CN101535479A - 凝血酶突变体 - Google Patents

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Abstract

一种凝血酶突变体，其中，所述凝血酶B链的活性中心的氨基酸中，至少将位于第205位的丝氨酸置换成其他氨基酸，且还进行下述中任意1种以上的置换：(I)将位于B链第89位的精氨酸置换成其他氨基酸；(II)将位于B链第69位的苏氨酸或位于B链第22位的丝氨酸置换成其他氨基酸；(III)将位于B链第200位的丙氨酸置换成其他氨基酸；(IV)将位于B链第65位的赖氨酸置换成苏氨酸。

Description

凝血酶突变体
技术领域
本发明涉及一种使具有抗血栓能力的失活凝血酶突变体的氨基酸序列得到最优化、进而赋予该失活凝血酶突变体以更高抗血栓能力的技术。
背景技术
脑、心脏中的大部分血管疾病为血栓病。虽然血栓病的主要原因是血流异常、凝固成分异常、血管内皮异常，但实际上血栓病是在它们的综合作用下诱发的。其中，全面参与、在血栓形成中起关键作用的是作为丝氨酸蛋白酶的凝血酶。凝血酶在凝血级联反应的最终阶段形成纤维蛋白凝结物，同时活化XI、V、VIII因子而加速凝血级联反应。另外，通过血小板及血管内皮上的凝血酶受体PAR1，引起血小板凝结和内皮细胞活化。据报道，该内皮细胞的活化引起血管壁的过高凝血性，进而通过负的连锁反应而促进血栓形成(非专利文献1)。
非专利文献2中记载，在对凝血酶的与主要凝血途径相关的底物识别中，Exosite I区域起重要的作用。非专利文献3中记载，凝血酶等丝氨酸蛋白酶在活性中心具有丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸，通过这3种氨基酸的电荷中继系统引起蛋白酶活性表达，甘氨酸193(193为该氨基酸在胰凝乳蛋白酶原中的位置，对应于凝血酶B链的第203位的甘氨酸)参与从丝氨酸蛋白酶的米氏复合体向四面复合体的转变进程。
将氨基酸置换的凝血酶突变体的研究也正在进行。以往关于通过凝血酶的基因重组将活性中心的氨基酸置换的重组体进行了下述几种研究。例如，非专利文献4中记载了关于将活性中心的丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶突变体对白血球的影响。非专利文献5中记载了将位于B链第203位的甘氨酸置换成丙氨酸的凝血酶突变体、将活性中心的丝氨酸置换成丙氨酸或苏氨酸的凝血酶突变体、将活性中心的组氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶突变体、以及将活性中心的天冬氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶突变体。但是，非专利文献4～5中所记载的凝血酶突变体，由于残存有以各文献记载的测定方法所无法检测的酶活性(凝血酶底物分解活性)水平，凝血酶底物结合能力显著降低，或者与血中大量存在的Fbgn具有高的结合能力等，因此，作为抗血栓剂、抗炎症剂，很难说它们具有足够的有效性。
另外，专利文献1、非专利文献6、非专利文献7、非专利文献8中记载有通过将氨基酸置换而具有酶活性(凝血酶底物分解活性)和抗凝血效果的凝血酶突变体。这些凝血酶突变体是通过保持或增强与血栓调节蛋白(thrombomodulin，以下有时称为“TM”)的结合能力，并且使纤维蛋白原分解能力显著降低，从而与TM特异性结合且使蛋白质C活化而显示抗血栓效果的凝血酶突变体。
专利文献2中公开了将活性中心的氨基酸置换，进一步将作为抗血栓剂的水蛭素C末端肽给予患者，在发生出血等问题时，以中和其水蛭素C末端肽的抗凝固活性作为目的的凝血酶原(prothrombin)突变体。
专利文献3～4中记载有将活性中心的丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶突变体，以及将活性中心的丝氨酸置换成丙氨酸且将活性中心的天冬氨酸置换成天冬酰胺的凝血酶突变体，抑制了洗涤血小板悬浊液中的凝血酶对凝血酶受体的刺激。
专利文献5中记载有通过将活性中心的氨基酸及其他氨基酸置换，底物分解活性丧失，进而降低了与纤维蛋白原、肝素以及血栓调节蛋白的亲和性、且具有高抗血栓能力的各种凝血酶突变体。
但是，专利文献5中报道的凝血酶突变体中，由于对血管壁中存在的肝素样物质(硫酸乙酰肝素)、血栓调节蛋白及整合蛋白略有亲和性，实际上与血管壁等结合而不能得到充分的血中循环量，并且由于被血管内皮内吞(endocytosis)而半衰期短等，尚有改善的余地。
因此，期待一种凝血酶突变体，其不损害抗血栓作用，与肝素、血栓调节蛋白及整合蛋白的亲和性更加降低且抗血栓能力提高。
专利文献1：国际公开第95/13385号小册子
专利文献2：国际公开第96/41868号小册子
