CN101553262A - 原弹性蛋白用于组织修复或恢复的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及原弹性蛋白以及使用弹性材料的组织修复和恢复。本文公开了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法，其包括加热具有碱性pH的原弹性蛋白溶液用以在溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。本文还公开了根据该方法制备的弹性材料及其应用。

Description

原弹性蛋白用于组织修复或恢复的用途
技术领域
本发明涉及原弹性蛋白以及使用弹性材料的组织修复和恢复。
背景技术
弹性蛋白是主要发现于皮肤、血管、肺以及需要一定程度的弹性来实现功能的其它组织和器官中的细胞外基质蛋白质。当原弹性蛋白分子上的赖氨酸残基通过赖氨酰氧化酶与其它原弹性蛋白上的赖氨酸残基发生交联时，形成弹性蛋白。
预期弹性蛋白可用于包括组织修复和恢复的医学应用以及为具有预定弹性的医学装置提供生物相容性表面。在这些应用中，一般通过使用与赖氨酸和其它带电残基反应的试剂(例如戊二醛)使重组原弹性蛋白分子上赖氨酸残基的侧链发生交联来产生弹性蛋白。
从重组原弹性蛋白产生弹性蛋白的一个问题是交联剂(例如戊二醛)可能在一些个体中具有毒性或者另外导致不希望的组织反应或过敏。另外，由于弹性蛋白的弹性性质倾向于依赖赖氨酸侧链的交联，因此弹性蛋白可提供的弹性性质的范围是有限的。同样地，出于交联的需要，排除了通过某些标准施用途径(例如注射)进行有效递送，这是因为在没有特殊防范的情况下，交联剂可能在递送至弹性蛋白预定形成部位之前便导致弹性蛋白的形成。
需要可在不使用交联剂的情况下形成的弹性材料。
还需要可通过注射施用到组织以在与注射部位相连的部位形成弹性材料的组合物。
还需要具有在弹性蛋白或用于组织修复、填充(bulking)和创伤愈合的其它蛋白质和生物材料中未发现之弹性性质的弹性材料。
还需要用于持续释放或受控释放药物化合物和组织因子的新型制剂，以及需要新的细胞和组织基质。
发明内容
本发明试图至少使上述局限性或问题之一最小化，在一些实施方案中，提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法。所述方法包括加热具有碱性pH的原弹性蛋白溶液用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料的步骤。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法。所述方法包括加热碱性pH至少约7.5和至少约25mM盐浓度的原弹性蛋白溶液用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法。所述方法包括向温度约37℃的原弹性蛋白溶液提供碱性pH用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法。所述方法包括向原弹性蛋白溶液提供碱性pH并使该溶液的温度升至约37℃，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法。所述方法包括将原弹性蛋白加至具有碱性pH及温度约为37℃的溶液中，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法。所述方法包括将原弹性蛋白加至具有碱性pH的溶液中并使该溶液的温度升至约37℃，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法。所述方法包括调节具有碱性pH且温度约为37℃的原弹性蛋白溶液的盐浓度，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法。所述方法包括调节具有碱性pH的原弹性蛋白溶液的盐浓度并使该溶液的温度升至约37℃，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于填充组织或矫正组织缺损的填充剂，所述填充剂由上文所述方法产生的弹性材料形成。
