CN101575633A - 一种利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化工程和酶工程技术领域，具体涉及一种利用猪肝、牛肝或羊肝等动物肝脏微粒体酶生物合成7－脱氢胆固醇的方法，包括以下步骤：(1)微粒体酶液的制备；(2)酶促转化反应；(3)皂化反应；(4)萃取。利用本发明可以生产出与化学合成完全一致的7－脱氢胆固醇。并且工艺简单易行，既可以降低维生素D3生产成本又减少环境污染。
Description
技术领域
本发明属于生化工程和酶工程技术领域。具体涉及一种利用动物肝脏微粒体酶合成7-脱氢胆固醇的方法
背景技术
维生素D3是人与动物生长、发育、繁殖、维持生命和保持健康必不可少的一种脂溶性维生素。它的主要作用是调节钙磷代谢，促进肠内钙磷吸收和骨质钙化，维持血钙和血磷的平衡，可用作药物制剂、食品和饲料添加剂等，在临床上还可用于治疗佝偻病、老年骨质疏松、甲状腺机能减退症等。目前维生素D3是采用光化学法生产，即以7-脱氢胆固醇(7-DHC)为原料，经紫外照射后转变为维生素D3前体(PreD3)，再热异构化而得。作为主生产原料的7-脱氢胆固醇，可采用多种不同的原料和工艺路线，通过化学合成法制备。如可从羊毛脂提取胆固醇，再进行酯化、氧化生成7-酮胆固醇酯，后者可还原成7α和7β-羟基胆固醇酯，再通过消除反应生成7-脱氢胆固醇。我国中科院理化所张建成等人的工艺路线，则以胆固醇为基本原料，经氧化、加成等一系列反应得到7-脱氢胆固醇。
目前，无论采用何种化学合成法制备原料7-脱氢胆固醇，都有反应步骤长，总产率不高，副反应多，条件难控制，效率偏低，成本高等缺点，从而影响维生素D3的生产成本、销售价格、市场推广。因此，研究开发一种工艺路线短、成本低的7-脱氢胆固醇生产方法变得十分迫切和必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的方法，它能够克服现有技术中的不足之处，缩短反应步骤，提高总产率，减少副反应，条件易于控制，效率高，成本低。
本发明的技术方案如下：
一种利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的方法，该方法包括以下步骤：
(1)微粒体酶液的制备
将切成块状的新鲜肝脏放入pH 7.3、0.1mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液中，在4℃条件下用组织匀浆机匀浆，过滤，滤液进行超声波细胞破碎，随后于4℃，12000r·min-1，10min离心分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2)酶促转化反应
将所述微粒体酶液和促进剂混匀，静置15min，加入一定量的角鲨烯或羊毛甾醇、还原型辅酶II、三磷酸腺苷、烟酰胺、MgCL2等混合物，反应5h，得到一种酶促转化反应液。
(3)皂化反应
步骤(2)反应液加入5ml 15％KOH-乙醇溶液，振荡反应1h，得到一种皂化反应液。
(4)萃取
步骤(3)反应液用有机溶剂萃取，萃取剂与反应液体积比为6∶1，萃取温度50℃，萃取时间1h，萃取结束后，氮气或减压条件下浓缩。
所述步骤(1)中的肝脏为猪肝、牛肝或羊肝等动物肝脏，缓冲溶液为0.01-0.1mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液，超声波处理条件为：功率150-400W、温度4-35℃、时间5-40min；
所述步骤(2)中混合物是1-100ug/ml的角鲨烯或羊毛甾醇、0.1-10mmol/L的还原型辅酶II、0.1-10mmol/L的三磷酸腺苷、1-100mmol/L的烟酰胺、1-10mmol/L MgCL2；
所述步骤(3)中皂化反应是加入15％KOH-乙醇溶液，在回流或密闭条件下进行，在60℃振荡反应1h；
所述步骤(4)中萃取剂石油醚加热到30-60℃，萃取剂与皂化反应液体积比为4∶1-8∶1，萃取时间1-4h，萃取2-3次。萃取后有机相在40℃氮气或减压条件下浓缩。
本发明的有益效果：
本发明从动物肝脏中提取微粒体酶，以角鲨烯或羊毛甾醇为原料，生物合成7-脱氢胆固醇的方法，简单易行，既可以降低维生素D3生产成本，又减少环境污染。
附图说明
图1为对照样品的高效液相色谱图。
图2-图6为不同条件下酶促转化反应液高效液相色谱图。
图7为标品7-脱氢胆固醇高效液相色谱图。
实施例1
(1)微粒体酶液的制备
将50g切成块状的新鲜猪肝脏放入pH 5、0.01mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液中，在4℃条件下用组织匀浆机匀浆，两层纱布过滤，滤液置于超声波细胞破碎仪中，处理条件为：功率400W、温度4℃、时间5min。随后离心(4℃，12000r·min-1，10min)分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2)酶促转化反应
