CN101570737A - 产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法 - Google Patents
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Abstract
产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，它涉及一种细菌互营共培养体的分离筛选方法。它解决了现有产氢产乙酸细菌共培养体的分离筛选方法仅能筛选分离出来甲烷菌与产氢产乙酸细菌共培养体和硫酸盐还原菌与产氢产乙酸细菌共培养体两种产氢产乙酸细菌共培养体的问题。方法：一、将样品振荡；二、恒温振荡；三、将富集培养液接种并培养；四、制菌悬液A；五、将菌悬液A稀释后接种并培养；六、制菌悬液B；七、将菌悬液B稀释后接种并培养；八、重复步骤五到步骤七。本发明分离筛选出的细菌互营共培养体，经PCR－DGGE可知共培养体的DNA特征指纹图谱，并对条带切胶测序可知均为非产甲烷菌或硫酸盐还原菌与产氢产乙酸菌的互营共培养体。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌互营共培养体的分离筛选方法。
背景技术
产氢产乙酸菌(HPA)又叫专性质子还原菌，是一类真细菌，此细菌于1967年由Bryant首次发现。该细菌主要将短链脂肪酸、醇类等生成甲烷的前体，即乙酸和氢气。但产氢产乙酸细菌一般需要与耗氢的细菌伴生。在厌氧环境中，常见的耗氢细菌有产甲烷细菌和硫酸盐还原菌。而微生物间的这种食物和能量上的相互依赖关系称为“互营现象”，产氢产乙酸细菌与其耗氢伴生菌组成的共培养体就是互营现象的典型代表。
目前只有少数几种得到了纯培养物。在此情况下，分离筛选产氢产乙酸细菌互营共培养体成为一种必然选择。然而，由于产氢产乙酸细菌对自然生境的适应及其对生理生态条件的特殊需求原因，阻碍了此细菌在人工培养基上的复苏和培养，并使得将其分离纯化非常困难，目前产氢产乙酸细菌共培养体的分离筛选方法却只可分离筛选出两种产氢产乙酸细菌共培养体(甲烷菌与产氢产乙酸细菌共培养体和硫酸盐还原菌与产氢产乙酸细菌共培养体)，很大的限制了对产氢产乙酸细菌互营机制的研究。
发明内容
本发明目的是为了现有产氢产乙酸细菌共培养体的分离筛选方法仅能筛选分离出来甲烷菌与产氢产乙酸细菌共培养体和硫酸盐还原菌与产氢产乙酸细菌共培养体两种产氢产乙酸细菌共培养体的问题，而提出的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法。
产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法按以下步骤实现：一、将具有完整甲烷发酵功能的厌氧活性污泥放入装有数颗玻璃珠的灭菌血清瓶中，通入氮气后封口，而后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件下振荡处理1～3h；二、将经步骤一振荡培养后的厌氧活性污泥接种到装有富集培养基的灭菌血清瓶中，然后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件恒温培养1～3个月；三、按接种量为10％～20％(V/V)将富集培养液接种到液体培养基上培养1～3个月；四、重复操作步骤三至液体培养基对富集培养液降解速率与甲烷产量达到稳定为止，得菌悬液A；五、在氮气环境中，取1mL菌悬液A用无菌厌氧水倍比稀释，然后将1mL经倍比稀释的菌悬液A接种于固体培养基上，而后在35℃的条件下恒温培养至固体培养基上有菌落出现；六、挑取单菌落放在液体培养基中，然后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件恒温培养至有乙酸、甲烷、氢气和二氧化碳产生，得菌悬液B；七、取1mL菌悬液B用无菌厌氧水倍比稀释，然后将1mL经倍比稀释的菌悬液B接种于固体培养基上，而后在35℃的条件下恒温培养至固体培养基上有菌落出现；八、重复步骤六到步骤七25～30次，即可分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体。
本发明可成功分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体，而由PCR-DGGE图谱测试可知这共培养体均是非产甲烷菌或硫酸盐还原菌与产氢产乙酸菌的互营共培养体。
附图说明
图1为具体实施方式二十三中分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体(7-m-2a)扩大1.5万倍的电子显微镜照片，图2为具体实施方式二十三中分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体(11-O-1)扩大1.7万倍的电子显微镜照片。