CN101524538A - 一种流感-大流行流感二价联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能大量生产制备高效且低成本的流感－大流行流感二价联合疫苗及其制备方法，包括流感全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗和大流行流感裂解疫苗的制备方法，并涉及一种新型流感－大流行流感注射用疫苗制剂及其制备工艺，包括毒种库的制备，疫苗原液生产与制备。本发明提供的流感－大流行流感二价联合疫苗制剂包含流感和禽流感两种抗原，可同时方便的预防流感和禽流感两种病毒性传染病，防止两种病的暴发流行。

Description

一种流感-大流行流感二价联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体是涉及一种联合疫苗及其制备方法，特别是指一种流感-大流行流感联合疫苗及其制备方法。

背景技术

流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三个型的流感病毒(influenza virus)分别引起的急性呼吸道传染病。甲型流感的流行通常会引起世界性的流感大流行，并能在家畜和家禽中引起流感流行；乙型常会引起流感局部爆发，但不引起世界性流感大流行；丙型以散发病例形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。流感在流行病学上的特点是突然爆发，迅速蔓延，波及面广，发病率高，在年迈体衰和慢性病患者中死亡率较高。其流行具有一定的季节性，在温、寒带地区，通常在冬春季流行，但在热带和亚热带地区，则任何季节都可流行。流感患者是流感的主要传染源，人感染后的潜伏期为1～3天，从潜伏期末到发病的急性期(约7天)都有传染性。婴幼儿和年老者常易从单纯型转为肺炎型，少数则损害全身血液系统和神经系统，出现脑炎症状而呈中毒型。近百年已经出现了5次世界性流感大流行，给人类造成了大量人员死亡与财产损失。我国用于预防流感的三种疫苗均为灭活疫苗，均含有流行的甲1、甲3及乙型3种流感病毒抗原成分；三种灭活疫苗分别为全病毒灭活苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。

禽流感(Avian influenzaAI)是由甲型动物流感病毒引起的一种严重危害养禽业的高度传染性、致死性疾病。自1997年起，一种新的H5N1亚型高致病性禽流感病毒在全世界范围内蔓延，并且突破种间屏障向人类传播。截至2007年5月26日，全世界确诊的H5N1亚型禽流感感染人数已达307人，死亡186人，死亡率高达60.6％。虽然目前尚无证据表明这种病毒获得了“人传人”的能力，但近年来禽类H5N1亚型流感在全球范围内的不断爆发，使用高致病性禽流感病毒与人流感病毒重组的空间空前加大，一旦这种病毒发生变异、重组而获得人与人之间传播的能力，将会引起人禽流感大流行，届时将导致上千万人死亡。人禽流感已成为人类潜在威胁之一。目前禽流感病毒跨种传播的机制还不十分清楚，但由于高致病性禽流感具有较高的死亡率，临床上治愈可能性比较小，而人体对这种新的病毒又不具有免疫力，所以一旦这种病毒获得了人与人之间传播的能力，将引发一场流感的大流行，世界卫生组织专家警告，这将比SARS更可怕，可能会导致上千万人死亡。高致病性禽流感已成为世界性公共卫生问题。我国现广泛使用的是称为大流行流感疫苗的含H5N1型禽流感病毒的裂解禽流感疫苗来对禽流感进行预防。

含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗的研究一直为众学者所关注，并以其方便、高效、低成本为新一代疫苗研究的热点，与单一疫苗相比，联合疫苗可减少疫苗接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，采用单一疫苗形式生产，由于各个生产环节环环相扣的冷链运作，费用极高。

此外，目前同为流感病毒感染的流感和禽流感联合疫苗还未见任何报道。

发明内容

本发明的第一个目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种方便、多效、低成本并能有效预防流感和大流行流感的流感-大流行流感二价联合疫苗。

