CN101530780A - 一种两步分离提纯柱及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种两步分离提纯柱及其应用，涉及分离提纯柱及其在食品安全检测中分离提纯邻苯二甲酸酯类的应用。它由上端的活性炭颗粒填料柱和下端的弗罗里硅土填料柱结合制成。该两步分离提纯柱应用于分离提纯邻苯二甲酸酯类。本发明采用活性炭颗粒柱与弗罗里硅土柱结合纯化富集邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)和邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)可以实现两者的检出限较粗提物的检出限减小。膜粗提物中DNOP和DBP的检出限均为经过活性炭颗粒柱与弗罗里硅土柱结合纯化富集后的10倍；苹果粗提物中DNOP和DBP的检出限分别为经过活性炭颗粒柱与弗罗里硅土柱结合纯化富集后的8.3倍和10倍。本发明易于大规模，大量样品的检测。
Description
技术领域
本发明属于化学技术领域，涉及食品检测方法，尤其是食品安全检测的前处理方法，具体为一种两步分离提纯柱及其在食品安全检测中分离提纯邻苯二甲酸酯类的应用。
背景技术
邻苯二甲酸酯类(phthalic acid esters，PAEs)又称酞酸酯，在塑料工业中常用做增塑剂和软化剂，其含量有时可高达高聚体本身的60％，以增大塑料的可塑性和韧性。邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)和邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)均属于邻苯二甲酸酯类，是目前应用非常广泛的增塑剂，具有生殖毒性、胚胎毒性和遗传毒性，它们在人体和动物体内，发挥着类似雌性激素的作用，干扰内分泌，含量高时，被认为可能损害人体肝脏、肾脏和生殖器官，并有致癌风险。它们与塑料基质不以氢键和范德华力连接，彼此保持独立的化学性质，在包装食品时，会迁移到食品中使食品受到污染。由于食品样品中PAEs含量较低，且基质复杂，准确分析测定有较大的难度，目前分析测定的难点是样品的前处理。
发明内容
本发明的目的是提供一种两步分离提纯柱及其在测定邻苯二甲酸酯类的应用，尤其是在分离提纯邻苯二甲酸二正辛酯和邻苯二甲酸二正丁酯的应用。使用本发明的方法可以使包装食品中的邻苯二甲酸酯类(PAEs)得到富集，便于检测。
本发明的一种两步分离提纯柱由上端的活性炭颗粒填料柱和下端的弗罗里硅土填料柱结合制成。
该两步分离提纯柱应用于分离提纯邻苯二甲酸酯类。
所述邻苯二甲酸酯类为邻苯二甲酸二正辛酯或邻苯二甲酸二正丁酯。
固体分离柱的制备采用活性碳柱与弗罗里硅土柱结合，活性炭柱与弗罗里硅土柱均干法上柱，加压使填料压实。
本发明所说的活性炭颗粒，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；本发明所说的弗罗里硅土(层析用，60-100目)，学名为硅镁型吸附剂，英文名flolisil，购自温州市化学用料厂。
以下对本发明分案进一步描述：
一、层析柱填料的选取
分别用等量中性氧化铝、酸性氧化铝、弗罗里硅土、硅藻土、硅胶、活性炭颗粒为填料装柱，对邻苯二甲酸二正辛酯和邻苯二甲酸二正丁酯进行动态吸附试验。结果表明活性炭颗粒和弗罗里硅土有较高的吸附率和解吸率，并且除杂效果显著，因此选用活性炭颗粒和弗罗里硅土分别作为填料，两柱结合纯化富集邻苯二甲酸二正辛酯和邻苯二甲酸二正丁酯。
二、上样液流速对吸附效果的影响
活性炭颗粒柱：分别取1mL DNOP和DBP浓度分别为0.00049mg/mL、0.0005235mg/mL的原料液(甲醇为溶剂)，按0.5、1.0、2.0、3.0mL/min的流速通过装柱量为0.500g的活性碳颗粒柱，收集流出液，N2吹干后，用甲醇定容至1mL，用HPLC进行检测，计算各吸附率。结果表明上柱流速的增大，吸附率降低，造成样品流失。但是流速过慢，吸附时间增加，检测周期延长。综合考虑，上样液流速选择1mL/min较为理想。
