CN101533013A - 一种快速检测全氟辛酸的胶体金层析试纸条及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种快速检测全氟辛酸的胶体金层析试纸条及制备方法，属于生物学免疫方法的检测技术领域。本发明的检测试纸条由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附全氟辛酸金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用全氟辛酸偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线，两条线平行排列。本试纸条特异性强，敏感性高，检出最低限量可达到5ppb；简便、快速、时效性强，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果；结果显示形象、直观、准确；节省费用，适用范围广，便于推广。

Description

一种快速检测全氟辛酸的胶体金层析试纸条及制备方法

技术领域

一种快速检测全氟辛酸的胶体金层析试纸条及制备方法，属于生物学免疫方法的检测技术领域。

背景技术

全氟辛酸，英文名称：Perfluorooctanoic acid(PFOA)，CAS号335-67-1，分子式为C₈HF₁₅O₂。全氟辛酸及其盐(PFOA)是一种常用的氟表面活性剂，具有很强的疏水性和疏油性，其化学结构远较其它表面活性剂稳定。由于它优异的耐热、耐低温、自润滑性及化学稳定性等，被应用在航天、电子、化学和消防领域，并被用在生活部门如不粘锅具、防水透气材料(如防水衣物)、皮革、汽车部件及微波炉爆玉米花袋等。PFOA难以降解，在环境中具有积累性和持久性，但其对人及环境的影响至今还没得出明确的结论。PFOA可通过摄取、吸入、皮肤接触而被吸收，从而诱发癌症、肝肿大等疾病。一些动物实验表明，PFOA能够扰乱脂肪酸的新陈代谢，影响生殖系统，可能与乳腺、睾丸、胰和肝肿瘤有关。PFOA的生物毒性作用还包括对免疫系统产生抑制作用，干扰线粒体代谢，导致肝细胞损伤，疾病感染致死等。由于其疏水疏油的特点，PFOA全氟有机物被生物摄取后一般不在脂肪组织中积累，其大部分与血浆蛋白结合存在于血液中，其余一部分则蓄积在动物的肝脏组织和肌肉组织中。由于它的这种分布特点以及没有很好的检测方法，使得PFOA的污染问题很长时间没有受到科学家的重视。全氟表面活性剂的研究在国际上已然成为环境科学和毒理学研究的热点，国内研究还尚属起步阶段。现有的仪器检测法样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，而且只有特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场检测，时效性差，难以推广，很难实现对PFOA进行快速、准确的检测。ELISA法以竞争性酶联免疫反应为检测原理，缩短了检测时间，可以定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程仍较复杂，而且国内外现处在研发阶段，因而ELISA方法的应用受到了较大限制。

发明内容

本发明的目的：针对现有检测全氟辛酸的技术的不足和缺陷，提供一种快速检测全氟辛酸的金标层析试纸条及其制备方法，使其能更加快速、灵敏、简便地检测全氟辛酸残留。

本发明的技术方案：一种全氟辛酸胶体金层析检测试纸条，由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附全氟辛酸金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用全氟辛酸偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线，两条线平行排列。

所述的衬板为不吸水的韧性材料；韧性材料为硬质塑胶条，或不吸水硬纸条。

所述的样品垫为玻璃纤维棉，或为尼龙膜，或为聚偏二氟乙烯膜，或为聚酯膜。

所述的金标结合垫为吸附全氟辛酸金标抗体的玻璃纤维棉。

所述的包被膜为硝酸纤维素膜，或为纯纤维素膜，或为羧化纤维素膜。

所述的吸水垫为吸水滤纸或滤油纸。

所述的全氟辛酸金标抗体为胶体金标记的全氟辛酸多克隆抗体，所述的偶联全氟辛酸的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或为鸡卵清白蛋白OVA。

所述试纸条的制备方法，首先需要制备偶联全氟辛酸载体蛋白，用于制备相应的检测线(T)线和抗体；而且需要制备全氟辛酸金标抗体，用于制备吸附全氟辛酸金标抗体的玻璃纤维棉；另外需要制备羊抗兔IgG抗体，用于制备对照线(C)线；