本发明的另一个目的是提供一种能高效且低成本地大量制备流感-大流行流感二价联合疫苗的制备方法。

为实现本发明的第一个目的，本发明的技术方案是，该流感-大流行流感二价联合疫苗包括有流感免疫抗原和禽流感免疫抗原以及疫苗佐剂。

进一步设置是所述的流感免疫抗原为含有H1N1、H3N2、B型的血凝素，其HA含量20-40μg/ml，大流行流感免疫原HA的含量为30-60μg/ml。

进一步设置是所述的流感免疫抗原为流感全病毒灭活液或流感病毒裂解液或提取的流感病毒亚单位抗原。

进一步设置是其流感免疫抗原生产所用流感病毒株为当年WHO推荐流感病毒株或相似株。

进一步设置是所述的禽流感免疫原为用禽流感病毒株制备的禽流感病毒裂解液。所述的禽流感病毒株为NIBRG-14。

进一步设置是所述的疫苗佐剂为甘油或氢氧化铝。该类佐剂为本领域技术人员所熟知，易于获得和制备。

为实现本发明的第二个目的，本发明的技术方案包括有以下步骤，

(1)、制备流感疫苗原液，选用当年WHO推荐甲1、甲3及乙型病毒株制备流感疫苗原液；

(2)、制备大流行流感病毒裂解疫苗原液，该大流行流感病毒裂解疫苗原液选用禽流感病毒株N IBRG-14为病毒种；

(3)、将步骤(1)和(2)中制备的两种疫苗抗原原液混合后，用0.01mol/L、PH 6.8-7.2的PBS溶液稀释，使H1N1、H3N2、B型的血凝素终浓度为20-40μg/ml，禽流感免疫原的HA为30-60μg/ml。

进一步设置是所述的流感疫苗原液为流感全病毒灭活液或流感病毒裂解液或提取的流感病毒亚单位抗原。

【联合疫苗的免疫效力比较试验】

文献表明，交叉血凝抑制试验和交叉单向免疫扩散试验证明各型血清仅与同型抗原有较高的血抑滴度或有反应，与其他型别抗原反应弱或无反应。所以在注射了流感和禽流感联合疫苗的动物体内分别检测禽流感和流感抗体基本无互相影响，结果是可信的。

采用未检出禽流感和流感病毒的血抑抗体和中和抗体的清洁级昆明小鼠，体重10～12g，采用不同稀释度的本发明所述联合疫苗、单独的大流行流感疫苗和流感疫苗经肌肉注射免疫小鼠，联合疫苗中注射剂A组含禽流感病毒血凝素3ug和流感病毒血凝素2ug，注射剂B组含禽流感病毒血凝素6ug和流感病毒血凝素4ug，单独的大流行流感疫苗含禽流感病毒血凝素3ug和6ug，流感疫苗含流感病毒血凝素2ug和4ug，每组4～5只，14天后加强一针，并分别于初免当天、加强免疫当天及加强免疫后14天采血分离血清，检测血清中禽流感中和抗体和流感血凝抑制抗体滴度。血凝抑制抗体滴度采用常规方法。中和抗体测定采用在鸡胚中测定中和抗体，固定病毒，稀释血清，等量混合，于37℃中和90min后，每只鸡胚接种100EID₅₀/0.5ml，计算各剂量接种小鼠的抗体几何平均滴度。

表1小鼠免疫后的禽流感血清抗体滴度(1∶x)

表2小鼠免疫后的流感病毒血清血凝抗体滴度(1∶x)

从表1中可看出，小鼠接种一针联合疫苗和大流感疫苗14天后，禽流感的中和抗体滴度非常低；进行了第二针接种14天后，中和抗体滴度都有明显升高，且可看出只经流感免疫的小鼠都不能检测出明显的禽流感中和抗体滴度。数据显示本发明提供的流感-大流行流感二价联合疫苗和单独大流行流感疫苗均能诱发小鼠产生有效的禽流感抗体。