弗罗里硅土柱：分别取1mL DNOP和DBP浓度分别为0.00049mg/mL、0.0005235mg/mL的原料液(二氯甲烷为溶剂)，按0.5、1.0、2.0、3.0mL/min的流速通过装柱量为1.000g的活性碳颗粒柱，收集流出液，N2吹干后，用甲醇定容至1mL，用HPLC进行检测，计算各吸附率。结果表明上柱流速的增大，吸附率降低，造成样品流失。但是流速过慢，吸附时间增加，检测周期延长。综合考虑，上样液流速选择1mL/min较为理想。
三、洗脱体系的确定
本发明中所说的丙酮，其浓度百分比均为体积比，其溶剂为水。
活性炭颗粒柱：由于邻苯二甲酸二正辛酯和邻苯二甲酸二正丁酯均为弱极性脂溶性物质，初选乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、丙酮、10％丙酮+正己烷、20％丙酮+正己烷、30％丙酮+正己烷为备选洗脱体系。将1mL DNOP和DBP浓度分别为0.00049mg/mL、0.0005235mg/mL的原料液(甲醇为溶剂)以1mL/min的流速通过装柱量为0.5000g的活性碳颗粒柱，吸附完成后，分别用5mL的乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、丙酮、10％丙酮+正己烷、20％丙酮+正己烷、30％丙酮+正己烷进行洗脱，收集各洗脱液，N2吹干后，用甲醇定容至1mL，用HPLC进行检测，计算各种洗脱剂的洗脱率。结果显示，对于DNOP，乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、丙酮、10％丙酮+正己烷、20％丙酮+正己烷、30％丙酮+正己烷的洗脱率分别为87.78％、77.64％、95.36％、48.76％、53.21％、66.68％、74.70％、63.60％；对于DBP，洗脱率分别为48.61％、72.78％、92.97％、24.89％、52.60％、41.31％、62.50％、43.74％。可以看出，二氯甲烷的洗脱率最高，因此选用二氯甲烷为洗脱剂。同样的操作重复5次，二氯甲烷作洗脱剂时，DNOP和DBP的RSD值分别为2.56％和2.87％。
弗罗里硅土柱：初选甲醇、乙酸乙酯、丙酮、20％丙酮+正己烷、40％丙酮+正己烷为备选洗脱体系。将1mLDNOP和DBP浓度分别为0.00049mg/mL、0.0005235mg/mL的原料液(二氯甲烷为溶剂)以1mL/min的流速通过装柱量为1.000g的弗罗里硅土柱，吸附完成后，分别用5mL的甲醇、乙酸乙酯、丙酮、20％丙酮+正己烷、40％丙酮+正己烷进行洗脱，收集各洗脱液，N2吹干后，用甲醇定容至1mL，用HPLC进行检测，计算各种洗脱剂的洗脱率。结果显示，对于DNOP，甲醇、乙酸乙酯、丙酮、20％丙酮+正己烷、40％丙酮+正己烷的洗脱率分别为85.09％、74.87％、84.93％、93.34％、91.86％；对于DBP，洗脱率分别为42.48％、51.57％、81.76％、98.22％、98.06％。可以看出，20％丙酮+正己烷作为洗脱剂最佳。同样的操作重复5次，20％丙酮+正己烷作洗脱剂时，DNOP和DBP的RSD值分别为3.81％和2.11％。
四、洗脱流速的选择
活性炭颗粒柱：将1mL浓度为0.00049mg/mL的DNOP，和1mL浓度为0.0005235mg/mL的DBP原料液(均以甲醇为溶剂)以1mL/min的流速通过装柱量为0.500g的活性碳颗粒柱，吸附完成后，用5mL的二氯甲烷分别以0.5、1.0、2.0、3.0mL/min的流速进行洗脱，收集各洗脱液，N2吹干后，用甲醇定容至1mL，用HPLC进行检测，测定DNOP和DBP的含量，计算各洗脱率。结果显示，对于DNOP，洗脱率分别为94.48％、93.62％、85.86％、82.54％；对于DBP，洗脱率分别为93.28％、91.97％、90.22％、88.76％。结果表明，相同体积的洗脱剂洗脱活性炭颗粒柱，流速越慢，洗脱率越高。但是流速慢耗时长，不经济，综合考虑，选择洗脱流速为1mL/min。
