KR20090108005A - Ｎｅｌｌ 펩티드의 발현계 - Google Patents

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KR20090108005A
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슈니치 쿠로다
벤 우
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Abstract

NELL 펩티드를 제조하는 방법이 개시된다.
NELL 펩티드, 연골(cartilage), 형성(formation), 재생(regeneration), 조성물

Description

Ｎｅｌｌ 펩티드의 발현계{Expression System of Nell Peptide}
연방정부가 지원하는 연구개발에 의해 안출된 발명의 권리에 관한 진술
본 발명의 일부는 NIH/NIDR 인가번호 DE9400 및 CRC/NIH 인가번호 RR00865에 의해 지원되었다. 미합중국 정부는 본 발명의 일부 권리를 가질 수 있다.
관련출원에 대한 상호 참조
본 출원은 국제특허출원 PCT/US2004/003808(2004년 2월 9일 출원) 및 국제특허출원 PCT/US2006/005473(2006년 2월 16일 출원)의 미국 국내단계인 미국출원 US10/544,553(2005년 8월 5일)의 일부계속출원이다. 상기 국제특허출원들의 교시 내용은 전체가 참조로서 본 명세서에 도입되었다.
발명의 분야
본 발명은 대체로 NELL 펩티드 또는 관련 약제의 발현방법 및 정제방법에 관한 것이다.
발명의 배경
성장인자는 인비보(in vivo) 상태 또는 인비트로(in vitro) 상태에서 한정된 개체수의 세포의 성장 및 분화에 영향을 주는 물질(예, 펩티드)이다.
골형성은 장골(연골내 골형성) 및 편평골(막내(intramembranous) 골형성)의 성장 중에 일어난다. 또, 골형성은 골격의 일체화를 보존하기 위해 성체기(adult life)에서 연속적으로 발생하는 골재형성(bone remodeling) 중에 일어난다. 마지막으로, 골형성은 골절이나 외과적 상태와 같은 골손상의 발생시의 골치유 중에 일어난다. 개개의 골형성 기구가 장골 및 편평골의 발생학적 발육에 수반되는 것으로 생각되지만, 치유는 막내 골형성을 수반하는 것으로 생각된다.
양 골형성 기구에 의한 골형성은 성장인자에 의해 조절되는 골아세포의 활성에 관련된다. 골아세포는 골수간질세포(marrow stromal cells)(간충직 줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)라고도 함)의 풀(pool)로부터 유도된다. 이들 세포는 다양한 조직 내에 존재하고, 골수간질 내에 널리 퍼져있다. MSC는 다능성을 가지고, 골아세포, 연골세포, 섬유아세포, 근세포, 및 지방세포를 포함하는 다양한 유형의 세포로 분화될 수 있다. 성장인자는 각각 골형성에 영향을 주는 골형성세포의 증식, 분화 및 골아세포의 광질화에 영향을 주는 것으로 생각된다.
예를 들면 두개골유합증(craniosynostosis; CS) 환자의 골의 치료 및 클레프트 그라프팅(cleft grafting)시 자가골(autogenous bone)이 이용되어 왔다. 두개골유합증(두개골 봉합부의 조기 봉합증)은 3,000명의 유아 중 1명이 걸리므로 인간의 가장 일반적인 선천성 두개안면변형(congenital craniofacial deformity)의 하나이다. 두개골 조기봉합은 두개골 이형성(cranial dimorphism)을 유발하므로 외과적 교정을 요할 수 있다. 인간 두개골유합증의 두개골 조기봉합은 두개관 과성장(calvarial overgrowth) 및 골유합의 확실하게 구별될 수 있는 2가지 과정에 의해 발생할 수 있다. 최근, 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2; FGF2) 및 섬유아세포 성장인자 수용체 1(fibroblast growth factor receptor 1; FGFR1)은 CBFA1-매개의 경로(8)를 통해 두개골 조기봉합에 관계가 있는 것으로 보고 있다. CBFA1의 미센스변이(missense mutation)는 두개골 지연봉합을 나타내는 쇄골두개골 이형성증(cleidocranial dysplasia)에 관련이 있다.
자가골 이식술은 예를 들면 장골능(iliac crest) 또는 두개관(calvara)로부터 취한 자가골을 이용하여 실시되고 있다. 이들 도우너(donor) 부위는 통증, 보행곤란, 장골능 도우너 부위로 인한 대퇴부 지각장해, 및 감염을 포함하는 병적상태, 신경학적 결손, 및 두개관 이식을 이유로 한 혈종(hematomas)을 수반한다. 또, 도우너 부위는 체적이 한정되고, 수술시간 및 입원기간을 증대시키는 원인이 될 수 있다.
알로플래스틱 이식 물질(alloplastic grafting materials)도 사용되고, 성장인자는 동물모델에서 시험되었다. 예를 들면, bFGF는 골재생 및 골치유의 용도로 잠재성을 보이고 있다. 골형성 성장인자의 다른 패밀리는 골형태형성 단백질(bone morphogenic protein; BMP)로서 설명되었다. 특히, BMP-2 재조합 단백질은 하악골 합체증(mandibular continuity defects) 및 구개열장해(cleft palate defects)를 자가 미립자 골 및 골수와 동일하거나 우수하게 재생하는 것이 입증되었다. BMP 및 기타 골형성 인자는 임상에의 적용을 위한 용도가 연구되었다. 그러나, BMP의 최소의 유효량의 사용에 드는 비용이 임상에서의 사용을 제한하는 인자가 되어왔다.
척추고정술(spinal fusion)은 척주의 하나 이상의 추골을 합체하여 추골들 사이에 더 이상 운동이 발생하지 않도록 하는 수술기법이다. 적응증은 골절된 척추의 치료, 기형의 수정, 운동으로부터의 통증 제거, 불안정 치료, 및 경추추간판 헤르니아(servical disc herniation)를 포함한다. 수술은 척추들 사이가 견고하게 결합하도록 척추들 사이에 골이식편(bone graft)을 이식하는 것을 수반한다. 수술은 또 골이식편의 안정화 및 치료를 돕기 위한 플레이트, 나사, 케이지(cages), 및 최근의 골형태발생 단백질 2 및 7을 포함하는 보충요법을 수반할 수 있다. 자가골 이식술은 임상에서 선호하는 방법이지만 약 30-50%의 실패가 수반된다. 자가골 이식술은 또 심각한 병적상태를 수반한다.
연골은 일 유형의 치밀한 연결조직이다. 이것은 견고한 겔상의 기질 내에 분산된 연골세포로 구성되어 있다. 연골은 혈관이 없고(혈관이 포함되지 않음), 영양소는 기질을 통해 확산된다. 연골은 관절, 흉곽, 귀, 코, 기관 및 추간판들 사이에서 발견된다. 연골에는 3가지의 주요 타입이 있다. 즉, 하이얼린(hyaline) 연골(예, 늑연골, 코의 연골, 기관, 기관지, 관절의 관절 연골), 탄성(elastic) 연골(예, 외이, 이도, 유스타키관의 일부, 후두개, 및 후두부 연골의 일부), 및 섬유연골(예, 반월판(예, 수관절 삼각섬유연골 복합체, 슬반월판), 척추 디스크, 측두하악골 관절판, 치골결합부, 건(tendons) 및 인대의 뼈에 대한 연결부)이 있다. 연골의 주요 목적 중의 하나는 골침착(즉, 연골내 골화 중)이 개시되는 하부구조를 제공하는 것이다. 연골의 다른 중요한 목적은 관절골의 운동을 위한 원활한 표면을 제공하는 것이다. 예를 들면, 슬관절에서 가장 현저하게 발견되는 관절연골은 일반적으로 극저의 마찰, 고내마모성, 빈약한 재생특성을 특징으로 한다. 관절연 골은 슬관절의 내압축성 및 내하중 특성의 대부분을 부담하고, 관절연골이 없으면 보행이 불가능할 정도로 고통스럽다. 연골의 또 하나의 중요한 목적은 견고하면서도 유연한 지지체(예, 비연골, 척추원판, 기관연골, 슬반월판, 기관지 연골)를 제공하는 것이다. 예를 들면, 반월판과 같은 연골은 관절의 안정성, 윤활성, 힘의 전달 면에서 결정적인 역할을 한다. 체중의 부하 상태에서 반월판은 경골 상에 대퇴골의 균형 잡힌 위치를 유지하고, 표면의 접촉면적을 증대시킴으로써 압축력을 분산시키고, 그것에 의해 평균 응력을 2 내지 3배 감소시킨다. 또, 반월판은 관절액과 상호작용하여 얼음과 얼음 사이의 미끄러운 정도의 5배에 해당하는 마찰계수를 생성한다. 다른 예로서, 척추 디스크는 스페이서(spacer)의 기능, 충격흡수재의 기능, 및 운동체로서의 기능을 포함하여 많은 중요한 기능을 가진다. 이 척추 디스크의 젤라틴질의 중앙부분은 수핵(nucleus pulposus)이라고 불린다. 이것은 80-90%가 물로 구성되어 있다. 이 수핵의 고형 부분은 II형 콜라겐 및 비응집성 프로티오글리칸(non-aggregated proteoglycan)이다. 상기 수핵의 외측의 인대상 환은 섬유륜(annulus fibrosus)이라고 불린다. 이것은 수핵을 액밀상태로 밀봉하여 척추 디스크에 하중이 가해짐에 따라 척추 디스크 내압이 상승될 수 있게 한다. 섬유륜은 레이디얼 타이어의 플라이와 다르지 않은 중첩하는 레이디얼 밴드를 구비하고, 이것은 비틀림 응력이 정상 하중 하에서 파열을 발생시키지 않고 섬유륜을 통해 분산될 수 있게 한다. 척추 디스크는 유압실린더의 기능을 한다. 섬유륜은 수핵과 상호작용한다. 수핵이 압력을 받으면 섬유륜은 수핵의 팽창이나 헤르니아(hernia)를 방지하기 위한 격납기능(containment function)을 한다.
