CN101538539A - 用于生物合成维吉尼亚霉素m的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种以绿灰链霉菌为菌种,生物合成维吉尼亚霉素M的培养基,其包括:氮源2%~10%、碳源4%~8%、硫酸盐0.0005%~0.005%和碳酸钙0.1%~1.0%。使用本发明培养基进行维吉尼亚霉素M的生物合成,其合成水平通常可稳定地达到1g/l以上,最高可达到1.5g/l。由于生物合成水平高,所需要的原料成本低,所以降低了生产成本,具有很高的经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养基,具体说,涉及一种以绿灰链霉菌(Streptomycesvirginiae MAFF 10-06014)为菌种,生物合成维吉尼亚霉素M的培养基。
背景技术
维吉尼亚霉素(Virginiamycin,简称VGM)是由维吉尼链霉菌产生的一种内酯环肽,由VGM-M(M1,M2)和VGM-S(S1~S6)组成,其中VGM-M1和VGM-S1为主要成分。单独VGM-M1或VGM-S1的抗菌作用很弱,但二者存在协同效应,两者合为一体可以产生强大的杀菌效果。商业维吉尼亚霉素产品是M1和S1的混合物,比例一般为3∶1,在全球被作为“动物生长促进剂”广泛应用于畜禽配合饲料。
维吉尼亚霉素几乎不被畜禽肠道吸收,用药后在畜禽体组织中残留量很少。可用来防治细菌性下痢和鸡坏死性肠炎。它能杀灭有害及多余的肠内细菌,减少乳酸、氮气、挥发性脂肪酸等有毒物质产生,减缓肠道蠕动,延长饲料在肠道内停留时间,增加养分的吸收,令肠壁变薄,增加肠壁渗透性,促进对氨基酸和磷的吸收,提高饲料利用率。它还能提高鸡对饲料中黄色素的吸收,提高鸡肉、蛋的黄色素含量。在质量上有稳定性好等优点,室温下保持三年效价不变。
目前,市场上的维吉尼亚霉素为美国史克药厂畜禽保健公司发酵法生产,它由70%M1和30%S1混合组成。而在国内,尚未实现大规模生产。Optimization of agitation and aeration conditions for maximum virginiamycinproduction.Appl Microbiol Biotechnol.1999(51).164~169等也曾提到过几种生物合成维吉尼亚霉素的培养基,由于其使用的是酵母抽提物等非常用氮源和甘油等非常用碳源,且产量不高,其中维吉尼亚霉素M产量仅为400mg/l左右,不适用于大规模生产。因此有必要开发一种成本更为低廉,产量进一步提高的培养基,以适应工业化生产的需要。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提高绿灰链霉菌发酵生物合成维吉尼亚霉素M的效价。
为此,本发明提供一种以绿灰链霉菌为菌种,生物合成维吉尼亚霉素M的培养基,其包括:
氮源 2%~10%
碳源 4%~8%
硫酸盐 0.0005%~0.005%
碳酸钙 0.1%~1.0%。
该培养基的有机氮源包括但不仅限于豆粕,大豆分离蛋白、玉米浆、花生粉、棉仔饼粉和黄豆饼粉等,优选为黄豆饼粉。培养基中有机氮源浓度最优为5%。
本发明中的有机碳源包括但不仅限于淀粉、葡萄糖、糊精和蔗糖,优选为淀粉。培养基中有机碳源的浓度优选为6.0%。
本发明中的硫酸盐包括但不仅限于硫酸锰、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌等,优选硫酸锌。培养基中硫酸盐的浓度优选为0.001%。
这里所述的浓度(%)为g/100ml。
本发明培养基中还需添加碳酸钙。碳酸钙的浓度优选为0.5%。
本发明培养基在发酵初始的pH值控制在4.0~8.0,优选为5.0。
本发明还提供一种生物合成维吉尼亚霉素M的方法,包括将绿灰链霉菌接种于所述的培养基中进行发酵,其中所述方法的发酵时间为35至45小时,优选38小时。
本发明中,发酵时间控制在35~45h,优选在38h。
本发明还提供一种生物合成维吉尼亚霉素M的方法,
本发明中,绿灰链霉菌湿菌体的培养使用V.I.Zvenigorodskii,B.V.Tyaglov,and T.A.Voeikova.Isolation of Components of the PeptideAntibiotic Virginiamycin and Breeding of Their Producer,Streptomycesvirginiae.Applied Biochemistry and Microbiology,Vol.37,No.3,2001,.260-266的方法。
本发明方法中的培养基中有机碳源及氮源的廉价,大大降低了成本,同时提高了发酵单位,有利于放大进行规模化生产。
本发明方法发酵合成维吉尼亚霉素M的发酵水平通常可稳定地达到1g/L以上,最高发酵单位可达1.5g/L。
具体实施方式
本发明所使用主要培养基成份(黄豆饼粉,豆粕,花生粉及棉仔饼粉)均购自福建浦城绿康生化有限公司。
实施例1
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.5g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例2
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、80g黄豆饼粉(浓度2%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到0.9g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例3
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、400g黄豆饼粉(浓度10%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.0g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例4
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、160g淀粉(浓度4%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.1g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例5
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、320g淀粉(浓度8%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到0.9g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例6
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.02g硫酸锌(浓度0.0005%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.4g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例7
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.2g硫酸锌(浓度0.005%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.4g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例8
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙4g(浓度0.1%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.1g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例9
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙40g(浓度1.0%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.2g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例10
