解产物在其天然的条件下通过抗-flag抗体M2(Sigma)亲和层析柱纯化，并用3Xflag肽洗脱。
B.CHO系统#2
载体设计：图4A描述所述cDNA构成物核酸序列以及被用于所述构成物的三种不同信号肽的氨基酸序列。
宿主细胞系：所述CHO-K1是粘附细胞系，可适于在无血清培养基中悬浮培养。构成物pcDNA3.1-hNELL1-c-myc/His、pIL2-hNELL1-c-myc/His或pN2-hNELL1-c-myc/His可用lipofectamin(Invitrogen)或磷酸钙处理而被转染。通过向所述细胞培养基中加入G418(400-600ug/ml)维持约2周来选择稳定细胞系。通过有限稀释进一步筛选稳定转化细胞，用于具有高产率生产rhNELL1的单克隆。所述被选择的稳定细胞系可用于生产rhNELL1的实验室或工业放大生物反应器。
纯化操作：包含培养基或细胞溶解产物的rhNELL1肽通过采用抗-c-myc琼脂糖的免疫沉淀法进行纯化。图4B是采用抗-c-myc抗体的Western印迹检测采用抗-c-myc琼脂糖的免疫沉淀后的不同构成物转染细胞分泌的NELL1。图4C是采用抗-c-myc或小鼠抗人类NELL1抗体的Western印迹检测采用兔抗人类NELL-1抗体-NHS活化的琼脂糖的免疫沉淀后的分泌的NELL1。
C.CHO系统#3
载体设计：构建采用NELL1后NELL2前导肽序列的所有cDNA构成物(来源于AragnenBiosciences、Lonza或Cytovance)。
宿主细胞系：所述CHO细胞系是粘附细胞系，可适于在无血清培养基中悬浮培养。所述所有构成物被转染。通过向所述细胞培养基中加入合适的因素维持约2周来选择所述稳定细胞系。通过有限稀释进一步筛选稳定转化细胞，用于具有高产率生产rhNELL1的单克隆。所述被选择的稳定细胞系可用于生产rhNELL1的实验室或工业放大生物反应器。
纯化操作：包含培养基或细胞溶解产物的rhNELL1肽通过本领域技术人员所熟知的分析的或预备的蛋白质纯化方法(例如大小排阻层析、离子交换层析、亲和层析、免疫亲和层析、高效液相色谱)进行提纯。
浓缩操作：rhNELL1采用冻干法或超滤法进行浓缩。
D：HEK293系统
载体设计：cDNA片段被连接入所述表达载体pSecTagA(Invitrogen)。得到的表达构成物，pSec-hNell-1-Tag，包括鼠免疫球蛋白K-链前导序列、成熟人类NELL1编码区的cDNA片段以及在c-末端双标签(tag)的Myc和His序列。
宿主细胞系：所述NELL1肽表达载体将pSec-hNell-1-Tag转染入适于无血清培养基并以悬浮形式生长的人胚肾细胞系(HEK-293)。细胞瞬时转染后培养几天，收集条件培养基用于纯化rhNell-1，或者细胞用Zeocin(250ug/ml)处理以选择稳定表达细胞系。通过有限稀释进一步筛选稳定转化细胞，用于具有高产率生产rhNell-1的单克隆(single clones)。所述被选择的稳定细胞系可用于生产rhNell-1的实验室或工业放大生物反应器。
纯化操作：包含培养基的rhNell-1肽在其天然的条件下通过Ni2+亲和层析柱纯化，并用1M咪唑洗脱。在4℃广泛透析20小时除去至少1000体积PBS(Ph7.4)后，检测所述rhNell-1的完整性、纯度和生物活性。
此外，为了用一个新的序列例如大鼠血清白蛋白、CD33、tPA和人白介素-2(interlukin-2)前导序列替换存在的前导序列，或向所述主链序列加入基因扩增靶标(例如DHFR或GS)，对亲代载体的修饰将会导致产生新的表达载体和系统。在本发明中，所述天然的人Nell-1信号肽不能足够有效地引导所述蛋白质分泌，有时甚至所述外前导序列也不能很好地起作用。因此，也需要在框架中具有通过包含内蛋白质(intraprotein)His标签和溶蛋白性裂解位点如″MPHHHHHHGGGDDDDKDPM″的间隔物将小的天然分泌蛋白质(例如人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))融合的表达载体构成物。所述用于纯化Nell-1的抗原标签(epitope tags)可以是下列中之一：6Xhistidines、3Xflag、Myc、GST(谷光苷肽S-转移酶)、EGFP或CTHS(代表小泛肽修饰蛋白质的SUMO的一半的C-末端)等，但也可以是同表1所列举的质粒pSecTag(supra)一样的双His加Myc。