表2中所示的数据表明，小鼠接种了本发明提供的流感-大流行流感二价联合疫苗和单独流感疫苗后，其流感中和抗体滴度均能达到有效数值，表明联合疫苗和单独大流行流感疫苗均能诱发小鼠产生有效的流感抗体。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、通过上述联合疫苗的免疫效力比较试验表明，本发明提供的的流感-大流行流感二价联合疫苗可以有效地预防流感和大流行流感。

2、与单一疫苗相比，本发明提供的流感-大流行流感二价联合疫苗可以减少疫苗接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；此外疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，而本发明提供的联合疫苗形式生产，则可以大大降低疫苗成本和市场价格，具有显著的经济效益，且有利于疫苗的推广保护受众的健康。

具体实施方式

本发明所涉及的口服流感-大流行流感联合疫苗其制备流程如下：

(1)流感和禽流感疫苗种子库的制备：和其它各种剂型的流感疫苗一样，要建立原代、主代、工作代三级种子库，三级种子库须经检定：血凝滴度、病毒滴度、无菌试验，支原体、鉴别试验、外源因子(禽腺病毒、白血病毒检测)等项目。

(2)流感和禽流感病毒液的制备：工作种子接种鸡胚，经培养、收获病毒液、澄清过滤、纯化处理后灭活，制成全病毒液，须经检定：血凝含量、无菌试验，灭活试验、鉴别试验等项目。之后分别按流感和禽流感裂解或亚单位疫苗原液制备方法进行制备。

(3)联合疫苗制备：将两种疫苗原液按比例混合稀释。

本发明中采用的甲1、甲3及乙型三种流感病毒株均为WHO专家推荐毒种，禽流感病毒株为N IBRG-14，来自英国国家生物制品检定所，系用A/Vietnam/1194/2004(H5N1)(简称1194株)和PR8株(H1N1)病毒通过重配得到，按《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》建立疫苗种子库并进行检定后备生产使用。

本发明所涉及流感病毒疫苗原液的制备方法分为三种。第一种为流感全病毒灭活疫苗，其制备方法为将单价流感病毒接种于9-11日龄鸡胚尿囊腔中，置33℃-35℃培育48-72h，筛选活胚置2℃-8℃冷却一定时间收获尿囊液，合并后加β-丙内酯置2℃-8℃灭活，将已灭活单价病毒合并液进行超滤浓缩，浓缩液再应用柱层析法纯化，最后经滤膜除菌过滤，制成单价病毒原液。

第二种为裂解疫苗，其病毒培养方法与全病毒灭活疫苗相同，将收获的尿囊液病毒经澄清和透析(去尿酸盐)，再经超滤浓缩和柱层析或超速区带离心纯化病毒后，使用裂解剂TritonX-100使病毒裂解，再经纯化、浓缩和透析，β-丙内酯置2℃-8℃灭活后，除菌过滤制成疫苗原液，该疫苗原液去除了病毒脂质体成分，保留病毒HA、NA和内部抗原。

第三种亚单位疫苗的病毒培养方法也与全病毒灭活疫苗相同，在裂解疫苗基础上，提取病毒亚单位(HA、NA)，主要工艺包括病毒灭活、病毒裂解和有效抗原(亚单位)纯化三个过程，这种疫苗原液只含有高度纯化的流感病毒表面抗原(HA、NA)，完全去除病毒脂质体和内部抗原。

本发明中大流行流感疫苗只涉及裂解苗一种，其原液制备方法与流感裂解苗一致。大流行流感裂解疫苗原液生产用毒种为N IBRG-14(简称R1194株)，来自英国国家生物制品检定所。禽流感病毒接种于9-11日龄鸡胚尿囊腔中，置33℃-35℃培育48-72h，筛选活胚置2℃-8℃冷却一定时间收获尿囊液，将收获的尿囊液病毒经澄清和透析(去尿酸盐)，再经超滤浓缩和柱层析或超速区带离心纯化病毒后，使用裂解剂TritonX-100使病毒裂解，再经纯化、浓缩和透析，β-丙内酯置2℃-8℃灭活后，除菌过滤制成大流行流感疫苗原液。