연골은 마모, 부상 또는 질병에 의해 손상될 수 있다. 노화됨에 따라, 체내 연골의 수분 및 단백질의 함량이 변화한다. 이 변화의 결과 연골은 더욱 취약해지고, 두께가 얇아진다. 골관절염은 운동범위의 제한, 골손상 및 고통을 수반하는 일반적 질환이다. 극도의 스트레스 및 만성피로가 결합되면, 골관절염은 직접 관절표면의 마모로서 나타나고, 극단적인 경우는 골이 관절에 노출될 수 있다. 다른 예로서, 보호를 위한 안정된 반월판이 손실되면 관절이완이 증대되거나 비정상 운동이 유발되어 관절의 불안정화로 이어진다. 과도한 운동 및 좁아진 접촉면적은 조기 관절염 변화를 촉진한다. 세포수준에서, 초기에 관절연골의 표층으로부터 세포의 손실이 있고, 그 후 연골분열이 뒤따르고, 이어서 비박화(thinning) 및 침식이 발생하고, 최종적으로 하층의 원골(raw bone)이 돌출한다. 종래 관절염 가장 빠른 변화는 전체 반월판의 손실 후 3주 후라고 지적되어 왔다. 또 다른 예로서, 적층되어 척추(면관절)를 형성하는 척추 디스크 및 관절의 양자는 일부가 연골로 구성되어 있고, 이 영역은 시간이 경과함에 따라 마모 및 파열하는 경향(퇴행성 변화)이 있다. 내부 수핵이 탈수됨에 따라, 척추 디스크 공간은 협착되고, 과도한 윤상인대(annular ligament)가 팽창한다. 진행성 세포핵 탈수증 하에서 윤상섬유(annular fibers)는 균열 및 파열될 수 있다. 정상 연조직 장력의 손실은 척수분절의 아탈구(sublux)(예, 관절의 부분적인 전위)를 유발할 수 있고, 골극형성(bone spurs), 포라멘 협착(foraminal narrowing), 역학적 불안정성, 및 통증으로 이어진다. 윤상섬유가 신장되거나 파열되면 압력을 받은 핵물질이 팽창 또는 헤르니아를 일으킬 수 있고, 신경조직을 가압하여 통증 및 쇠약화를 유발할 수 있 다. 이것은 핀치드 너브(pinched nerve), 척추 디스크탈출, 또는 척추 디스크 헤르니아라고 부르는 장해이다. 신경근장해는 척추골 사이의 척추 디스크 손상이 원인인 신경근자극이라고 부른다. 기계적 기능장해도 척추 디스크 퇴행 및 통증(예, 퇴행성 척추 디스크 질환)의 원인이 될 수 있다. 예를 들면, 척추 디스크는 척추 디스크를 통과하는 증대되는 힘에 견디기 위한 척추 디스크의 능력에 과부하가 걸릴 때의 외상과 같이 손상을 받을 수 있고, 윤상섬유의 내측 부분 또는 외측 부분이 파열될 수 있다. 이들 파열된 윤상섬유는 이것에 높은 응력이 가해졌을 때 염증반응을 위한 병소가 될 수 있고, 직접적인 통증 또는 심방척추근(deep paraspinal muslcles)의 보상성 보호발작(compensatory protective spasm)을 통한 통증의 원인이 될 수 있다.
연골 손상 또는 연골 쇠약에 적용할 수 있는 여러 가지 상이한 치료법이 존재한다. 골관절염은 미국의 고령자 인구의 신체장해의 두 번째 원인이다. 이것은 퇴행성 질환으로서 대체로 경미한 상태에서 출발하고, 시간이 경과되고 마모가 진행됨에 따라 단계적으로 악화된다. 경도 내지 중등도의 증상이 있는 환자를 위해, 이 질환은 수차례의 비수술적 치료로 대처할 수 있다. 고정구(braces) 및 항염증제(예, 디클로페낙(diclofenac), 이부프로펜(ibuprofen), 및 나프록센(naproxen)), COX-2 선택적 저해약, 하이드로코르티손, 글루코사민, 및 콘드로이틴 설페이트과 같은 약물요법을 사용하면 연골 결손증에 기인된 통증이 완화된다는 것이 밝혀졌고, 일부에서는 이것이 퇴행과정을 지연시킬 수 있다고 주장되고 있다.
관절전치환술(total joint replacement)을 제외한 대부분의 관절연골 외과적 치료법은 여러 가지 치료군으로 나눌 수 있다. 감염 및 통증을 중단시키기 위한 목적으로 병변 연골 및 손상된 연골을 제거하는 치료법은 쉐이빙(shaving)(연골절제술) 및 창면절제술(debridement)을 포함한다. 다른 치료군은 드릴링(drilling), 마이크로프랙쳐술(microfracture surgery), 연골형성술, 및 스펀지얼라이제이션(spongialization)과 같은 연골생성을 유발하기 위한 목적의 광범위한 연마치료법(abrasive procedures)으로 구성된다. 연마법, 드릴링법, 및 마이크로프랙쳐술은 20년 전에 시작되었다. 이들 치료법은 골의 연골하판의 혈관손상 후의 연골조직의 자연치유 현상에 의존한다. 레이저를 이용한 치료법은 현재는 실험적인 것으로서 다른 치료군을 구성한다. 이것은 병변 연골의 제거와 연골 재형성법을 결합하고, 또한 연골증식을 유발한다. 추가의 치료법은 연골자가이식법(예, 겐자임(Genzyme)에 의한 카티셀(Carticel))을 포함한다.
반월판 연골에 적용할 수 있는 다른 치료법은 외과적 조기 처치법 및 파열된 조직의 봉합치료법 또는 중증의 경우 동종 반월판 이식법(allograft meniscus transplantation)을 포함한다.
척추 디스크 헤르니아 및 좌골신경통을 가지고 있는 환자의 대다수가 수술 없이 치유되지만, 수술이 필요한 경우의 치료법은 추궁절개술(laminotomy; 척수를 둘러싸고 있는 척추골 내에 소공을 형성하는 수술), 피부를 통한 니이들(needle)법에 의한 추궁절제술(laminectomy; 신경조직에 인접한 골벽(bony wall)의 제거수술), 척추 디스크 용해법(화학적 수핵용해술(chemonucleolysis)), 및 기타 방법을 포함한다. 전통적인 치료에 대해 반응하지 않고 개인 생활에 장해가 있는 기계적 동 통증후군을 가지는 환자들의 문제는 척추고정술, 추간판내 전열응고법(또는 환상형성(annuloplasty)), 후부 동적 안정화법(posterior dynamic stabilization), 인공 척추 디스크 기술, 단백질, 펩티드, 유전자 치료법 또는 뉴클레오티드를 이용하여 수행되는 다양한 분자에 기초한 치료법을 이용한 아직은 실험적 치료법인 척추 디스크 재생요법으로 대처할 수 있다. 종래, 연골 질환의 치료를 위해 수많은 치료방법이 설명되어왔으나, 이것은 정상 연골조직생태의 재생을 추구하지 않는 공적이거나 기계적인 해결방법임이 분명하다. 따라서, 연골형성을 자극하기 위한 방법에 대한 요구가 존재한다.
따라서, 골의 성장, 골질환, 또는 골상해에서 골형성을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 대한 요구가 존재한다.
따라서, 연골형성 및 연골재생을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 NELL1 및 NELL2 단백질의 발현방법 및 정제방법에 관한 것으로서, 이 방법은:
분비 시그널 펩티드를 코드하는 핵산을 가지는 프레임 내의 적어도 하나의 NELL 펩티드를 코드하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 구축물을 제공하는 단계;
포유동물 세포를 상기 핵산 구축물에 의해 트랜스팩션하는 단계; 및
상기 NELL 펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부의 실시예에서, 상기 포유동물 세포는 차이니즈햄스터(Chinese hamster)의 난소세포이다. 이방법은 상기 세포주(cell line)로부터 분비되는 NELL 펩티드를 포집하는 단계; 및 상기 NELL 펩티드를 실질적으로 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부의 실시예에서, 상기 방법은 골형성을 유도하기 위한 NELL 펩티드의 활성을 시험하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 발현계(expression system)에 의해 생성되는 NELL 단백질은 단독으로 사용되거나 골 또는 연골의 생성 또는 재생을 위한 기타 약제와 함께 사용될 수 있다. 일부의 실시예에서, 본 명세서에 기재된 NELL 단백질은 모든 원하는 배합(formulation)의 조성물을 형성하는데 이용될 수 있다. NELL 단백질 조성물 및 배합의 일부의 예는 미국특허 US11/392,294, 및 국제특허출원 PCT/US2006/005473에 기재되어 있고, 이들 특허의 교시내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 도입되었다. 일부의 실시예에서, 상기 조성물 또는 배합은 캐리어(예를 들면, 약학적으로 허용가능한 캐리어)를 포함할 수 있다. 일부의 실시예에서, 기질(substrate)은 임플란트의 인접부에서의 골연골, 디스크, 또는 기타 형태의 조직 치유를 촉진할 수 있는 세포 및/또는 NELL1 펩티드를 포함할 수 있다.
