CN101526529A - 呋喃妥因代谢物检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及呋喃妥因代谢物检测试剂盒。本发明提供一种检测呋喃妥因代谢物的酶联免疫试剂盒，包括有：包被呋喃妥因代谢物衍生物抗原的酶联板与酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体或包被呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体的酶联板与酶标记呋喃妥因代谢物衍生物抗原；所述呋喃妥因代谢物衍生物抗原是采用活性酯法将呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与载体蛋白进行偶联得到的。本发明提供的试剂盒内生产的试剂盒使用方便，而且在准确性、灵敏度、特异性等方面均性能良好。

Description

呋喃妥因代谢物检测试剂盒

技术领域

本发明涉及呋喃妥因代谢物检测试剂盒。

背景技术

硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素，它有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用作为家畜、家禽、人工养殖水产品的促生长添加剂。但通过长期的实验室研究发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，并由此推断，人类长期使用该类药物或长期食用添加该类促生长剂的家畜、家禽、人工养殖水产品，同样也可发生癌变和基因突变。所以此类药物禁止在治疗和饲料中使用。

我国于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令，在农业部发布的193号公告的《食品动物禁用兽药及其他化合物清单》中，硝基呋喃类抗生素在所有食品动物和所有用途中都被禁止使用。

欧盟委员会于2003年通过了2003/181/EC委员会决议，建立了用于检测禽肉产品和水产品中硝基呋喃类药物的代谢物的各种方法的最小要求性能限值(Minimum Required Performance Limits，MRPL)为1μg/kg，欧盟从第三国进口的动物性产品中硝基呋喃类药物的代谢物的含量不得超过1μg/kg。2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃妥因。因此，为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展，建立准确可靠，灵敏度高的定性定量方法是十分必要的。

由于呋喃妥因在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物(AHD)则能存留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，检测监管部门就以检测代谢产物为手段达到检测呋喃妥因残留的目的。

国内外现已开发出检测呋喃妥因的酶联免疫试剂盒，但是现在国内大部分需求是从国外进口的，国内生产的试剂盒在准确性、灵敏度、特异性等方面还不能优于进口试剂盒。

发明内容

为了克服现有技术中存在的上述缺陷。

本发明提供一种检测呋喃妥因代谢物(AHD)的酶联免疫试剂盒，包括有：包被呋喃妥因代谢物衍生物抗原的酶联板与酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体或包被呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体的酶联板与酶标记呋喃妥因代谢物衍生物抗原；所述呋喃妥因代谢物衍生物抗原是采用活性酯法将呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与载体蛋白进行偶联得到的。

上述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白或血蓝蛋白。

上述酶联板是以聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶或琼脂糖凝胶为载体，用pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5％v/v甲醇的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，含有8％-15％w/v的脱脂奶和1％w/v惰性蛋白的溶液作为封闭液制备而成的。

上述酶联板的制备方法如下：

(1)用包被缓冲液将呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与载体蛋白偶联物或抗抗体以0.02-0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；

(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15-30s，去除水分；

(3)向酶联板的每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

作为优化，上述酶为过氧化物酶或半乳糖甘酶，优选为过氧化物酶。

上述酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体是采用戊二醛法进行偶联制得。

上述酶标记抗原是采用活性酯法将标记酶与呋喃妥因代谢物半抗原进行偶联得到。

上述呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体。

作为优化，上述试剂盒还包含呋喃妥因代谢物衍生物标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液和浓缩复溶液。更优选底物显色液为单底物液。

本发明提供的试剂盒内生产的试剂盒使用方便，而且在准确性、灵敏度、特异性等方面均性能良好。

附图说明

图1是呋喃妥因检测标准曲线图。

具体实施方式

本发明的检测原理：本发明是采用ELISA直接竞争法，当包被原为呋喃妥因代谢物衍生物偶联抗原时是将呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白偶联物(AHD-BGG)吸附于固相载体上，加入样本或呋喃妥因代谢物衍生物标准品，然后加酶标记呋喃妥因代谢物特异性抗体，待测样品中残留的呋喃妥因代谢物(经前处理衍生化以后)和酶标板上包被的呋喃妥因代谢物衍生物抗原竞争酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体。显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中呋喃妥因代谢物残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出呋喃妥因代谢物的浓度。

包被蛋白为呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体时是将特异性抗体吸附于固相载体上，加入酶标记呋喃妥因代谢物衍生物抗原，再加入样本或呋喃妥因代谢物衍生物标准品溶液，待测样本中残留的呋喃妥因代谢物(经前处理衍生化以后)和酶标记呋喃妥因代谢物衍生物抗原竞争呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中呋喃妥因代谢物残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出呋喃妥因代谢物的浓度，与标准溶液颜色比较则可判断样品中呋喃妥因代谢物的浓度范围。