在另一个实施方案中，本发明提供了创伤密封剂(sealant)，所述密封剂由上文所述方法产生的弹性材料形成。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有由上文所述方法产生之弹性材料的假体或医学装置。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于形成弹性材料的包含第一容器、第二容器和书面说明的试剂盒，所述第一容器包含原弹性蛋白，所述第二容器包含待加入到原弹性蛋白以形成包含原弹性蛋白之碱性溶液的试剂，所述书面说明是关于从所述原弹性蛋白和所述试剂形成弹性材料的指导。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于形成弹性材料的组合物，其包含具有碱性pH以及阻止溶液中原弹性蛋白形成弹性材料之温度的原弹性蛋白溶液。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于从原弹性蛋白形成弹性材料的装置，所述装置包含第一腔室、第二腔室、分配手段，所述第一腔室包含原弹性蛋白溶液，所述第二腔室包含用于调节所述第一腔室中溶液pH的试剂，所述分配手段用于分配所述第一腔室的溶液以及所述试剂以形成所述溶液和试剂的混合物，从而在所述混合物中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于从原弹性蛋白形成弹性材料的装置，所述装置包含第一腔室、第二腔室和分配手段，所述第一腔室包含具有碱性pH的原弹性蛋白溶液，所述第二腔室包含用于向所述第一腔室的溶液提供约150mM或更低盐浓度的溶液，所述分配手段用于分配所述第一腔室和第二腔室的溶液以形成溶液混合物，从而在所述混合物中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一个实施方案中，本发明提供了持续或受控释放的植入物，所述植入物是由上文所述方法产生的弹性材料形成的。
在另一个实施方案中，本发明提供了细胞或组织基质，所述细胞或组织基质是由上文所述方法产生的弹性材料形成的。
在另一个实施方案中，本发明提供了形成原弹性蛋白之纯化溶液的方法，其包括：
-提供原弹性蛋白溶液；
-调节所述溶液pH以形成具有碱性pH的溶液，使得原弹性蛋白在该溶液中沉淀；
-取出所述沉淀物；
-将所取出的沉淀物添加至具有基本上非碱性pH和/或基本上低温的溶液，使得所述沉淀物分散于溶液中以形成原弹性蛋白的纯化溶液。
在另一个实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白溶液形成弹性材料的方法，其包括：
-(1)提供原弹性蛋白溶液；
-(2)调节所述溶液pH以形成具有碱性pH的溶液，使得原弹性蛋白在溶液中沉淀；
-(3)取出所述沉淀物；
-(4)将所取出的沉淀物添加至具有基本上非碱性pH和/或基本上低温的溶液，使得所述沉淀物分散于溶液中；以及
-(5)使所述溶液的温度升至约37℃，以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
附图说明
图1：注射后第15天从大鼠注射部位收集的H&E染色切片。
图2：包埋有成纤维细胞的弹性材料之H&E染色切片。细胞存在于弹性材料内的孔中。
图3：SEM成像显示成纤维细胞片层在弹性材料上生长。
实施方案详述
本发明人发现，可以通过调节溶液的碱度、温度或盐浓度而由原弹性蛋白溶液制成弹性材料。在一些实施方案中，仅通过调节温度和/或碱度来形成弹性材料。在另一些实施方案中，所述弹性材料可具有0mM的盐浓度。
本发明人所开发的弹性材料不同于弹性蛋白，因为它的形成不需要原弹性蛋白分子的交联。相反，弹性蛋白在用赖氨酰氧化酶或戊二醛等试剂使原弹性蛋白发生交联时形成。
一个优点是本发明的弹性材料一般来说更具有生物相容性，这是因为它不含有化学交联剂。然而，应理解本发明的弹性材料可通过赖氨酰氧化酶或其它化学试剂(例如戊二醛)进行交联。
另一个优点是本发明的弹性材料可提供弹性蛋白中不能发现的性质。这些性质包括拉伸强度、反弹(recoil)、可压缩性、生物可降解性以及持久性，特别是在组织或体腔中。因此，根据本发明，原弹性蛋白可用于提供使用弹性蛋白尚未获得的装置、假体和组织修复试剂。
还有一个优点是可简单地通过调节温度、pH或盐度来控制弹性材料的形成。如本文所证明地，这使得可以通过施用途径(例如注射)更有效地在组织中形成弹性材料。
应理解，“弹性材料”是指可不经原弹性蛋白氨基酸残基的交联而从原弹性蛋白形成的材料，而在天然形成弹性蛋白时(例如通过赖氨酰氧化酶)或者在制备弹性蛋白时(例如通过戊二醛)原弹性蛋白的氨基酸残基发生交联。一经形成，本发明的弹性材料可以通过赖氨酰氧化酶或其它化学试剂(例如戊二醛)进行交联。
如下文所述的“弹性材料”还可包含其它组分。
一般地，“弹性材料”不是自由流动的液体。它可以是凝胶、膏、固体或明显缺乏流动性的其它状态。有利地，根据本发明可设计或选择所需的状态性质，这通过在所述弹性材料形成过程中调控温度、pH或盐度的参数来实现，或者通过用能够交联可交联氨基酸侧链的试剂(这样的交联剂实例是戊二醛)将所述材料交联来实现。
在向其施加的力(例如压缩或拉伸)撤去后，“弹性材料”一般恢复到特定形状或形态。
“弹性材料”还指压缩和拉伸后可复原的、力学性能持久的(mechanically durable)或者相对低滞后(relatively low hysteresis)的易弯材料。这种材料可以是可拉伸的、抗张的、可复原或者能够反弹的。
