CN101555237A - 一类新的单萜类化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,公布了一类新的单萜类化合物及其制备方法。化合物I由富含蒎烷类单萜苷的提取物经产羧酸酯酶的微生物转化,并利用硅胶柱层析方法对转化产物进行分离制备。化合物II由化合物I经产葡萄糖苷酶的微生物转化,并利用硅胶柱层析方法对转化产物进行分离制备。化合物I和化合物II的化学名分别为:(1R,3R,4R,6S,9S)-6-甲基-4-羟基-1-(β-D-葡萄吡喃糖氧基)-9-(羟甲基-7-氧代三环[4.3.0.03,9]壬烷-8-酮和(1R,3R,4R,6S,9S)-6-甲基-1,4-二羟基-9-(羟甲基-7-氧代三环[4.3.0.03,9]壬烷-8-酮。药理实验表明本发明公布的两个单萜化合物具有良好的镇痛效果。本发明的制备方法简单,成本低,对环境污染小。
Description
技术领域:
本发明涉及生物有机化学技术领域,涉及一类新的单萜类化合物及其制备方法。
背景技术:
近些年来,以天然产物中的活性单体为底物对其进行系统的结构改造和修饰,用以制备活性更好,毒性更低的化合物,是生物有机化学领域的研究热点同时也具有良好的应用前景。发明人多年来从事天然产物的化学与生物学研究,尤其对萜类化合物有着深入的研究。单萜类的含氧化合物多具有较强的生物活性,是医药、化妆品和食品工业的重要原料。
芍药中单萜及单萜苷类化合物是其活性的主要物质基础,芍药中代表性成分:芍药苷和芍药内酯苷为具有笼状蒎烷结构的单萜苷类化合物。发明人对芍药内酯苷和芍药苷的植物来源进行了深入的研究,发现这两种化合物存在于芍药和牡丹的根、茎、叶中,资源丰富。发明人以白芍为原料,采用溶剂提取、液-液萃取和柱层析等多种分离、纯化手段相结合,对芍药中有药理活性的蒎烷类单萜苷类化合物进一步分离、纯化,获得纯度达90%以上的白芍双苷(芍药内酯苷、芍药苷)组合物(专利号为ZL 02133298.3),并将其用于新药开发,经过药理、药效学的研究表明,白芍双苷具有良好的升白作用,(专利申请号为200510015840.0)。
基于白芍双苷的优良药理作用及独特的结构特点,在现有工作的基础上,发明人以富含蒎烷类单萜苷的提取物为原料,对其进行结构改造,期望得到活性更好的化合物。有文献报道:含芍药苷的制剂口服后,在肠道细菌分泌的β葡萄糖苷酶和酯酶的催化下转化成的芍药苷代谢产物,具有强烈抗人类先天性癫痫中枢性惊厥的作用(刘欣、崔翌,糖苷酶与药物研发《天然产物与研发》2005,17(2):223)。从结构上看,芍药苷和芍药内酯苷非常相似:C1位羟基与葡萄糖基结合成糖苷,C9位羟甲基与苯甲酸成酯。因而我们认为将芍药内酯苷的苯甲酰基和葡萄糖基分别水解得到的两个新化合物很可能具有良好的生物学活性。初步药理实验证明两个新的化合物具有良好的镇痛作用,同时这两个化合物还可作为先导化合物,对其做进一步的结构修饰,如烷基化、酰基化及酯化,可以得到一类结构类似,但具有多种不同生物学活性的化合物。发明人最初的技术路线是分别利用碱和酸将原料的苯甲酰基和葡萄糖基水解得到相应的化合物,但实际操作发现在强碱、强酸条件下,生成的目标产物不稳定,产生多种副产物,使目标产物收率极低。因此难以通过化学方法获得从理论上看较容易得到的化合物I、II。因而寻求一种新的试验方法来获得稳定且产率高的目标产物是必需的。
发明内容:
本发明的一个目的在于公开一类新的单萜类化合物;本发明的另一个目的在于公开这类单萜化合物的制备方法。本发明的单萜类化合物其结构式为:
化合物I 化合物II
化合物I的制备方法:
1)微生物培养:将产羧酸酯酶的菌体的固体斜面接种于查氏培养基中,置于恒温摇床于28℃、250rpm震荡培养48h。
2)加入底物:将富含蒎烷类单萜苷的组合物溶于水中,配制成浓溶液。加入已培养了48h的菌体发酵液中,同样条件下继续培养72h。
3)发酵液的处理:发酵液抽滤后收集滤液,在减压条件下低温浓缩至小体积,用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液合并后减压浓缩,真空干燥得粗粉。