(1)、将全氟辛酸PFOA与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原PFOA-BSA：

(2)、将人工结合抗原PFOA-BSA按常规方法免疫制得抗全氟辛酸多抗；

(3)、用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；

(4)、用0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液为pH9.0，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌，逐滴加入150μL多抗溶液，平衡过夜，逐滴加入5％BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，再将金标抗体溶液常温3000rpm离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，余下的溶液体积以下称原体积，取该余下的红色上清溶液于4℃以11000rpm离心40min，溶液分为二层：透明上清及管底可流动的暗红色沉淀；轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心；重复2～4次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得全氟辛酸胶体金标记抗体；

所述重悬液为含5％蔗糖的0.002mol/L pH9.0的硼酸钠缓冲液；

(5)、将1:100～500稀释的全氟辛酸胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备全氟辛酸金标结合垫；

(6)、在包被膜上用全氟辛酸偶联的载体蛋白溶液印制直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制直线式隐形对照线C线，两条线平行排列；

(7)、试纸条的组装：将样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫由一端依次粘附在衬板上，即得到用于免疫检测的全氟辛酸胶体金层析检测试纸条。

胶体金层析试纸条检测反应原理

全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid)，因为分子量仅为414，属于小分子物质。本发明采用竞争法，即样品中的全氟辛酸和固定在包被膜上的包被抗原PFOA-OVA竞争胶体金标记的抗全氟辛酸多克隆抗体。

当试纸条以样品垫末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下往上泳动，溶解金标垫上干燥的金标抗体，若待测样品中不存在待测药物，则金标抗体会直接泳动到检测线和硝酸纤维膜上的PFOA-OVA发生免疫反应，从而胶体金颗粒发生聚集，形成红色的线条，然后其他未结合的金标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与控制线上的羊抗兔二抗发生第二次免疫反应，同样形成红色线条，这样包被膜上就会有两条红色线条，表示样品为阴性。若待测样品中存在待测药品，则金标抗体首先会和样品中的检测物发生免疫反应，当未发生反应的金标抗体有剩余时，才会在检测线上与PFOA-OVA发生免疫反应，形成红色线条，其颜色强度弱于阴性时的线条强度；而当金标抗体全部和样品中的全氟辛酸发生免疫结合时，就不会再有抗体与控制线包被原结合，从而检测线就不会有红色线条出现。控制线是为检验金标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在待测药物全氟辛酸，控制线都应该显现。如果控制线不显色，则说明试纸条失效。

本发明的有益效果：本发明的检测试纸条具有下列优点：

①特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条以胶体金标记高亲和力的多克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到5ppb。

②简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果。

③结果显示形象、直观、准确。检测试纸条均以显示红色线T线和C线作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条红色线C线时，表示在被检样品中含有被检物，显示两条红色线T线和C线时，表示在被检样品中不含被检物。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。

④节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条，比用仪器分析和ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。

附图说明

图1、全氟辛酸胶体金层析检测试纸条剖面结构示意图。

图2、全氟辛酸胶体金层析检测试纸条俯视结构示意图。

具体实施方式

要制成全氟辛酸检测试纸条，首先需要制备偶联全氟辛酸载体蛋白，用于制备相应的检测线(T线)和抗体；而且需要制备全氟辛酸金标抗体，用于制备相应的金标抗体纤维棉；另外需要制备羊抗兔IgG抗体，用于制备对照线(C线)。

1、全氟辛酸与载体蛋白偶联

碳二亚胺法：将全氟辛酸(PFOA)与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原PFOA-BSA。具体制备方法如下：

2mg(0.00483mmol)全氟辛酸、8mg(0.000121mmol)牛血清蛋白BSA溶于1mL0.1mol/L的PBS缓冲液，逐滴加入现配的水溶性碳二亚胺EDC的甲醇溶液，室温轻柔搅拌3小时，即得偶联物PFOA-BSA混合液；

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

将人工抗原PFOA-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液。

2、抗全氟辛酸多克隆抗体的制备

多抗制备：用全氟辛酸载体蛋白结合抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为1mg/次，背部皮下多点注射。首免，用全氟辛酸载体蛋白结合抗原与等量弗氏完全佐剂(FCA)混合，充分乳化；加强免疫，用全氟辛酸载体蛋白结合抗原与等量弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，首免后3周进行，连续免疫4-5次，每次间隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到10⁵以上时，采血并分离收集血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用。