专利文献3：国际公开第92/14750号小册子
专利文献4：美国专利第5,256,766号说明书
专利文献5：国际公开第2005/089070小册子
非专利文献1：J.Biol.Chem.，261，(1986)，15928～15933
非专利文献2：日本血栓止血学会志，第10卷，2～3号(1999)
非专利文献3：沃伊特生物化学(日文原文：ヴォ—ト生化学)，上卷，1996年，p331～340，东京化学同人
非专利文献4：Experimental cell research，219，650～656(1995)
非专利文献5：Biochimica et Biophyscia Acta，1451(1999)173～186
非专利文献6：J.Biol.Chem，Vol.275，39827～39830
非专利文献7：J.Biol.Chem，Vol.279，26387～26394
非专利文献8：J.Biol.Chem，Vol.277，27581～27584
发明内容
本发明的课题是提供一种不损害或提高抗血栓作用、并且降低了与肝素、血栓调节蛋白以及整合蛋白亲和性的凝血酶突变体。
为了解决上述课题，本发明人进行了深入研究。结果发现，通过至少将凝血酶B链的活性中心的氨基酸中位于第205位的丝氨酸及位于B链第89位的精氨酸置换成其他氨基酸，可得到与肝素的亲和性降低且活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time，APTT)延长效果提高的失活凝血酶突变体。进一步发现，通过至少将凝血酶B链的活性中心的氨基酸中位于第205位的丝氨酸置换成其他氨基酸，并将位于B链第69位的苏氨酸及位于B链第22位丝氨酸中的至少1个置换成其他氨基酸，可得到与血栓调节蛋白的亲和性降低且保持APTT延长效果及PAR1活化抑制能力的凝血酶突变体。进一步发现，通过至少将凝血酶B链的活性中心的氨基酸中位于第205位的丝氨酸及位于B链第200位的丙氨酸置换成其他氨基酸，可以不损害APTT延长效果、并且降低了与整合蛋白的结合性。更进一步发现，通过至少将凝血酶B链的活性中心的氨基酸中位于第205位的丝氨酸置换成其他氨基酸，并且将位于B链第65位的赖氨酸置换成苏氨酸，可得到高的APTT延长效果，从而完成本发明。
即，本发明如下所述。
(1)一种凝血酶突变体，其中，所述凝血酶B链的活性中心的氨基酸中，至少将位于第205位的丝氨酸置换成其他氨基酸，且还进行下述任意1种以上的置换：
(I)将位于B链第89位的精氨酸置换成其他氨基酸；
(II)将位于B链第69位的苏氨酸或位于B链第22位的丝氨酸置换成其他氨基酸；
(III)将位于B链第200位的丙氨酸置换成其他氨基酸；以及
(IV)将位于B链第65位的赖氨酸置换成苏氨酸。
(2)如(1)所述的凝血酶突变体，其中，置换位于B链第69位的苏氨酸及位于B链第22位的丝氨酸的氨基酸为侧链具有2个以上烷基的氨基酸。
(3)一种凝血酶突变体，其中，所述凝血酶B链的活性中心的氨基酸中，至少将位于第205位的丝氨酸置换成其他氨基酸，且还将位于B链第65位的赖氨酸置换成苏氨酸。
(4)如(1)～(3)任一项所述的凝血酶突变体，其中，所述凝血酶B链的活性中心的氨基酸中，至少将位于第205位的丝氨酸和位于第43位的组氨酸分别置换成其他氨基酸。
(5)一种编码(1)～(4)任一项所述的凝血酶突变体的多核苷酸。
(6)一种含有(5)所述的多核苷酸的重组载体。
(7)一种导入了(6)所述的重组载体的转化体。
(8)一种凝血酶突变体的制备方法，其中，所述方法包括培养(7)所述的转化体以生成(1)～(4)任一项所述的凝血酶突变体的工序。
(9)一种含有(1)～(4)任一项所述的凝血酶突变体的医药组合物。
(10)如(9)所述的医药组合物，其中，所述医药组合物为抗血栓剂。
下面详细说明本发明。
本发明的第一类型的凝血酶突变体，为至少将凝血酶B链的活性中心的氨基酸中位于第205位的丝氨酸(位于B链第205位的丝氨酸对应于序列号2的第254位的丝氨酸)和位于B链第89位的精氨酸(位于B链第89位的精氨酸对应于序列号2的第138位的精氨酸)分别置换成其他氨基酸。
本说明书中，作为凝血酶B链的活性中心的氨基酸，除了位于第205位的丝氨酸外，例如还有位于第203位的(位于B链第203位的甘氨酸对应于序列号2的第252位的甘氨酸)、第99位的天冬氨酸(位于B链第99位的天冬氨酸对应于序列号2的第148位的天冬氨酸)及第43位的组氨酸(位于B链第43位的组氨酸对应于序列号2的第92位的组氨酸)。本发明的凝血酶突变体的活性中心的氨基酸中，除了将第205位的丝氨酸置换外，也可以将第203位的甘氨酸、第99位的天冬氨酸及第43位的组氨酸中的1个或1个以上的氨基酸置换成其他氨基酸。本发明的凝血酶突变体的B链的活性中心的氨基酸中，优选将第205位的丝氨酸和第43位的组氨酸置换成其他氨基酸。即，作为本发明的第一类型的凝血酶突变体，更加优选将位于B链第205位的丝氨酸、位于B链第43位的组氨酸及位于B链第89位的精氨酸分别置换成其他氨基酸的凝血酶突变体。