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法按以下步骤实现：一、将具有完整甲烷发酵功能的厌氧活性污泥放入装有数颗玻璃珠的灭菌血清瓶中，通入氮气后封口，而后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件下振荡处理1～3h；二、将经步骤一振荡培养后的厌氧活性污泥接种到装有富集培养基的灭菌血清瓶中，然后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件恒温培养1～3个月；三、按接种量为10％～20％(V/V)将富集培养液接种到液体培养基上培养1～3个月；四、重复操作步骤三至液体培养基对富集培养液降解速率与甲烷产量达到稳定为止，得菌悬液A；五、在氮气环境中，取1mL菌悬液A用无菌厌氧水倍比稀释，然后将1mL经倍比稀释的菌悬液A接种于固体培养基上，而后在35℃的条件下恒温培养至固体培养基上有菌落出现；六、挑取单菌落放在液体培养基中，然后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件恒温培养至有乙酸、甲烷、氢气和二氧化碳产生，得菌悬液B；七、取1mL菌悬液B用无菌厌氧水倍比稀释，然后将1mL经倍比稀释的菌悬液B接种于固体培养基上，而后在35℃的条件下恒温培养至固体培养基上有菌落出现；八、重复步骤六到步骤七25～30次，即可分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体。
本实施方式步骤一中具有完整甲烷发酵功能的厌氧活性污泥于2006年1月20号取自哈尔滨啤酒厂废水处理车间二沉池排放的剩余污泥。
本实施方式中所有培养基均在高压蒸汽灭菌锅中温度为115℃灭菌30min后方可使用。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中氮气的纯度为99.99％。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中以130r/min的振速振荡2h。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤二中富集培养基每1000mL由20g的丁酸钠、20g的丙酸钠、10mL的微量元素液、10mL的维生素溶液、20mL的瘤胃液、30mL的无菌发酵上清液、50mL的矿质元素液、1.0g的酵母膏、浓度为0.2％(w/v)的刃天青2滴、0.5g的半胱氨酸、1.96g的氯化钙和余量的蒸馏水组成，pH为7.0。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。
本实施方式中无菌发酵上清液由驯化完全且高效稳定的细菌富集物于5000r/min条件下离心15min并取上清液，然后采用经过121℃高压灭菌20min、孔径大小为0.22μm的微孔滤膜过滤得到；在配制富集培养基过程中无菌发酵上清液为最后一个加入。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是微量元素液由0.1g的ZnSO4·7H2O、0.03g的MnCl2·4H2O、0.3g的H3BO3、0.2g的CoCl2·6H2O、0.01g的CaCI2·2H2O、0.02g的NiCI2·6H2O、0.03g的Na2MoO4·2H2O和0.15g的FeCl2·4H2O溶于1000mL的蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四不同的是维生素溶液由20mg的烟酸、10mg的维生素B1、10mg的对氨基苯甲酸、50mg的维生素B6、2mg的维生素H、2mg的叶酸、10mg的盐酸吡哆醇、5mg的核黄素B2和5mg硫胺素溶于1000mL蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式四不同的是瘤胃液由牛解剖1～2h内取得的牛瘤胃液，然后经过两层纱布过滤，而后以速度为5000r/min离心15min后取上清液而得。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四不同的是矿质元素液由10.0g的KH2PO4、6.6g的MgCl2·6H2O、8.0g的NaCl、8.0g的NH4Cl和1.0g的CaCl2·2H2O溶于1000mL的蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中在温度为35℃、振速速率为130r/min的条件恒温培养2个月。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中将富集培养液按接种量为15％(V/V)接种到液体培养基上培养2个月。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三与步骤六中的液体培养基相同，其中液体培养基每1000mL由20g的丁酸钠、20g的丙酸钠、10mL的微量元素液、10mL的维生素溶液、20mL的瘤胃液、浓度为0.2％(w/v)的刃天青2滴、1g的半胱氨酸、3g的NaCl、0.1g的MgCl2、0.75g的K2HPO4、0.75g的KH2PO4、1.0g的NH4Cl、1.0g的酵母膏、1g的胰蛋白胨、1.96g的CaCl2和余量蒸馏水组成，pH值为7.0。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式十一不同的是微量元素液由0.1g的ZnSO4·7H2O、0.03g的MnCl2·4H2O、0.3g的H3BO3、0.2g的CoCl2·6H2O、0.01g的CaCI2·2H2O、0.02g的NiCI2·6H2O、0.03g的Na2MoO4·2H2O和0.15g的FeCl2·4H2O溶于1000mL的蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式十一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十一不同的是维生素溶液由20mg的烟酸、10mg的维生素B1、10mg的对氨基苯甲酸、50mg的维生素B6、2mg的维生素H、2mg的叶酸、10mg的盐酸吡哆醇、5mg的核黄素B2和5mg硫胺素溶于1000mL蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式十一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式十一不同的是瘤胃液由牛解剖1～2h内取得的牛瘤胃液，然后经过两层纱布过滤，而后以速度为5000r/min离心15min后取上清液而得。