CN101580533A - 一种重组人复合α干扰素(cIFN)异构体的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高速逆流色谱分离重组人复合α干扰素(cIFN)异构体的方法，所述的高速逆流色谱条件为：将5－26％(w/w)聚乙二醇(PEG)，7－28％(w/w)无机或有机酸和其盐，和余量的水混合、静置得到双水相体系，上相为固定相，下相为流动相，重量百分比是以所述的双水相体系的总重量为基准；高速逆流色谱仪主机转速为600－1200转/分钟；流动相流速为0.5－1.5ml/分钟。

Description

一种重组人复合α干扰素(cIFN)异构体的分离方法

技术领域

本发明涉及蛋白质的分离纯化，尤其涉及一种重组人复合α干扰素(cIFN)异构体的分离方法。

背景技术

重组人复合α干扰素(cIFN)是一种氨基酸序列重组的非天然存在的I型α干扰素。集中了各种天然干扰素的优点，具有更强、更广谱的抗病毒作用。体外抗病毒活性实验证明，cIFN的抗病毒活性是其他两种常用干扰素(IFN-α2a、IFN-α2b)的5-10倍。在治疗丙型肝炎上复合α干扰素的总治愈率高达40％，并且对SARS表现出高度抗病毒活性。

正确构象的复合α干扰素单体蛋白含有两对分子内二硫键，但是在cIFN制备过程中，容易受到环境因素胁迫，而致使一条或两条二硫键断裂，二硫键断裂后的cIFN分子极不稳定，常常形成低活性，甚至无活性的聚合体，聚合体严重时在临床上引起免疫原性。因此制备正确构象cIFN单体蛋白对于临床应用非常重要，对于研究制备过程中其发生聚合降解机理，实现优化基因工程菌表达调控策略和分离纯化工艺具有十分重要的意义。但靠原有的一般分离手段很难将其分开。

高速逆流色谱技术(HSCCC)建立在一种特殊的流体动力学平衡基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生的不对称离心力场，保证两相溶剂系统的有效混合，分配和充分保留，从而实现物质在两相溶剂中的高效分离。

双水相聚合物分离体系，条件温和(含水量高达70％-90％)，为蛋白质等生物大分子的分离提供了一个理想而温和的环境，特别适用于生物大分子，如蛋白质、核酸和细胞粒子的提取和纯化，并且传质过程和平衡过程快速，易于进行连续化操作，易于放大，使其在许多生物物质的分离纯化中得到广泛的应用。双水相体系(ATPS)应用于HSCCC中成为双水相体系高速逆流色谱技术，它结合了两者的优点，在特殊的HSCCC仪器上可实现对生物大分子尤其是蛋白质等的有效分离纯化。

如今利用HSCCC对大分子活性物质分离已经取得了一些成果，如，细胞色素c、肌红蛋白、卵白蛋白和牛血红蛋白四种标准蛋白的分离，鸡白蛋白的分离，但是将HSCCC运用于分离分子量仅差4个质子的cIFN异构体目前国内外还没有相关报道。

发明内容

本发明旨在提供一种有效分离cIFN两种二硫键异构体混合物的方法。

本发明提供了一种高速逆流色谱分离重组人复合α干扰素(cIFN)异构体的方法，所述的高速逆流色谱条件为：

将5-26％(w/w)聚乙二醇(PEG)，7-28％(w/w)无机或有机酸和其盐，和余量的水混合、静置得到双水相体系，上相为固定相，下相为流动相，重量百分比是以所述的双水相体系的总重量为基准；

高速逆流色谱仪主机转速为600-1200转/分钟；

流动相流速为0.5-1.5ml/分钟。

在另一优选例中，所述的聚乙二醇选自PEG1000、PEG2000、PEG4000、和/或PEG6000。

在另一优选例中，所述的聚乙二醇的分子量选自PEG2000、和/或PEG4000。

在另一优选例中，所述的双水相体系中含有1-6％(w/w)PEG2000，5-20％(w/w)PEG4000，6-24％(w/w)无机或有机酸盐，1-4％(w/w)无机或有机酸。