本发明的第一类型的凝血酶突变体的氨基酸序列的一个例子表示在序列号6(B链为氨基酸编号第50～308)中。
用于置换位于B链第89位的精氨酸的氨基酸，只要是使凝血酶突变体的肝素亲和性降低的氨基酸，则没有特别限制，优选丙氨酸。
本发明的凝血酶突变体中，优选将位于B链第205位的丝氨酸置换成丙氨酸、苏氨酸或甘氨酸，其中特别优选将其置换成丙氨酸。优选将位于B链第203位的甘氨酸置换成丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸中的任一个。优选将位于B链第99位的天冬氨酸置换成天冬酰胺。优选将位于B链第43位的组氨酸置换成丙氨酸、丝氨酸或天冬酰胺，更加优选将其置换成丙氨酸。
上述第一类型的凝血酶突变体，与肝素的亲和性降低且APTT延长效果比置换前提高。
另外，关于与肝素的亲和性降低，可以通过使用肝素柱等的结合分析等进行确认(参照国际公开第2005/089070号小册子)。
另外，关于活化部分凝血活酶时间(APTT)延长，可以按照通常APTT测定方法测定添加了突变体的血浆的APTT，通过与对照进行比较来确认。
本发明的第二类型的凝血酶突变体，为至少将凝血酶B链的活性中心的氨基酸中位于第205位的丝氨酸置换成其他氨基酸，并将位于B链第69位的苏氨酸(位于B链第69位的苏氨酸对应于序列号2的第118位的苏氨酸)及位于B链第22位的丝氨酸(位于B链第22位的丝氨酸对应于序列号2的第71位的丝氨酸)中的至少1个分别置换成其他氨基酸的凝血酶突变体。
其中，该类型凝血酶突变体包括：(i)将位于B链第69位的苏氨酸及位于B链第205位的丝氨酸分别置换成其他氨基酸的凝血酶突变体；(ii)将位于B链第22位的丝氨酸及位于B链第205位的丝氨酸分别置换成其他氨基酸的凝血酶突变体；(iii)将位于B链第69位的苏氨酸、位于B链第22位的丝氨酸及位于B链第205位的丝氨酸分别置换成其他氨基酸的凝血酶突变体。
上述(i)～(iii)的组合中，也可以进一步将位于第203位的甘氨酸、位于第99位的天冬氨酸以及位于第43位的组氨酸中的1个或1个以上的氨基酸置换成其他氨基酸；上述(i)～(iii)的组合中，优选进一步将位于第43位的组氨酸置换成其他氨基酸。
本发明的第二类型的凝血酶突变体的氨基酸序列的一个例子表示在序列号12(B链为氨基酸编号第50～308)中。
优选将位于B链第69位的苏氨酸置换成侧链具有2个以上烷基的氨基酸(例如，谷氨酰胺、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、谷氨酸或缬氨酸)，特别优选将其置换成谷氨酰胺。
同样，优选将位于B链第22位的丝氨酸也置换成侧链具有2个以上烷基的氨基酸(例如，谷氨酰胺、精氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、谷氨酸或缬氨酸)，特别优选将其置换成谷氨酰胺。
上述第二类型的凝血酶衍生物，与血栓调节蛋白的亲和性降低，且具有与位于B链第69位的苏氨酸或位于B链第22位的丝氨酸置换前相同的APTT延长效果及PAR1活化抑制能力。
另外，关于与血栓调节蛋白的亲和性降低，可以通过后述的使用凝血酶结合池的结合分析等进行确认。
本发明的第三类型的凝血酶突变体，为至少将凝血酶B链的活性中心的氨基酸中位于第205位的丝氨酸和位于B链第200位的丙氨酸(位于B链第200位的丙氨酸对应于序列号2的第249位的丙氨酸)分别置换成其他氨基酸。
除了将位于B链第200位的丙氨酸及第205位的丝氨酸置换外，也可以进一步将位于第203位的甘氨酸、第99位的天冬氨酸以及第43位的组氨酸中的1个或1个以上的氨基酸置换成其他氨基酸，优选除了将位于B链第200位的丙氨酸及第205位的丝氨酸置换外，进一步将位于第43位的组氨酸置换成其他氨基酸。
本发明的第三类型的凝血酶突变体的氨基酸序列的一个例子表示在序列号16(B链为氨基酸编号50～308)中。
置换位于B链第200位的丙氨酸的氨基酸，只要是使凝血酶突变体与整合蛋白的亲和性降低的氨基酸，则没有特别限制，优选丝氨酸。
上述第三类型的凝血酶突变体，与整合蛋白的亲和性降低且保持与置换前相同的APTT延长效果。
本发明的第一至第三类型的凝血酶突变体中，也可以进一步将位于B链第65位的赖氨酸(位于B链第65位的赖氨酸对应于序列号2的第114位的赖氨酸)置换成其他氨基酸。作为置换位于B链第65位的赖氨酸的氨基酸，例如有丙氨酸、苏氨酸等，更加优选苏氨酸。
本发明的第四类型的凝血酶突变体，为至少将凝血酶B链的活性中心的氨基酸中的位于第205位的丝氨酸置换成其他氨基酸，且将位于B链第65位的赖氨酸(位于B链第65位的赖氨酸对应于序列号2的第114位的赖氨酸)置换成苏氨酸的凝血酶突变体。