일부의 실시예에서, 본 발명은 다양한 임상적 적용에서 골형성 분화, 골아세포 광질화 및/또는 골형성을 유도하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또 다양한 임상적 적용에서 연골형성 분화 및/또는 연골형성 광질화를 유도하는 방법을 포함한다.
일부의 실시예에서, 본 발명은 공지의 성장인자보다 큰 효과를 제공할 수 있고, 및/또는 다른 성장인자의 활성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 임상적 적용시 저용량의 성장인자가 사용될 수 있다. 이것은 적어도 임상치료의 가능성이 더욱 높다는 점에서 중요하다. 또, 본 발명은 적어도 NELL1이 골형성 분화, 골아세포 광질화 및 골형성을 향상시켜 BMP 단독에 비해 임상적 치료율 및 효율을 향상시킬 수 있다는 점에서 유리하다. 본 발명은 또 NELL1이 연골형성 분화 및/또는 연골형성 광질화를 향상시켜 BMP 단독에 비해 임상적 치료율 및 효율을 향상시킬 수 있다는 점에서 유리하다.
NELL 단백질 조성물 및 배합의 일부의 실시예는 미국특허 US11/392,294 및 국제특허출원 PCT/US2006/005473에 기재되어 있고, 이들 특허의 교시내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 도입되었다.
도 1A-1B는 NELL 펩티드의 하나의 제조방법의 흐름도를 도시한 것이다.
도 2A-2B는 시그널(signal) 펩티드-NELL1-FLAG 핵산 구축물을 도시한 것이다. 밑줄 친 아미노산 서열은 멜리틴(melittin) 시그널 펩티드로부터 유도된 것이다. 알라닌(Alanine) 및 프로린(Proline) 사이의 결합은 하이파이브(High Five) 세포에 의한 분비를 위한 추정상 절단부위(putative cleavage site)이다. RTVLGFG----의 잔기(residues)는 생쥐/인간 NELL1 단백질의 성숙 단백질로부터 유도된다.
도 3A-3D는 NELL1-FLAG의 세포외 발현산물을 도시한 것이다. 도 3A는 무혈 청 배지(생산성: 약 3mg/L배지) 내에서 하이파이브 세포로부터 생산된 정제 NELL1 펩티드를 함유하는 UnoQ-용출액(UnoQ-eluate)의 CBB 염색된 SDS-PAGE 겔이고; 도 3B는 항-FLAG 항체를 이용한 웨스턴블로팅(Western blotting)이다. 도 3C는 무혈청 배지(생산성: < 3mg/L배지) 내에서 COS7 세포로부터 생산된 정제 NELL1 펩티드를 함유하는 UnoQ-용출액의 CBB 염색된 SDS-PAGE 겔이다. 도 3D는 항-FLAG 항체를 이용한 웨스턴블로팅이다.
도 4A-4C는 CHO 발현계에 의한 NELL1 펩티드 생산을 도시한 것이다. 도 4A는 본 예에서 사용된 cDNA 구축물의 핵산 서열 및 3종의 상이한 시그널 펩티드의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 4B는 항-c-myc 아가로스(anti-c-myc agarose)를 이용한 면역침강(immunoprecipitation)후 상이한 구축물에 의한 트랜스팩션으로부터 NELL1의 분비를 검출하는 항-c-myc 항체를 가지는 웨스턴블롯(Western blot)이다. 도 4C는 토끼 항-인간 Nell-1 항체-NHS 활성화된 세파로스(sepharose)를 이용하는 면역침강 후 NELL1의 분비를 검출하는 항-c-myc 또는 마우스 항-인간 NELL1 항체를 가지는 웨스턴블롯이다.
본 발명은 NELL1 및 NELL2 단백질의 발현방법 및 정제방법에 관한 것이다. 이 방법은:
분비 시그널 펩티드(secretory signal peptide)를 코드하는 핵산을 가지는 프레임(frame) 내의 적어도 하나의 NELL 펩티드를 코드하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 구축물(nucleic acid construct)을 제공하는 단계;
포유동물 세포를 상기 핵산 구축물에 의해 트랜스팩션(transfecting)하는 단계; 및
상기 NELL 펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부의 실시예에서, 포유동물 세포는 차이니즈햄스터 난소세포이다. 상기 방법은 상기 세포주로부터 분비된 NELL 펩티드를 포집하는 단계; 및 상기 NELL 펩티드를 실질적으로 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부의 실시예에서, 상기 방법은 골형성을 유도하기 위한 상기 NELL 펩티드의 활성을 시험하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 발현계에 의해 생성되는 NELL 단백질은 단독으로 사용되거나 골 또는 연골의 생성 또는 재생을 위한 기타 약제와 함께 사용될 수 있다. 일부의 실시예에서, 본 명세서에 기재된 NELL 단백질은 모든 원하는 배합의 조성물을 형성하는데 이용될 수 있다. 일부의 실시예에서, 상기 조성물 또는 배합은 캐리어(예를 들면, 약학적으로 허용가능한 캐리어)를 포함할 수 있다. 일부의 실시예에서, 기질(substrate)은 임플란트의 인접부에서의 골연골, 디스크, 또는 기타 형태의 조직 치유를 촉진할 수 있는 세포 및/또는 NELL1 펩티드를 포함할 수 있다.
일부의 실시예에서, 본 발명은 다양한 임상적 적용에서 골형성 분화, 골아세포 광질화 및/또는 골형성을 유도하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또 다양한 임상적 적용에서 연골형성 분화 및/또는 연골형성 광질화를 유도하는 방법을 포함한다.
일부의 실시예에서, 본 발명은 공지의 성장인자보다 큰 효과를 제공할 수 있고, 및/또는 다른 성장인자의 활성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 임상적 적용시 저용량의 성장인자가 사용될 수 있다. 이것은 적어도 임상치료의 가능성이 더욱 높다는 점에서 중요하다. 또, 본 발명은 적어도 NELL1이 골형성 분화, 골아세포 광질화 및 골형성을 향상시켜 BMP 단독에 비해 임상적 치료율 및 효율을 향상시킬 수 있다는 점에서 유리하다. 본 발명은 또 NELL1이 연골형성 분화 및/또는 연골형성 광질화를 향상시켜 BMP 단독에 비해 임상적 치료율 및 효율을 향상시킬 수 있다는 점에서 유리하다.
NELL 단백질 조성물 및 배합의 일부의 실시예는 미국특허 US11/392,294 및 국제특허출원 PCT/US2006/005473에 기재되어 있고, 이들 특허의 교시내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 도입되었다.
정의
"폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기(residues)의 폴리머를 지칭하는 것으로서 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 천연발생 아미노산의 인공적 화학적 유사물인 아미노산 폴리머 뿐 아니라 천연발생 아미노산 폴리머에 적용할 수 있다.
"항체(antibody)"라는 용어는 인텍트 면역글로블린(intact immunoglobulin), 경쇄 가변영역(light chain variable region) 및 중쇄 가변영역(heavy chain variable region)만을 포함하는 Fv 프래그먼트(fragment), 디설파이드 결 합(disulfide bond)에 의해 연결된 Fv 프래그먼트, Fab 또는 가변영역 및 일부의 정상영역(constant region)을 포함하는 (Fab)'2 프래그먼트, 단쇄 항체 등과 같은 다양한 형태의 개질형(modified) 또는 개변형(altered) 항체를 포함할 수 있다. 항체는 인텍트 분자 및 Fab 및 F(ab')2', 및/또는 에피토픽 디터미넌트(epitopic determinant)를 결합할 수 있는 단쇄항체(예, scFv)와 같은 상기 분자의 프래그먼트를 포함할 수 있다. 항체는 동물(마우스 또는 생쥐) 또는 인간 기원으로 하거나, 키메라(chimeric) 또는 인간화될 수 있다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체(mAb)(예, NELL1 또는 NELL2 단백질에 의해 코드되는 폴리펩티드에 대해 특이성을 가지는 모노클로날 항체)일 수 있다.
"포착제(capture agent)"는 다른 분자들과 특이적으로 결합하여 항체-항원, 렉틴-카보하이드레이트(lectin-carbohydrate), 핵산-핵산, 바이오틴(biotin)-아비딘(avidin) 등과 같은 결합복합체를 형성하는 분자를 의미할 수 있다.
"특이적 결합(specifically binds)"이라는 용어는 생체분자(예, 단백질, 핵산, 항체, 등)를 의미할 수 있고, 분자(예, 단백질 밀 기타 생물제제(biologics))의 불균일 집단 내의 존재하는 생체분자를 결정하는 결합반응을 의미할 수 있다. 따라서, 지정된 조건(예, 항체의 경우, 면역학적 측정조건 또는 핵산의 경우, 스트린전트 하이브리다이제이션(stringent hybridization) 조건) 하에서, 특정 리간드 또는 항체는 특정의 "표적" 분자에 결합할 수 있고, 샘플 내에 존재하는 다른 분자에는 상당 양이 결합하지 못할 수 있다.
