CN101574542A

CN101574542A - 载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料及其制备方法

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Publication number: CN101574542A
Application number: CNA2009103035139A
Authority: CN
Inventors: 张朝跃
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-06-22
Filing date: 2009-06-22
Publication date: 2009-11-11
Anticipated expiration: 2029-06-22
Also published as: CN101574542B

Abstract

本发明公开了一种载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料，该复合材料由外层不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料层和内层药理学上可接受的富含微孔的生物可降解基质薄膜材料层复合而成，其中内层是以生物可降解基质薄膜为基体材料，该基体材料由可增加其亲水性和细胞亲和性的物质进行表面改性处理后，其上还接种有转染了促肌腱愈合相关细胞因子基因的肌腱细胞。该复合材料的制备包括：先制备不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料复合物和表面改性后的生物可降解基质薄膜，再制备转基因肌腱细胞并将其接种到生物可降解基质薄膜上，最后经复合得到本发明的复合材料。本发明制备的复合材料生物相容性好，抗拉强度较强，能稳定肌腱内环境和促进肌腱损伤愈合。

Description

载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种外科用品的材料，尤其涉及一种修复肌腱损伤用的复合材料。

背景技术

在骨科领域，肌腱的损伤是临床常见的疾病，如外伤性肌腱损伤、自发性肌腱损伤、肿瘤或结核等病变。肌腱损伤后若不给予及时修复，会造成肢体功能的障碍，因而肌腱损伤后及时的手术修复和功能重建则成为骨外科关注的焦点。

肌腱损伤理想的修复原则为尽可能的恢复肌腱胶原纤维的连续性和生物力学强度，同时恢复其表面光滑，不与周围组织粘连。现代外科技术的发展使得肌腱损伤修复取得了很大进展，但在肌腱损伤实际愈合过程中，修复后的结构仍无法达到理想水平，而且粘连不可避免地发生，严重影响了患者肌腱生理功能的恢复。如何改变传统的肌腱修复方法、促进损伤肌腱愈合、尽早地进行功能锻炼以及如何有效地防止肌腱粘连，仍是一个世界性的难题。

对于如何防止肌腱粘连，国内外学者曾应用生物、非生物及药物等方法，诸如应用生物膜、硬脊膜、筋膜、血管、硅膜、含细胞因子的生物膜、透明质酸钠、纤维素封闭胶、自体腱鞘、金箔等物质，并进行了大量的研究，但迄今尚未取得突破性的进展，临床仍需二次手术进行肌腱松解。

目前还没有任何资料表明存在一种既能稳定肌腱内环境、促进损伤肌腱愈合，又能早期进行功能锻炼并可有效地防止肌腱粘连的修复方法或材料。随着医用材料学、细胞生物学、分子生物学及组织工程学的发展，从分子和基因水平对肌腱愈合过程的理解不断深入。利用细胞因子对肌建愈合进行调控，基因治疗的介入，组织工程技术和不可降解材料的应用，这些都为解决肌腱粘连这一难题带来了希望。通过采用理想的修复材料，并联合应用组织工程技术与转基因技术，将有可能为修复肌腱损伤提供一种理想的途径。因此，现阶段如何综合利用现有技术手段探寻一种理想的修复肌腱损伤的材料及方法，对于肌腱损伤的修复及肌腱功能的恢复将具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生物相容性好、抗拉强度较强、可塑性好、能稳定肌腱内环境和促进肌腱损伤愈合、且能有效防止肌腱粘连的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料，还提供一种操作简单、方便、成本较低的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料，其特征在于：所述复合材料由外层不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料层和内层药理学上可接受的富含微孔的生物可降解基质薄膜材料层复合而成(本发明中内、外层的区分是根据复合材料使用过程中距离损伤肌腱的远近确定，相应的直接接触损伤肌腱的材料层即可理解为最内层)，所述生物可降解基质薄膜材料层是以生物可降解基质薄膜为基体材料，所述基体材料由可增加其亲水性和细胞亲和性物质进行过表面改性处理，经表面改性处理后的所述基体材料上接种有转染了促肌腱愈合相关细胞因子基因的肌腱细胞。本发明的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料的外层(即所述的肌腱表面内固定聚酯材料层)的厚度一般控制在微米级到毫米级即可，没有严格的要求；内层(即所述的生物可降解基质薄膜材料层)的厚度一般控制在微米级。