此外，采用IRES的双顺反子或多顺反子载体可被构建用于在一定的环境下调控或诱导表达rhNell-1。为了获得长效的增殖和延迟的凋亡或适应于特定的需求(例如Tet(四环素)诱导系统和Flp-In特异位点整合体系)，宿主细胞的遗传修饰将被认为是为了促进rhNell-1的生产。
除了上述的生产rhNell-1的稳定表达系统之外，我们将不排除可能建立采用多-毫克纯化的质粒载体(pREP4)经阳离子聚合物PEI转染入HEK 293或BHK悬浮细胞的大范围瞬时转染(LST)方法，作为稳定系统备用的选择或补充。
实施例3.从培养基提纯NELL2蛋白质。
携带pIZT-FLC-NELL2的High Five细胞在无血清培养基(1L)中培养约3天。所述培养基在3000xg离心5分钟，收集所述上清液。加入PMSF得到最终浓度为1mM。加入饱和硫酸铵溶液(80％饱和度(v/v))，所述溶液在4度(degrees)保持1小时。所述溶液在15000xg离心30分钟，收集沉淀物。在4度将沉淀物溶解于50ml的20mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mmEDTA，并加样到在4度时在20mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA中平衡的(通过FPLC的1ml/min的速度(Amersham-Pharmacia))阴离子交换层析UnoQ柱(6ml，Bio-Rad)上。用所述相同的缓冲液充分冲洗柱子。
然后通过所述相同的具有0M至1.5M NaCl的缓冲液梯度洗脱所述结合的蛋白质。通过采用抗-Flag M2(Sigma)抗体的Western印迹鉴定所述NELL2-FLAG馏分。将阳性馏分收集入一试管中。在无缝纤维素管(Wako，cutoff MW 12000)中在4度透析最终产物过夜以除去1LPBS。所述产物在-70度储存。
虽然本发明的具体实施例已被陈列并进行描述，但是对本领域技术人员而言在不脱离本发明的情况下在它的更宽范围内进行的变化和修饰是明显的。因此，附加的权利要求书是将所有落入本发明的精神和范围内的所述变化和修饰包括入在它们的范围内。
序列表
Figure A20078004267100201
Figure A20078004267100211
Figure A20078004267100221
Figure A20078004267100231
Figure A20078004267100241
Figure A20078004267100251
Figure A20078004267100271
Figure A20078004267100281
Figure A20078004267100291
Figure A20078004267100301
Figure A20078004267100311
Figure A20078004267100321
Figure A20078004267100331
Figure A20078004267100351
Figure A20078004267100361
Figure A20078004267100371
Figure A20078004267100381
Figure A20078004267100391
Figure A20078004267100401
Figure A20078004267100411
Figure A20078004267100421
Figure A20078004267100441
Figure A20078004267100451
Figure A20078004267100471
Figure A20078004267100481
Figure A20078004267100491
Figure A20078004267100501
Figure A20078004267100511
Figure A20078004267100521
Figure A20078004267100551
Figure A20078004267100561