有可能肉眼观察从原弹性蛋白溶液形成弹性材料。原弹性蛋白溶液基本上是透明的。随着弹性材料的形成，由于过渡的沉淀样状态使该溶液的透明度降低而变得不透明。如上所述，弹性材料基本上呈固体形式，并且根据其组成可具有多种外观。也可使用本领域已知的任何合适的分析技术(例如监测温度或透光率(transmission)的改变)来观察弹性材料的形成。
应理解，“原弹性蛋白”一般指包含与原弹性蛋白亲水结构域相同或相似之序列或由其组成的肽。亲水结构域具有通常富含赖氨酸和丙氨酸残基的序列。这些结构域常由被2或3个丙氨酸残基隔开的一段赖氨酸所组成，例如AAAKAAKAA(SEQ ID NO：1)。其它亲水结构域不含有这种多丙氨酸串，但作为替代地在脯氨酸附近具有赖氨酸。相反，原弹性蛋白疏水结构域富含非极性氨基酸，尤其是甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸和丙氨酸，并且常出现3肽至6肽的重复，例如GVGVP(SEQ ID NO：2)、GGVP(SEQID NO：3)和GVGVAP(SEQ ID NO：4)。
重要的是，用于形成所述弹性材料的肽包含至少一部分所述亲水结构域，因为该结构域被认为对于在调节原弹性蛋白溶液的碱度、温度或盐浓度时形成弹性材料来说是重要的。
可用于形成本发明弹性材料的原弹性蛋白的实例包括由亲水结构域或其同源物组成的那些，以及包含亲水结构域或其同源物和部分或全部疏水结构域的那些。一些实例在下面给出：
·GGVPGAIPGGVPGGVFYP(SEQ ID NO：5)，GVGLPGVYP(SEQ ID NO：6)，GVPLGYP(SEQ ID NO：7)，PYTTGKLPYGYGP(SEQ ID NO：8)，GGVAGAAGKAGYP(SEQ ID NO：9)，TYGVGAGGFP(SEQ ID NO：10)；
·KPLKP(SEQ ID NO：11)，ADAAAAYKAAKA(SEQ ID NO：12)，GAGVKPGKV(SEQ ID NO：13)，GAGVKPGKV(SEQ ID NO：14)，TGAGVKPKA(SEQ ID NO：15)，QIKAPKL(SEQ ID NO：16)，AAAAAAAKAAAK(SEQ ID NO：17)，AAAAAAAAAAKAAKYGAAAGLV(SEQ ID NO：18)，EAAAKAAAKAAKYGAR(SEQ ID NO：19)，EAQAAAAAKAAKYGVGT(SEQ ID NO：20)，AAAAAKAAAKAAQFGLV(SEQ ID NO：21)，GGVAAAAKSAAKVAAKAQLRAAAGLGAGI(SEQ ID NO：22)，GALAAAKAAKYGAAV(SEQ ID NO：23)，AAAAAAAKAAAKAA(SEQ ID NO：24)，AAAAKAAKYGAA(SEQ ID NO：25)，CLGKACGRKRK(SEQ ID NO：26)
“原弹性蛋白”可具有与GenBank登录号AAC98394所示相同的序列。包含亲水结构域的其它原弹性蛋白序列是本领域已知的，包括但不限于CAA33627(人(Homo sapiens))、P15502(人)、AAA42271(褐家鼠(Rattus norvegicus))、AAA42272(褐家鼠)、AAA42268(褐家鼠)、AAA42269(褐家鼠)、AAA80155(小家鼠(Mus musculus)、AAA49082(红原鸡(Gallus gallus))、P04985(黄牛(Bos Taurus))、ABF82224(斑马鱼(Danio rerio))、ABF82222(热带爪蟾(Xenopus tropicalis))、P11547(绵羊(Ovis aries))。
“原弹性蛋白”也可以是这些序列的片段，只要该片段包含如上所述亲水结构域的至少一部分。一个实例是AAC98394的27至724位氨基酸。
“原弹性蛋白”还可包含具有例如上文所述序列(特别是AAC98394)的肽的同源物，或者是具有例如上文所述序列的肽的同源物，或者是具有例如上文所述序列的肽的同源物之片段。本文中“同源物”是指具有与参考序列不同但相似之序列的蛋白质。它还具有与所述参考序列相同的功能，例如当如上所述调整所述同源物的溶液以调节碱度、温度或盐浓度时形成弹性材料的能力。
在一些实施方案中，所述同源物与肽(例如上文所述，特别是AAC98394)或者包含至少一部分亲水结构域的肽片段(例如上文所述)具有至少60％的同源性。
应理解“原弹性蛋白”可以是天然的或重组的。
本文中“弹性蛋白样肽”(elastin-like peptide，ELP)是指由分离自分子凝聚所必需之原弹性蛋白或弹性蛋白疏水区域的小氨基酸序列(通常小于5个氨基酸长度)聚合而形成的化合物。一些常用的序列包括GVGVP(SEQ ID NO：2)、GGVP(SEQ ID NO：3)和GVGVAP(SEQ ID NO：4)。