上述技术方案中，所述的肌腱表面内固定聚酯材料层是通过研究肌腱生物力学特性(如断裂抗张强度800～2500N)和超微结构(如腱表面纳米级的小孔状结构)获得相关数据后制备出来，因此制备得到的肌腱表面内固定聚酯材料层能在最大程度上符合肌腱力学特性和生物学特性。所述的肌腱表面内固定聚酯材料层优选是由外层的富含微孔的聚酯材料薄膜和内层的聚酯材料网状结构复合而成。所述聚酯材料薄膜上的孔密度优选为1000～5000个/mm²，单孔的孔径大小一般为纳米级；该聚酯材料薄膜的厚度一般为微米级，而聚酯材料网状结构的厚度可以为毫米级。所述肌腱表面内固定聚酯材料层选用的聚酯材料优选为聚对苯二甲酸乙二酯(可外购)。本发明外层的肌腱表面内固定聚酯材料层质地柔顺、外表面光滑、含大量微孔(其功能在于允许营养物质及代谢产物的交换，但不允许组织的长入)，具有一定的可塑性、较强的抗拉能力(抗拉强度能达到800～2500N)及良好的生物相容性，可满足肌腱的生物力学要求，便于缝合固定。

上述技术方案中，所述生物可降解基质薄膜材料层的基体材料优选为聚羟基乙酸(poliglacolic acid，polyglycolide，PGA)、聚乳酸(polylatic acid，polylactide，PLA)或者聚乙交酯-丙交酯(Poly-lactic-glycolicacid，PLGA)制成的富含微孔的生物可降解基质薄膜(例如PGA筛网)，该生物可降解基质薄膜的孔密度优选为1000～5000个/mm²，单孔的孔径大小一般为微米级。所述的生物可降解基质薄膜材料层植入体内后会在较长时间内降解(与损伤肌腱的修复过程相匹配)，并被生物体吸收排除体外。

上述技术方案中，所述可增加生物可降解基质薄膜亲水性和细胞亲和性的物质优选为多肽、胶原、卵磷脂中的一种或多种。经表面改性处理后，所述生物可降解基质薄膜的亲水性和细胞亲和性较改性前明显增强，这将有利于后续转基因肌腱细胞的植入。

上述技术方案中，所述的促肌腱愈合相关细胞因子为胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子(PDGF)或转化生长因子-β(TGE-β)。

上述技术方案中，所述的转染了促肌腱愈合相关细胞因子基因的肌腱细胞可以为转染了促肌腱愈合相关细胞因子基因的兔屈趾肌腱细胞。所述的转染了促肌腱愈合相关细胞因子基因的肌腱细胞的生物学效应在所述生物可降解基质薄膜材料层的降解过程中会持续存在。

本发明还提供一种载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料的制备方法，其步骤为：先利用不可降解的聚酯材料制备不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料复合物，制备该肌腱表面内固定聚酯材料复合物时，先制备一富含微孔的聚酯材料薄膜，再制备一聚酯材料网状结构，然后将所述聚酯材料薄膜和聚酯材料网状结构复合叠加得到所述的肌腱表面内固定聚酯材料复合物；然后选用药理学上可接受的生物可降解基质薄膜材料物质制成富含微孔的生物可降解基质薄膜，用可增加其亲水性和细胞亲和性的物质对该生物可降解基质薄膜进行表面改性处理，再将转染了促肌腱愈合相关细胞因子基因的肌腱细胞接种于经过表面改性后的生物可降解基质薄膜上，得到生物可降解基质薄膜材料复合物；最后将所述生物可降解基质薄膜材料复合物复合在所述肌腱表面内固定聚酯材料复合物中的聚酯材料网状结构表面，得到本发明的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料。