本发明提供了一种检测动物源性食品中呋喃妥因代谢物的酶联免疫试剂盒，它含有：

(1)包被呋喃妥因代谢物衍生物抗原的酶联板或包被呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体的酶联板；

(2)酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体或酶标记呋喃妥因代谢物衍生物抗原；

(3)呋喃妥因代谢物衍生物标准品溶液；

(4)底物显色液；

(5)终止液；

(6)浓缩洗涤液；

(7)浓缩复溶液；

本发明所述试剂盒中呋喃妥因代谢物衍生物包被抗原是采用活性酯法将呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与载体蛋白进行偶联得到的，该载体蛋白可为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白、血蓝蛋白等大分子载体。制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5％甲醇的碳酸盐缓冲液；包被呋喃妥因代谢物衍生物抗原或抗体的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为去离子水或超纯水；所用的封闭液是含有8％-15％的脱脂奶和1％惰性蛋白的溶液。

本发明所述试剂盒中包被呋喃妥因代谢物衍生物抗原的酶联板或包被抗体的酶联板的制备步骤为：

(1)用包被缓冲液将呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与载体蛋白偶联物或抗体以0.02-0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；

(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15-30s，拍干；

(3)向酶联板的每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试验，酶联板的相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。

本发明所述试剂盒中酶标记物为酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体或酶标记呋喃妥因代谢物衍生物抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本发明优选过氧化物酶；酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液；酶标记物工作液所用的稀释液为含有50％甘油(可防止放入-20℃环境的酶标记物冻结，亦可长时间保持酶标记物的生物活性)、1％的叠氮化钠防腐剂(便于保存)的溶液。

本发明所述试剂盒中酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体的制备步骤为：

过氧化物酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体的制备：将抗体与过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗体与辣根过氧化物酶的结合率升高，传统GA一步法偶联反应不易控制，反应速度快的分子易发生自生聚合，且偶联效率不高。为了解决这些问题，我们将一步法进行了改进，克服了一步法的缺点。首先在被偶联的两种分子中，与偶联剂反映较弱的分子先用过量的偶联剂活化，然后去处多余的偶联剂；第二步将一端与某种分子连接的偶联剂，通过改变反应条件而与另一种分子连接起来。在戊二醛二步法中，酶本身并不产生缩合，因为在第二步酶分子上的一个游离氨基仅与戊二醛上的一个活性醛基联结，而戊二醛上另一个活性醛基则可与第二步加入的抗体球蛋白分子上的氨基结合生成酶结合物，因此，两步法优点是能生成均一的酶结合物，大多可使一个分子酶与一个分子球蛋白作用，抗体和酶的活性损失较少，所得酶结合物活性比一步法高10倍左右。二步法虽然操作较繁，但偶联效率提高，而且形成的同分子聚合物减少。

本发明所述试剂盒中酶标记抗原是采用戊二醛法将标记酶与呋喃妥因代谢物半抗原进行偶联得到。

本发明所述试剂盒中呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体，免疫原是采用活性酯法将呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白进行偶联得到的；抗体形式可为冻干粉、浓缩液、工作液；抗体稀释液为pH值7.4、0.08mol/L、含有0.3％明胶、5‰吐温-80和5‰甲醇的磷酸盐缓冲液。

本发明所述试剂盒中呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体，其制备方法如下：

(1)呋喃妥因代谢物衍生物单克隆抗体制备的步骤为：

a.动物免疫程序：采用纯系的8-12周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为100-300μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；

b.细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5-10∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

c.细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1-5×10⁶个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；

d.单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵-10⁶个/只，7-10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存；

e.抗体冻干粉可将腹水在37℃环境下烘干，放入-20℃保存；

f.抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02-0.08μg/ml浓度进行稀释。

(2)呋喃妥因代谢物衍生物多克隆抗体制备的步骤为：

采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫原(呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为1mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7-10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

本发明所述试剂盒中当标记酶为过氧化物酶时底物显色液为过氧化氢或过氧化脲与四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液、终止液为0.1-0.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为半乳糖甘酶时，底物显色液为0.5mol/L磷酸钾缓冲液，终止液为2mol/L的柠檬酸缓冲液；浓缩洗涤液为去离子水或超纯水；浓缩复溶液为含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。