3、全氟辛酸金标抗体和金标物结合垫的制备

柠檬酸三钠还原法制备胶体金：由于氯化金极易吸湿，因此使用小剂量封装的氯化金时，必须一次配完。将1g的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1％的水溶液。放在4℃冰箱内保存，保存时间长达几个月至1年左右。再取1％的氯金酸溶液10mL，配制成浓度为0.1g/l的氯金酸溶液。取0.1g/l氯金酸溶液50mL放入锥形瓶，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾并持续2min，在100r/min磁力搅拌下，加入1％柠檬酸三钠水溶液2mL，保持温度和搅拌速度不变，继续搅拌加热6min，直至溶液呈透亮的酒红色。室温冷却，4℃保存备用。获得直径为20nm-40nm的胶体金溶液。

用0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液为pH9.0，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌，逐滴加入150μL抗体溶液，平衡过夜。逐滴加入5％BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，以饱和游离的胶体金。再将金标抗体溶液常温低速(3000rpm)离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。取红色上清溶液于4℃以11000rpm离心40min。溶液分为二层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀。轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心。如此重复2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得西布曲明胶体金标记抗体。

将1∶100～500稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备全氟辛酸金标物结合垫。

实施例1：把0.5mg/ml的包被抗原及羊抗兔IgG喷在包被膜上，分别作为检测线(T)和控制线(C)，在37℃烘箱干燥10min。以同样方法，将一定浓度的金标抗体包被在结合垫上。试纸条组成为一个衬板，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫。将贴好的板切割成3mm宽的条，然后将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

检测操作方法：将全氟辛酸胶体金层析检测试纸条样品端插入待测样品液中，插入深度不超过标记线，约10～20秒钟取出检测试纸条，水平放置，15分钟左右观察判定检测结果。

结果判定：如果在包被膜上仅有C线一条红线显现，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有全氟辛酸；如果在包被膜上C线和T线两条红线都显现，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含全氟辛酸或含量低于检测限；如果在包被膜上C线红线不显现，则表明试纸条已失效。

Claims (4)

1.一种全氟辛酸胶体金层析检测试纸条，其特征在于由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附全氟辛酸金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用全氟辛酸偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线，两条线平行排列。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述的衬板为不吸水的韧性材料；所述的韧性材料为硬质塑胶条，或不吸水硬纸条；

所述的样品垫为玻璃纤维棉，或为尼龙膜，或为聚偏二氟乙烯膜，或为聚酯膜；

所述的金标结合垫为吸附全氟辛酸金标抗体的玻璃纤维棉；

所述的包被膜为硝酸纤维素膜，或为纯纤维素膜，或为羧化纤维素膜；

所述的吸水垫为吸水滤纸或滤油纸。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述的全氟辛酸金标抗体为胶体金标记的全氟辛酸多克隆抗体，所述的偶联全氟辛酸的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或为鸡卵清白蛋白OVA。

4.权利要求1所述试纸条的制备方法，其特征在于首先制备偶联全氟辛酸载体蛋白，用于制备相应的检测线T线和抗体；制备全氟辛酸金标抗体，用于制备吸附全氟辛酸金标抗体的玻璃纤维棉；制备羊抗兔IgG抗体，用于制备对照线C线；

(1)、将全氟辛酸PFOA与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原PFOA-BSA：

(2)、将人工结合抗原PFOA-BSA按常规方法免疫制得抗全氟辛酸多抗；

(3)、用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；

(4)、用0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液为pH 9.0，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌，逐滴加入150μL多抗溶液，平衡过夜，逐滴加入5％ BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，再将金标抗体溶液常温3000rpm离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，余下的溶液体积以下称原体积，取该余下的红色上清溶液于4℃以11000rpm离心40min，溶液分为二层：透明上清及管底可流动的暗红色沉淀；轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心；重复2～4次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得全氟辛酸胶体金标记抗体；

所述重悬液为含5％蔗糖的0.002mol/L pH 9.0的硼酸钠缓冲液；

(5)、将1:100～500稀释的全氟辛酸胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备全氟辛酸金标结合垫；

(6)、在包被膜上用全氟辛酸偶联的载体蛋白溶液印制直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制直线式隐形对照线C线，两条线平行排列；

(7)、试纸条的组装：将样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫由一端依次粘附在衬板上，即得到用于免疫检测的全氟辛酸胶体金层析检测试纸条。