在另一优选例中，所述的无机或有机酸和其盐的酸根选自磷酸根、柠檬酸根；金属离子选自钠离子、钾离子。

在另一优选例中，所述的高速逆流色谱仪主机转速为750-1000转/分钟。

在另一优选例中，所述的流动相流速为0.6-1.2ml/分钟。

在另一优选例中，所述的两种二硫键异构体分别在双水相体系中的分配系数相差1-4倍。

在另一优选例中，所述的两种二硫键异构体分别在双水相体系中的分配系数通过高效液相色谱(HPLC)测定，或通过测定蛋白浓度确定。

据此，本发明将HSCCC运用于分离分子量仅差4个质子的cIFN异构体。

附图说明

图1显示了经本发明提供的高效逆流色谱技术分离前的cIFN异构体在SDS-PAGE电泳和HPLC图谱上的情况；条带19KD位置上呈现两条带；

其中A是电泳图，电泳图中的1表示分子量标准、2表示c IFN异构体、a，b分别为两种cIFN单体蛋白条带；B是反相高效液相色谱图。

图2显示了HPLC线性梯度优化策略洗脱分离cIFN异构体的情况。

图3显示了实施例1中cIFN异构体HSCCC洗脱曲线；

其中I号洗脱峰为cIFN-A，II号洗脱峰为cIFN-B。

图4显示了实施例1中cIFN异构体经HSCCC分离得到的两种单体cIFN的HPLC检测图谱；

其中A表示实施例1中cIFN异构体，B表示图3中的I号洗脱峰，C表示图3中的II号洗脱峰。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现在一种双水相体系中，cIFN的两种异构体在其两相中的分配系数可以相差较大的倍数，从而使该双水相体系作为高速逆流色谱的固定相和流动相时，可以将cIFN的两种异构体进行有效分离。

在本发明中，cIFN是一种氨基酸序列重组的非天然存在的I型α干扰素，它可以通过本领域常规的方法获得。

如本文所用，“重组人复合α干扰素(cIFN)异构体”是指一种混合物，它含有两种二硫键异构体，这两种异构体中二硫键分别呈完整和断裂两种形式，化学性质非常相似，分子量最多仅相差4个质子(含有两对二硫键稳定的cIFN分子量为19300D)，在SDS-PAGE电泳图上表现为两条非常靠近的姊妹带。它可以通过本领域常规的方法得到，例如但不限于，毕赤酵母表达cIFN发酵上清液经联合多种分离纯化方法(如：Hiprep疏水层析、Blue Sepharose FF亲和层析、Superdex 75凝胶过滤层析等)制备得到的就是这种含有两种二硫键异构体的混合物。

在本发明中，高速逆流色谱(HSCCC)是指一种不用任何固态载体的液-液色谱技术，是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离。

在本发明中，可以使用本领域熟知的商品化的高速逆流色谱仪，例如但不限于美国Pharma Tech Research Corp.生产的CCC-1000和CCC-3000，ConwayCentrichrom Inc.产生的DP-1000，英国Brunel Institute of Bioengineering(BIB)产生的Brunel CCC，上海同田生物技术有限公司(Tauto Biotech Ltd.)生产的TautoTBE-200V型，Tauto TBE-300V型。优选上海同田生物技术有限公司(Tauto Bi otechLtd.)生产的Tauto TBE-200V型高速逆流色谱仪系统，所述的系统包括高速逆流色谱仪的主机、柱温控制装置、泵液装置、检测装置和结果处理装置)；所述的主机包括聚四氟乙烯管(直径1.8mm)缠绕在支架上形成多层螺旋管作为分离柱(柱容积为200mL)、进样器、主机转速控制装置。TBE-200V型高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司)，聚四氟乙烯管(直径1.8mm)缠绕在支架上形成多层螺旋管作为分离柱位于恒温夹套内，通过循环水浴(HX-1050，北京博医康实验仪器有限公司)控制分离柱的温度。进样圈体积20mL。通过无级变频调速控制主机转速为700-1000r/min。同时主机通过TBP-1002型泵(上海同田生化技术有限公司)进行泵液，流出液用4波段UV检测仪(上海康华仪器厂)进行检测，并连接浙大智达N2000色谱工作站记录检测结果。

一般而言，HSCCC中流动相的流动方向和主机的旋转方向都是可调的。在本发明中，主机的旋转方向规定为面对电机轴时顺时针方向为正转，由于电机与主机是通过皮带传动，因此，二者的旋转方向相同；将流动相从首端流入定义为正向。