将得到的20ml微粒体酶液添加20ml 1ug/ml角鲨烯、2ml 2mmol/L还原型辅酶II、1ml 5mmol/L三磷酸腺苷、2ml 20mmol/L烟酰胺，反应5h，得到一种酶促转化反应液。
(3)皂化反应
将所述酶促转化反应液加入5ml 15％KOH-乙醇溶液，30℃振荡反应2h，得到一种皂化反应液。
(4)萃取
将所述皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与反应液体积比为4∶1，萃取温度30℃，萃取时间1h。萃取结束后，有机相在40℃氮气或减压条件下浓缩、检测。色谱条件为：C18柱：5μm，250mm×4.6mm，流动相乙腈-异丙醇为7∶3，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm，结果参见附图2。
实施例2
(1)微粒体酶液的制备
将50g切成块状的新鲜猪肝脏放入pH 6.5、0.05mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液中，在4℃条件下用组织匀浆机匀浆，两层纱布过滤，滤液置于超声波细胞破碎仪中，处理条件为：功率150W、温度35℃、时间40min。随后离心(4℃，12000r·min-1，10min)分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2)酶促转化反应
将得到的20ml微粒体酶液添加20ml 40ug/ml角鲨烯、2ml 1mmol/L还原型辅酶II、1ml 2.5mmol/L三磷酸腺苷、2ml 30mmol/L烟酰胺，反应5h，得到一种酶促转化反应液。
(3)皂化反应
将所述酶促转化反应液加入5ml 15％KOH-乙醇溶液，70℃振荡反应1h，得到一种皂化反应液。
(4)萃取
将所述皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与反应液体积比为6∶1，萃取温度60℃，萃取时间4h。萃取结束后，有机相在40℃氮气或减压条件下浓缩、检测。色谱条件为：C18柱：5μm，250mm×4.6mm，流动相乙腈-异丙醇为7∶3，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm，结果参见附图3。
实施例3
(1)微粒体酶液的制备
将50g切成块状的新鲜羊肝脏放入pH 9、0.05mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液中，在4℃条件下用组织匀浆机匀浆，两层纱布过滤，滤液置于超声波细胞破碎仪中，处理条件为：功率300W、温度4℃、时间20min。随后离心(4℃，12000r·min-1，10min)分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2)酶促转化反应
将得到的20ml微粒体酶液添加20ml 40ug/ml角鲨烯、2ml 2mmol/L还原型辅酶II、1ml 5mmol/L三磷酸腺苷、2ml 40mmol/L烟酰胺，1ml 1mmol/L MgCL2，反应5h，得到一种酶促转化反应液。
(3)皂化反应
将所述酶促转化反应液加入5ml 15％KOH-乙醇溶液，60℃振荡反应2h，得到一种皂化反应液。
(4)萃取
将所述皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与反应液体积比为8∶1，萃取温度40℃，萃取时间4h。萃取结束后，有机相在40℃氮气或减压条件下浓缩、检测。色谱条件为：C18柱：5μm，250mm×4.6mm，流动相乙腈-异丙醇为7∶3，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm，结果参见附图4。
实施例4
(1)微粒体酶液的制备
将50g切成块状的新鲜牛肝脏放入pH 8、0.1mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液中，在35℃条件下用组织匀浆机匀浆，两层纱布过滤，滤液置于超声波细胞破碎仪中，处理条件为：功率250W、温度4℃、时间30min。随后离心(4℃，12000r·min-1，10min)分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2)酶促转化反应