4)转化产物的分离纯化:将步骤3)得到的粗粉用硅胶柱层析分离,以二氯甲烷:甲醇梯度洗脱,分段收集,通过TLC检测,合并单一点的洗脱液,减压浓缩,得到白色晶体即为化合物I。其纯度经薄层色谱和高效液相色谱(检测器:ELSD)检测达99%以上。
化合物II的制备方法:
1)微生物培养:将产葡萄糖苷酶的菌体的固体斜面接种于查氏培养基中,置于恒温摇床于28℃、250rpm震荡培养48h。
2)加入底物:将化合物I溶于水中,配制成浓溶液。加入已培养了48h的菌体发酵液中,同样条件下继续培养72h。
3)发酵液的处理:发酵液抽滤后收集滤液,在减压条件下低温浓缩至小体积,用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液合并后减压浓缩,真空干燥得粗粉。
4)转化产物的分离纯化:将步骤3)得到的粗粉用硅胶柱层析分离,以二氯甲烷:甲醇梯度洗脱,分段收集,经TLC检测,合并单一点,减压浓缩,得棕色油状物即为化合物II。其纯度经薄层色谱和高效液相色谱(检测器:ELSD)检测达99%以上。
化合物I结构鉴定:
化合物I为白色结晶,薄层色谱法检查时无紫外吸收,硫酸显色为褐色。UV谱(MeOH)中,无紫外吸收。质谱(图1)中显示[M+Na]+为399,其分子量可确定为376。IR光谱中(图2)1748cm-1处可见内酯羰基的特征吸收。1H-NMR谱中(图3)给出一组葡萄糖片断质子信号[δ4.96(1H,d,glc-1′H),2.94-3.19(4H,glc-H),4.02,3.59(2H,glc-6′H)],一个甲基质子信号[δ1.31(3H,s)],三个连氧碳上的质子信号[δ4.46,4.49(2H,d)与4.02(1H,t)]和五个烷基质子信号[δ1.74(1H,d);2.19(1H,dd),3.61(1H),1.79(1H,dd);2.58(1H,t)]。没有出现芍药内酯苷单取代苯基的特征质子信号,但在低场区其质子信号峰的裂分情况和化学位移与芍药内酯苷非常相似。13C-NMR谱(图4)中给出一组葡萄糖碳信号[δ97.9、70.3、73.3、76.9、77.0、61.3],一个羰基碳信号[δ175.5],四个连氧碳信号[δ90.3、66.3、56.2、85.3]和五个烷基碳信号[δ40.9、40.0、26.8、58.4、20.1]。比芍药内酯苷少了一组苯甲酰碳信号。基于以上数据分析,鉴定化合物I为芍药内酯苷去苯甲酰基产物,分子式为C16H24O10,化学结构为:
[化学名](1R,3R,4R,6S,9S)-6-甲基-4-羟基-1-(β-D-葡萄吡喃糖氧基)-9-(羟甲基)-7-氧代三环[4.3.0.03,9]壬烷-8-酮
化合物II结构鉴定:
化合物II为白色结晶。硫酸显色为棕黄色。质谱(图5)显示[M]+为214,其分子量可确定为214。IR光谱中(图6)3445cm-1为羟基峰,1758cm-1为内酯的羰基峰。1H-NMR谱(图7)给出一个甲基的氢信号[δ1.15(3H,s)],三个连氧的氢信号[δ4.97(1H,t),5.70(1H,d);6.01(1H,d)]和四个烷基的氢信号[δ2.19(1H,dd);2.67(1H,dd),2.01(1H,dd);2.81(1H,dd)]。没有出现芍药内酯苷单取代苯基的特征质子信号和葡萄糖质子信号,但在低场区其质子信号的裂分情况和化学位移与芍药内酯苷非常相似。13C-NMR谱(图8)中给出五个连氧碳信号[δ209.8、169.5、139.3、121.1、74.3],五个烷基碳信号[δ71.9、39.2、38.6、36.6、24.1]。比芍药内酯苷少了一组苯甲酰碳信号和葡萄糖碳信号。利用HSQC谱(图9),可知5.70(1H,d)、6.01(1H,d)为121.1碳(9位羟甲基碳)上的质子信号;4.9(1H,t)为74.3碳(4位碳)上的质子信号;3.65(1H,t)为36.6碳上的质子信号;2.81(1H,dd)、2.67(1H,dd)为38.6碳上的质子信号;2.19(1H,dd)、2.01(1H,dd)为39.8碳上的质子信号;1.15(3H,s)为24.1碳(甲基)上的质子信号。