弗罗里硅土柱：将1mL DNOP和DBP浓度分别为0.00049mg/mL、0.0005235mg/mL的原料液(二氯甲烷为溶剂)以1mL/min的流速通过装柱量为1.000g的弗罗里硅土柱，吸附完成后，分别用5mL的20％丙酮+正己烷以流速0.5、1.0、2.0、3.0mL/min进行洗脱，收集各洗脱液，N2吹干后，用甲醇定容至1mL，用HPLC进行检测，测定DNOP和DBP的含量，计算各洗脱率。结果显示，对于DNOP，洗脱率分别为93.36％、92.06％、90.13％、89.34％、；对于DBP，洗脱率分别为95.08％、93.88％、91.46％、88.22％。以上数据可以看出，相同体积的洗脱剂洗脱活性碳颗粒柱，流速越慢，洗脱率越高。但是流速慢耗时长，综合考虑，选择洗脱流速为1mL/min。
本发明的有益效果：
本发明采用活性炭颗粒柱与弗罗里硅土柱结合纯化富集邻苯二甲酸二正辛酯和邻苯二甲酸二正丁酯，解决了由于食品样品中PAEs含量较低，基质复杂，准确分析测定有较大难度的问题，使分析测定的样品前处理难点得以化解。使用本发明的方法可以使包装食品中的邻苯二甲酸酯类(PAEs)得到富集，便于检测。
采用活性炭颗粒柱与弗罗里硅土柱结合纯化富集邻苯二甲酸二正辛酯和邻苯二甲酸二正丁酯，可以实现两者的检出限较粗提物的检出限减小。膜粗提物中DNOP和DBP的检出限均为经过活性炭颗粒柱与弗罗里硅土柱结合纯化富集后的10倍；苹果粗提物中DNOP和DBP的检出限分别为经过活性炭颗粒柱与弗罗里硅土柱结合纯化富集后的8.3倍和10倍。该富集方法易扩大规模，进行大量样品的检测。
本发明对包装食品安全的检测具有较高的应用价值。
附图说明
图1为本发明的一种两步分离提纯柱结构图，图中：1、用以加压的注射器，2、连接器一，3、活性炭颗粒填料，4、隔板一，5、调节流速的阀门一，6、连接器二，7、弗罗里硅土填料，8、隔板二，9、调节流速的阀门二。
具体实施方式
为验证本发明的两步分离提纯柱实际应用的效果，特提供以下实施例：两步分离提纯柱处理后提取物回收率及检出限的比较。
实施例1
将聚氯乙烯(PVC)膜剪成0.5cm×0.5cm大小的碎片。称取0.500g的膜，添加1.96mg/kg的DNOP标准液和2.094mg/kg的DBP标准液。加30ml正己烷，超声30min，残渣用20ml正己烷分3次洗涤，合并洗涤液，旋转蒸发浓缩至3-5ml后，进行后续操作。
①不过柱：直接氮吹仪吹干，用甲醇定容至1ml，测定DNOP和DBP浓度，并计算回收率；
②过活性炭柱：添加约0.500g活性炭颗粒，先用2ml二氯甲烷预淋洗柱，再用2ml正己烷预淋洗柱，然后上样，用5ml二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，氮吹仪吹干，用甲醇定容至1ml，测定DNOP和DBP浓度，并计算回收率；
③过弗罗里硅土柱：添加1.500g弗罗里硅土填料，先用5ml按体积比为20％丙酮水溶液+正己烷预淋洗柱，再用2ml正己烷预淋洗柱，然后上样，用5ml按体积比为20％丙酮水溶液+正己烷洗脱，收集洗脱液，氮吹仪吹干，用甲醇定容至1ml，测定DNOP和DBP浓度，并计算回收率；
④先过活性炭柱再过弗罗里硅土柱：柱1(添加约0.500g活性炭颗粒)先用2ml二氯甲烷预淋洗柱，再用2ml正己烷预淋洗柱，然后上样，用5ml二氯甲烷洗脱，收集洗脱液I，柱2(添加1.500g弗罗里硅土填料)先用5ml按体积比为20％丙酮水溶液+正己烷预淋洗柱，再用2ml正己烷预淋洗柱，将洗脱液I上样至柱2，用5ml按体积比为20％丙酮水溶液+正己烷洗脱，收集洗脱液，氮吹仪吹干，用甲醇定容至1ml，测定DNOP和DBP浓度，并计算回收率。
液相测定条件：流速1ml/min，进样；量20ul，检测波长238nm，流动相：甲醇：水＝95：5(DNOP)，甲醇：水＝80：20(DBP)。重复5次。
表1 膜四种处理后提取物回收率及检出限的比较
| DNOP检出限(mg/kg) | 回收率(％) | DBP检出限(mg/kg) | 回收率(％) | |
| ①不过柱 | 0.196 | 84.09 | 0.1047 | 80.07 |
| ②过活性炭柱 | 0.098 | 86.58 | 0.02094 | 87.17 |