本发明人发现了存在一组温度、碱度和盐浓度条件，在所述条件下原弹性蛋白溶液可形成弹性材料。不希望受假设的限制，认为这些条件影响导致形成所述弹性材料的原弹性蛋白分子亲水结构域之间的相互作用。因此，所述弹性材料不同于由带电氨基酸侧链交联形成的天然或人工弹性蛋白。也不同于ELP凝聚形成的材料。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法，其包括加热具有碱性pH的原弹性蛋白溶液，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法，其包括向温度约为37℃的原弹性蛋白溶液提供碱性pH，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法，其包括向原弹性蛋白溶液提供碱性pH并使该溶液的温度升至约37℃，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法，其包括将原弹性蛋白加至具有碱性pH且温度约为37℃的溶液中，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法，其包括将原弹性蛋白加至具有碱性pH的溶液中并使该溶液的温度升至约37℃，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法，其包括调节具有碱性pH且温度约为37℃的原弹性蛋白溶液的盐浓度，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
一般地，浓度大于约1.5mg/mL的原弹性蛋白溶液能够形成期望完整性的弹性材料，尽管也可使用更低的浓度。在大多数应用中，所述溶液浓度小于约300mg/mL。因此，浓度为约1.5mg/mL～约300mg/mL的原弹性蛋白溶液是优选的。更优选地，使用浓度为约10mg/mL～约300mg/mL的原弹性蛋白溶液。最优选地，使用浓度为约10mg/ml～约200mg/mL的原弹性蛋白溶液。
已确定约pH 7.5或更高的pH足以导致在溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。pH一般不超过约pH 13，因为在该pH之上弹性材料的形成不太好。更优选地，约pH 9～pH 13是理想的。然而，最优选使用约pH 10～pH 11的pH。其它可使用的pH值包括8.0、8.5、9.5、10、10.5和11.5。
可通过多种方式来调节碱度，所述方式包括(1)向原弹性蛋白溶液中直接添加pH增高物质，(2)通过将含有足够量pH增高物质的溶液与原弹性蛋白溶液混合使之成为碱性的。pH增高物质可以是碱、缓冲液、质子吸收物质。已发现包括Tris碱、NH4OH和NaOH的实例可用作pH增高或控制物质。
当pH为碱性并且低于约9.5时，形成本发明的弹性材料可能需要盐。当使用盐时，浓度一般大于25mM，可能高达200mM。优选地，所述盐浓度为约100mM～150mM。更优选地，所述盐浓度为约150mM。特别地，本发明人发现随着pH降至pH 10以下(但仍保持碱性)，形成所述弹性材料需要盐，并且所需盐的量随着pH降低而升高。所以，例如，在约pH 9～10时需要盐，例如应向该溶液提供等同于约60mM的盐浓度。在一些实施方案中，所述溶液具有等同于哺乳动物等渗盐水(150mM)或更低的摩尔渗透压浓度。在另一些实施方案中，所述溶液具有大于150mM的渗透压。所述盐浓度还可以是0mM。
所述溶液的盐浓度可以通过加入盐来控制，包括任何离子化合物、单价或二价离子或者能够影响溶液渗透压的低分子量物质。例如，可使用NaCl、KCl、MgSO4、Na2CO3或葡萄糖。优选的盐是NaCl。
在另一个实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白溶液形成弹性材料的方法，其包括：
-(1)提供原弹性蛋白溶液；
-(2)调节所述溶液pH以形成具有碱性pH的溶液，使得原弹性蛋白在该溶液中沉淀；
-(3)取出所述沉淀物；
-(4)将所取出的沉淀物添加至具有基本上非碱性pH和/或基本上低温的溶液，使得所述沉淀物分散于溶液中；以及
-(5)使所述溶液的温度升至约37℃，以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在一个实施方案中，步骤(2)中所述溶液的温度优选为约4℃～约37℃，步骤(4)中低于约4℃。另外，在一个实施方案中，步骤(2)中所述溶液的pH优选至少约pH 9，步骤(4)中低于约pH 9。步骤(4)中pH可以低至约pH 7.5。另外，在一个实施方案中，所述溶液的盐浓度优选为约0mM～200mM。