HMBC谱中(图10),2.19(1H,dd,)、2.01(1H,dd,)两个质子与6位上的甲基碳信号δ24.1有远程相关,可判定为5位碳(δ39.8)上的两个质子;3.65(1H,t)与8位羰基碳信号δ209.8有远程相关,可判定为3位碳(δ36.6)上的质子,同时3.65(1H,t)与139.3碳有远程相关,可判定δ139.3为1位上的碳信号;2.81(1H,dd)、2.67(1H,dd)两个质子与1位碳δ139.3有远程相关,可判定为2位碳(δ38.6)上的两个质子;δ71.9与4位碳(δ74.3)上的质子4.97(1H,t,4H)有远程相关,可判定其为9位碳信号。基于以上数据分析,鉴定化合物II为芍药内酯苷去苯甲酰基和葡萄糖基的产物,分子式为C10H1405,化学结构为
[化学名](1R,3R,4R,6S,9S)-6-甲基-1,4-二羟基-9-(羟甲基)-7-氧代三环[4.3.0.03,9]壬烷-8-酮
本发明制备的新的单萜类化合物具有较好的镇痛作用。
发明人用生物转化的方法,分别利用具有羧酸酯酶和葡萄糖苷酶活性的真菌将蒎烷类单萜苷的苯甲酰基和葡萄糖基温和的水解掉,转化产物单一,转化率可达92%,目标产物的总收率在63%以上。因而该方法与化学方法相比具有明显的优势。
本发明的优点是:首次以芍药中有代表性的活性蒎烷类单萜苷的提取物为原料,通过微生物转化法得到两个新的单萜类化合物,本发明的制备方法简单,成本低,对环境污染小,得到的两个全新活性单体化合物,可作为先导化合物,做进一步结构修饰后,可以获得一大类新的结构类似,但具有多种生物学活性的化合物,也可以直接将其开发成高活性的新药。
附图说明:
图1:化合物I的质谱
图2:化合物I的IR光谱
图3:化合物I的1H-NMR谱图
图4:化合物I的13C-NMR谱图
图5:化合物II的质谱
图6:化合物II的IR光谱
图7:化合物II的1H-NMR谱图
图8:化合物II的13C-NMR谱图
图9:化合物II的HMQC谱
图10:化合物II的HMBC谱
图11:化合物I的1H-NMR谱和13C-NMR谱归属表
图12:化合物II的1H-NMR谱和13C-NMR谱归属表
具体实施方式
实验例1:
1、化合物I、II的镇痛作用--大鼠扭体实验
实验方法:取雄性大鼠50只,随机分为空白对照组,阳性对照组,白芍双苷注射液组(100mg/kg)、化合物I组(100mg/kg)及化合物II组(100mg/kg),每组各10只动物。分别尾静脉注射生理盐水,阳性药(康莱特注射液),白芍双苷注射液,化合物I的盐溶液及化合物I I的盐溶液,给药30分钟之后,腹腔注射1%醋酸(0.5ml/只),观察并记录注射醋酸后0-15分钟及15-30分钟两个时间段内扭体次数。如表1所示,化合物I、II能显著减少大鼠扭体反应次数,与白芍双苷注射液相比,镇痛作用稍强。阳性对照药康莱特注射液与空白组相比也具有显著性差异。
疼痛抑制率=(生理盐水组扭体均数-药物扭体均数)/生理盐水组扭体均数
表1化合物I、II对醋酸致大鼠扭体反应的影响
*:p<0.05,**:p<0.01,均与空白组比较
2.化合物I、II的镇痛作用--小鼠热板实验
实验方法:实验前首先筛选小鼠,将反应潜伏期小于5秒,大于30秒者剔除,取合格雌性小鼠90只,随机分为空白对照组,阳性对照组,白芍双苷注射液组(50mg/kg)、化合物I组(50mg/kg)及化合物II组(50mg/kg),每组各18只动物,给药前测定两次痛阈值(两次间隔5分钟),取其均值为其基础痛阈值,分别尾静脉注射生理盐水,阳性药(康莱特注射液),白芍双苷注射液,化合物I的盐溶液及化合物II的盐溶液。给药后15、30、45、60、90分钟分别将小鼠置于54.5℃±0.5℃的恒温热板上,以小鼠舔后足为痛反应指标,测定其痛阈值,并计算出痛阈提高百分率。如表2、3所示阳性组与给药组均表现出显著的阵痛趋势。
痛阈提高百分率=(给药后痛阈值-基础痛阈值)/基础痛阈值
表2 化合物I、II镇痛作用(小鼠热板法)