将制备好的流感疫苗原液，包括流感全病毒灭活液，或流感病毒裂解液，或提取的流感病毒亚单位抗原按比例与大流行流感裂解疫苗原液混合，用0.01mol/L PBS(PH 6.8-7.2)溶液稀释，使H1N1、H3N2、B型的血凝素终浓度为20-40μg/ml，禽流感免疫原的含量为30-60μg/ml；即为制成的流感-大流行流感联合疫苗注射针剂。

优选实施例

本实施例流感疫苗原液选用流感全病毒灭活疫苗原液，该流感全病毒灭活疫苗原液生产用毒种为：H1N1型IVR-148株、H3N2型为NYMC X-175C株、以及B型B/Florida/4/2006株。选择健康鸡群的9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。3-4lg EID₅₀、0.2ml接种，33℃培养48～72h。之后筛选活胚置2℃-8℃冷却后收获尿囊液和羊水，合并后加β-丙内酯(终浓度1∶4000)置2℃-8℃，24-48h灭活病毒，之后37℃水解2h，得疫苗原液。用截留50万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗液，之后用8倍体积的0.01mol/L PBS(PH 7.2)进行衡滤。浓缩疫苗液经Sepharose 4FF凝胶柱层析或超速区带离心纯化后，得到纯化流感全病毒灭活疫苗原液。

当然本发明所用的流感疫苗原液也可以选用流感病毒裂解液或提取的流感病毒亚单位，适应不同的年龄群体。流感裂解疫苗原液生产用毒种为H1N1型IVR-148株、H3N2型NYMC X-175C株、以及B型B/Florida/4/2006株。选择健康鸡群的9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。3-4lg EID₅₀、0.2ml接种，33℃培养48～72h。之后筛选活胚置2℃-8℃冷却后收获尿囊液和羊水，将收获的尿囊液病毒经澄清和透析(去尿酸盐)，再经截留50万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗液后，使用凝胶过滤柱Sepharose 4FF或超速区带离心纯化病毒后，再使用0.5％的TritonX-100为裂解剂室温放置2小时使病毒裂解，再经10万分子量的超滤器超滤，采用的超滤缓冲液为8倍体积的0.01mol/L PBS(PH 7.2)来去除Triton X-100；加入β-丙内酯(终浓度1∶4000)置2℃-8℃，24-48h灭活病毒，之后37℃水解2h，最后0.22μm孔径滤器除菌过滤后得裂解疫苗液。

大流行流感裂解疫苗原液生产用毒种为NIBRG-14(简称R1194株)，来自英国国家生物制品检定所。选择健康鸡群的9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。3-4lg EID₅₀、0.2ml接种，33℃培养48～72h。之后筛选活胚置2℃-8℃冷却后收获尿囊液和羊水，将收获的尿囊液病毒经澄清和透析(去尿酸盐)，再经截留50万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗液后，使用凝胶过滤柱Sepharose 4FF或超速区带离心纯化病毒后，再使用0.5％的TritonX-100为裂解剂室温放置2小时使病毒裂解，再经10万分子量的超滤器超滤，采用的超滤缓冲液为8倍体积的0.01mol/L PBS(PH 7.2)去除TritonX-100；加入β-丙内酯(终浓度1∶4000)置2℃-8℃，24-48h灭活病毒，之后37℃水解2h，最后0.22μm孔径滤器除菌过滤后得大流行流感裂解疫苗原液。

择一选择上述一种流感疫苗原液与上述制备的大流行流感疫苗原液用0.01mol/L PBS(PH 6.8-7.2)溶液稀释。稀释后最终使流感H1N1、H3N2、B型三型的血凝素分别达到20-40μg/ml，禽流感HA抗原量为30-60μg/ml，即为流感-大流行流感二价联合疫苗。