在本发明中，主机的旋转方向和流动相的流动方向的组合可以有4种，包括正向旋转正向流动、正向旋转反向流动、反向旋转正向流动、和反向旋转反向流动。使用本发明优选的上海同田生物技术有限公司(Tauto Biotech Ltd.)生产的Tauto TBE-200V型高速逆流色谱仪系统进行重组人复合α干扰素(cIFN)异构体的分离时，优选高速逆流色谱仪反向旋转，流动相反向流动。

在本发明中，高速逆流色谱设备主机的旋转速度为600-1200转/分钟，较佳地为750-1000转/分钟，更佳地为850-950转/分钟；流动相的流速为0.5-1.5ml/分钟，较佳地为0.6-1.2ml/分钟，更佳地为0.7-1.0ml/分钟。

在本发明中，高速逆流色谱分离时的色谱柱温度为5-30℃，较佳地为10-25℃，更佳地为15-20℃。

如本文所用，“双水相”或“双水相体系”是指在高速逆流色谱中互不混溶的两相溶剂都是水相，而没有有机相。可以使用本领域常用的方法配制双水相体系，例如但不限于按所用双水相体系的组成称取所需的成相聚合物和成相盐，将两者分别溶于占所需量一半的蒸馏水中，充分混合，于分液漏斗中静置分相。静置后会分成上、下两相，其中上相也可以称为高速逆流色谱中的固定相，下相也可以称为高速逆流色谱中的流动相。

如本文所用，“分配系数”是指待分离的样品在双水相体系的上、下两相中的浓度之比。可以使用本领域熟知的方法获得分配系数，例如但不限于HPLC面积划分法、和蛋白浓度测定法，较佳地为HPLC面积划分法。

所述的HPLC面积划分法是将待测样品和双水相体系混合、搅拌使所有固体物完全溶解。静置分相，分别取上、下相进样，分别计算出上、下相中每个峰的面积，则样品中每个成分的分配系数K为：上相中该成分峰面积与下相中该成分峰面积之比，即K＝S_U/S_L(下标U和L分别表示上、下相)。

所述的蛋白浓度测定法是利用Bradford考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。将待测样品和双水相体系混合、搅拌使所有固体物完全溶解。静置分相，分别取上、下相用1cm光径的比色杯测A₅₉₅；以相同组成但不含蛋白质样品的上、下相加入到考马斯亮蓝溶液中作空白对照，用1cm光径的比色杯测A₅₉₅。计算分配系数K，K定义为测得上、下相的吸光度之比，即K＝AU/AL(下标U和L分别表示上、下相)。

在本发明中，用K1和K2分别表示cIFN异构体中两种cIFN蛋白单体a，b的分配系数。

在本发明中，所述的双水相体系中含有成相聚合物和成相盐，所述的成相聚合物选自聚乙二醇(PEG)，优选PEG，更优选PEG1000、PEG2000、PEG4000、和/或PEG6000；所述的成相盐选自无机酸和/或其盐、有机酸和/或其盐，例如磷酸、磷酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、硫酸、硫酸盐、或其组合，优选磷酸、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸柠檬酸钾、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、或其组合，更优选柠檬酸三钠和柠檬酸。

本发明优选的双水相体系是使K1和K2相差1-4倍的体系，更佳地是相差1.5-3倍的体系。

本发明的双水相体系优选自PEG-柠檬酸盐体系，以双水相体系的总重量为基准，其中含有10-18％(w/w)聚乙二醇(PEG)，10-18％(w/w)柠檬酸和其盐，以及余量的水；较佳地含有1-6％(w/w)PEG2000，8-12％(w/w)PEG4000，9-15％(w/w)柠檬酸盐，1-3％(w/w)柠檬酸，以及余量的水；更佳地含有2-4％(w/w)PEG2000，9-11％(w/w)PEG4000，10-13％(w/w)柠檬酸盐，1.2-3％(w/w)柠檬酸，以及余量的水；所述的柠檬酸盐优选柠檬酸三钠。

本发明的双水相体系的pH在cIFN蛋白生物活性pH范围内，即pH5-9，优选pH6-8。

主机转速为800-1000转/分钟；流动相流速为0.6-1.2ml/分钟。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、首次运用双水相高速逆流色谱将分子量仅相差4个质子的cIFN异构体进行了有效分离；