*:p<0.05 **:p<0.01,与各自给药前比较
表3 化合物I、II痛阈提高百分率
实施例2:
干燥芍药药材切片1Kg,用水煮沸提取2次,每次2小时,提取液过滤后通过反向吸附树脂柱,再用醇-水溶液(50%)洗脱,洗脱液浓缩后用氧化铝柱层析,得富含蒎烷类单萜苷的提取物12.5g(经液相检测芍药内酯苷含量为42.2%)。蒎烷类单萜苷的提取物5g,溶解后加入到已培养48h的菌体[梅林青霉3.4474(xxl)]发酵液中,继续培养72h后取下摇瓶。发酵液抽滤去除菌丝体,滤液减压浓缩至小体积,用等量乙酸乙酯萃取3遍,萃取液合并后减压浓缩,真空干燥得12g粗粉。将该粗粉用甲醇溶解,拌入36g100-140目硅胶,挥发溶剂至干,待上样。取200g 200-300目硅胶,湿法装柱,然后加入拌样硅胶,进行柱层析。以二氯甲烷∶甲醇梯度洗脱(20∶1,15∶1,12∶1),分段收集,经TLC检测,收集12∶1洗脱部分,得白色粉末1040mg(收率63%)即为化合物I。
实施例3:
化合物I 500mg,溶解后加入到已培养48h的菌体[总状共头霉3.264(xxl)]发酵液中,继续培养72h后取下摇瓶。发酵液抽滤除去菌丝体,滤液减压浓缩至小体积,用等量乙酸乙酯萃取3遍,萃取液合并后减压浓缩,真空干燥得600mg粗粉。将该粗粉用甲醇溶解,拌入1.8g100-140目硅胶,挥发溶剂至干,待上样。取24g 200-300目硅胶,湿法装柱,然后加入拌样硅胶,进行柱层析。以二氯甲烷∶甲醇(30∶1)为洗脱剂,分段收集,经TLC检测,合并单点,得白色粉末200mg(收率70%)即为化合物II。
实施例4:
化合物I 2.5g,与微晶纤维素2.25g及硬脂酸镁0.25g混合,混合物用于打片,每片重0.2g,每片含化合物I 0.1g。
实施例5:胶囊剂的制备
化合物II 2.5g,与玉米淀粉2.5g,加水制成软材,过12目筛造粒,干燥,制得颗粒,装入胶囊,每粒胶囊内容物重0.2g,含化合物II 0.1g。
实施例6:颗粒剂的制备
化合物II 2.5g,淀粉5.0g,糖粉2.0g。将化合物I、药用淀粉和糖粉分别过100目筛后混合均匀,用适量乙醇制粒,于60度干燥,经整粒机整粒,分装即得。
实施例7:注射剂的制备
化合物I 2.0g,甘油20ml,注射用水200ml。将处方量化合物I加入20%甘油溶液100ml中,搅拌至溶解,加入1‰活性炭,60℃加热搅拌30min,过滤,补加注射用水至200ml,无菌条件下0.22μm微孔滤膜过滤,灌装于5ml安瓿中,封口,115℃灭菌30min。
Claims (5)
2、如权利要求1所述的一类新的单萜类化合物,其特征在于:当R为葡萄糖基时,其化合物为(1R,3R,4R,6S,9S)-6-甲基-4-羟基-1-(β-D-葡萄吡喃糖氧基)-9-(羟甲基)-7-氧代三环[4.3.0.03,9]壬烷-8-酮(I),当R为H时,其化合物为(1R,3R,4R,6S,9S)-6-甲基-1,4-二羟基-9-(羟甲基)-7-氧代三环[4.3.0.03,9]壬烷-8-酮(II)。
3、一种如权利要求1或2所述的一类新的单萜类化合物的制备方法,其特征在于:化合物(I)的制备方法为:以富含蒎烷类单萜苷的提取物为底物,利用产羧酸酯酶的微生物对底物进行生物转化,用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取、利用硅胶柱层析进行转化产物的制备分离;化合物(II)制备方法为:以化合物I为底物,利用产葡萄糖苷酶的微生物对底物进行生物转化,用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取、利用硅胶柱层析进行转化产物的制备分离。
4、如权利要求1或2所述的一类新的单萜类化合物,其特征在于:
该类化合物可与药学可接受的载体结合制成各种单方药物制剂。
5、如权利要求1所述的一类新的单萜类化合物在制备镇痛药物中的应用。
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