除了将位于B链第65位的赖氨酸及第205位的丝氨酸置换外，也可以进一步将位于第203位的甘氨酸、第99位的天冬氨酸以及第43位的组氨酸中的1个或1个以上的氨基酸置换；优选除了将位于B链第65位的赖氨酸及第205位的丝氨酸置换外，还将位于第43位的组氨酸置换。
本发明的第四类型的凝血酶突变体的氨基酸序列的一个例子表示在序列号14(B链为氨基酸编号50～308)中。
上述第四类型的凝血酶突变体，与将位于B链第65位的赖氨酸置换成丙氨酸的情况相比，APTT延长效果提高。
另外，本说明书中，位于B链第205位的丝氨酸、位于B链第89位的精氨酸、位于B链第69位的苏氨酸、位于B链第22位的丝氨酸、位于B链第200位的丙氨酸、位于B链第65位的赖氨酸等，表示从B链的第1位的氨基酸(例如，位于序列号2的氨基酸编号50的异亮氨酸)开始计数的位置。另外，上述置换氨基酸的位置，根据氨基酸的缺失、插入、添加等，位置有时前后偏移。例如，如果在N末端部插入1个氨基酸残基，则原来第205位的丝氨酸变为第206位，这种对应于第205位丝氨酸的丝氨酸，在本发明中也称为第205位的丝氨酸。
本发明的凝血酶突变体中，也可以将上述第一至第四类型的氨基酸的置换进行组合。
进一步地，本发明的凝血酶突变体，只要是在不损害所发明效果的范围内，可以是在B链(位于序列号2的氨基酸编号50～308)中，除了上述特定的氨基酸外，还具有将1个或多个氨基酸进行置换、缺失、插入、添加的氨基酸序列的凝血酶突变体。这里，1个或多个是指1～20个、优选1～10个、更加优选1～5个。另外，本发明的凝血酶突变体，也可以是在A链(序列号2的氨基酸编号1～49)中具有将1个或多个氨基酸进行置换、缺失、插入、添加的氨基酸序列的凝血酶突变体。在这种情况下，1个或多个是指1～10个、优选1～5个、更加优选1～3个。
本发明的凝血酶突变体的氨基酸序列优选与序列号2的氨基酸序列80％以上相同，更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上相同。
本发明所使用的凝血酶突变体包括A链和B链，而且将该B链中上述特定的氨基酸进行了置换。本发明所使用的凝血酶突变体，只要在生物体内A链及B链通过S-S键可以形成交联的立体结构，则没有特别限制。由于A链及B链是将凝血酶前体蛋白质进行作用而生成，因此也可以是将本发明的凝血酶突变体以prethrombin和凝血酶原等前体蛋白质的形式给予生物体，在生物体内进行作用而形成上述立体结构。另外，以基因重组或化学合成等方法分别制备A链及B链，既可以使它们在体外形成S-S键，也可以将它们分别给药，在生物体内使上述A链及B链通过S-S键而形成交联的立体结构。
本文中，所谓A链，如果是人野生型凝血酶，则是指对应于序列号2的氨基酸编号1～49的区域；所谓B链，如果是人野生型凝血酶，则是指对应于序列号2的氨基酸编号50～308的区域。
人凝血酶中，A链N末端的13个氨基酸残基通过自我分解而被切离。因此，A链也可以是从N末端切离13个氨基酸残基(例如，序列号2的氨基酸编号1～13的残基)后的序列。进一步，在生物体内可以形成上述立体结构的凝血酶原及prethrombin等凝血酶前体蛋白质也包括在本发明的凝血酶突变体之中。另外，人野生型凝血酶原的氨基酸序列，作为登录号P00734公开在SwissProt的数据库中。
本发明中得到的凝血酶突变体，也可以通过凝血酶原给予生物体内。这种情况下，在血栓部位具有抗血栓效果的凝血酶得到活化，从而在血栓形成部位发挥抗血栓效果，并在生物体内获得更佳的部位特异性抗血栓效果。
本发明的凝血酶突变体通过以下来获得：例如采用PCR等获得野生型凝血酶基因(例如，序列号3)，通过定点突变法等将目的突变导入，制备编码各突变体的DNA，将该DNA插入载体等中，并使其在CHO(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢)细胞等哺乳动物细胞等中进行表达。这样的DNA可以编码上述A链及B链，也可以是分别表达各链。对于定点突变法并没有特别限定，例如，可以使用市售的QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制造)等进行。另外，通过化学合成也可以得到凝血酶突变体。
作为编码本发明的凝血酶突变体的多核苷酸，例如有具有序列号5、11、13、15的碱基序列的多核苷酸，但是，只要编码本发明的凝血酶突变体，则并不限于这些。另外，编码本发明的凝血酶突变体的多核苷酸，也可以是编码下述凝血酶突变体的多核苷酸：与序列号5、11、13、15的碱基序列的互补序列在严格条件下进行杂交、编码至少具有上述特定的突变并具有上述所希望效果的凝血酶突变体。这里，作为严格条件，例如为65℃、相当于0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下洗涤1次，更加优选洗涤2～3次的条件。