| ③过弗罗里硅土柱 | 0.098 | 81.61 | 0.02094 | 84.50 |
| ④先过活性炭柱再过弗罗里硅土柱 | 0.0196 | 98.22 | 0.01047 | 94.69 |
由表1可以看出，回收率在80.07％-98.22％之间，表明试验方法可行，且经过4种不同处理的样品回收率有明显差异。样品经过①、②、③处理的样品目标物的回收率差异不大；④处理的目标物回收率最高，且经过④处理的检出限比①处理的减小了10倍。
实施实例2
苹果洗净后于高速组织捣碎机中打碎后，称取15.00g，添加0.327mg/kg的DNOP标准液和0.2327mg/kg的DBP标准液。加入提取液(V(丙酮)：V(正己烷)＝1:3)50mL，超声提取1h，抽滤弃渣。用10mL提取液洗涤抽滤瓶和漏斗，滤液转移至分液漏斗，收集有机相，水相用50mL正己烷分两次萃取后合并有机相。旋转蒸发浓缩至3-5ml后，进行后续操作。
①不过柱：直接氮吹仪吹干，用甲醇定容至1ml，测定DNOP和DBP浓度，并计算回收率；
②过活性炭柱：添加约0.500g活性炭颗粒，先用2ml二氯甲烷预淋洗柱，再用2ml正己烷预淋洗柱，然后上样，用5ml二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，氮吹仪吹干，用甲醇定容至1ml，测定DNOP和DBP浓度，并计算回收率；
③过弗罗里硅土柱：添加1.500g弗罗里硅土填料，先用5ml按体积比为20％丙酮水溶液+正己烷预淋洗柱，再用2ml正己烷预淋洗柱，然后上样，用5ml按体积比为20％丙酮水溶液+正己烷洗脱，收集洗脱液，氮吹仪吹干，用甲醇定容至1ml，测定DNOP和DBP浓度，并计算回收率；
④先过活性炭柱再过弗罗里硅土柱：柱1(添加约0.500g活性炭颗粒)先用2ml二氯甲烷预淋洗柱，再用2ml正己烷预淋洗柱，然后上样，用5ml二氯甲烷洗脱，收集洗脱液I，柱2(添加1.500g弗罗里硅土填料)先用5ml按体积比为20％丙酮水溶液+正己烷预淋洗柱，再用2ml正己烷预淋洗柱，将洗脱液I上样至柱2，用5ml按体积比为20％丙酮水溶液+正己烷洗脱，收集洗脱液，氮吹仪吹干，用甲醇定容至1ml，测定DNOP和DBP浓度，并计算回收率。
表2 苹果四种处理后提取物回收率及检出限的比较
| DNOP检出限(mg/kg) | 回收率(％) | DBP检出限(mg/kg) | 回收率(％) | |
| ①不过柱 | 0.0545 | 84.56 | 0.04654 | 85.55 |
| ②过活性炭柱 | 0.0327 | 86.98 | 0.02327 | 87.30 |
| ③过florisil柱 | 0.0327 | 77.56 | 0.02327 | 81.12 |
| ④先过活性炭柱再过florisil柱 | 0.00654 | 94.70 | 0.004654 | 95.18 |
由表2看出回收率在77.56％-95.18％之间，表明试验方法可行，且经过4种不同处理的样品回收率有明显差异。样品经过①、②、③处理的样品目标物的回收率差异不大；④处理的目标物回收率最高，且经过④处理的DNOP检出限是①处理的0.12倍，经过④处理的DBP检出限比①处理减小了10倍。
用活性炭柱和弗罗里硅土柱两柱结合对PAEs纯化富集的研究上未见报道。本发明开发活性炭柱和弗罗里硅土柱两柱结合对PAEs纯化富集，可以实现两者的检出限较粗提物的检出限减小。膜粗提物中DNOP和DBP的检出限均为经过活性炭颗粒柱与弗罗里硅土柱结合纯化富集后的10倍；苹果粗提物中DNOP和DBP的检出限分别为经过活性炭颗粒柱与弗罗里硅土柱结合纯化富集后的8.3倍和10倍。
Claims (3)
1、一种两步分离提纯柱，其特征在于：它由上端的活性碳颗粒填料柱和下端的弗罗里硅土填料柱结合制成。
2、如权利要求1一种两步分离提纯柱的应用，其特征在于：该两步分离提纯柱应用于分离提纯邻苯二甲酸酯类。
3、如权利要求2一种两步分离提纯柱的应用，其特征在于：所述邻苯二甲酸酯类为邻苯二甲酸二正辛酯或邻苯二甲酸二正丁酯。
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