其它步骤及参数与具体实施方式十一相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中氮气的纯度为99.99％。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中固体培养基每1000mL由20g的丁酸钠、20g的丙酸钠、10mL的微量元素液、10mL的维生素溶液、20mL的瘤胃液、0.2％(w/v)刃天青2滴、1g的半胱氨酸、3g的NaCl、0.1g的MgCl2、0.75g的K2HPO4、0.75g的KH2PO4、1.0g的NH4Cl、1.0g的酵母膏、1g的胰蛋白胨、2％(w/w)的琼脂、1.96g的CaCl2和余量蒸馏水组成，pH值为7.0。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十六不同的是微量元素液由0.1g的ZnSO4·7H2O、0.03g的MnCl2·4H2O、0.3g的H3BO3、0.2g的CoCl2·6H2O、0.01g的CaCI2·2H2O、0.02g的NiCI2·6H2O、0.03g的Na2MoO4·2H2O和0.15g的FeCl2·4H2O溶于1000mL的蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式十六相同。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十六不同的是维生素溶液由20mg的烟酸、10mg的维生素B1、10mg的对氨基苯甲酸、50mg的维生素B6、2mg的维生素H、2mg的叶酸、10mg的盐酸吡哆醇、5mg的核黄素B2和5mg硫胺素溶于1000mL蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式十六相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式十六不同的是瘤胃液由牛解剖1～2h内取得的牛瘤胃液，然后经过两层纱布过滤，而后以速度为5000r/min离心15min后取上清液而得。其它步骤及参数与具体实施方式十六相同。
具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤六中液体培养基每1000mL由20g的丁酸钠、20g的丙酸钠、10mL的微量元素液、10mL的维生素溶液、20mL的瘤胃液、浓度为0.2％(w/v)的刃天青2滴、1g的半胱氨酸、3g的NaCl、0.1g的MgCl2、0.75g的K2HPO4、0.75g的KH2PO4、1.0g的NH4Cl、1.0g的酵母膏、1g的胰蛋白胨、1.96g的CaCl2和余量蒸馏水组成，pH值为7.0。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式二十不同的是微量元素液由0.1g的ZnSO4·7H2O、0.03g的MnCl2·4H2O、0.3g的H3BO3、0.2g的CoCl2·6H2O、0.01g的CaCI2·2H2O、0.02g的NiCI2·6H2O、0.03g的Na2MoO4·2H2O和0.15g的FeCl2·4H2O溶于1000mL的蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式二十相同。
具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式二十不同的是维生素溶液由20mg的烟酸、10mg的维生素B1、10mg的对氨基苯甲酸、50mg的维生素B6、2mg的维生素H、2mg的叶酸、10mg的盐酸吡哆醇、5mg的核黄素B2和5mg硫胺素溶于1000mL蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式二十相同。
具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施方式二十不同的是瘤胃液由牛解剖1～2h内取得的牛瘤胃液，然后经过两层纱布过滤，而后以速度为5000r/min离心15min后取上清液而得。其它步骤及参数与具体实施方式二十相同。
具体实施方式二十四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤六中在温度为35℃、振速速率为130r/min的条件恒温培养至有乙酸、甲烷、氢气和二氧化碳产生。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤七中在35℃的条件下恒温培养固体培养基上有菌落出现。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十六：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤八中重复步骤六到步骤七28次。