本实施例制备的流感-大流行流感二价联合疫苗免疫原性实验：

将如本实施例制备的联合疫苗，按照0.5-1.0ml剂量通过腹腔注射接种小鼠，进行疫苗的安全性、免疫原性和有效性试验。

结果接种疫苗组与未接种疫苗组的动物，经观察均无临床症状，其排泄物未检测道流感病毒和禽流感病毒，组织器官也无病理改变，动物试验结果初步验证了灭活疫苗的安全性。

疫苗接种后10、15、30天采血，采用常规EIA法检测禽流感病毒IgG抗体及常规细胞中和试验法、血凝抑制法检测保护性中和抗体，其结果IgG总抗体10天均已阳转，表明该疫苗具有良好的免疫原性，结果见表3。

表3联合疫苗免疫接种后10、15、30天两种抗原IgG总抗体检测结果

用10、15、30天免疫血清与禽流感毒株中和后进行细胞中和试验，结果证实其免疫血清对禽流感毒株有良好的中和作用，其中和抗体效价平均可达1∶16-1∶32，即疫苗的有效性得以初步证实，结果见表4。

表4联合疫苗免疫接种10、15、30天禽流感病毒中和抗体检测结果

联合疫苗免疫接种小鼠30天后小鼠较对照疫苗抗体增长倍数大于4倍，见表5。

表5联合疫苗免疫接种30天后流感病毒中和抗体检测结果

动物预试验结果基本证实，按本发明所述制备的联合疫苗，不仅具有良好的安全性和免疫原性，中和试验结果又进一步证实了按本发明所述制备的联合疫苗的有效性。

Claims (10)

1.一种流感-大流行流感二价联合疫苗，其特征在于：包括有流感免疫抗原和大流行流感免疫抗原以及疫苗佐剂。

2.根据权利要求1所述的流感-大流行流感二价联合疫苗，其特征在于：所述的流感免疫抗原为含有H1N1、H3N2、B型的血凝素，其含量为20-40μg/ml，大流行流感免疫原HA含量为30-60μg/ml。

3.根据权利要求1或2所述的流感-大流行流感二价联合疫苗，其特征在于：所述的流感免疫抗原为流感全病毒灭活液或流感病毒裂解液或提取的流感病毒亚单位抗原。

4.根据权利要求3所述的流感-大流行流感二价联合疫苗，其特征在于：其流感免疫抗原生产所用流感病毒株为当年WHO推荐流感病毒株或相似株。

5.根据权利要求4所述的流感-大流行流感二价联合疫苗，其特征在于：所述的禽流感免疫原为用大流行流感病毒株制备的大流行流感流感病毒裂解液。

6.根据权利要求5所述的流感-大流行流感二价联合疫苗，其特征在于：所述的大流行流感病毒株为N IBRG-14。

7.根据权利要求6所述的流感-大流行流感二价联合疫苗，其特征在于：所述的疫苗佐剂为甘油或氢氧化铝。

8.根据权利要求1或2所述的流感-大流行流感二价联合疫苗，其特征在于：所述的疫苗佐剂为甘油或氢氧化铝。

9.一种流感-大流行流感二价联合疫苗的制备方法，其特征在于：包括有以下步骤：

(1)、制备流感疫苗原液，选用当年WHO推荐甲1、甲3及乙型病毒株制备流感疫苗原液；

(2)、制备大流行流感病毒裂解疫苗原液，该大流行流感病毒裂解疫苗原液选用大流行流感病毒株N IBRG-14为病毒种；

(3)、将步骤(1)和(2)中制备的两种疫苗抗原原液混合后，用0.01mol/L、PH 6.8-7.2的PBS溶液稀释，使H1N1、H3N2、B型的血凝素终浓度为20-40μg/ml，禽流感免疫原的HA为30-60μg/ml。

10.根据权利要求9所述的流感-大流行流感二价联合疫苗的制备方法，其特征在于：所述的流感疫苗原液为流感全病毒灭活液或流感病毒裂解液或提取的流感病毒亚单位抗原。