将得到的20ml微粒体酶液加与1ml 1mmol/L促进剂混匀，静置15min，再添加20ml 100ug/ml角鲨烯、2ml 10mmol/L还原型辅酶II、1ml 10mmol/L三磷酸腺苷、2ml 100mmol/L烟酰胺，反应5h，得到一种酶促转化反应液。
(3)皂化反应
将所述酶促转化反应液加入5ml 15％KOH-乙醇溶液，70℃振荡反应2h，得到一种皂化反应液。
(4)萃取
将所述皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与反应液体积比为7∶1，萃取温度60℃，萃取时间4h。萃取结束后，有机相在40℃氮气或减压条件下浓缩、检测。色谱条件为：C18柱：5μm，250mm×4.6mm，流动相乙腈-异丙醇为7∶3，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm，结果参见附图5。
实施例5
(1)微粒体酶液的制备
将50g切成块状的新鲜猪肝脏放入pH 7.3、0.1mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液中，在4℃条件下用组织匀浆机匀浆，两层纱布过滤，滤液置于超声波细胞破碎仪中，处理条件为：功率300W、温度4℃、时间20min。随后离心(4℃，12000r·min-1，10min)分离，取上清液，得到所述微粒体酶液。
(2)酶促转化反应
将得到的20ml微粒体酶液加与1ml 1mmol/L促进剂混匀，静置15min，再添加20ml30ug/ml角鲨烯、2ml 2mmol/L还原型辅酶II、1ml 5mmol/L三磷酸腺苷、2ml 30mmol/L烟酰胺、1ml 10mmol/L MgCL2，反应5h，得到一种酶促转化反应液。
(3)皂化反应
将所述酶促转化反应液反应液加入5ml 15％KOH-乙醇溶液，60℃振荡反应1h，得到一种皂化反应液。
(4)萃取
将所述皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与反应液体积比为6∶1，萃取温度40℃，萃取时间1h。萃取结束后，有机相在40℃氮气或减压条件下浓缩、检测。色谱条件为：C18柱：5μm，250mm×4.6mm，流动相乙腈-异丙醇为7∶3，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长280nm，结果参见附图6。
Claims (3)
1、一种利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)微粒体酶液的制备
将切成块状的新鲜肝脏放入pH 5-9、0.01-0.1mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液中，在4-35℃条件下用组织匀浆机匀浆，过滤，滤液进行超声波细胞破碎，处理条件为：功率150-400W、温度4-35℃、时间5-40min，随后于4℃，12000r·min-1，10min离心分离，取上清液，得到所述微粒体酶液，
(2)酶促转化反应
将所述微粒体酶液和促进剂混匀，静置15min，加入1-100ug/ml的角鲨烯或羊毛甾醇、0.1-10mmol/L还原型辅酶II、0.1-10mmol/L三磷酸腺苷、1-100mmol/L烟酰胺、1-10mmol/L MgCL2反应5h，得到一种酶促转化反应液，
(3)皂化反应
将步骤(2)制备得的反应液加入5ml 10-15％KOH-乙醇溶液，在30-70℃振荡反应1-2h，得到一种皂化反应液，
(4)萃取
将步骤(3)制备得的皂化反应液用有机溶剂石油醚萃取，萃取剂与皂化反应液体积比为4∶1-8∶1，萃取温度30-60℃，萃取时间1-4h，萃取结束后，在氮气或减压条件下浓缩，得到7-脱氢胆固醇。
2、根据权利要求1所述的利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的新鲜肝脏为猪肝、牛肝或羊肝。
3、根据权利要求1所述的利用动物肝脏微粒体酶生物合成7-脱氢胆固醇的方法，其特征在于，
步骤(1)中的肝脏为猪肝，缓冲溶液为0.1mol/L的谷胱甘肽磷酸缓冲溶液，匀浆温度为4℃，超声波处理条件为：功率300W、温度4℃、时间20min；
步骤(2)中混合物是30ug/ml的角鲨烯或羊毛甾醇、2mmol/L的还原型辅酶II、5mmol/L的三磷酸腺苷、30mmol/L的烟酰胺、10mmol/L MgCL2；
步骤(3)所述皂化反应是加入15％KOH-乙醇溶液，在回流或密闭条件下进行，在60℃振荡反应1h；
步骤(4)中萃取剂石油醚加热到50℃，萃取剂与反应液B体积比为6∶1，萃取时间为2h，萃取2-3次，萃取后有机相在40℃氮气或减压条件下浓缩。
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