因此，在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法，其包括加热具有低于10的碱性pH以及150mM或更低盐浓度的原弹性蛋白溶液，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。因为原弹性蛋白溶液和所述弹性材料的pH较接近于哺乳动物pH，所以这些实施方案对于体内应用是特别优选的。
在另一些实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白产生弹性材料的方法，其包括调节具有碱性pH的原弹性蛋白溶液的盐浓度并使该溶液的温度升至约37℃，用以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
已确定约37℃的温度对于在溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料来说是优选的。然而，在一些实施方案中，可使用低于37℃的温度。一般地，温度高于4℃。通常低于42℃。本发明人发现，形成弹性材料所需的温度与原弹性蛋白溶液中原弹性蛋白浓度呈负相关。也就是说，低浓度原弹性蛋白的溶液需要较高的温度来形成弹性材料。本发明人还发现，作为原弹性蛋白溶液在特定温度下所保持时间的函数，柔韧性增加，完整性持续更长。
可通过将所述溶液提供到哺乳动物组织中或其上来加热所述溶液，使得来自所述组织的热传递提高所述溶液的温度，或者通过对所述组织进行照射来实现。
或者，可通过将所述溶液与非生命表面(inanimate surface)相接触并加热所述表面来加热所述溶液。所述非生命表面可在模具或铸件上来提供，用于为所述方法形成的弹性材料提供预定的形状或形态，还可以在假体、支架等装置上来提供。
当通过加热溶液来引发弹性材料形成时(即当合适的pH和/或盐条件已提供时)，一般将所述溶液保存在低于30℃的温度下，优选约4℃，直到需要形成弹性材料时。
优选地，初始溶液中的大部分原弹性蛋白用于形成所述弹性材料。
在一些实施方案中，可以将能够交联原弹性蛋白残基(例如赖氨酸)侧链的试剂与通过上述方法从原弹性蛋白溶液形成的弹性材料进行交联。如本文所述，交联不是形成所述弹性材料所必需的，事实上这是本发明弹性材料与弹性蛋白之间的区别点。不希望受理论的限制，本发明人认为所述弹性材料的形成至少部分是由于包括带电酪氨酸、赖氨酸和精氨酸残基的电荷相互作用以及稳定性氢键的组合所致。本发明人认为可能形成了二酪氨酸。重要的是，这些相互作用是在没有交联剂的情况下发生的。
然而，在下述一些应用中，当所述弹性材料已形成时，将这些侧链进行交联是有用的，因为这为所述弹性材料提供了另外的性质。具体地，与交联剂不存在时形成的弹性材料相比，使用交联剂(例如戊二醛)使得弹性材料更硬、更致密、更坚韧，因此可能在体内更具有生物稳定性。对于要求更高的组织复原应用来说或者当不需要与周围天然组织相容时，本发明人建议该材料可能比非交联弹性材料更加优选。值得注意的是，当将戊二醛加到碱性pH的原弹性蛋白溶液中时，本发明人出乎意料地发现，随着所述弹性材料的形成呈现出特别的颜色，这在临床上可用作固体形成的判定因素。
预期可以使用可用于(天然或人工)形成弹性蛋白的任何交联剂。实例包括赖氨酰氧化酶、转谷氨酰胺酶、戊二醛、京尼平(genipin)和胺反应交联剂(例如BS3)。在一个实施方案中，所述交联剂是戊二醛，并且以约0.001w/v％溶液至约0.5w/v％溶液的浓度使用。
本发明的方法和由此形成的弹性材料在组织填充应用中是特别有用的，例如，当需要利用美容来修缮或改善外观时的应用(例如使唇丰满、填充鼻唇沟、减少皱纹或者其它组织改善)，或者当需要支持先天性缺损或由疾病或手术切除造成之缺损时的医学应用。
更详细地，由于所述弹性材料的形成可通过调节温度、pH或盐度来简单地控制，因此这允许通过将具有或已具有碱性pH的原弹性蛋白溶液注射到所需部位并使热从组织传递以导致所述弹性材料形成，从而原位形成填充剂。另外，可通过调整盐度或pH或者通过在所述弹性材料已形成之后加入交联剂来调节所述弹性材料形成的时间以及所形成材料的弹性特征和持久性。
主要的益处是可通过使用细号针来有效地提供所述填充剂。在该施用模式中，可通过调整温度、pH或盐浓度、或者降低注射用制备物中pH之前在高pH下的孵育时间中的一种或多种来控制用于形成填充剂的原弹性蛋白溶液的粘度。
所述原弹性蛋白溶液可皮内或皮下注射，或者在真皮中或真皮下更深处注射，或者注射进其它组织，以提供弹性材料的储库(depot)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了利用美容来改善组织的方法，其包括将含有原弹性蛋白的溶液注射进需要美容改善的组织，以根据上述方法在所述组织中形成弹性材料。所述美容改善可以是去除或减少皮肤皱纹，使嘴唇丰满或者还原或重塑组织的外观、组织特征或面部特征。在注射前所述原弹性蛋白溶液可保持冷却，例如在约4℃下，然后通过来自组织的热传递加温至体温。或者，可使用外部能量源照射所述组织以提高原弹性蛋白溶液的温度，从而在该组织中形成弹性材料。