上述载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料更具体的制备方法如下：

(1)不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料复合物的制备：首先利用不可降解的聚酯材料(优选用聚对苯二甲酸乙二酯)吹膜制成富含微孔的聚酯材料薄膜(微孔的大小与腱表面滑膜小孔的大小一致，一般为纳米级，孔密度建议控制在1000～5000个/mm²)，然后利用所述的聚酯材料喷制一层力学强度符合肌腱生物力学特性(例如抗拉强度满足800～2500N)的聚酯材料网状结构(可以用喷丝机喷制，通过改变网状结构的构型或喷丝的粗细或二者同时进行调整来满足不同的抗拉强度要求)，再通过常规的热压方法将所述富含微孔的聚酯材料薄膜复合在聚酯材料网状结构上，得到不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料复合物；制备该复合物时，厚度一般控制在微米级到毫米级即可；

(2)表面改性后的生物可降解基质薄膜的制备：首先利用溶液浇铸-粒子沥滤法将药理学上可接受的生物可降解基质薄膜材料物质(优选聚羟基乙酸、聚乳酸或者聚乙交酯-丙交酯)制成富含微孔的生物可降解基质薄膜，再将该生物可降解基质薄膜置于浸渍液中进行表面改性处理，处理完成后取出得到表面改性后的生物可降解基质薄膜，无菌条件下冻干备用；所述浸渍液为多肽、胶原、卵磷脂中的一种或多种溶于PBS缓冲液后配制得到，制备该生物可降解基质薄膜时，其厚度一般控制在微米级即可；

(3)转基因肌腱细胞的制备及接种：①肌腱细胞的分离：取动物或自体的肌腱组织，无菌条件下去除该肌腱组织的外膜，洗涤，以Handerson分步酶消化法分离出肌腱细胞后接种于培养瓶中；②肌腱细胞的培养：先进行原代培养，培养液为F12培养基加10％小牛血清，再加入青霉素、链霉素，并在37℃温度下培养，待细胞贴壁且长成单层后，用胰蛋白酶消化使肌腱细胞悬浮分布均匀，再进行传代培养；③真核表达载体的构建及基因转染：构建或选用一载促肌腱愈合相关细胞因子的真核表达载体(例如pcDNA3.1(+)-IGF-I)，然后取传代培养后获得的第二代肌腱细胞接种于培养瓶中，待细胞长满瓶底约70％时，用转染试剂盒转染所述的第二代肌腱细胞；④肌腱细胞接种：将转染了促肌腱愈合相关细胞因子基因的肌腱细胞接种于所述表面改性后的生物可降解基质薄膜上，并在适宜的条件下进行培养后得到载转基因肌腱细胞和经过表面改性的生物可降解基质薄膜材料复合物；所述促肌腱愈合相关细胞因子优选为胰岛素样生长因子-I、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子或转化生长因子-β；

(4)构建载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料：使用纤维蛋白胶将所述生物可降解基质薄膜材料复合物复合在所述肌腱表面内固定聚酯材料复合物中的聚酯材料网状结构表面上，得到本发明的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料。将得到的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料放置在二氧化碳培养箱内放置，定时更换培养液，以保证细胞营养。

上述的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料可用于修复损伤的肌腱，具体的修复方法为：首先，通过环裹包绕法用本发明的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料将肌腱断端缝接处覆盖(覆盖范围以肌腱断端为中心，包括肌腱断端及断端两侧的正常肌腱)，并用涤纶缝线固定，术中也可根据肌腱的具体情况将载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料修剪成带状或条索状并用涤纶缝线固定至肌腱断端缝接处。固定材料除可以使用不可降解的涤纶缝线，还可使用锁扣夹。