"핵산(nucleic acid)" 또는 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 상호 공유결합하고 있는 적어도 2개의 뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 본 발명의 핵산은 단일사슬 또는 이중사슬일 수 있고, 인산디에스테르 결합(phosphodiester bonds)를 포함할 수 있다. 그러나 경우에 따라, 핵산 유사체는 예를 들면, 포스포아미드(phosphoramide), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 오메틸포스포로아미다이트(omethylphosphoroamidite) 결합 및/또는 펩티드 핵산 백본(backbone) 및 결합을 포함하는 대체 백본(alternate backbone)을 포함하는 것에 포함될 수 있다. 유사 핵산은 포지티브 백본 및/또는 넌-리보스(non-ribose) 백본을 가질 수 있다. 핵산은 또 하나 이상의 탄소환 당(carbocyclic sugars)도 포함할 수 있다. 상기 리보스-포스페이트 백본의 개질은 표식(labels)과 같은 추가 부분의 추가를 촉진하기 위해 행해지거나 예를 들면 생리학 환경 내에서 상기 분자들의 안정성 및 반감기를 증대시키기 위해 행해질 수 있다.
"특이적 하이브리다이제이션(specific hybridization)"은 프로브(probe)가 그 표적 서열에 우선적으로 하이브리다이즈되고, 기타 서열에는 작은 범위로 하이브리다이즈될 수 있는 조건을 포함하는 스트린전트 조건 하에서 핵산 분자의 특정 뉴클레오티드 서열에 대한 우선적인 결합, 듀플렉싱(duplexing), 또는 하이브리다이징을 의미할 수 있다.
"NELL1 cDNA"는 서열번호:1, 3 및 5를 나타내고, "NELL2 cDNA"는 서열번호:7, 9, 11 및 13을 나타낸다.
NELL 펩티드
NELL1은 골내에 주로 분산되어 있는 810 aa (아미노산) 펩티드이다. 성인에서 NELL1은 두개안면골(craniofacial bone)에서 고수준으로 발현되고, 장골(long bone) 내에서 저수순으로 발현된다. NELL1의 골아세포 분화, 골형성 및 골재생에서의 역할이 조사되었다. NELL2는 신경세포 및 뇌에 분포되는 816 aa 펩티드이다.
인간 NELL1 유전자는 프로모터 영역(promoter region) 내에 적어도 3개의 Cbfa1 응답요소(response elements)를 포함한다. Cbfa1은 NELL1 프로모터 내에서 이들 응답요소에 특이적으로 결합한다. NELL1 발현은 성장 중 및 성체상태의 적어도 전골아세포(preosteoblasts), 골아세포 및 비대연골세포(hypertrophic chondrocytes) 내에서 내인성 발현되는 전사인자(transcription factors)의 제어 하에서 이루어질 수 있다. 쇄골두개 디스오스토시스(cleidocranial disostosis)는 적어도 부분적으로 Cbfa 혼란(disrupton)에 의해 유발되는 것으로 생각되는 두개골 발육장해(developmental cranial defect)이다.
NELL1 펩티드는 NELL1 유전자 또는 cDNA에 의해 발현될 수 있는 단백질로서, 서열번호: 2, 4 및 6을 포함한다. 상기 NELL1 펩티드는 골형성세포 분화, 골아세포 분화 또는 골형성의 유발능력을 지속시키는 NELL1 펩티드 프래그먼트를 포함할 수 있다. NELL2 펩티드는 NELL2 유전자 또는 cDNA에 의해 발현될 수 있는 단백질로서, 서열번호: 8, 10, 12 및 14를 포함한다. 이 NELL2 펩티드는 NELL2 펩티드 전체 서열과 유사한 활성을 지속시키는 NELL2 펩티드 프래그먼트를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "유도체"라는 용어는 NELL 펩티드, 그 구조적 등가체, 또는 그 입체배좌(conformational) 등가체로부터 유도된 모든 화학적 또는 생물학적 화합물 또는 물질을 의미한다. 예를 들면, 이러한 유도체는 모든 프로드러그(pro-drug) 형태, 페그 형태(PEGylated form), 또는 NELL 펩티드를 더욱 안정화시키거나 더욱 양호한 친골성(osteophilicity) 또는 친유성(lipophilicity)을 가지도록 하는 모든 기타 형태의 NELL 펩티드를 포함할 수 있다. 일부의 실시예에서, 상기 유도체는 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(아미노산), C1-C20개의 탄소를 가지는 히드로카르빌(hydorcarbyl) 단쇄, 또는 생체적합성 폴리머에 결합된 NELL 펩티드일 수 있다. 일부의 실시예에서, "유도체"라는 용어는 NELL 펩티드 모방체(mimetics)를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "모방체"라는 용어는 자신의 백본 내에 적어도 하나의 넌-펩티드(non-peptide) 결합을 가지는 펩티드를 의미한다. 펩티드 결합은 아미노산 분자의 카르복시산기 및 다른 아미노산 분자의 아미노기 사이에 형성되는 화학결합이다.
펩티드의 모방체의 합성은 본 기술분야에서 충분히 설명된 것이다. 다음은 펩티드 유사체를 포함하는 펩티드의 합성을 위한 기본적 과정의 일례를 설명한 것이다:
펩티드 합성을 개시하기 전, 아미노산(출발물질)의 아민 단말(amine terminus)은 FMOC(9-플루오로메틸 카바메이트) 또는 기타 보호기를 이용하여 보호될 수 있고, 메리필드 수지(Merrifield resin; 유리 아민)와 같은 고상 담체(solid support)가 개시제(initiator)로서 사용된다. 다음, 단계(1) 내지 단계(3)의 반응 이 원하는 펩티드가 얻어질 때까지 반복 수행된다: (1) 유리-아민을 카보디이미드 화학반응을 이용하여 카복실 말단과 반응시킨다. (2) 아미노산 서열이 정제된다. (3) 보호기(예를 들면, FMOC 보호기)를 약산성 조건 하에서 제거하여 유리 아민을 생성한다. 다음 상기 펩티드를 수지로부터 절단하여 독립된 펩티드 또는 펩티드 모방체를 얻을 수 있다.
일 실시예에서, 본 방법은 분비 시그널 펩티드를 코드하는 핵산 서열을 구비하는 프레임 내에서 NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드를 코드하는 핵산 서열을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 분비 시그널 펩티드는 분비된 꿀벌 단백질의 분비 시그널 펩티드일 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 서열은 멜리틴(melittin) 시그널 서열, 드로스필라(drosphila) 면역글로블린-결합 단백질 시그널 서열, 에퀸 인터페론-감마(eIFN-감마) 시그널 펩티드, 스네이크 포스포리파제(snake phospholipase) A2 인히비터 (inhibitor) 시그널 펩티드, 인간 및/또는 닭의 리소자임(lysozyme) 시그널 펩티드를 포함(그러나, 이들 시그널 펩티드에 한정되지 않음)하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 포유동물 발현계를 위해 프로트립신(protrypsin) 선도서열(leading sequence)이 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 본 방법은 NELL 펩티드를 코드하는 핵산 구축물로 곤충 세포주(insect cell line)를 트랜스팩션하는 단계; 및 NELL 펩티드의 발현 및/또는 분비를 허용하는 조건 하에서 상기 곤충 세포주를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 세포주는 일시적으로 또는 안정하게 NELL 펩티드를 코드하는 핵산 구축물에 의해 트랜스팩션될 수 있다.
NELL 펩티드 발현계
NELL 펩티드는 모든 생물계(biological system) 내에서 발현될 수 있다. 예를 들면, NELL 펩티드는 박테리아계, 효모계, 식물계, 또는 동물계 내에서 발현될 수 있다.
일부의 실시예에서, NELL 펩티드는 본 기술분야에 주지된 무세포 발현계(cell free expression system) 내(예를 들면, 대장균 무세포 단백질 번역계 또는 소맥배아 무세포 단백질 번역계) 내에서 발현될 수 있다.
일부의 실시예에서, NELL 펩티드는 담배, 옥수수, 쌀, 또는 대두로부터 유도된 유전자이식 식물세포계 내에서 발현될 수 있다.
이와 같은 발현계들은 바이러스 캐리어 또는 바이러스 벡터(viral vector), 펩티드 캐리어, 또는 단쇄 폴리머 분자와 같은 캐리어를 포함할 수 있다.
일부의 실시예에서, NELL 펩티드는 곤충 세포 내에서 발현될 수 있다. 곤충계 내에서 발현되는 NELL1 및 NELL2 펩티드는 기능적 형태의 단백질이다.
COS7 세포는 NELL1 및 NELL2 단백질을 저수준(예를 들면, 약 10 μg/L 배지)으로 생산하는데 사용될 수 있으나, 발현을 위해 혈청-함유 배지가 필요하다. 시그널 펩티드에 관해서는 NELL1 및 NELL2 외인성 시그널 펩티드는 COS7 세포 내에서의 발현을 허용한다.