2、为蛋白质生物大分子的分离提供了一个理想而温和的环境，比在HPLC中利用有机溶剂分离好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

溶剂的配制

双水相体系的配制

根据所用双水相体系的组成称取所需的PEG和成相盐，将两者分别溶于占所需量一半的蒸馏水中，充分混合，于分液漏斗中静置分相，上下相分装500ml溶剂瓶，超声，抽滤，待用。

分离样品的制备

称量一定量PEG和成相盐，加入一定量的cIFN异构体样品溶解使其组成与所用分离体系相同(样品本身是溶液状，计算出比例，直接加入PEG和盐就可以)，轻微搅拌使所有固体物完全溶解。

分配系数的测定

HPLC面积划分法

固定相：C4柱(Grace Vydac公司)

流动相：A相：水+0.01％三氟乙酸(TFA)，B相：60％乙腈+30％二氧六环+10％水+0.01％TFA；

梯度洗脱条件：B相浓度0-5分钟，5％；5-55分钟，5％-60％；55-60分钟，60％。

双水相体系中上相(又称固定相)保留率的测定

将双水相体系中的上相(固定相)充满HSCCC分离柱，以一定的转速和旋转方向运转主机，同时以所需流速泵入双水相体系中的下相(流动相)，并收集溢出口流出的固定相；流动相从溢出口稳定流出时，记录所排出的固定相体积Ve。固定相保留率(R)定义为保留在分离柱内的固定相体积占分离柱总容积(t)的比例，R＝(Vt-Ve)/(Vt)。

高速逆流色谱分离操作

将双水相体系中的上相(固定相)充满HSCCC分离柱，并以一定的转速和旋转方向运转主机，同时以所需流速泵入双水相体系中的下相(流动相)；流动相从溢出口稳定流出时，即表明分离柱内的两相平衡已建立；经由进样圈进样。

实施例1

高速逆流色谱双水相体系分离cIFN异构体

材料和方法

TBE-200V型高速逆流色谱仪，购自上海同田生物技术有限公司

cIFN异构体，将cIFN发酵上清液先经过离子交换层析，再经过疏水层析制得。在SDS-PAGE条带19KD位置上呈现两条带，HPLC上呈两个峰，(见图1)，但质谱分析则为同一物质。

PEG2000、PEG4000，柠檬酸三钠，柠檬酸的来源如下：

名称	来源
		聚乙二醇(PEG)	上海化学试剂公司
柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾	上海化学试剂公司
		乙腈，二氧六环，甲醇，异丙醇，三氟乙酸等	国药化学试剂有限公司
低分子量标准蛋白	饶那生物工程公司

配制双水相体系：按质量比例3∶10∶12∶2称取PEG200036g，PEG4000120g，柠檬酸三钠144g，柠檬酸24g，加纯水876ml，超声搅拌溶解，倒入2L分液漏斗混合，静置分相，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相，超声，抽滤待用。

TBE-200V型高速逆流仪器，采取反接反转，调节主机转速为880r/min，流动相流速为0.8ml/min，温度控制在20℃左右。在此条件下固定相保留率＝36.7％。

上下相平衡后，开始进样约4ml，样品浓度为约0.3mg/ml，进样后，在检测仪波长214nm下调零点与斜率，同时将连接的色谱工作站通道打开开始记录。分离结果如图3所示。

将收集到的分离峰溶液转移至透析袋中，在4℃冰箱中进行反复透析和浓缩，直到基本除去溶液中柠檬酸盐，并浓缩到一定体积。利用建立的RP-HPLC方法检测分离前样品及分离处理后的两个洗脱峰。检测结果如图4所示，cIFN制备品种中两个单体含量分别约为55％和28％，经过HSCCC分离后，I号洗脱峰纯度为99.4％(b)，回收率达到90.9％；II号洗脱峰纯度为98.6％(c)，回收率达到92.3％。

实施例2

高速逆流色谱双水相体系分离cIFN异构体

材料和方法

TBE-200V型高速逆流色谱仪，购自上海同田生物技术有限公司

cIFN异构体，将cIFN发酵上清液先经过离子交换层析，再经过疏水层析制得。在SDS-PAGE上呈现两条带，HPLC上呈两个峰，(见图1)，但质谱分析则为同一物质。