Claims (23)

1.在哺乳动物细胞中表达肽的方法，所述方法包括：
提供一核酸构成物，该核酸构成物在其框架中包含至少一编码至少一NELL肽的核酸及一编码一分泌信号肽的核酸；
用所述核酸构成物转染哺乳动物细胞；和
在适合表达所述NELL肽的条件下培养所述哺乳动物细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述分泌信号肽是NELL1或NELL2肽信号序列。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述核酸编码NELL1或NELL2，
其中NELL1选自下列组包括：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，
其中NELL2选自下列组包括：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。
5.如权利要求2所述的方法，进一步包括收集从所述细胞系分泌的NELL肽；和基本上纯化所述NELL肽。
6.如权利要求3所述的方法，进一步包括收集从所述细胞系分泌的NELL肽；和基本上纯化所述NELL肽。
7.如权利要求5所述的方法，进一步包括测试所述NELL肽诱导骨形成的活性。
8.如权利要求6所述的方法，进一步包括测试所述NELL肽诱导骨形成的活性。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括层析纯化。
10.如权利要求2所述的方法，其中所述纯化包括层析纯化。
11.一用于在哺乳动物细胞中表达一NELL肽的核酸构成物，所述核酸构成物在其框架中包含至少一编码至少一NELL肽的核酸及一编码一分泌信号肽的核酸。
12.如权利要求11所述的核酸，其中所述昆虫分泌信号肽是NELL1或NELL2肽信号序列。
13.如权利要求11所述的核酸，其中所述核酸编码NELL1或NELL2，
其中所述NELL1选自下列组包括：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，
其中NELL2选自下列组包括：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。
14.如权利要求11所述的核酸构成物，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
15.一用于表达一NELL肽的哺乳动物细胞系，所述细胞系包括一核酸构成物，所述核酸构成物在其框架中包含至少一编码至少一NELL肽的核酸及一编码一分泌信号肽的核酸。
16.如权利要求15所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞系包括CHO细胞。
17.如权利要求16所述的细胞，其中所述CHO细胞分泌NELL1或NELL2肽。
18.如权利要求16所述的细胞，其中所述分泌信号肽是NELL1或NELL2肽信号序列。
19.如权利要求16所述的细胞，其中所述核酸编码NELL或NELL2肽，
其中所述NELL1选自下列组包括：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6和
其中NELL2选自下列组包括：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14。
20.一重组肽包括一氨基酸序列，所述氨基酸序列选自下列组包括：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14，及其组合，
其中所述重组肽由根据权利要求16所述的细胞系生产。
21.如权利要求20所述的重组肽，进一步包括一NELL1或NELL2分泌肽。
22.用于诱导骨或软骨形成的组合物包括：
有效量的根据权利要求20所述的重组肽，和
一任选的载体。
23.一针对根据权利要求20所述的重组肽的抗体。
CNA2007800426712A 2006-11-17 2007-11-08 Nell肽表达系统 Pending CN101583716A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/601,529 US7691607B2 (en) 2004-02-09 2006-11-17 Expression system of NELL peptide
US11/601,529 2006-11-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101583716A true CN101583716A (zh) 2009-11-18

Family

ID=39402395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007800426712A Pending CN101583716A (zh) 2006-11-17 2007-11-08 Nell肽表达系统

Country Status (8)

Country Link
US (3) US7691607B2 (zh)
EP (1) EP2097526A4 (zh)
JP (1) JP2010509917A (zh)
KR (1) KR20090108005A (zh)
CN (1) CN101583716A (zh)
AU (1) AU2007319449A1 (zh)
CA (1) CA2669891A1 (zh)
WO (1) WO2008060941A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102659928A (zh) * 2010-09-17 2012-09-12 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN102659927A (zh) * 2010-09-17 2012-09-12 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN104059128A (zh) * 2010-09-17 2014-09-24 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7884066B2 (en) * 1999-10-05 2011-02-08 The Regents Of The University Of California NELL-1 enhanced bone mineralization
WO2009042859A1 (en) 2007-09-28 2009-04-02 Ut-Battelle, Llc Methods for promoting wound healing and muscle regeneration with the cell signaling protein nell 1
CA2735813A1 (en) * 2008-08-04 2010-02-11 Showa University Technique for heterotropic regeneration and control of tissues and organs by using nell-1
EP2350286B1 (en) * 2008-10-07 2016-07-20 The Regents of The University of California Recombinant nell protein production
EP2411406B1 (en) 2009-03-25 2017-03-01 The Regents of The University of California Isoform nell-1 peptide
WO2011022071A2 (en) * 2009-08-20 2011-02-24 The Regents Of The University Of California Cardiac compositions
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
CN101921315B (zh) * 2010-09-17 2012-10-31 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
EP3027235A1 (en) 2013-07-30 2016-06-08 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US10912864B2 (en) 2015-07-24 2021-02-09 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US10973953B1 (en) 2016-08-18 2021-04-13 Musculoskeletal Transplant Foundation Methods and compositions for preparing transplant tissue
US10752663B2 (en) 2016-08-29 2020-08-25 NellOne Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regenerating tissues
US11364323B2 (en) 2018-09-17 2022-06-21 Rejuvablast LLC Combination grafts for tissue repair or regeneration applications
AU2019204031A1 (en) 2019-05-31 2020-12-17 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006089023A2 (en) * 2005-02-16 2006-08-24 The Regents Of The University Of California Pharmaceutical compositions for treating or preventing bone conditions