일 실시예에서, 본 발명은 곤충 세포주를 이용하는 NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 기능성 NELL 펩티드의 발현방법을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 곤충 세포는 하이파이브 세포(high five cell), Sf9 세포 및 기타 Sf 세포일 수 있다.
일 실시예에서, 본 방법은 NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드를 코드하는 핵산 서열을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열은 NELL 펩티드의 적어도 기능 부분을 코드하는 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 서열은 인간 NELL1(서열번호:1), 생쥐 NELL1(서열번호:3), 마우스 NELL1(서열번호:5), 또는 인간 NELL2(서열번호:7), 생쥐 NELL2(서열번호:9), 마우스 NELL2(서열번호: 11), 닭 NELL2(서열번호:13)을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 이들 서열에 한정되지 않는다. 상기 핵산 서열은 또 전술한 서열의 임의의 부분과 적어도 약 75% 서열의 유사성을 가지는 서열과 같이 실질적 서열 유사성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
더욱 상기 핵산은 NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드를 코드하는 핵산 서열의 발현을 위한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 발현 벡터는 pJZT/V5-His(Invitrogen)일 수 있고, 선택 마아커(selective marker)는 또 블래스트시딘(blastcidin) 및 네오마이신(neomycin)을 포함할 수 있다.
더욱, 상기 핵산은 유전자 발현 수준을 모니터하기 위한 레포터 생산물(reporter products)을 코드하거나, 펩티드의 발현수준을 모니터하기 위해 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 시각화될 수 있는 펩티드 태그(tags)를 코드하는 추가의 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 서열은 상기 핵산의 발현과 간섭하거나 또는 발현된 펩티드 산물의 기능성과 간섭하지 않도록 선택될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 곤충 세포 내의 NELL1 및/또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드의 발현을 위한 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열은 NELL 펩티드의 적어도 기능적 부분을 코드하는 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 서열은 인간 NELL1(서열번호:1), 생쥐 NELL1(서열번호:3), 마우스 NELL1(서열번호:5), 또는 인간 NELL2(서열번호:7), 생쥐 NELL2(서열번호:9), 마우스 NELL2(서열번호: 11), 닭 NELL2(서열번호:13)을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 이들 서열에 한정되지 않는다. 상기 핵산 서열은 또 전술한 서열의 임의의 부분과 적어도 약 75% 서열의 유사성을 가지는 서열과 같이 실질적 서열 유사성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 차이니즈햄스터 난소세포(CHO 세포)와 같은 포유동물 세포 내의 NELL1 및/또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드의 발현을 위해 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열은 NELL 펩티드의 적어도 기능 부분을 코드하는 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다. 예를 들면, 상기 핵산 서열은 인간 NELL1(서열번호:1), 생쥐 NELL1(서열번호:3), 마우스 NELL1(서열번호:5), 또는 인간 NELL2(서열번호:7), 생쥐 NELL2(서열번호:9), 마우스 NELL2(서열번호: 11), 닭 NELL2(서열번호:13)을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 이들 서열에 한정되지 않는다. 상기 핵산 서열은 또 전술한 서열의 임의의 부분과 적어도 약 75% 서열의 유사성을 가지는 서열과 같이 실질적 서열 유사성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
일부의 실시예에서, 포유동물 세포(예, CHO 세포) 내에서 NELL1 및/또는 NELL2 펩티드의 생산을 위해, NELL1 및/또는 NELL2를 위한 발현계는 핵산을 포함하거나 또는 내인성 시그널 펩티드를 발현하는 cDNA를 포함할 수 있다. 일부의 실시 예에서, NELL1 및/또는 NELL2 펩티드를 위한 발현계는 핵산을 포함하거나 또는 NELL2 시그널 펩티드를 발현하는 cDNA를 포함할 수 있다. NELL2 시그널 핵산 또는 cDNA를 NELL1 펩티드 발현계 내에 결합시키면 NELL1 펩티드가 더욱 효율적으로 생산될 수 있다.
상기 핵산 구축물은 시그널 펩티드를 코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 NELL 펩티드를 코드하는 핵산을 발현하기 위한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 더욱, 상기 핵산 서열은 유전자 발현 수준을 모니터하기 위해 레포터 산물을 코드하거나, 펩티드의 발현수준을 모니터하기 위해 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 시각화될 수 있는 펩티드 태그(tags)를 코드하는 추가의 핵산을 포함할 수 있다
핵산 구축물은 발현 벡터 및 선택가능한 마이커라고도 부르는 선택 유전자(예, 해당 클로닝 벡터에 의해 형질전환(transform)된 숙주세포의 생존 또는 성장을 위해 필요한 단백질을 코드하는 유전자)를 포함하는 클로닝 벡터(cloning vector)를 포함할 수 있다. 이 유전자의 존재는 상기 벡터를 결실(delete)하는 모든 숙주세포가 형질전환된 숙주를 초과하는 성장 또는 복제(reproduction)시에 이점을 얻지 않는다는 것을 보장한다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생물질 또는 기타 독소(예, 암피실린(ampicillin), 네오마이신, 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 테트라사이클린(tetracycline))에 내성을 부여하고, (b) 영양요구성 결핍(auxotrophic deficiencies)을 보완하는 단백질을 코드한다.
핵산 구축물은 또 숙주생물에 의해 인식되는, 그리고 핵산을 코드하는 NELL 에 기능이 가능하게(operably) 결합되는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 핵산의 전사 및 번역을 제어하는 구조 유전자의 개시 코돈(start codon)으로부터 상류측에 위치(대체로 약 100 내지 1000 bp 이내)하는 비번역 서열로서, 유도 프로모터 및 구성적 프로모터를 포함한다. 유도 프로모터는 배양조건의 일부의 변화(예, 영양소의 존재 또는 비존재 또는 온도변화)에 응답하여 제어 하에서 DNA로부터의 전사 수준의 증대를 개시하는 프로모터이다. 현재, 다양한 잠재적 숙주세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 주지되어 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계를 가지도록 배치되면 기능이 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들면, 프리서열(presequence) 또는 분비 리더(secretory leader)용 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질(preprotein)로서 발현되면 폴리펩티드용 DNA에 기능이 가능하게 결합되고; 프로모터 또는 인핸서는 이것이 코드 서열(coding sequence)의 전사에 영향을 미치는 경우 그 코드 서열에 기능이 가능하게 결합되고; 또는 리보솜 결합부위는 이것이 번역을 촉진하기 위해 위치되는 경우 코드 서열에 기능이 가능하게 결합된다.
일 실시예에서, 본 발명은 기능적 NELL 펩티드를 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 세포는 CHO 세포일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 세포는 NELL 펩티드를 코드하는 핵산 구축물에 의해 트랜스팩션될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포주는 NELL 펩티드를 코드하는 핵산 구축물에 의해 일시적으로 또는 안정하게 트랜스팩션될 수 있다. 일 실시예에서, 핵산(예, cDNA(들))을 발현하는 NELL은 세포(예, 곤충 세포 또는 차이니즈햄스터 난소세포(CHO 세포))의 트랜스팩션이 가능한 유전자 발현 벡터 또는 바이러스 입자 내로 클론될 수 있다.
상기 핵산 서열은 또 곤충 분비 시그널 펩티드를 코드하는 핵산 서열을 구비하는 프레임 내의 NELL 펩티드(예, NELL1 또는 NELL2 펩티드)를 코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 기능적 NELL 펩티드를 발현함과 동시에 기능적 단백질을 분비할 수 있는 세포를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드를 포함할 수 있고, 분비 시그널 펩티드를 포함할 수 있다.
예를 들면, NELL 펩티드의 아미노산 서열은 인간 NELL1(서열번호:2), 생쥐 NELL1(서열번호:4), 마우스 NELL1(서열번호:6), 또는 인간 NELL2(서열번호:8), 생쥐 NELL2(서열번호:10), 마우스 NELL2(서열번호: 12), 닭 NELL2(서열번호:14)를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 그러나, 이들 서열에 한정되지 않는다. 상기 아미노산 서열은 또 전술한 서열의 임의의 부분과 적어도 약 75% 서열의 유사성을 가지는 서열과 같이 실질적 서열 유사성을 가지는 서열을 포함하거나, 또는 NELL1 펩티드와 유사한 활성 결합 도메인을 포함할 수 있다.
펩티드 정제
일부의 실시예에서, 본 발명은 후술하는 표준 펩티드 정제법(그러나, 이것에 한정되지 않음)에 따라 배지 내에 분비된 NELL1 및/또는 NELL2 펩티드의 정제방법을 포함한다.
본 방법은 또 분비된 NELL 펩티드의 포집단계 및/또는 사용하기 위한 NELL 펩티드의 정제단계를 포함할 수 있다. 펩티드 산물은 다양한 기능시험 또는 발현시험을 통해 활성을 시험할 수 있다. 예를 들면, NELL 펩티드가 어떤 파라메터에 관하여 대조 물질에 비해 상당한 효과를 가지는 경우, 이 NELL 펩티드는 측정된 파라메터를 발효하는 기능이 있다는 평가를 받는다.
일 실시예에서, 선택된 세포가 NELL 펩티드를 발현 및/또는 분비하기 위해 선택된 핵산 서열을 발현하는지의 여부가 시험될 수 있다. 일 실시예에서, NELL 펩티드의 존재, 양 및/또는 활성이 시험될 수 있다.