本发明所述试剂盒中呋喃妥因代谢物衍生物标准品溶液为六个浓度梯度的呋喃妥因代谢物衍生物溶液，呋喃妥因代谢物衍生物稀释液为含有5‰甲醇的磷酸盐缓冲液。

本发明所述试剂盒中试剂的配制具体为：

a.呋喃妥因代谢物衍生物标准溶液：呋喃妥因代谢物衍生物系列标准溶液6瓶，浓度为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L，1-3ml/瓶。

b.包被缓冲液：pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5％甲醇的碳酸盐缓冲液。

c.封闭液：含有8％-15％的脱脂奶和1％惰性蛋白的溶液。

d.洗涤液：去离子水或超纯水，30-50ml/瓶，1瓶。

e.酶标记物：酶标记抗抗体工作液或酶标记呋喃妥因代谢物衍生物抗原工作液，7-12ml/瓶，1瓶。

f.底物显色液过氧化氢或过氧化脲与四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，10-15ml/瓶，1瓶。

g.底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液：pH8.1、含有MgCl₂0.01％的100mmolTris-HCl；

h.终止液：1-2mol/L硫酸、盐酸或2mol/L氢氧化钠缓冲液，5-8ml/瓶，1瓶。

i.抗体稀释液：pH值7.4、0.08mol/L、含有0.3％明胶、5‰土温-80和5‰甲醇的磷酸盐缓冲液。

j.浓缩复溶液：含有5％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液，为正常使用浓度的5-10倍，30-50ml/瓶，1瓶。

k.衍生化试剂溶液：100％甲醇或100％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)

本发明所述检测动物源性食品中呋喃妥因代谢物的方法，包括了以下步骤：

(1)样品前处理；

(2)用本发明所述的试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

(1)本发明中样品前处理方法为：

样本前处理需配制：

用去离子水将2×浓缩复溶液按1∶1稀释，用于样本提取后的复溶。

衍生化试剂：称15.1mg邻硝基苯甲醛用衍生化试剂溶液定溶至10ml。

C液：(供奶样用)称12.5g亚硝基铁氰化钾用去离子水定溶至100ml。

D液：(供奶样用)称29.8g硫酸锌用去离子水溶解定溶至100ml。

0.1M K₂HPO₄称22.8g K₂HPO₄·3H₂O加去离子水溶解定溶至1L

1M HCl取8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。

1M NaOH称取4g NaOH加水定溶至100ml。

a.肉样或鱼虾

取1±0.05g的均质样本(肉样/鱼虾)加入4ml的去离子水，0.5ml1M HCl和100μl衍生化试剂，充分振荡；置于72℃过夜孵育(大约2-4h)；分别加入5ml 0.1M K₂HPO₄，0.4ml 1M NaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振荡30s；在室温下(20-25℃)4000r/min以上离心10min；取出2.5ml的乙酸乙酯到另一洁净容器中于50℃氮气/空气吹干；用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml己稀释好的复溶液充分混合；在室温下(20-25℃)4000r/min以上离心10min；取50μl下层相用于分析。

样本稀释倍数：2

本法的优点在于提高了衍生化的温度，使反应时间大大缩短。

b.奶样

取2ml牛奶，将其置5000rpm离心10min，除去上层脂肪，取下层50μl，试剂盒所提供的复溶液按1∶40倍稀释。

样本稀释倍数：40

c.蜂蜜

取1±0.05g样本到离心管中；加入4ml的去离子水溶解，再加入0.5ml 1M HCl和100μl衍生化试剂，充分振荡；置于72℃过夜孵育(大约2-4h)；分别加入5ml 0.1M K₂HPO₄，0.4ml 1M NaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振荡30s；在室温下(20-25℃)4000r/min以上离心10min；取出2.5ml的乙酸乙酯到另一洁净容器中于50℃氮气/空气吹干；用1ml正己烷溶解干燥物，用1ml己稀释好的复溶液充分混合；在室温下(20-25℃)4000r/min以上离心10min。

样本稀释倍数：2

d.蛋类

称取制备好的鸡蛋样本2g，加入到50ml离心管中，分别加入4ml水，0.5ml 1M HCl，200μl C液，振荡混匀；加入200μl D液，充分振荡5min，室温(20-25℃)3000g以上离心10min；取全部上清液，加入200μl衍生化试剂，充分振荡，50℃水浴2h(中间每半个小时剧烈振荡1-2分钟)；分别加入5ml 0.1M K₂HPO₄，0.4ml 1M NaOH5ml乙酸乙酯，剧烈振荡30s，室温(20-25℃)4000r/min以上离心10min；取2.5ml上层有机相于50℃下氮气吹干；加入1ml正己烷溶解干燥物；加入2ml稀释后的复溶液，振荡10s，4000r/min以上离心10min(如出现乳化现象，请于60℃水浴中加热5min，再重复离心)；除去上层有机相；取下层水相50μl用于分析。