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为4.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.4g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例11
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为8.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.3g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例12
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g豆粕(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.2g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例13
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g大豆分离蛋白(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.3g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例14
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g玉米浆(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.2g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例15
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g花生粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.4g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例16
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g棉仔饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.3g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例17
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g葡萄糖(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.3g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例18
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g糊精(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.4g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例19
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g蔗粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.4g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例20
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锰(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.3g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例21
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸镁(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.2g/l的维吉尼亚霉素M。
实施例22
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸亚铁(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到1.4g/l的维吉尼亚霉素M。
对比例1
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、240g淀粉(浓度6%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到0.7g/l的维吉尼亚霉素M。
对比例2
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、40g黄豆饼粉(浓度1%)、240g淀粉(浓度6%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到0.3g/l的维吉尼亚霉素M。
对比例3
在7.0L的发酵罐中,加入3.6L自来水、200g黄豆饼粉(浓度5%)、400g淀粉(浓度10%)、0.04g硫酸锌(浓度0.001%),用氢氧化钠或盐酸调pH为5.0,加碳酸钙20g(浓度0.5%),绿灰链霉菌湿菌体的培养使用上述文献的方法,用量为0.4L(10%),得到4L反应液。搅拌速度500rpm、通气量1v/v及培养温度28℃,培养38小时,取样分析,结果得到0.4g/l的维吉尼亚霉素M。
Claims (15)
1.一种用于绿灰链霉菌生物合成维吉尼亚霉素M的培养基,其包括:
氮源 2%~10%
碳源 4%~8%
硫酸盐 0.0005%~0.005%
碳酸钙 0.1%~1.0%。
2.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述氮源为豆粕、大豆分离蛋白、玉米浆、花生粉、棉仔饼粉或黄豆饼粉。
3.如权利要求2所述的培养基,其特征在于,所述氮源为黄豆饼粉。
4.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述氮源的浓度为5%。
5.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述碳源为葡萄糖、淀粉、糊精或蔗糖。
6.如权利要求5所述的培养基,其特征在于,所述碳源为淀粉。
7.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述碳源的浓度为6%。
8.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述硫酸盐为硫酸锰、硫酸镁、硫酸亚铁或硫酸锌。
9.如权利要求8所述的培养基,其特征在于,所述硫酸盐为硫酸锌。
10.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述硫酸盐的浓度为0.001%。
11.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述碳酸钙的浓度为0.5%。
12.如权利要求1所述的培养基,其特征在于,其在发酵初始的pH值为4.0~8.0。
13.如权利要求12所述的培养基,其特征在于,其在发酵初始的pH值为5.0。
14.一种生物合成维吉尼亚霉素M的方法,包括将绿灰链霉菌接种于权利要求1至13任一所述的培养基中进行发酵,其中所述方法的发酵时间为35至45小时。
15.如权利要求14所述的方法,其特征在于,所述发酵时间为38小时。
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