일 실시예에서, NELL 펩티드는 본 기술분야의 전문가들에게 주지된 다수의 방법 중의 임의의 방법에 의해 검출 및 정량화되었다. 상기 방법들은 전기영동법(electrophoresis), 캐필러리 전기영동법(capillary electrophoresis), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC), 하이퍼디퓨전 크로마토그래피(hyperdiffusion chromatography) 등과 같은 생화학적 분석법 또는 액체 침강소(precipitin) 또는 겔 침강소 반응법, 면역확산법(immunodiffusion)(단순 면역확산법 또는 이중 면역확산법), 면역전기영동법(immuno electrophoresis), 방사면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 효소면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assays; ELISA), 면역형광측정법(immunofluorescent assays), 웨스턴 블로팅법(western blotting) 등과 같은 여러 가지 면역학적 방법들을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 웨스턴블롯(면역블롯(immunoblot)) 분석은 선택된 샘플 내의 NELL 펩티드(들)의 존재의 검출 및 정량화를 위해 사용될 수 있다. 이 분석방법은 분자량에 기초한 겔 전기영동법에 의해 샘플 단백질을 분리하는 단계, 상기 분리된 단백질을 적절한 고상 담체(solid support)(예, 니트로셀룰로스 필터, 나일론 필터, 또는 유도체화 나일론 필터)에 이송하는 단계, 및 상기 샘플을 표적 펩티드에 특이적 결합하는 항체와 함께 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 시험은 본 기술분야의 전문가들에게 주지되어 있는 표준방법에 따라 (포지티브 또는 네거티브 또는 표적 폴리펩티드의 양으로서) 득점이 채점될 수 있다. 특정의 채점방법은 시험의 형식 및 표식(label)의 선택에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 웨스턴블롯 시험법은 효소 표식에 의해 생산된 착색 산물을 시각화하는 것에 의해 채점될 수 있다. 정확한 분자량에서 명확하게 시각화된 착색 밴드(band) 또는 착색 스폿(spot)은 포지티브로 채점될 수 있고, 명확하게 시각화된 스폿 또는 밴드가 존재하지 않으면 네거티브로서 채점될 수 있다. 밴드 또는 스폿의 명암도(intensity)는 표적 폴리펩티드의 농도의 정량적 척도를 제공할 수 있다.
실시예
재조합 단백질 생산법 및 정제법은 본 기술분야의 전문가들에게 주지된 것으로서, 다수의 영리회사는 단백질 생산 서비스를 제공하고 있다. 후술하는 실시예는 특허청구된 발명을 설명하기 위해 제공된 것으로서, 본 발명이 이 실시예에 제한되지 않는다. 일반적으로 발현숙주는 박테리아, 효모 및 균류, 포유동물 세포, 식물, 유전자도입 동물(transgenic animal)(예, 산양유(goat milk)), 또는 무세포 발현계(예, 소맥배아 또는 대장균 추출물)일 수 있다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다. 일반적으로, 발현소(expression elements)는 프로카리오틱(Prokaryotic) 프로모터, 효모 프로모터, 포유동물 프로모터, 식물 프로모터, 또는 바이러스 프로모터일 수 있다. 단백질 발현 스트라테지 (strategies)는 세포내 또는 세포외 융합 단백질 및 디스플레이(display) 스트라테지일 수 있다. 재조합 단백질의 후처리 프로세싱은 채집(harvest), 용해(lysis), 여과(filtration), 한외여과(ultrafiltration), 침전(precipitation), 및/또는 단백질 포착(capture), 정제(purification), 폴리싱(polishing), 및 최적화(optimization)를 포함하는 기타 단백질 프로세싱/정제 스트라테지를 포함할 수 있다.
실시예 1. NELL 펩티드의 발현
cDNA 프래그먼트는 발현 벡터 PiZT/V5-His(3.4kb)(EcoRV 부위, Invitrogen) 내에 결합되고, 멜리틴(melittin) 시그널 펩티드, 성숙 생쥐 NELL1의 BamHI-EcoRI cDNA 프래그먼트, 및 FLAG 태그 서열을 포함하였다. 도 2A-2B는 본 실시예에서 사용된 cDNA 구축물의 핵산 서열 및 대응하는 예측되는 펩티드 서열을 도시한 것이다.
하이파이브 세포(BTI-TN-5B1-4)는 무혈청 배지에 적응되었고, 세포들은 NELL1 펩티드 발현 벡터를 이용하여 트랜스펙션되었다. 세포들은 NELL1 FLAG 구축물을 발현하는 세포 개체군만을 선택하기 위해 제오신(zeocin)으로 처리되었다. 생존 세포 개체군은 안정한 형질전환세포(transformants)임이 확인되었다. 세포외 배지는 수집되어 NELL1 펩티드의 존재에 대해 시험되었다. NELL1 펩티드는 정제 후 후술된 기능시험에 이용되었다.
도 2A는 정제된 NELL1 펩티드를 함유하는 UnoQ-용출액의 CBB 염색된 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다. 배지는 전술한 바와 같이 UnoQ 컬럼(column)(Bio-Rad) 상에 가해졌다. 도 2B는 단백질 래더(ladder)에 관련하여 NELL1-FLAG를 표현하는 항-FLAG 항체를 사용하는 웨스턴블롯을 보여준다. 펩티드: 140 kDa(세포간 전구체(intercellular precursor)), 130 kDa(성숙 형태; 90 kDa 펩티드), 400 kDa(분비 형태, 호모트리머(homotrimer)). 상기 실시예에서, 발현계의 생산성은 약 3 mg(NELL1 펩티드)/L(배지)였다.
펩티드의 발현 또는 분비가 전혀 없는 발현계(예, 효모를 포함하는 박테리아 발현) 또는 펩티드 생산이 극히 저조한 발현계(예, 대장균 융합 펩티드 계, CHO-dhfr 세포, >10 mcg/L)에 비해, 본 발명의 발현계(포유동물 세포 및 곤충 세포)는 다량의 기능 단백질의 생산 효율이 경이적이고도 실질적으로 높았다.
재조합 생쥐 NELL1 단백질의 발현 및 정제
곤충 세포에 의한 C-단말에 FLAG-태그된 NELL1 펩티드의 생산을 위해, 곤충 발현 벡터 pIZT/V5-His(Invitrogen) 내에 pTB701-NELL1-FLC 플라스미드(Kuroda, BBRC)로부터 유도된 FLAG 에피토프(epitope)에 융합된 생쥐 NELL1 cDNA를 삽입함으로써 PiZT-NELL1-FLC 플라스미드가 구축되었다. 또, NELL1 원형(original) 분비 시그널 서열은 PCR법을 이용하여 꿀벌 멜리틴 시그널 서열에 치환되었다. 하이파이브 세포는 Invitrogen사로부터 구입되었고, 하이파이브 무혈청 배지(Invitrogen) 내에서 배양되었다. 하이파이브 세포는 FuGene6(Roche)를 이용하는 pIZT-NELL1-FLC 플라스미드를 이용하여 트랜스팩션되었다. 트랜스팩션 후 48시간 경과 후, 세 포는 400 mg/ml의 제오신(Invitrogen)을 이용하여 선택되었다. 안정한 발현 세포주가 정착될 때까지 3 내지 4일 마다 선택 배지를 교환하였다. NELL1 분비는 면역침전 시험법 및 웨스턴블롯 시험법을 이용하여 확인되었다. 하이파이브 세포는 배지 내에서 NELL1 펩티드(140 kDa)를 발현하는 것이 밝혀졌다.
재조합 생쥐 NELL1-FLC 펩티드는 UNO Q-1 컬럼(Bio-Rad)을 이용하여 음이온교환(anion exchange) 크로마토그래피법에 의해 제오신 내성의 하이파이브 세포의 배지로부터 정제되었다. NELL1 펩티드는 500 mM의 NaCl에서 용출되었다.
COS7 세포에 의한 C-단말에 FLAG-태그된 NELL1 펩티드의 생산을 위해, 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen) 내에 pTB701-NELL1-FLC 플라스미드로부터 유도된 FLAG 에피토프(epitope)에 결합된 생쥐 NELL1 cDNA를 삽입함으로써 pcDNA3.1-NELL1-FLC 플라스미드가 구축되었다.
COS7 세포는 10% FBS가 보충된 DMEM 내에서 배양되었다. COS7 세포는 내인성 NELL 시그널 펩티드 플라스미드를 이용함과 동시에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 pcDNA3.1-NELL1-FLC에 의해 트랜스팩션되었다.
도 3C는 NELL1-FLAG를 포함하는 UnoQ-용출액(UnoQ-eluate)의 CBB 염색된 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다. 이들 발현의 연구 결과 COS 세포가 기능적 NELL 펩티드를 발현하면 반드시 NELL의 N말단이 수식(modifying)(예, 시그널 서열을 포함하는 것)되어 분비 효율을 증대시킨다는 것이 밝혀졌다. 도 3D는 NELL1-FLAG 발현을 표현하는 항-FLAG 항체를 사용하는 웨스턴블롯을 도시한 것이다.