通过将本发明的凝血酶突变体与药学上可接受的载体进行组合，可用作医药组合物。作为药学上可接受的载体，并没有特别限制，可以使用通常药剂中通用的注射剂用溶剂、稳定剂、稀释剂、表面活性剂等。对本发明的医药组合物的给药单位的剂型并没有特别限定，可以根据治疗目的适当选择。例如注射剂等。本发明的医药组合物的给药量可根据症状等适当进行选择。
另外，作为医药组合物的用途，例如可以优选抗血栓治疗药、抗炎症剂、血小板凝集抑制剂、血小板粘着抑制剂、凝血酶受体活化抑制剂等。
实施例
实验例1
(1)人野生型凝血酶的表达
将含有人野生型凝血酶的A链及B链的DNA(序列号3)插入载体中以转染CHO细胞，得到prethrombin生产细胞。
另外，序列号4中所表示的人野生型prethrombin的序列中，氨基酸编号1～43为信号序列、44～92为A链、93～351为B链。
将prethrombin生产细胞在2升CD-CHO培养基中培养10天。在20升10mM PIPES缓冲液(pH7)中，将得到的2升prethrombin生产细胞的培养液于4℃透析2次、每次进行6小时，之后将透析液添加到500ml的CM Cellulofine(Chisso公司)中，用1升10mM PIPES缓冲液(pH7)洗涤。然后，用溶解于10mM PIPES缓冲液(pH 7)的0M～1M的NaCl进行线性梯度洗脱。将洗脱液分为多份，每份25ml，通过使用抗人凝血酶多克隆抗体(CosmoBio公司)的Western印迹法对这些部分进行确认，人野生型凝血酶在约0.5M的条件下得到洗脱。
(2)人野生型凝血酶的纯化
接着，将98ml含有蛇静脉酶(Ecarin)活化后的凝血酶的溶液添加到200ml用50mM Tris-HCl缓冲液、0.1M NaCl(pH8)平衡过的硫酸化Cellulofine柱(Chisso公司)中，所述蛇静脉酶活化后的凝血酶的溶液是水蛭素C末端肽结合实验中所使用的残留的凝血酶。用200ml相同缓冲液洗涤相同柱后，用50mM Tris-HCl缓冲液、1M NaCl(pH8)进行洗脱。进一步，将洗脱液在50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8)中透析，添加到用相同缓冲液平衡过的水蛭素C末端肽柱(200mg水蛭素C末端肽、30ml NHS活化的Cellulofine(Chisso公司))中。用150ml 50mMTris-HCl缓冲液洗涤该水蛭素C末端肽柱(WO2005/089070)后，用50mMTris-HCl缓冲液、1M NaCl、4M盐酸胍(pH8)进行洗脱，在SDS-PAGE上得到约5mg大致纯化的、具有水蛭素结合能力的人野生型凝血酶。
(3)APTT测定方法
关于本实施例中的方法，只要没有特别指定，则APTT的测定按照下述方法进行。
将标准血浆(国際試薬社)与样品混合，加入总量25％的APTT试剂(国際試薬社)，于37℃培养5分钟；5分钟后，添加0.1M CaCl2使其达到8mM，测定从添加钙开始到凝固为止的时间。
(4)肝素结合能力的确认方法F：
将5ml人野生型凝血酶或凝血酶突变体添加到用50mM NaHCO3/50mM NaCl溶液平衡过的HI-TRAP HEPARIN柱(Amersham Pharmacia公司)中，用15ml 50mM NaHCO3/0.1M NaCl溶液洗涤后，使用缓冲液A(50mM NaHCO3/0.1M NaCl)和缓冲液B(50mM NaHCO3/1M NaCl)，在流速0.5ml/min、100分钟的条件下，进行缓冲液B0％～100％的梯度洗脱。
实施例1
(1)将位于B链第89位的精氨酸置换成丙氨酸、位于B链第65位的赖氨酸置换成丙氨酸、位于B链第43位的组氨酸置换成丙氨酸、位于B链第205位的丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶突变体(以下称为89A65A43A205A凝血酶)的表达
通过使用对应于各突变点的突变导入引物的PCR法合成编码89A65A43A205A凝血酶的DNA。对89A65A43A205A凝血酶进行编码的DNA的碱基序列表示于序列号5。
使用实验例1的(1)的方法表达89A65A43A205A凝血酶。根据实验例1的(2)的方法，通过硫酸化Cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行纯化。在SDS-PAGE上得到约5mg大致纯化的89A65A43A205A凝血酶。测定与肝素凝胶的结合能力时，在约0.3M NaCl的条件下得到洗脱(人野生型凝血酶为在约0.5M NaCl的条件下得到洗脱)。