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394370A (en) 1981-09-21 1983-07-19 Jefferies Steven R Bone graft material for osseous defects and method of making same
US4409332A (en) 1982-01-12 1983-10-11 Jefferies Steven R Collagen-enzyme conjugates that exhibit no inflammatory response and method for making the same
US5486359A (en) 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US5674844A (en) 1991-03-11 1997-10-07 Creative Biomolecules, Inc. Treatment to prevent loss of and/or increase bone mass in metabolic bone diseases
US5674725A (en) 1991-07-11 1997-10-07 British Technology Group Limited Implant materials having a phosphatase and an organophosphorus compound for in vivo mineralization of bone
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5452289A (en) * 1993-01-08 1995-09-19 Multi-Tech Systems, Inc. Computer-based multifunction personal communications system
US5385887A (en) 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
US5763416A (en) 1994-02-18 1998-06-09 The Regent Of The University Of Michigan Gene transfer into bone cells and tissues
US5942496A (en) 1994-02-18 1999-08-24 The Regent Of The University Of Michigan Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells
US6083690A (en) 1995-06-02 2000-07-04 Osteoscreen, Inc. Methods and compositions for identifying osteogenic agents
US6352972B1 (en) 1995-06-06 2002-03-05 Marcel E. Nimni Bone morphogenetic proteins and their use in bone growth
US6008208A (en) 1995-10-23 1999-12-28 Osteoscreen, Inc. Compositions and methods for treating bone deficit conditions
US6048964A (en) 1995-12-12 2000-04-11 Stryker Corporation Compositions and therapeutic methods using morphogenic proteins and stimulatory factors
US6200606B1 (en) 1996-01-16 2001-03-13 Depuy Orthopaedics, Inc. Isolation of precursor cells from hematopoietic and nonhematopoietic tissues and their use in vivo bone and cartilage regeneration
JP3646191B2 (ja) 1996-03-19 2005-05-11 大塚製薬株式会社 ヒト遺伝子
US6005088A (en) 1996-03-19 1999-12-21 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Human NPIK gene
US5831059A (en) * 1997-03-27 1998-11-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human COP9 developmental protein
US6077987A (en) * 1997-09-04 2000-06-20 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Genetic engineering of cells to enhance healing and tissue regeneration
US6462019B1 (en) 1998-07-10 2002-10-08 Osteoscreen, Inc. Inhibitors of proteasomal activity and production for stimulating bone growth
PT1129064E (pt) * 1998-11-12 2008-01-31 Invitrogen Corp Reagentes de transfecção
US6743613B2 (en) * 1999-04-23 2004-06-01 Human Genome Sciences, Inc. Lysyl-oxidase HOHEC84 polynucleotides
US7052856B2 (en) * 1999-10-05 2006-05-30 The Regents Of The University Of California NELL-1 enhanced bone mineralization
WO2004072100A2 (en) 2003-02-07 2004-08-26 The Regents Of The University Of California Nell peptide expression systems and bone formation activity of nell peptide
US7687462B2 (en) * 1999-10-05 2010-03-30 The Regents Of The University Of California Composition for promoting cartilage formation or repair comprising a nell gene product and method of treating cartilage-related conditions using such composition
AU2001280767A1 (en) * 2000-07-31 2002-02-13 Active Motif Peptide-mediated delivery of molecules into cells
KR100420798B1 (ko) * 2001-02-10 2004-03-02 (주)알에이싸이언스 펩타이드 벡터
US20030096414A1 (en) * 2001-03-27 2003-05-22 Invitrogen Corporation Culture medium for cell growth and transfection
US20030039968A1 (en) 2001-07-10 2003-02-27 Applera Corporation Isolated human secreted proteins, nucleic acid molecules encoding human secreted proteins, and uses thereof
CA2498751A1 (en) 2002-09-13 2004-03-25 The Regents Of The University Of California Nell-1 enhanced bone mineralization
US7514530B2 (en) * 2004-04-26 2009-04-07 Centre National De La Recherche Scientifique Peptide carrier for delivering siRNA into mammalian cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006089023A2 (en) * 2005-02-16 2006-08-24 The Regents Of The University Of California Pharmaceutical compositions for treating or preventing bone conditions