재조합 생쥐 NELL2 단백질의 발현 및 정제
곤충 세포에 의한 C-단말에 FLAG-태그된 NELL2 펩티드의 생산을 위해, 곤충 발현 벡터 pIZT/V5-His(Invitrogen) 내에 pTB701-NELL2-FLC 플라스미드로부터 유도된 FLAG 에피토프에 융합된 생쥐 NELL2 cDNA를 삽입함으로써 pIZT-NELL1-FLC 플라스미드가 구축되었다. 하이파이브 세포는 Invitrogen사로부터 구입되었고, 하이파이브 무혈청 배지(Invitrogen) 내에서 배양되었다. 하이파이브 세포는 FuGene6(Roche)를 이용하는 pIZT-NELL1-FLC 플라스미드를 이용하여 트랜스팩션되었다. 트랜스팩션 후 48시간 경과 후, 세포는 400 mg/ml의 제오신(Invitrogen)을 이용하여 선택되었다. 안정한 발현 세포주가 정착될 때까지 3 내지 4일 마다 선택 배지를 교환하였다. NELL2 발현은 면역침전 시험법 및 웨스턴블롯 시험법을 이용하여 배지 내에서 확인되었다. 하이파이브 세포는 배지 내에서 NELL2 펩티드(140 kDa)를 발현하는 것이 밝혀졌다.
재조합 생쥐 NELL2-FLC 펩티드는 UNO Q-1 컬럼(Bio-Rad)을 이용하여 음이온교환(anion exchange) 크로마토그래피법에 의해 제오신 내성의 하이파이브 세포의 배지로부터 정제되었다. NELL2 펩티드는 500 mM의 NaCl에서 용출되었다.
실시예 2. 포유동물계 내의 NELL1 의 발현
비바이러스성 DNA 송달에 의해 rhNELL1의 생산을 위해 사용되는 포유동물 발현계는 표 1에 열거된 안정한 현탁계(suspension system)을 포함할 수 있다. 그러나, 이것에 한정되지 않는다. 이하에서, 벡터 설계, 숙주 세포주 배양, 안정 세포주의 트랜스팩션 및 선택뿐 아니라 HEK293계 및 COH계 내의 rhNELL-1의 정제를 포함하는 방법(protocols)을 비교적 상세하게 설명한다. 그러나, 이것은 본 기술분 야의 전문가들에게 주지된 것이다.
표 1. rhNell-1의 생산을 위한 포유동물 발현계
계 (System) 친 벡터 (parental vector) 리더 서열 (leader sequence) 유전자 증폭 (gene amplification)
CHO P3Xflag-CMV 프리프로트립신 (preprotrypsin) No/optinal
DXB11 Mp19-Lp 인간 tPA DHFR/MTX
HEK293 pSecTag 면역글로블린 No/optinal
NS/0 또는 Sp2/0 pdCs-Fc-X Ig 및 fc 프래그먼트의 경쇄 DHFR/MTX
pEE12 해당없음 GS/MSX
DHFR: 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase); MTX: 메토트렉세이트(methotrexate); GS: 글루타민 합성효소(glutamine synthetase); MSX: 메티오닌 설폭시민(methionine sulphoximine)
A. CHO 계 #1
벡터 설계 : cDNA 프래그먼트는 발현 벡터 p3XFlag-CMV(Sigma) 내에 결합되었다. 얻어진 발현 구축물 pCMV-rhNELL3Xflag는 프리프로트립신 선도 서열(leading sequence), 성숙 인간(mature human) NELL1을 코드하는 영역의 cDNA 프래그먼트, 및 c말단의 3Xflag 서열을 포함한다.
숙주 세포주 : CHO-K1은 접착성 세포주(adherent cell line)였고, 무혈청 배지 내의 현탁 배양(suspension culture)에 적응시킬 수 있다. pCMV-rhNELL-1-3Xflag의 구축물은 리포펙타민(lipofectamin)(Invitrogen) 또는 칼슘 포스페이트 처리에 의해 트랜스팩션되었다. 안정 세포주는 약 2주간 세포 배지 내에 G418(400-600 ug/ml)을 첨가함으로써 선택되었다. 또 상기 안정한 형질전환세포는 희석을 제한함으로써 고생산성의 rhNELL1을 가지는 단일 클론을 위해 더 스크리닝(screened)되었다. 선택된 안정 세포주는 실험실 규모 또는 산업 규모의 rhNell-1의 생산을 위한 생물반응기에서 사용될 수 있다.
정제방법 : rhNELL1 펩티드를 함유하는 배지 또는 세포 용해물(lysate)은 비변성 조건(native condition)에서 항-flag 항체 M2(Sigma) 어피니티 컬럼(affinity column)을 통해 정제되고, 3Xflag 펩티드에 의해 용출되었다.
B. CHO 계 #2
벡터 설계 : 도 4A는 cDNA 구축물의 핵산 서열 및 이 구축물을 위해 사용된 3종의 상이한 시그널 펩티드의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
숙주 세포주 : CHO-K1은 접착성 세포주였고, 무혈청 배지 내의 현탁 배양에 적응시킬 수 있다. pcDNA3.1-nNELL1-c-myc/His, pIL2-hNELL1-c-myc/His, 또는 pN2-hNELL1-c-myc/His의 구축물은 리포펙타민(Invitrogen) 또는 칼슘 포스페이트 처리에 의해 트랜스팩션되었다. 안정 세포주는 약 2주간 세포 배지 내에 G418(400-600 ug/ml)을 첨가함으로써 선택되었다. 또 상기 안정한 형질전환세포는 희석을 제한함으로써 고생산성의 rhNELL1을 가지는 단일 클론을 위해 더 스크리닝되었다. 선택된 안정 세포주는 실험실 규모 또는 산업 규모의 rhNELL1의 생산을 위한 생물반응기에서 사용될 수 있다.
정제방법 : rhNELL1 펩티드를 함유하는 배지 또는 세포 용해물은 항-c-myc 아가로스(agarose)를 통한 면역침전법을 통해 정제되었다. 도 4B는 항-c-myc 아가로 스(anti-c-myc agarose)를 이용한 면역침강(immunoprecipitation)후 상이한 구축물에 의한 트랜스팩션으로부터 NELL1의 분비를 검출하는 항-c-myc 항체를 가지는 웨스턴블롯(Western blot)이다. 도 4C는 토끼 항-인간 Nell-1 항체-NHS 활성화된 세파로스(sepharose)를 이용하는 면역침강 후 NELL1의 분비를 검출하는 항-c-myc 또는 마우스 항-인간 NELL1 항체를 가지는 웨스턴블롯이다.
C. CHO 계 #3
벡터 설계 : NELL1 또는 NELL2 리더 펩티드(leader peptide) 서열을 이용하여 독자적(proprietary) cDNA 구축물(Aragnen Biosciences, Lonza, 또는 Cytovance)이 구축되었다.
숙주 세포주 : 상기 독자적 CHO 세포주는 접착성 세포주였고, 무혈청 배지 내의 현탁 배양에 적응시킬 수 있다. 상기 독자적 구축물은 트랜스팩션되었다. 안정 세포주는 약 2주간 세포 배지 내에 적절한 인자들을 첨가함으로써 선택되었다. 또 상기 안정한 형질전환세포는 희석을 제한함으로써 고생산성의 rhNELL1을 가지는 단일 클론을 위해 더 스크리닝되었다. 선택된 안정 세포주는 실험실 규모 또는 산업 규모의 rhNELL1의 생산을 위한 생물반응기에서 사용될 수 있다.
정제방법 : rhNELL1 펩티드를 함유하는 배지 또는 세포 용해물은 본 기술분야의 전문가에게 주지된 분석적(analytical) 및 조제적(preparative) 단백질 정제법(예, 치수 배제(size exclusion) 크로마토그래피법, 이온교환 크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 면역친화성(immunoaffinity) 크로마토그래피법, 고성능 액체 크로마토그래피법)을 통해 정제되었다.
농축방법 : rhNELL1은 동결건조법(lyophilization) 또는 한외여과법(ultrafiltration)을 이용하여 농축되었다.
D. HEK293 계
벡터 설계 : cDNA 프래그먼트는 발현 벡터 pSecTagA(Invitrogen) 내에 결합되었다. 그 결과 얻어진 발현 구축물 pSec-hNell-1-Tag는 마우스 면역글로블린 κ-쇄 리더 서열(κ-chain leader sequence), 성숙 인간 NELL1 코드 영역의 cDNA 프래그먼트, 및 c-말단에서 Myc 및 His 서열의 이중 태그(dual tag)를 포함한다.
숙주 세포주 : 무혈청 배지에 적응되고 현탁계에서 성장되는 인간 배아 신장 세포주 HEK-293이
NELL1 펩티드 발현 벡터 pSec-hNell-1-Tag에 의해 트랜스팩션되었다. 세포는 2-3일간 일시적 트랜스팩션으로서 배양된 후 rhNell-1의 정제를 위해 조절된 배지를 포집되거나 안정된 발현 세포주를 선택하기 위해 제오신(Zeocin)(250 ug/ml)으로 처리되었다. 상기 안정 형질전환세포는 희석을 제한함으로써 고생산성의 rhNell-1을 가지는 단일 클론을 위해 더 스크리닝(screened)되었다. 선택된 안정 세포주는 실험실 규모 또는 산업 규모의 rhNell-1의 생산을 위한 생물반응기에서 사용될 수 있다.