(2)用本发明所述的试剂盒进行检测：

1)从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2)取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3)配液：将40ml浓缩洗涤液(20倍浓缩)用蒸馏水或去离子水稀释至800ml备用(或按需要量稀释)。

4)编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5)加标准品/样本50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体50μl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。37℃环境中反应30min。

6)取出将孔内液体甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。

7)显色：每孔加入底物液100μl，轻轻振荡混匀，37℃环境中避光显色15min。

8)测定：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。

(3)分析检测结果：

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与SEM的含量成负相关。

1)定性判定：

用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含AHD浓度范围(ng/ml)。假设样品1的吸光度值为0.268，样品2的吸光度值为1.230，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.671；0.05ppb为1.425；0.15ppb为1.103；0.45ppb为0.567；1.35ppb为0.205；4.05ppb为0.104。则样品1的浓度范围是0.45ppb-1.35pb；样品2的浓度范围是0.05ppb-0.15ppb。(再乘以相应的稀释倍数)

2)定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，即百分吸光度值。

B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀-0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以AHD标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图，见图1。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中AHD实际浓度。

本发明提供的检测动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留的酶联免疫试剂盒及方法，样品前处理过程简单，检测时间断、费用低廉，且能同时检测大批样品。

实施例1检测呋喃妥因代谢物的酶联免疫试剂盒组分的制备

1.抗原的合成

a.包被原的合成

将呋喃妥因代谢物采用邻硝基苯甲醛衍生物法合成呋喃妥因代谢物衍生物半抗原，再将半抗原通过重氮化反应和牛丙种球蛋白载体蛋白用活性酯法进行偶联得到。

b.免疫原的合成

将呋喃妥因代谢物采用邻硝基苯甲醛衍生物法合成呋喃妥因代谢物衍生物半抗原，再将半抗原通过重氮化反应和钥孔槭血蓝蛋白载体蛋白用活性酯法进行偶联得到。

2.呋喃妥因代谢物衍生物鼠单克隆抗体的制备

a.动物免疫

采用。Balb/c小鼠作为免疫动物，以呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为300μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。

b.细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

c.细胞冻存和复苏

取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×10⁶个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的制备与纯化

采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁶个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，20℃保存。

3.呋喃妥因代谢物衍生物兔多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为3mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

4.酶标板的制备

用包被缓冲液将呋喃妥因代谢物衍生物特异性兔抗体稀释成0.06μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育6h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次1min，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，37℃温育1h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例2检测呋喃妥因代谢物的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测呋喃妥因代谢物的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被呋喃妥因代谢物衍生物抗原的酶联板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的呋喃妥因代谢物衍生物特异性鼠抗体；

(3)呋喃妥因代谢物标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35g/L、4.05μg/L；

(4)底物显色液过氧化氢与四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液；

(5)终止液为2mol/L的硫酸缓冲液；

(6)浓缩洗涤液为去离子水或超纯水；

(7)抗体稀释液为pH值7.4、0.08mol/L、含有0.3％明胶、5‰吐温-80和5‰甲醇的磷酸盐缓冲液。

(8)浓缩复溶液含有5％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液；

实施例3检测呋喃妥因代谢物的酶联免疫试剂盒的的组建

组建检测呋喃妥因代谢物的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被呋喃妥因代谢物衍生物特异性兔抗体的酶联板；

(2)用半乳糖甘酯酶标记的呋喃妥因代谢物衍生物抗原；

(3)呋喃妥因代谢物衍生物标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.025μg/L、0.075μg/L、0.225μg/L、0.675μg/L、2.025μg/L；

(4)底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液；

(5)终止液为2mol/L的氢氧化钠缓冲液；

(6)浓缩洗涤液为PH 7.4，含有0.8％吐温20和0.1％叠氮化钠(NaN₃)防腐剂的磷酸盐缓冲液；

(7)浓缩复溶液为含有50％甲醇、1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。

实施例4样品中呋喃妥因代谢物残留的检测

1.样品前处理

取1g鱼虾的均质物，依次加入4ml的蒸馏水，0.5ml1M的HCl和100μl 10mM的2-硝基苯甲醛，充分振荡。72℃孵育2小时，分别加入5ml 0.1M K₂HPO₄，0.4ml 1M NaOH和5ml的乙酸乙酯，剧烈振荡30秒钟在室温下(20-25℃)离心，转速为3000rpm。取出2.5ml的乙酸乙酯层蒸干，用1ml的正己烷溶解干燥物，用1ml的复溶液适当的混合。在室温(20-25℃)、3000rpm离心。用50μl的下层液体进行分析。