(2)89A65A43A205A凝血酶的APTT的测定
将100μl 50μg/ml的89A65A43A205A凝血酶(PBS：137mM NaCl，2.68mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4(pH 7.4))与100μl标准血浆(国際試薬社)混合，测定APTT。将同样仅添加PBS的标准血浆作为对照进行测定时，对照的APTT为46秒，89A65A43A205A凝血酶的APTT为121秒，延长为对照的2.63倍。
比较例1
(1)将位于B链第43位的组氨酸置换成丙氨酸、位于B链第205位的丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶突变体(以下称为43A205A凝血酶)的表达
通过使用对应于各突变点的突变导入引物的PCR法合成编码43A205A凝血酶的DNA。对43A205A凝血酶进行编码的DNA的碱基序列表示于序列号7。
使用实验例1的(1)的方法表达43A205A凝血酶。根据实验例1的(2)的方法通过硫酸化Cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行纯化。在SDS-PAGE上得到约5mg大致纯化的43A205A凝血酶。根据实验例1的(4)的方法测定与肝素凝胶的结合能力时，在与人野生型凝血酶相同的约0.5M NaCl的条件下得到洗脱。
(2)43A205A凝血酶的APTT的测定
将100μl 50μg/ml的43A205A凝血酶(PBS：137mM NaCl，2.68mMKCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4(pH 7.4))与100μl标准血浆(国際試薬社)混合，测定APTT。将同样仅添加PBS的标准血浆作为对照进行测定时，对照的APTT为43秒，43A205A凝血酶的APTT为75.5秒，延长为对照的1.76倍。
比较例2
(1)将位于B链第65位的赖氨酸置换成丙氨酸、位于B链第43位的组氨酸置换成丙氨酸、位于B链第205位的丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶突变体(以下称为65A43A205A凝血酶)的表达
通过使用对应于各突变点的突变导入引物的PCR法合成编码65A43A205A凝血酶的DNA。对65A43A205A凝血酶进行编码的DNA的碱基序列表示于序列号9。
使用实验例1的(1)的方法表达65A43A205A凝血酶。根据实验例1的(2)的方法通过硫酸化Cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行纯化。在SDS-PAGE上得到约5mg大致纯化的65A43A205A凝血酶。测定与肝素凝胶的结合能力时，在与人野生型凝血酶相同的约0.5M NaCl的条件下得到洗脱。
(2)65A43A205A凝血酶的APTT的测定
将100μl 50μg/ml的65A43A205A凝血酶(PBS：137mM NaCl，2.68mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4(pH 7.4))与100μl标准血浆(国際試薬社)混合，测定APTT。将同样仅添加PBS的标准血浆作为对照进行测定时，对照的APTT为44.5秒，65A43A205A凝血酶的APTT为105.5秒，延长为对照的2.37倍。
根据以上实验结果可知，通过将位于第89位的精氨酸进行置换，可得到与肝素的亲和性降低且APTT延长效果提高的凝血酶衍生物。
实施例2
(1)将位于B链第69位的苏氨酸置换成谷氨酰胺、位于B链第65位的赖氨酸置换成丙氨酸、位于B链第43位的组氨酸置换成丙氨酸、位于B链第205位的丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶突变体(以下称为69Q65A43A205A凝血酶)的表达
通过使用对应于各突变点的突变导入引物的PCR法合成编码69Q65A43A205A凝血酶的DNA。对69Q65A43A205A凝血酶进行编码的DNA的碱基序列表示于序列号11。
使用实验例1的(1)的方法表达69Q65A43A205A凝血酶。根据实验例1的(2)的方法通过硫酸化Cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行纯化。在SDS-PAGE上得到约5mg大致纯化的69Q65A43A205A凝血酶。根据实验例1的(4)的方法测定与肝素凝胶的结合能力时，在与人野生型凝血酶相同的约0.5M NaCl的条件下得到洗脱。
(2)69Q65A43A205A凝血酶的APTT的测定