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102659928A (zh) * 2010-09-17 2012-09-12 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN102659927A (zh) * 2010-09-17 2012-09-12 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN102659927B (zh) * 2010-09-17 2014-02-05 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN102659928B (zh) * 2010-09-17 2014-02-05 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN104059128A (zh) * 2010-09-17 2014-09-24 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用
CN104059128B (zh) * 2010-09-17 2016-08-03 上海凯茂生物医药有限公司 一种人工合成的信号肽及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2097526A4 (en) 2010-11-03
AU2007319449A1 (en) 2008-05-22
US20100137218A1 (en) 2010-06-03
EP2097526A2 (en) 2009-09-09
KR20090108005A (ko) 2009-10-14
JP2010509917A (ja) 2010-04-02
US20120077742A1 (en) 2012-03-29
US20070128697A1 (en) 2007-06-07
US7691607B2 (en) 2010-04-06
US8053412B2 (en) 2011-11-08
CA2669891A1 (en) 2008-05-22
WO2008060941A2 (en) 2008-05-22
WO2008060941A3 (en) 2008-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101583716A (zh) Nell肽表达系统
US20190248851A1 (en) Recombinant nel-like (mell) protein production
US7807787B2 (en) NELL-1 peptide
KR100259827B1 (ko) 재조합 골형태 형성 단백질 헤테로다이머, 그 조성물 및 사용방법
Mason et al. Cartilage and bone regeneration using gene-enhanced tissue engineering.
US5284756A (en) Heterodimeric osteogenic factor
JP2713715B2 (ja) 新規骨誘導組成物
Han et al. Collagen‐targeted BMP3 fusion proteins arrayed on collagen matrices or porous ceramics impregnated with Type I collagen enhance osteogenesis in a rat cranial defect model
Jones Do we have the auxin receptor yet?
CN1088616A (zh) 大潜在转化生长因子-β复合物及其有用结构物的生产方法
US20040023322A1 (en) Method of producing non-recombinant BMP-2 and use thereof
Marden et al. Growth and differentiation factors: role in bone induction and potential application in craniofacial surgery
CN101787369A (zh) 优化的重组人骨形态发生蛋白-2的dna序列及其编码蛋白的制备和用途
Segat et al. Matrilins: structure, expression and function
Zhao et al. Expression of rhBMP-2 in Escherichia coli and its activity in inducing bone formation
Rzepski MATRIX EXPRESSION IN PASSAGED CHONDROCYTES IS REGULATED BY TROPOMYOSIN 3.1
Ceresoli Production of Human Recombinant Differentiation Factors in Transgenic Tobacco Plants
Zhou Investigation of Post-Translational Strategies to Enhance Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 Production in Mammalian Cell Culture Systems
Grässel et al. P120 DIFFERENTIAL EXPRESSION OF GROWTH AND ANGIOGENESIS FACTORS IN PATIENTSWITH ASEPTIC OSTEONECROSIS OF THE FEMORAL HEAD AND PATIENTSWITH HIP OSTEOARTHRITIS

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20091118