2.用试剂盒检测

向呋喃妥因代谢物衍生物偶联抗原包被的96孔酶标板微孔中加系列标准品或样本溶液(各2孔)50μl，再加入酶标记呋喃妥因代谢物衍生物抗体工作液50μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，每孔加入250μl洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入底物显色液100μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min。每孔加入终止液2mol/L硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准溶液的吸光度平均值(B)，除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(Bo)，再乘以100％，得到百分吸光度值。以呋喃妥因代谢物浓度的半对数为x轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，将样品溶液的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品溶液中呋喃妥因代谢物所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品溶液中呋喃妥因代谢物的实际浓度。

实施例5样品中呋喃妥因代谢物残留的检测

1.样品前处理

取2ml牛奶，将其置5000rpm离心10min，除去上层脂肪，取下层50μl，试剂盒所提供的复溶液按1∶40倍稀释。

2.用试剂盒检测

向呋喃妥因代谢物衍生物特异性兔抗体包被的96孔酶标板微孔中加入半乳糖甘酶标记的呋喃妥因代谢物衍生物抗原50μl，再加入系列标准品或样本溶液50μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，重复洗涤过程。加入对硝基磷酸盐缓冲液100μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min。每孔加入终止液2mol/L。氢氧化钠50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(Bo)再乘以100％，得到百分吸光度值。以呋喃妥因代谢物衍生物浓度(μg/L)的半对数为x轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，将样品溶液的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品溶液所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品溶液中呋喃妥因代谢物实际浓度。

实验例1标准品精密度试验

从每批按照实施例1(4)中的方法制备的酶联板中，各抽出10个微孔，测定0.45μg/L。标准溶液的吸光度值(OD值)，重复3次，计算变异系数CV％，结果见表1。

表1标准可重复性试验(CV％)

结果表明变异系数范围在4.5％-9.3％之间，符合了变异系数小于20％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了标准。

实验例2样本可重复性试验

以1μg/L，浓度的呋喃妥因代谢物对鱼虾、肌肉和牛奶，添加到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各五个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表2、表3。

表2鱼虾、肌肉样品可重复性试验

表3牛奶样品可重复实验

结果表明鱼虾、肌肉样本变异系数均低于20％，牛奶样本的变异系数均低于20％，符合了变异系数小于25％的规定，说明本试剂盒测定样本的精密度达到了标准。

实验例3试剂盒的准确度试验

取两个浓度的呋喃妥因代谢标准品溶液，分别为0.3μg/kg(L)和1μg/kg(L)，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率。

表4试剂盒的准确度

结果表明鱼虾、肌肉添加的回收率在73.5％-93％之间，牛奶添加回收率在78％-90％之间。

实验例4

试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、呋喃妥因代谢物添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒在2-8℃可以保存6个月以上。

Claims (10)

1.一种呋喃妥因代谢物检测试剂盒，包括有：

包被呋喃妥因代谢物衍生物抗原的酶联板与酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体或包被呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体的酶联板与酶标记呋喃妥因代谢物衍生物抗原；

所述呋喃妥因代谢物衍生物抗原是采用活性酯法将呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与载体蛋白进行偶联得到的。

2.根据权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白或血蓝蛋白。

3.根据权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述酶联板是以聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶或琼脂糖凝胶为载体，用pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5％v/v甲醇的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，含有8％-15％w/v的脱脂奶和1％w/v惰性蛋白的溶液作为封闭液制备而成的。

4.根据权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述酶联板的制备方法如下：

(1)用包被缓冲液将呋喃妥因代谢物衍生物半抗原与载体蛋白偶联物或抗抗体以0.02-0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；

(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15-30s，拍干；

(3)向酶联板的每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

5.根据权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述酶为过氧化物酶或半乳糖甘酶。

6.根据权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体是采用戊二醛法进行偶联制得。

7.根据权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记抗原是采用戊二醛法将标记酶与呋喃妥因代谢物半抗原进行偶联得到。

8.根据权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述呋喃妥因代谢物衍生物特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体。

9.据权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含呋喃妥因代谢物衍生物标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液和浓缩复溶液。

10.据权利要求9所述的呋喃唑酮代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为单底物液。

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