将100μl 50μg/ml的69Q65A43A205A凝血酶(PBS：137mM NaCl，2.68mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4(pH 7.4))与100μl标准血浆(国際試薬社)混合，测定APTT。将同样仅添加PBS的标准血浆作为对照进行测定时，对照的APTT为45秒，69Q65A43A205A凝血酶的APTT为105.5秒，为与65A43A205A凝血酶大致相同的延长效果。
(3)69Q65A43A205A凝血酶与TM的结合特异性的确认
通过将69Q65A43A205A凝血酶的0.1mg/ml 10mM磷酸缓冲液(pH7)溶液和65A43A205A凝血酶的0.1mg/ml 10mM磷酸缓冲液(pH 7)溶液分别添加到NHS活化的CM葡聚糖池(日製産業社)中，于25℃搅拌10分钟，通过这样的操作将受试样品(凝血酶突变体)固定在NHS活化的CM葡聚糖池中，得到69Q65A43A205A凝血酶固定化池及65A43A205A凝血酶固定化池。69Q65A43A205A凝血酶池中约1365arc的蛋白质被固相化，65A43A205A凝血酶池中约1800arc的蛋白质被固相化。接着，加入0.2ml 1M的乙醇胺(pH8)进行封闭处理。
进一步，将两池用50mM磷酸缓冲液、2M NaCl、30mM苯甲脒(pH7.4)洗涤，回收后，在69Q65A43A205A凝血酶固定化池及65A43A205A凝血酶固定化池中，分别加入100μl 50nM可溶性TM溶液(CosmoBio公司)(溶解于50mM磷酸缓冲液、0.15M NaCl(pH 7.4)中)，10分钟后，69Q65A43A205A凝血酶固相化池中吸附有约8arc sec的TM，65A43A205A凝血酶固相化池中吸附有约18arc sec的TM(将固定化量设为1000arc sec时，69Q65A43A205A凝血酶固相化池中吸附有5.8arcsec的TM，65A43A205A凝血酶固相化池中吸附有10arc sec的TM)。通过将位于第69位的丝氨酸置换成谷氨酰胺，在保持APTT延长效果的状态下，TM结合能力进一步降低。
实施例3
(1)将位于B链第65位的赖氨酸置换成苏氨酸、位于B链第43位的组氨酸置换成丙氨酸、位于B链第205位的丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶突变体(以下称为65T43A205A凝血酶)的表达
通过使用对应于各突变点的突变导入引物的PCR法合成编码65T43A205A凝血酶的DNA。对65T43A205A凝血酶进行编码的DNA的碱基序列表示于序列号13。
使用实验例1的(1)的方法表达65T43A205A凝血酶。根据实验例1的(2)的方法通过硫酸化Cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行纯化。在SDS-PAGE上得到约5mg大致纯化的65T43A205A凝血酶。测定与肝素凝胶的结合能力时，在与人野生型凝血酶相同的约0.5M NaCl的条件下得到洗脱。
(2)65T43A205A凝血酶的APTT的测定
将100μl 50μg/ml的65T43A205A凝血酶(PBS：137mM NaCl，2.68mMKCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4(pH 7.4))与100μl标准血浆(国際試薬社)混合，测定APTT。将同样仅添加PBS的标准血浆作为对照进行测定时，对照的APTT为45秒，65T43A205A凝血酶的APTT为120秒、延长为对照的2.67倍。与将位于第65位的赖氨酸置换成丙氨酸的凝血酶(65A43A205A凝血酶)相比，将位于第65位的赖氨酸置换成苏氨酸的凝血酶(65T43A205A凝血酶)有效地延长了APTT。
实施例4
(1)将位于B链第200位的丙氨酸置换成丝氨酸、位于B链第65位的赖氨酸置换成丙氨酸、位于B链第43位的组氨酸置换成丙氨酸、位于B链第205位的丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶突变体(以下称为200S65A43A205A凝血酶)的表达
通过使用对应于各突变点的突变导入引物的PCR法合成编码200S65A43A205A凝血酶的DNA。对200S65A43A205A凝血酶进行编码的DNA的碱基序列表示于序列号15。
使用实验例1的(1)的方法表达200S65A43A205A凝血酶。根据实验例1的(2)的方法通过硫酸化Cellulofine、水蛭素C末端肽柱进行纯化。在SDS-PAGE上得到约5mg大致纯化的200S65A43A205A凝血酶。测定与肝素凝胶的结合能力时，在与人野生型凝血酶相同的约0.5M NaCl的条件下得到洗脱。