与现有技术相比，本发明的优点在于：一方面，本发明的肌腱内固定用复合材料上含大量微孔，允许营养物质及代谢产物的交换，但不允许组织的长入，因而可以稳定肌腱的内环境；另一方面，本发明的肌腱内固定用复合材料上含有大量转基因肌腱细胞，这种转基因肌腱细胞可以持续、高效的分泌促肌腱愈合的细胞因子，可以促进损伤肌腱愈合。本发明的肌腱内固定用复合材料不仅具有良好的生物相容性、较强的抗拉强度和一定的可塑性，而且使用其修复损伤的肌腱后既能稳定肌腱的内环境、促进损伤肌腱愈合，又能在缝合处理后的肌腱断端无张力的情况下，允许损伤肌腱早期持续地进行功能锻炼，有效的防止肌腱粘连；在肌腱断端缝接处再行内固定，可以增加肌腱断端的抗拉能力，这样早期进行功能锻炼不会使肌腱断裂，而且肌腱早期活动可以减轻甚至防止粘连。此外，本发明的肌腱内固定用复合材料的制备方法也相对简单，操作方便，成本较低，能够广泛应用于临床肌腱损伤的修复。而使用本发明肌腱内固定用复合材料的修复方法也非常容易操作，便于在修复手术中进行推广和应用。

附图说明

图1为本发明实施例的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料的层状结构示意图。

图例说明：

1、肌腱表面内固定聚酯材料层

11、聚对苯二甲酸乙二酯薄膜

12、聚对苯二甲酸乙二酯网状结构

2、生物可降解基质薄膜材料层

21、生物可降解基质薄膜

22、转染了IGF-I基因的肌腱细胞

具体实施方式

实施例：

如图1所示，一种呈带状的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料，该复合材料是由外层的不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料层1和内层的药理学上可接受的富含微孔的生物可降解基质薄膜材料层2复合而成。不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料层1又是由内、外两层结构复合而成，其外层是用聚对苯二甲酸乙二酯制成的富含微孔的聚对苯二甲酸乙二酯薄膜11(该薄膜上均布有纳米级小孔，孔密度4500个/mm²，孔径约为0.6nm，厚度为20μm)，其内层是用聚对苯二甲酸乙二酯制成的聚对苯二甲酸乙二酯网状结构12(厚度为1.1mm)。生物可降解基质薄膜材料层2的基体材料为生物可降解基质薄膜21(本实施例选用的是PGA筛网，筛网上均布有微米级小孔)，该PGA筛网由胶原(Boehringer Mannheim公司生产的I型胶原)进行过表面改性处理，经表面改性处理后的PGA筛网的内表面上接种有转染了IGF-I基因的肌腱细胞22。

本实施例的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料的构建步骤如下：

(1)不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料复合物的制备

首先利用原料聚对苯二甲酸乙二酯吹膜制成富含微孔的聚对苯二甲酸乙二酯薄膜11(该薄膜上均布有纳米级小孔，孔密度4500个/mm²，孔径约为0.6nm，厚度为20μm)，然后利用喷丝机喷制一层力学强度符合肌腱生物力学特性的聚对苯二甲酸乙二酯网状结构12(抗拉强度为900N，厚度为1.1mm)，再通过常规的热压方法将聚对苯二甲酸乙二酯薄膜11复合在聚对苯二甲酸乙二酯网状结构12上，得到不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料复合物；

(2)表面改性后的生物可降解基质薄膜的制备

本实施例的生物可降解基质薄膜材料层2的基体材料直接选用美国Tyco Healthcare公司生产的PGA筛网(美国Tyco Healthcare公司生产，DEXONMESH^TM，#8，其上均布有微米级小孔)，用以增加基体材料亲水性和细胞亲和性的物质选用Boehringer Mannheim公司生产的I型胶原，用PBS缓冲液配制得到浓度为1％的I型胶原溶液，然后将该PGA筛网置于I型胶原溶液中进行表面改性处理，浸渍时间为30min，取出得到表面改性后的生物可降解基质薄膜，无菌条件下冻干备用；

(3)转基因肌腱细胞的制备及接种

①肌腱细胞的分离：取出兔的屈趾肌腱，无菌条件下用剪刀去除该肌腱的外膜组织，Hank’s液(晶美生物技术公司，上海)洗涤3次，再以Handerson分步酶消化法分离出肌腱细胞并接种于培养瓶中；

Handerson分步酶消化法分离肌腱细胞的具体步骤包括：1)将整段肌腱加0.25％胰蛋白酶，37℃温度下恒温孵育30min后，弃上清液；2)将余下腱段剪碎成2mm²大小的碎块，再加入0.1％的胶原酶，37℃温度下恒温孵育90min；3)再加入含小牛血清的F12培养基(Sigma公司，美国)终止消化，1200r/min的转速下离心5min；4)弃上清液，加入F12培养基充分混匀，接种于培养瓶中；