정제방법 : rhNell-1 펩티드를 함유하는 배지는 비변성 조건(native condition)에서 Ni2 + 어피니티 컬럼(affinity column)을 통해 정제되고, 1M의 이미다졸(imidazole)에 의해 용출되었다. 상기 rhNell-1은 4℃에서 20시간 동안 적어 도 1000배 체적의 PBS(pH 7.4)에 대하여 대규모 투석(dialysis)을 행한 후 그 완전성(integrity), 순도 및 생물활성이 시험되었다.
또, 기존의 리더 서열을 생쥐 혈장 알부민(serum albumin), CD33, tPA 및 인간 인터루킨-2(interlukin-2) 리더 서열과 같은 새로운 서열로 대체하거나, DHFR 또는 GS와 같은 유전자 증폭 표적을 백본 서열(backbone sequence)에 추가하기 위한 친벡터(parent vectors)의 변이(modifications)에 의해 새로운 발현 벡터 및 발현계가 얻어질 것이다. 본 발명에서, 인간 Nell-1의 비변성 시그널 펩티드는 단백질의 분비를 안내하는데 충분히 효과적이지 않고, 때때로 외부 선도 서열(external leading sequence)도 양호하게 작용하지 않는다. 따라서, 단백질간 His 태그(intraprotein His tag) 및 "MPHHHHHHGGGDDDDKDPM"과 같은 단백질 분해성 절단부위(proteolytic cleavage site)를 포함하는 스페이서(spacer)에 의해 인간 과립구-매크로파지 콜로니 자극인자(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor;GM-CSF)와 같은 소형의 천연 분비 단백질의 융합에 의해 프레임(frame) 내에서의 발현 벡터의 구축이 필요할 수 있다. Nell-1의 정제를 위해 사용되는 에피토프(epitope) 태그는 6X히스티딘(6XHistidines), 3XFlag, Myc, GST(glutathione S-transferase), CTHS (C-terminal half of SUMO(small ubiquitin modifying protein))의 EGFP 중의 하나일 수 있으나, 전게한 표 1에 열거된 플라스미드 pSecTag와 같이 His + Myc의 이중 태그일 수도 있다.
더욱, 특정 환경 하에서 rhNell-1의 조절발현 또는 유도발현을 위해 IRES를 이용하는 디시스트로닉 벡터(dicistronic vectors) 또는 멀티시스트로닉 벡 터(multicistronic vectors)가 구축될 수 있다. 오래 지속되는 증식(proliferation) 및 지연형 아폽토시스(delayed apoptosis)를 얻기 위해, 또는 Tet(tetracycline) 유도계 및 Flp-In 특이적 부위 통합계(integration system)와 같은 특별한 요구에 부합하기 위해, rhNell-1 생산의 개선을 위한 유전자 개질이 고려될 수 있다.
전술한 rhNell-1의 생산을 위한 안정한 발현계에 더하여, 본 발명자들은 보조적 대체안(backup alternative)으로서 또는 안정계에 대한 보완으로서 캐티온성 폴리머(cationic polymer)에 의해 HEK293 또는 BHK 현탁세포를 트랜스팩션하기 위해 수 밀리그램의 정제된 플라스미드 벡터(pREP4)를 이용하는 대규모의 일시적 트랜스팩션(LST) 방법을 수립할 가능성을 배제하지 않는다.
실시예 3. 배지로부터 NELL2 단백질의 정제
pIZT-FLC-NELL2를 포함하는 하이파이브 세포는 무혈청 배지(1L) 내에서 약 3일 동안 배양되었다. 상기 배지는 5분간 3000 x g로 원심분리되고, 부유물은 수집되었다. PMSF가 1 mM의 최종 농도까지 첨가되었다. 포화 암모늄 설페이트 용액(80% 포화(v/v))이 첨가되었고, 용액은 4℃에서 1시간 동안 유지되었다. 용액은 30분간 15000 x g로 원심분리되고, 침전물은 수집되었다. 침전물은 4℃의 온도의 20 mM의 트리스-염산(pH 8.0) 및 1 Mm의 EDTA로 된 50 ml의 용액 내에 용해되었고, 4℃의 온도의 20 mM의 트리스-염산(pH 8.0) 및 1 Mm의 EDTA에 조절(FPLC(Amersham-Pharmacia)에 의해 1 ml/분의 속도)된 음이온교환 크로마토그래피 UnoQ 컬럼(6 ml, Bio-Rad)에 가해졌다. 상기 컬럼은 동일 버퍼액을 이용하여 완전히 세척되었다.
다음, 상기 결합 단백질은 동일 버퍼액의 NaCl을 0 M로부터 1.5 M까지 점차적으로 변화시켜 용출되었다. 상기 NELL2-FLAG 획분(fractions)은 항-Flag M2(Sigma) Ab를 이용하여 웨스턴블로팅에 의해 동정되었다. 포지티브 획분은 하나의 관(tube) 내에 포집되었다. 최종 산물은 1 L의 PBS에 대하여 시임레스(seamless) 셀룰로스 관(Wako, cutoff MW 12000) 내에서 4℃의 온도에서 철야로 투석되었다. 생산물은 -70℃에서 보관되었다.
이상 본 발명의 특정 실시예에 대해 설명하였으나, 본 기술분야의 전문가는 본 발명으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서의 변경 및 개량을 할 수 있다는 것은 명백하다. 따라서, 첨부된 청구범위는 이와 같은 본 발명의 진정한 정신 및 범위 내의 모든 변경 및 개량을 포함하는 것이다.

Claims (23)

  1. 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법으로서, 상기 방법이:
    분비 시그널 펩티드를 코드하는 핵산을 가지는 프레임 내의 적어도 하나의 NELL 펩티드를 코드하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 구축물을 제공하는 단계;
    포유동물 세포를 상기 핵산 구축물에 의해 트랜스팩션하는 단계; 및
    상기 NELL 펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 포유동물 세포는 차이니즈햄스터 난소세포인 것을 특징으로 하는 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 분비 시그널 펩티드는 NELL1 또는 NELL2 펩티드 시그널 서열인 것을 특징으로 하는 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 핵산이 NELL1 또는 NELL2를 코드하고,
    상기 NELL1은 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 및 서열번호:6을 포함하는 그룹으로부터 선택되고,
    상기 NELL2는 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 서열번호:10, 서열번 호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 및 서열번호:14로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 세포주로부터 분비된 NELL 펩티드를 포집하는 단계; 및
    상기 NELL 펩티드를 실질적으로 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 세포주로부터 분비된 NELL 펩티드를 포집하는 단계; 및
    상기 NELL 펩티드를 실질적으로 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 골형성을 유도하기 위한 상기 NELL 펩티드의 활성을 시험하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 골형성을 유도하기 위한 상기 NELL 펩티드의 활성을 시험하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 정제단계는 크로마토그래피 정제법을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법.
  10. 청구항 2에 있어서, 상기 정제단계는 크로마토그래피 정제법을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포 내의 펩티드의 발현방법.
  11. 포유동물 세포 내의 NELL 펩티드의 발현을 위한 핵산 구축물로서, 상기 핵산 구축물이 분비 시그널 펩티드를 코드하는 핵산을 구비하는 프레임 내에서 적어도 하나의 NELL 펩티드를 코드하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 구축물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 곤충 분비 시그널 펩티드는 NELL1 또는 NELL2 펩티드 시그널 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 구축물.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산이 NELL1 또는 NELL2를 코드하고,
    상기 NELL1은 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 및 서열번호:6을 포함하는 그룹으로부터 선택되고,
    상기 NELL2는 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 및 서열번호:14로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 구축물.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 핵산 구축물.
  15. NELL 펩티드를 발현하는 포유동물 세포주로서, 상기 세포주는 분비 시그널 펩티드를 코드하는 핵산을 구비하는 프레임 내에서 적어도 하나의 NELL 펩티드를 코드하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 포유동물 세포주.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 포유동물 세포주는 CHO 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포주.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 CHO 세포는 NELL1 또는 NELL2 펩티드를 분비하는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포주.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 분비 시그널 펩티드는 NELL1 또는 NELL2 펩티드 시그널 서열인 것을 특징으로 하는 포유동물 세포주.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 핵산이 NELL1 또는 NELL2를 코드하고,
    상기 NELL1은 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호 :5, 또는 서열번호:6을 포함하는 그룹으로부터 선택되고,
    상기 NELL2는 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 및 서열번호:14로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포주.
  20. 서열번호:1, 서열번호:2, 서열번호:3, 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 서열번호:10, 서열번호:11, 서열번호:12, 서열번호:13, 서열번호:14, 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 펩티드로서,
    상기 재조합 펩티드는 청구항 16에 따른 세포주에 의해 생성되는 재조합 펩티드.
  21. 청구항 20에 있어서, NELL1 또는 NELL2 분비 펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 펩티드.
  22. 골형성 또는 연골형성을 유도하기 위한 조성물로서,
    청구항 20에 따른 유효량의 재조합 펩티드, 및
    선택적으로 캐리어를 포함하는 조성물
  23. 청구항 20에 따른 재조합 펩티드에 대한 항체.
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