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十七：本实施方式产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法按以下步骤实现：一、将具有完整甲烷发酵功能的厌氧活性污泥放入装有数颗玻璃珠的250mL灭菌血清瓶中，通入氮气后封口，而后在温度为35℃、振速速率为130r/min的条件下振荡处理2h；二、将经步骤一振荡培养后的厌氧活性污泥接种到装有60mL富集培养基的250mL灭菌血清瓶中，然后在温度为35℃、振速速率为130r/min的条件恒温培养2个月；三、按接种量为15％(V/V)将富集培养液接种到液体培养基上培养2个月；四、重复操作步骤三至液体培养基对富集培养液降解速率与甲烷产量达到稳定为止，得菌悬液A；五、在氮气环境中，取1mL富集后菌悬液A用无菌厌氧水倍比稀释，然后将1mL经倍比稀释后的菌液接种于固体培养基上，而后在35℃的条件下恒温培养至固体培养基上有菌落出现；六、挑取单菌落放在液体培养基上，然后在温度为35℃、振速速率为130r/min的条件恒温培养至有乙酸、甲烷、氢气和二氧化碳产生，得菌悬液B；七、取1mL菌悬液B然后用无菌厌氧水倍比稀释，然后将1mL经倍比稀释后的菌液接种于固体培养基上，而后在35℃的条件下恒温培养固体培养基上有菌落出现；八、重复步骤六到步骤七28次，即可分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体。
本实施方式步骤三中对将富集培养液接种到液体培养基上分别做10组平行样，经测得10组平行样中，其中有5组成功分离筛选出非产甲烷菌与产氢产乙酸菌的互营共培养体(可用7-m-2a作为代码)，有4组成功分离筛选出硫酸盐还原菌与产氢产乙酸菌的互营共培养体(可用11-O-1作为代码)，有1组成功分离选出2个产氢产乙酸细菌互营共培养体，将这2个产氢产乙酸细菌互营共培养体进行生理生化试验测试，可知这2个产氢产乙酸细菌互营共培养体为7-m-2a互营共培养体和11-O-1互营共培养体。对7-m-2a互营共培养体和11-O-1互营共培养体进行PCR-DGGE菌群结构分析，并从7-m-2a互营共培养体和11-O-1互营共培养体的DGGE图谱中切取条带进行DNA回收，重新扩增目的片断和电泳检测，然后对每个重新扩增条带的16S rDNA片断进行克隆和序列测定，将所得的序列片断在GenBank数据库进行同源性分析和检测，最终可验证出产氢产乙酸互营共培养体7-m-2a和11-O-1中主要存在以下3类细菌：(1)降解丙酸的专性质子还原菌，即产氢产乙酸菌，脱硫肠状菌(Desulfotomaculum sp.)Iso-W2；(2)能利用乙酸和氢气的Sedimentibacter sp.JN18_A14_H(属于消化链球菌科)；(3)降解氨基酸、苯甲酸、甲苯等的细菌，如羟基苯甲酸梭(Clostridiumhydroxybenzoicum)。
本实施方式中可分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体(7-m-2a和11-O-1)，7-m-2a经电镜扫描如图1所示，11-O-1经电镜扫描如图2所示，从图1与图2均可已很清楚的看出这两种共培养体中各组分菌体表面光滑、细胞呈杆状和梭状。
Claims (10)
1、产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，其特征在于产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法按以下步骤实现：一、将具有完整甲烷发酵功能的厌氧活性污泥放入装有数颗玻璃珠的灭菌血清瓶中，通入氮气后封口，而后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件下振荡处理1～3h；二、将经步骤一振荡培养后的厌氧活性污泥接种到装有富集培养基的灭菌血清瓶中，然后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件恒温培养1～3个月；三、按接种量为10％～20％(V/V)将富集培养液接种到液体培养基上培养1～3个月；四、重复操作步骤三至液体培养基对富集培养液降解速率与甲烷产量达到稳定为止，得菌悬液A；五、在氮气环境中，取1mL菌悬液A用无菌厌氧水倍比稀释，然后将1mL经倍比稀释的菌悬液A接种于固体培养基上，而后在35℃的条件下恒温培养至固体培养基上有菌落出现；六、挑取单菌落放在液体培养基中，然后在温度为35℃、振荡速率为100～200r/min的条件恒温培养至有乙酸、甲烷、氢气和二氧化碳产生，得菌悬液B；七、取1mL菌悬液B用无菌厌氧水倍比稀释，然后将1mL经倍比稀释的菌悬液B接种于固体培养基上，而后在35℃的条件下恒温培养至固体培养基上有菌落出现；八、重复步骤六到步骤七25～30次，即可分离筛选出产氢产乙酸细菌互营共培养体。
2、根据权利要求1所述的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，其特征在于步骤一中氮气的纯度为99.99％。
3、根据权利要求1或2所述的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，其特征在于步骤一中以130r/min的振速振荡2h。
4、根据权利要求3所述的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，其特征在于步骤二中富集培养基每1000mL由20g的丁酸钠、20g的丙酸钠、10mL的微量元素液、10mL的维生素溶液、20mL的瘤胃液、30mL的无菌发酵上清液、50mL的矿质元素液、1.0g的酵母膏、浓度为0.2％(w/v)的刃天青2滴、0.5g的半胱氨酸、1.96g的氯化钙和余量的蒸馏水组成，pH为7.0。