②肌腱细胞的培养：先进行原代培养，培养液为F12培养基加10％小牛血清(晶美生物技术公司，上海)，再加入青霉素(100u/ml)和链霉素(100ug/ml)；在37℃、5％CO₂、饱和适度的条件下培养，待细胞贴壁且长成单层后，用0.25％胰蛋白酶(Sigma公司，美国)消化，使细胞悬浮分布均匀，再进行传代培养；

③真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-I的构建及基因转染：选用已构建好的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-I(该真核表达载体可外购)，然后取上述传代培养后得到的第二代肌腱细胞接种于25ml的培养瓶中，待细胞长满瓶底约70％时，用Lipopolyamine转染试剂盒(购自Promega公司)并根据其操作说明转染所述的第二代肌腱细胞；

④肌腱细胞接种：取转染了IGF-I基因的肌腱细胞，消化离心，用不含小牛血清的F-12培养基制成4.0×10⁵/ml的细胞悬液，将该细胞悬液接种到已制备的表面改性后的生物可降解基质薄膜的内表面，得到载转基因肌腱细胞和经过表面改性的生物可降解基质薄膜材料复合物；再将该生物可降解基质薄膜材料复合物放置在二氧化碳培养箱(Forma公司，美国)内培养4h，然后加入含10％小牛血清的完全培养液适量，继续置于二氧化碳培养箱内培养，以后定时更换培养液，以保证肌腱细胞营养；

(4)构建载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料

使用纤维蛋白胶将上述制得的载转基因肌腱细胞和经过表面改性的生物可降解基质薄膜材料复合物复合在已制备的肌腱表面内固定聚酯材料复合物的内表面上(即聚对苯二甲酸乙二酯网状结构上)，得到载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料。将构建得到的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料放置在二氧化碳培养箱内，定时更换培养液，以保证细胞营养。

将本实施例制备得到的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料修复损伤肌腱，具体的修复方法为：用环裹包绕法将肌腱断端缝接处覆盖，并用涤纶缝线固定。

本实施例制备得到的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料，其外层不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料层1的质地较柔顺，外表面较光滑且含大量微孔，具有一定的可塑性、较强的抗拉能力和良好的生物相容性，便于缝合固定，可满足肌腱的生物力学要求；其内层药理学上可接受的富含微孔的生物可降解基质薄膜材料层2植入体内后，在八周左右的时间内降解(与损伤肌腱的修复过程相匹配)，并被机体吸收排除体外。

载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料修复损伤的肌腱后，能够很好地稳定肌腱的内环境，促进损伤肌腱愈合，而且能早期进行功能锻炼并可有效的防止肌腱粘连。

Claims

1.一种载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料，其特征在于：所述复合材料由外层不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料层和内层药理学上可接受的富含微孔的生物可降解基质薄膜材料层复合而成，所述生物可降解基质薄膜材料层是以生物可降解基质薄膜作为基体材料，所述基体材料由可增加其亲水性和细胞亲和性的物质进行过表面改性处理，经表面改性处理后的所述基体材料上接种有转染了促肌腱愈合相关细胞因子基因的肌腱细胞。

2.根据权利要求1所述的肌腱内固定用复合材料，其特征在于：所述肌腱表面内固定聚酯材料层是由外层的富含微孔的聚酯材料薄膜和内层的聚酯材料网状结构复合而成；所述聚酯材料薄膜上的微孔的密度为1000～5000个/mm²，微孔的孔径大小为纳米级。

3.根据权利要求1或2所述的肌腱内固定用复合材料，其特征在于：所述肌腱表面内固定聚酯材料层所选用的聚酯材料为聚对苯二甲酸乙二酯。

4.根据权利要求1所述的肌腱内固定用复合材料，其特征在于：所述生物可降解基质薄膜材料层的基体材料为聚羟基乙酸、聚乳酸或者聚乙交酯-丙交酯制成的富含微孔的薄膜，该富含微孔的薄膜的孔密度为1000～5000个/mm²，单孔的孔径大小为微米级。