还可将原弹性蛋白溶液应用至组织表面，以由弹性材料提供覆盖或支持。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了在疾病、外伤、手术切除或其它创伤部位支持组织或器官的方法，该方法包括将含有原弹性蛋白的溶液注射或以其它方式施加到需要支持的组织或器官中或其周围，从而根据上述方法在所述组织或器官中或其周围形成弹性材料。在一个实施例中，注射原弹性蛋白溶液以形成弹性材料，其在括约肌部位周围提供了增加物(augmentation)，例如作为一种尿失禁治疗形式用于填充在膀胱括约肌周围。
在上述实施方案中，碱性原弹性蛋白溶液在注射前可以被冷却，例如至约4℃，然后通过来自组织的热传递被加温至体温。或者，可使用外部能量源照射组织以提高原弹性蛋白溶液的温度从而在组织中形成弹性材料。
应理解，可根据上述方法在外部制备所述弹性材料，然后将其插入组织或组织腔中。
例如，可将原弹性蛋白溶液浇铸到模具中，根据上述方法形成弹性材料，从而得到随后植入患者体内的合适形状。一个实例是当手术切除患者组织的一部分而留下空腔时，需要用生物相容的弹性材料进行填充。在这些情况下，可使用已知方法评估需填充位置的形状，并基于该评估来制备合适的模具。然后，在模具内浇铸原弹性蛋白溶液，根据上文所述方法形成弹性材料，以用于植入需要填充的位置内。
在另一个实施例中，可根据上文所述方法使原弹性蛋白溶液形成颗粒形式的弹性材料。例如，可使用乳液、微流体(microfluidic)或本领域已知用于制备颗粒的其它体系来形成颗粒。还可以从原弹性蛋白浓度低于约1.5mg/mL的原弹性蛋白溶液形成颗粒。所述颗粒可以基本上为球形，具有0.1微米至10微米的直径。可使用本领域已知的高速递送技术将弹性材料颗粒递送至需要治疗的位置。
根据上文所述方法从原弹性蛋白溶液形成弹性材料的一个优点是所述弹性材料可快速形成，事实上比形成弹性蛋白可达到的速度更快。这使得可以在模具中形成弹性蛋白无法形成的多种精巧以及复杂的形状。另一个优点是，由于可通过调整温度、pH和/或盐度来控制从原弹性蛋白材料形成弹性材料的速度，因此在受控方法中可以导入气体以形成气泡并产生开放的海绵样基质。或者，需要时可避免形成气泡。
另一个在外部形成组织植入物的方法是使用包括基于激光的蚀刻(laser based lithography)、电喷雾和电纺(electrospinning)的技术。
根据上文所述方法从原弹性蛋白溶液形成的弹性材料特别地可用于密封创伤或者用于为新修复的创伤增加支持，特别是当肉芽组织已经取下但实质纤维化(其会赋予愈合创伤以强度)尚未发生时的创伤。这些创伤的实例包括手术创伤或者外伤(例如撕裂伤、擦伤、刺伤或烧伤、或者其它缺损)导致的创伤。所述创伤可位于皮肤、皮下、深部组织或者其功能实现需要至少一些弹性的器官中。
根据上文所述方法从原弹性蛋白溶液形成的弹性材料可用于常规使用纤维蛋白密封剂(fibrin sealant)和手术粘合胶(surgical glue)的场合。一个实例是在吻合术需要有效密封以减少流体损失时。另一个实例是当需要快速阻止血流时，或者需要预防微生物侵入时。
有多种施用途径。这些包括将原弹性蛋白溶液喷、刷拭、倾倒、涂(paste)或者接触到创伤上，以使得根据上述方法在创伤中或创伤表面上形成弹性材料。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了密封组织创伤的方法，其包括将原弹性蛋白溶液喷、涂、倾倒、刷拭或者接触到组织创伤，以使得根据上述方法形成弹性材料。
在这些实施方案中，原弹性蛋白溶液可添加其它化合物、蛋白质和因子以促进、调节或改善创伤密封。
如上所述，根据上文所述方法从原弹性蛋白溶液形成弹性材料的一个优点是所述弹性材料可快速形成，事实上比弹性蛋白形成可达到的速度更快。因此，设想有可能获得对创伤的快速密封。另外，对温度、pH和/或盐度的调整影响所述弹性材料形成的速度意味着可更有效地控制创伤密封的速度。
除了上文所述的组织支持和填充剂之外，根据上文所述方法从原弹性蛋白溶液形成的弹性材料特别地可用于制备假体和医学装置。实例包括用于支持开放生物结构(例如导管和腔室)的植入物或支架。其它实例包括用于辅助生物结构反弹的带。
另一应用是为生物不相容的医学装置(例如起搏器或耳蜗植入物)提供生物相容性涂层，其具有弹性、可复原并且能够持久位于组织部位。在这些实施方案中，所述弹性材料对避免纤维化来说是重要的。
所述弹性材料可快速形成(事实上比弹性蛋白形成可达到的速度更快)意味着可以将薄的均匀表面涂层施加到医学装置，在不干扰所述装置性能的情况下提供生物相容性。
在另一些实施方案中，本发明提供了试剂盒和组合物，其用于根据如上所述的方法使用原弹性蛋白溶液形成弹性材料。在一种形式中，试剂盒包含第一容器、第二容器和书面说明，所述第一容器包含原弹性蛋白，所述第二容器包含提供碱性溶液的试剂，所述书面说明是关于使用所述原弹性蛋白和试剂形成弹性材料的指导。