5、根据权利要求4所述的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，其特征在于微量元素液由0.1g的ZnSO4·7H2O、0.03g的MnCl2·4H2O、0.3g的H3BO3、0.2g的CoCl2·6H2O、0.01g的CaCI2·2H2O、0.02g的NiCI2·6H2O、0.03g的Na2MoO4·2H2O和0.15g的FeCl2·4H2O溶于1000mL的蒸馏水组成。
6、根据权利要求4所述的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，其特征在于维生素溶液由20mg的烟酸、10mg的维生素B1、10mg的对氨基苯甲酸、50mg的维生素B6、2mg的维生素H、2mg的叶酸、10mg的盐酸吡哆醇、5mg的核黄素B2和5mg硫胺素溶于1000mL蒸馏水组成。
7、根据权利要求4所述的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，其特征在于瘤胃液由牛解剖1～2h内取得的牛瘤胃液，然后经过两层纱布过滤，而后以速度为5000r/min离心15min后取上清液而得。
8、根据权利要求4所述的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，其特征在于矿质元素液由10.0g的KH2PO4、6.6g的MgCl2·6H2O、8.0g的NaCl、8.0g的NH4Cl和1.0g的CaCl2·2H2O溶于1000mL的蒸馏水组成。
9、根据权利要求1所述的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，其特征在于步骤三与步骤六中的液体培养基相同，其中液体培养基每1000mL由20g的丁酸钠、20g的丙酸钠、10mL的微量元素液、10mL的维生素溶液、20mL的瘤胃液、浓度为0.2％(w/v)的刃天青2滴、1g的半胱氨酸、3g的NaCl、0.1g的MgCl2、0.75g的K2HPO4、0.75g的KH2PO4、1.0g的NH4Cl、1.0g的酵母膏、1g的胰蛋白胨、1.96g的CaCl2和余量蒸馏水组成，pH值为7.0。
10、根据权利要求1所述的产氢产乙酸细菌互营共培养体的分离筛选方法，其特征在于步骤五中固体培养基每1000mL由20g的丁酸钠、20g的丙酸钠、10mL的微量元素液、10mL的维生素溶液、20mL的瘤胃液、0.2％(w/v)刃天青2滴、1g的半胱氨酸、3g的NaCl、0.1g的MgCl2、0.75g的K2HPO4、0.75g的KH2PO4、1.0g的NH4Cl、1.0g的酵母膏、1g的胰蛋白胨、2％(w/w)的琼脂、1.96g的CaCl2和余量蒸馏水组成，pH值为7.0。
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| CN102533609A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-04 | 农业部沼气科学研究所 | 沼气干发酵复合菌 |
| CN101875962B (zh) * | 2010-02-08 | 2012-11-28 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种生物电化学技术筛选高效产甲烷菌群的方法 |
| CN104293728A (zh) * | 2014-10-09 | 2015-01-21 | 中国科学院城市环境研究所 | 一种产氢产乙酸菌与硫酸盐还原菌优势菌群的构建方法 |
| CN108330090A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-07-27 | 常州大学 | 针对猪粪废弃物中温沼气发酵高含量挥发性脂肪酸的复合生物制剂的制备方法和用途 |
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2009
- 2009-06-15 CN CNA2009100722948A patent/CN101570737A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101875962B (zh) * | 2010-02-08 | 2012-11-28 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种生物电化学技术筛选高效产甲烷菌群的方法 |
| CN102533609A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-04 | 农业部沼气科学研究所 | 沼气干发酵复合菌 |
| CN104293728A (zh) * | 2014-10-09 | 2015-01-21 | 中国科学院城市环境研究所 | 一种产氢产乙酸菌与硫酸盐还原菌优势菌群的构建方法 |
| CN108330090A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-07-27 | 常州大学 | 针对猪粪废弃物中温沼气发酵高含量挥发性脂肪酸的复合生物制剂的制备方法和用途 |
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Open date: 20091104 |