5.根据权利要求1所述的肌腱内固定用复合材料，其特征在于：所述可增加生物可降解基质薄膜亲水性和细胞亲和性的物质为多肽、胶原、卵磷脂中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的肌腱内固定用复合材料，其特征在于：所述的促肌腱愈合相关细胞因子为胰岛素样生长因子-I、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子或转化生长因子-β。

7.一种载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料的制备方法，其步骤为：先利用不可降解的聚酯材料制备不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料复合物，制备该肌腱表面内固定聚酯材料复合物时，先制备一富含微孔的聚酯材料薄膜，再制备一聚酯材料网状结构，然后将所述聚酯材料薄膜和聚酯材料网状结构复合叠加得到所述的肌腱表面内固定聚酯材料复合物；然后选用药理学上可接受的生物可降解基质薄膜材料物质制成富含微孔的生物可降解基质薄膜，用可增加其亲水性和细胞亲和性的物质对该生物可降解基质薄膜进行表面改性处理，再将转染了促肌腱愈合相关细胞因子基因的肌腱细胞接种于经过表面改性后的生物可降解基质薄膜上，得到生物可降解基质薄膜材料复合物；最后将所述生物可降解基质薄膜材料复合物复合在所述肌腱表面内固定聚酯材料复合物中的聚酯材料网状结构表面，得到本发明的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料。

8.根据权利要求7所述的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料复合物的制备：首先利用不可降解的聚酯材料吹膜制成富含微孔的聚酯材料薄膜，然后利用所述的聚酯材料喷丝制得一层力学强度符合肌腱生物力学特性的聚酯材料网状结构，再通过热压把所述富含微孔的聚酯材料薄膜复合在聚酯材料网状结构上，得到不可降解的肌腱表面内固定聚酯材料复合物；

(2)表面改性后的生物可降解基质薄膜的制备：首先利用溶液浇铸-粒子沥滤法将药理学上可接受的生物可降解基质薄膜材料物质制成富含微孔的生物可降解基质薄膜，再将该生物可降解基质薄膜置于浸渍液中进行表面改性处理，处理完成后取出得到表面改性后的生物可降解基质薄膜，无菌条件下冻干备用；所述浸渍液为多肽、胶原、卵磷脂中的一种或多种溶于PBS缓冲液后配制得到；

(3)转基因肌腱细胞的制备及接种：取动物或自体的肌腱组织，去外膜，洗涤，然后以Handerson分步酶消化法分离出肌腱细胞后接种于培养瓶中进行原代培养，培养液为F12培养基加小牛血清，再加入青霉素、链霉素在37℃温度下培养，待细胞贴壁且长成单层后，用胰蛋白酶消化使肌腱细胞悬浮分布均匀，再进行传代培养；构建或选用一载促肌腱愈合相关细胞因子的真核表达载体，然后取传代培养后获得的第二代肌腱细胞接种于培养瓶中培养，再利用转染试剂盒转染所述的第二代肌腱细胞；最后将转染了促肌腱愈合相关细胞因子基因的肌腱细胞接种于所述表面改性后的生物可降解基质薄膜上，进行培养后得到载转基因肌腱细胞和经过表面改性的生物可降解基质薄膜材料复合物；

(4)构建载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料：使用纤维蛋白胶将所述生物可降解基质薄膜材料复合物复合在所述肌腱表面内固定聚酯材料复合物中的聚酯材料网状结构表面上，得到载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料。

9.根据权利要求7或8所述的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料的制备方法，其特征在于：所述聚酯材料为聚对苯二甲酸乙二酯，所述聚酯材料薄膜上微孔的孔径为纳米级，微孔密度为1000～5000个/mm²。

10.根据权利要求7或8所述的载转基因细胞的肌腱内固定用复合材料的制备方法，其特征在于：所述药理学上可接受的生物可降解基质薄膜材料物质为聚羟基乙酸、聚乳酸或者聚乙交酯-丙交酯；所述促肌腱愈合相关细胞因子为胰岛素样生长因子-I、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子或转化生长因子-β。