在一个实施方案中，本发明提供了形成弹性材料的组合物，其包含具有碱性pH及阻止溶液中原弹性蛋白形成弹性材料之温度的原弹性蛋白溶液。如上所述，所述组合物可包含盐，特别是当所述溶液的pH低于pH 10时。在一些形式中，可采用粉末形式提供所述组合物，其在使用时进行水化以提供原弹性蛋白溶液。经过加热，在溶液中从原弹性蛋白形成所述弹性材料。
根据所述试剂盒和组合物所提供的用途(例如用于组织填充、创伤密封或本文所述的其它应用)，还可以向所述试剂盒和组合物提供其它分子。例如，另一些结缔组织分子可与原弹性蛋白制剂在一起提供或用于一起配制。实例包括胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、纤维蛋白、糖胺聚糖(例如透明质酸和硫酸肝素、软骨素等分子)。也可提供这些分子的人造形式，例如ELP。
在另一些形式中，可向原弹性蛋白制剂提供药物化合物或用于一起配制，包括抗生素、生长促进剂、抗菌剂、血管发生化合物、抗癌剂等。
另一些形式可提供生物因子，例如组织因子、细胞因子、生长因子等。特别优选的是参与创伤愈合、纤维化和肉芽形成的因子。
另一些形式可提供细胞，特别是参与创伤愈合的细胞。实例包括上皮细胞、纤维细胞、成纤维细胞、角质形成细胞前体、角质形成细胞、肌纤维母细胞、吞噬细胞等。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于从原弹性蛋白形成弹性材料的设备或装置，其包含第一腔室、第二腔室和分配手段，所述第一腔室包含原弹性蛋白溶液，所述第二腔室包含用于调节所述第一腔室溶液pH的试剂，所述分配手段用于分配所述第一腔室的溶液和所述第二腔室的试剂以形成所述溶液和试剂的混合物，从而在所述混合物中从原弹性蛋白形成弹性材料。
在另一个实施方案中，本发明提供了从原弹性蛋白形成弹性材料的装置，所述装置包含第一腔室、第二腔室和分配手段，所述第一腔室包含具有碱性pH的原弹性蛋白溶液，所述第二腔室包含用于向所述第一腔室的溶液提供约150mM或更低盐浓度的溶液，所述分配手段用于分配所述第一腔室和第二腔室的溶液以形成溶液的混合物，从而在所述混合物中从原弹性蛋白形成弹性材料。
这些装置可用于根据上文所述方法通过将所述原弹性蛋白溶液喷、涂、涂抹或注射到预期组织部位或无生命表面(例如模具)来施加所述原弹性蛋白溶液以形成弹性产物。例如，可改造所述装置使其可与细号针连接。在另一种形式中，可改造所述装置使其可与喷雾器连接。
应理解，如上所述，所述装置可在所述第一或第二腔室中或者在该装置的另一腔室中含有其它分子、化合物、因子和细胞。
本发明人发现可得到本发明弹性材料的前体或中间形式，当适当调整pH、盐浓度或温度时其可回复到溶液形式。更详细地，本发明人发现，当在高于约4℃(优选约37℃)下将含原弹性蛋白的溶液pH调节至高于约pH 9时，形成了随后可从溶液中分离出来的沉淀物。然后当pH降低到非碱性条件和/或温度降低时，有可能使得所述沉淀解离并分散。所分散的沉淀物含有至少一些游离的原弹性蛋白。
预期该发现特别可用于从重组表达系统中纯化原弹性蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了形成原弹性蛋白纯化溶液的方法，其包括：
-提供原弹性蛋白溶液；
-调节所述溶液pH以形成具有碱性pH的溶液，使得原弹性蛋白在所述溶液中沉淀；
-取出所述沉淀物；
-将所取出的沉淀物添加至具有基本上非碱性pH和/或基本上低温的溶液，使得所述沉淀物分散于溶液中以形成原弹性蛋白的纯化溶液。
根据上文所述方法从原弹性蛋白溶液形成的弹性材料的一个特别重要的应用是提供持续或受控释放化合物的机制。更具体地，通过在所述材料形成过程中调整pH或盐度，或者通过用戊二醛或其它交联剂在所述材料形成后交联所述材料，有可能设计或选择具有特别持久性质的弹性材料。例如，本发明人发现交联形式的所述弹性材料与非交联形式相比倾向于更硬、更致密、更坚固。而后者倾向于更类似天然弹性蛋白。一些形式倾向于在组织中更易降解，因此为接种于所述弹性材料中的药物或类似分子提供了更快速地爆发式释放。另一些形式则更持久、较不易降解，因而为药物或类似分子提供了更长时间的释放。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了持续或受控释放的植入物，所述植入物是根据上文所述方法从原弹性蛋白溶液形成的弹性材料。所述持续释放的植入物可含有如上所述的分子、化合物、因子和细胞。
如上所述，由于可通过调整温度、pH和/或盐度来控制从原弹性蛋白溶液形成弹性材料的速率，因此可在受控方法中导入气体以形成气泡并得到具有开放海绵样基质的弹性材料。这为接种实现组织再生和创伤修复的细胞、组织和因子提供了特别有用的支架或基质。合适细胞和因子的实例在上文有描述。