PEG2000、PEG4000，柠檬酸三钠，柠檬酸，它们的来源同实施例1中所述。

采用TBE-200V型高速逆流仪器，配有恒流泵，15ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱体积为200ml，UV紫外检测器。按质量比例1∶8∶9∶1称取PEG200012g，PEG400096g，柠檬酸三钠108g，柠檬酸12g，加纯水972ml，超声搅拌溶解，倒入2L分液漏斗混合，静置分相，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相，超声，抽滤待用。

先用固定相充满整个柱体，然后开启高速逆流色谱仪，采取反接反转，调节主机转速为800r/min，流动相流速为1.2ml/min，温度控制在20℃左右。待整个体系建立动态平衡后，称量PEG20000.07g，PEG40000.55g，柠檬酸三钠0.62g，柠檬酸0.70g，以5ml样品溶解，由进样阀进样，在检测仪波长214nm下调零点与斜率，然后根据检测器紫外谱图，分别收集cIFN-A、cIFN-B。

将收集到的分离峰溶液冻干制备蛋白质或转移至透析袋中，在4℃冰箱中进行反复透析和浓缩，直到基本除去溶液中柠檬酸盐，并浓缩到一定体积。

经建立的HPLC分析，可以获得同实施例1相似纯度的cIFN-A和cIFN-B。

实施例3

高速逆流色谱双水相体系分离cIFN异构体

材料和方法

TBE-200V型高速逆流色谱仪，购自上海同田生物技术有限公司

cIFN异构体，将cIFN发酵上清液先经过离子交换层析，再经过疏水层析制得。在SDS-PAGE上呈现两条带，HPLC上呈两个峰，(见图1)，但质谱分析则为同一物质。

PEG2000、PEG4000，柠檬酸三钠，柠檬酸，它们的来源同实施例1中所述。

采用TBE-200V型高速逆流仪器，配有恒流泵，15ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱体积为200ml，UV紫外检测器。按质量比例6∶12∶15∶3称取PEG200072g，PEG4000144g，柠檬酸三钠180g，柠檬酸36g，加纯水768ml，超声搅拌溶解，倒入2L分液漏斗混合，静置分相，取其上层溶液(上相)为固定相，下层溶液(下相)为流动相，超声，抽滤待用。

先用固定相充满整个柱体，然后开启高速逆流色谱仪，采取反接反转，调节主机转速为1000r/min，流动相流速为0.6ml/min，温度控制在20℃左右。待整个体系建立动态平衡后，称量PEG20000.41g，PEG40000.821g，柠檬酸三钠1.028g，柠檬酸0.206g，以5ml样品溶解，由进样阀进样，在检测仪波长214nm下调零点与斜率，然后根据检测器紫外谱图，分别收集cIFN-A、cIFN-B。

将收集到的分离峰溶液冻干制备蛋白质或转移至透析袋中，在4℃冰箱中进行反复透析和浓缩，直到基本除去溶液中柠檬酸盐，并浓缩到一定体积。

经建立的HPLC分析，可以获得同实施例1相似纯度的cIFN-A和cIFN-B。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种重组人复合α干扰素异构体的分离方法，其特征在于，用高速逆流色谱进行分离，所述的高速逆流色谱条件为：

将5-26％(w/w)聚乙二醇，7-28％(w/w)无机或有机酸和其盐，和余量的水混合、静置得到双水相体系，上相为固定相，下相为流动相，重量百分比是以所述的双水相体系的总重量为基准；

高速逆流色谱仪主机转速为600-1200转/分钟；

流动相流速为0.5-1.5ml/分钟。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚乙二醇选自PEG1000、PEG2000、PEG4000、和/或PEG6000。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的聚乙二醇的分子量选自PEG2000、和/或PEG4000。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的双水相体系中含有1-6％(w/w)PEG2000，5-20％(w/w)PEG4000，6-24％(w/w)无机或有机酸盐，1-4％(w/w)无机或有机酸。

5.如权利要求1或4任一所述的方法，其特征在于，所述的无机或有机酸和其盐的酸根选自磷酸根、柠檬酸根；金属离子选自钠离子、钾离子。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高速逆流色谱仪主机转速为750-1000转/分钟。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相流速为0.6-1.2ml/分钟。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的两种二硫键异构体分别在双水相体系中的分配系数相差1-4倍。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的两种二硫键异构体分别在双水相体系中的分配系数通过高效液相色谱测定，或通过测定蛋白浓度确定。

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