(2)200S65A43A205A凝血酶的APTT的测定
将100μl 50μg/ml的200S65A43A205A凝血酶(PBS：137mM NaCl，2.68mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4(pH 7.4))与100μl标准血浆(国際試薬社)混合，测定APTT。将同样仅添加PBS的标准血浆作为对照进行测定时，对照的APTT为44秒，200S65A43A205A凝血酶的APTT为104秒、延长为对照的2.36倍。200S65A43A205A凝血酶与65A43A205A凝血酶显示相同的APTT延长效果。
通过将位于B链第200位的丙氨酸置换成丝氨酸，成为使凝血酶特有的整合蛋白结合序列(RGDA序列)发生突变的序列，且得到保持APTT延长效果的衍生物。
比较例3
(1)将位于B链第197位的精氨酸置换成丙氨酸、位于B链第65位的赖氨酸置换成丙氨酸、位于B链第43位的组氨酸置换成丙氨酸、位于B链第205位的丝氨酸置换成丙氨酸的凝血酶突变体(以下称为197A65A43A205A凝血酶)的表达
通过使用对应于各突变点的突变导入引物的PCR法合成编码197A65A43A205A凝血酶的DNA。对197A65A43A205A凝血酶进行编码的DNA的碱基序列表示于序列号17。
使用实验例1的(1)的方法表达197A65A43A205A凝血酶。根据实验例1的(2)的方法通过硫酸化Cellulofine进行纯化。197A65A43A205A凝血酶不与水蛭素C末端肽柱结合。在SDS-PAGE上得到约5mg大致纯化的197A65A43A205A凝血酶。
(2)197A65A43A205A凝血酶的APTT的测定
将100μl 50μg/ml的197A65A43A205A凝血酶(PBS：137mM NaCl，2.68mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4(pH 7.4))与100μl标准血浆(国際試薬社)混合，测定APTT。将同样仅添加PBS的标准血浆作为对照进行测定时，对照的APTT为46秒，197A65A43A205A凝血酶的APTT为83秒、延长为对照的1.8倍。197A65A43A205A凝血酶与65A43A205A凝血酶相比，APTT延长效果降低。
工业实用性
由于本发明的凝血酶突变体与血管壁中存在的肝素样物质(硫酸乙酰肝素)、血栓调节蛋白和/或整合蛋白之间的亲和性显著降低，且具有高的抗血栓能力，因此可以有效地应用于血栓病等方面的治疗，且没有副作用。
序列表
SEQUENCE LISTING序列表
<110>Chisso Corporation智索株式会社
     FUJIMORI KOGYO Co.，Ltd.藤森工业株式会社
<120>Thrombin derivative凝血酶突变体
<130>SE5299-C7234
<150>JP2006-309007
<151>2006-11-15
<160>18
<170>PatentIn version 3.1
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Claims (10)

1、一种凝血酶突变体，其中，所述凝血酶B链的活性中心的氨基酸中，至少将位于第205位的丝氨酸置换成其他氨基酸，且还进行下述中任意1种以上的置换：
(I)将位于B链第89位的精氨酸置换成其他氨基酸；
(II)将位于B链第69位的苏氨酸或位于B链第22位的丝氨酸置换成其他氨基酸；
(III)将位于B链第200位的丙氨酸置换成其他氨基酸；以及
(IV)将位于B链第65位的赖氨酸置换成苏氨酸。
2、如权利要求1所述的凝血酶突变体，其中，置换位于B链第69位的苏氨酸及位于B链第22位的丝氨酸的氨基酸为侧链具有2个以上烷基的氨基酸。
3、一种凝血酶突变体，其中，所述凝血酶B链的活性中心的氨基酸中，至少将位于第205位的丝氨酸置换成其他氨基酸，且还将位于B链第65位的赖氨酸置换成苏氨酸。
4、如权利要求1～3任一项所述的凝血酶突变体，其中，所述凝血酶B链的活性中心的氨基酸中，至少将位于第205位的丝氨酸和位于第43位的组氨酸分别置换成其他氨基酸。
5、一种编码权利要求1～4任一项所述的凝血酶突变体的多核苷酸。
6、一种含有权利要求5所述的多核苷酸的重组载体。
7、一种导入了权利要求6所述的重组载体的转化体。
8、一种凝血酶突变体的制备方法，其中，所述方法包括培养权利要求7所述的转化体以生成权利要求1～4任一项所述的凝血酶突变体的工序。
9、一种含有权利要求1～4任一项所述的凝血酶突变体的医药组合物。
10、如权利要求9所述的医药组合物，其中，所述医药组合物为抗血栓剂。
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