有利地，可控制所述弹性材料的孔隙率，使得再生组织可穿过所形成的结构。或者，可形成具有孔的结构，其足以使得仅仅分子和因子扩散进出所述弹性材料。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了细胞或组织基质，所述细胞或组织基质是利用上文所述方法从弹性材料形成的。
实施例
实施例1在无交联剂的情况下形成弹性材料
原弹性蛋白优选在大于1.5mg/mL(通常10～200mg/mL)的浓度下混合于磷酸盐缓冲液中，使用1M NaOH调节溶液pH至约pH 9～约pH 13，优选pH 11。然后，将所述溶液加温至高于4℃，优选至约37℃。形成软膏样实体，然后固化以形成弹性材料。
实施例2在较低碱性pH范围下用盐形成弹性材料
将原弹性蛋白以10mg/mL的浓度溶于水溶液中。分别将水溶液的盐浓度和pH滴定为0～150mM和pH 7～12。将原弹性蛋白溶液的温度提高至37℃，利用肉眼和触觉来评估形成弹性材料的能力。在冷却后测试这样形成的任何弹性材料的持久性。
随着pH降低可看到两个过渡点。在pH 10以上，在溶液中从原弹性蛋白形成持久的弹性材料不需要溶液中的盐。但是，随着pH降低到10以下，需要约60mM的盐浓度使得在溶液中从原弹性蛋白形成持久的弹性材料。
实施例3在交联剂存在时形成弹性材料
原弹性蛋白溶液在大于1.5mg/mL(通常10～200mg/mL)的浓度下与戊二醛(0.001～0.5％(重量/体积))混合于碱性pH(约pH 8.5)的磷酸盐缓冲液中，加温形成弹性材料。所述材料呈粉红色，并且与根据实施例1和2形成的弹性材料相比具有更高的密度和硬度。
实施例4原弹性蛋白的纯化
将自细菌表达系统获得的含原弹性蛋白的粗制上清调节至pH 9～13，优选11，从而将原弹性蛋白分子从所述溶液中沉淀出来形成沉淀物。从上清中分离所述沉淀物并重悬于具有非碱性pH及较低温度的缓冲液中，从而使沉淀物在缓冲液中分散形成溶液。然后在冷冻条件下保存所述溶液。
实施例5体内形成弹性材料
使用26号针将经pH调节的200mg/ml原弹性蛋白溶液的单次剂量(0.1m1)皮内注射到健康雌性Sprague Dawley大鼠中。大鼠的体温导致快速发生热诱导弹性材料形成。在15天的时间内观察所述动物，然后进行组织学检查。无定形的实体材料存在于皮下(hypodermis)包括皮肤肌肉下的疏松结缔组织(图1)中。使用BA-4弹性蛋白特异性抗体的免疫组化染色证实了在该大储库中存在持久性弹性材料。
实施例6掺入药物的弹性材料
通过将pH调节到10.8、在37℃下孵育1小时、冷却然后重新调节pH至7.4而制得弹性材料。将药物紫杉醇的颗粒包埋于样品中。加热到37℃后，样品固化，得到包含所分配药物颗粒的弹性材料。将H1299肺癌细胞接种于所制备的弹性材料上及其周围。对照弹性材料不含紫杉醇。观察到接种于含紫杉醇之弹性材料上的细胞发生凋亡。而细胞侵入对照样品。对照样品以及含有紫杉醇但未接触细胞的弹性材料未发生凋亡。
实施例7弹性材料和细胞相互作用
将成纤维细胞掺入弹性材料中(图2)或者接种到弹性材料上(图3)。
序列表
<110>悉尼大学
<120>原弹性蛋白用于组织修复或恢复的用途
<130>81301417:TPG:KES
<150>2006906319
<151>2006-11-13
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Claims (15)

1.从原弹性蛋白产生弹性材料的方法，其包括加热具有碱性pH的原弹性蛋白溶液以在所述溶液中从原弹性蛋白形成弹性材料。
2.权利要求1的方法，其中所述碱性pH大于约7.5。
3.权利要求1的方法，其中所述碱性pH大于约9。
4.前述任一项权利要求的方法，其中所述温度大于约4℃。
5.前述任一项权利要求的方法，其中所述温度约为37℃。
5.前述任一项权利要求的方法，其中所述原弹性蛋白溶液具有小于约200mM的盐浓度。
6.权利要求1的方法，其中所述盐浓度大于约60mM，所述pH小于约10。
7.前述任一项权利要求的方法，其中所述原弹性蛋白以大于约1.5mg/mL的浓度存在于所述溶液中。
8.前述任一项权利要求的方法，其中所述原弹性蛋白以约10mg/mL～200mg/mL的浓度存在于所述溶液中。
9.前述任一项权利要求的方法，其中所述原弹性蛋白包含与原弹性蛋白亲水结构域相同或相似的序列。
10.前述任一项权利要求的方法，其中所述原弹性蛋白由与原弹性蛋白亲水结构域相同或相似的序列组成。
11.前述任一项权利要求的方法，其中所述弹性材料还包含选自药物、生物细胞、生物因子和生物分子的组分。
12.用于医学应用的弹性材料，其中所述弹性材料根据前述任一项权利要求的方法而形成。
13.权利要求12的弹性材料，其中所述医学应用选自填充组织、矫正组织缺损和密封创伤。
14.权利要求12或13的弹性材料，其中所述弹性材料是选自以下的产品：假体或医学装置、持续释放或受控释放的植入物、细胞或组织基质。
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