CN101522918A - 用于治疗和诊断癌症及癌转移的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及根据TPTE和CXCR4的表达水平使得有可能对癌症疾病、癌症疾病的转移行为和/或癌症复发的发生进行评估和/或预后的方法。具体地，本发明的方法使得有可能对癌转移(特别是远处转移)的发生进行评估和/或预后。优选地，本发明的方法允许区分恶性病症和良性病症。

Description

用于治疗和诊断癌症及癌转移的组合物及方法
尽管存在跨学科的方法并已充分应用了经典的治疗方法，但癌症仍是最主要的死亡原因之一。
具体而言，转移是导致癌症治疗失败的最关键因素之一。尽管蛋白质表达模式分析、基因阵列分析和肿瘤组织中关键因子的确定已改进了肿瘤的预后分类，但是对切除的原发肿瘤所进行的分析仍然难于预测转移风险。完全切除肿瘤后，存活通常取决于是否发生转移。目前对原发肿瘤是否已发生转移的预测即便可能也是十分困难的。
肿瘤细胞在生物学方面显著区别于其来源的非恶性细胞。这些差异是由于肿瘤发生过程中获得的遗传改变所致，尤其是还导致癌细胞中形成定性或定量改变的分子结构。特别地，这类肿瘤相关结构是在恶性转化过程中表达被诱导或增强的基因产物。
对获得转移表型进行调节的因素大多尚不明确。已知一些组织病理学参数(例如肿瘤阶段和组织学分级)与无肿瘤存活(tumor-freesurvival)有关。然而，还不能通过定量肿瘤组织中的关键因子来预测转移风险。
本发明的一个目的是提供用于诊断和治疗癌症(特别是癌转移)的组合物和方法。具体地，本发明的一个目的是提供用于诊断癌转移行为的组合物和方法。
这些目的通过权利要求书的主题来实现。
本文所述研究证明，同时表达TPTE和CXCR4的癌症与缺少至少一种这些分子的肿瘤相比，显示出提高近30倍的转移(特别是远处转移)风险。因此，这些标志物的组合可用于对癌症患者的临床预后进行评估，以及用于靶向性治疗方法。
因此，本发明涉及使得有可能对癌症疾病、癌症疾病的转移行为和/或癌症复发的发生进行评估和/或预后的方法。具体地，本发明的方法使得有可能对癌转移(特别是远处转移)的发生进行评估和/或预后。优选地，本发明的方法允许区分恶性病症和良性病症。
在一些具体的实施方案中，本发明的方法使得有可能对已施用或将施用的癌症疗法的成功性进行评估和/或预后。具体地，本发明的方法使得有可能对癌症治疗(例如通过手术、化学治疗和/或放射治疗)后癌症复发的发生进行评估和/或预后。
在一个方面中，本发明涉及用于对患者中的癌症、癌转移行为和/或癌症复发的出现进行诊断、监测(即确定其消退、发展、病程和/或发病)和/或预后的方法，该方法包括定量和/或定性测定分离自所述患者的生物样品中TPTE的表达水平以及定量和/或定性测定分离自所述患者的生物样品中CXCR4的表达水平。在一个具体的优选实施方案中，本发明在这一方面中涉及诊断患者是否具有癌转移(特别是远处转移)的方法。
在本发明方法的一些具体实施方案中，TPTE表达水平和CXCR4表达水平在同一样品中同时或先后测定。在本发明方法的另一些实施方案中，TPTE表达水平和CXCR4表达水平在不同样品中测定，其中所述不同样品可以是同类样品，例如它们可以是在相同或不同时间点从相同或不同身体部位取自该患者的血样，或者可以是不同类的样品，例如一种为血样，另一种为尿样。
优选地，与无癌症、无癌症风险、无癌转移、无癌转移风险、无癌症复发和/或无癌症复发风险的受试者中的表达水平相比，提高的TPTE表达水平和CXCR4表达水平指示了癌症或癌症可能性、癌转移行为或癌转移行为可能性和/或癌症复发或癌症复发可能性。
优选地，TPTE表达水平的定量和/或定性测定包括在分离自患者的生物样品中(i)检测或定量测定选自以下的核酸：(a)包含选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，以及(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或(ii)检测或定量测定由(i)所述核酸编码的蛋白质或肽或者其部分或衍生物；和/或(iii)检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的抗体；和/或(iv)检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物(任选地在与MHC分子的复合体中)具有特异性的T淋巴细胞。优选地，所述定量和/或定性测定TPTE表达水平中(i)所述核酸包含编码蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性测定TPTE表达水平中(ii)所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物。
优选地，CXCR4表达水平的定量和/或定性测定包括在分离自患者的生物样品中(i)检测或定量测定选自以下的核酸：(a)包含选自SEQID NO：47和48之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，以及(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或(ii)检测或定量测定(i)所述核酸编码的蛋白质或肽或者其部分或衍生物；和/或(iii)检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的抗体；和/或(iv)检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物(任选地在与MHC分子的复合体中)具有特异性的T淋巴细胞。优选地，所述定量和/或定性测定CXCR4表达水平中(i)所述核酸包含编码蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性测定CXCR4表达水平中(ii)所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物。
用于实现所述定量和/或定性测定表达水平的工具在本文中描述，并且对于技术人员来说是显然的。
根据本发明，对核酸的检测或定量测定可使用与所述核酸特异性杂交的寡核苷酸或多核苷酸探针来进行，或者可以通过选择性扩增所述核酸(例如通过PCR法扩增)来进行。在一个实施方案中，所述探针包含所述核酸中6-50、特别是10-30、15-30和20-30个连续核苷酸的序列，所述扩增中使用的引物各包含所述核酸中6-50、特别是10-30、15-30和20-30个连续核苷酸的序列。
优选地，本发明方法中对所述核酸的检测或定量测定包括(i)将生物样品与特异性结合该核酸的试剂接触，以及(ii)检测或定量测定该试剂与该核酸之间复合体的形成。优选地，所述与该核酸特异性结合的试剂为与所述核酸特异性杂交的寡核苷酸或多核苷酸。
根据本发明，对蛋白质或肽或者其部分或衍生物的检测或定量测定可使用与所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物特异性结合的抗体来进行。在一些具体实施方案中，本发明方法中待检测或待测定其量的蛋白质或肽或者其部分或衍生物存在于与MHC分子的复合体中。
优选地，本发明方法中对所述蛋白质或肽或者所述其部分或衍生物的检测或定量测定包括：(i)将生物样品与特异性结合该蛋白质或肽或者其部分或衍生物的试剂接触，以及(ii)检测或定量测定所述试剂与该蛋白质或肽或者其部分或衍生物之间复合体的形成。优选地，所述与该蛋白质或肽或者其部分或衍生物特异性结合的试剂是与所述蛋白质或肽或者与所述其部分或衍生物特异性结合的抗体。
根据本发明，对抗体的检测或定量测定可使用与所述抗体特异性结合的蛋白质或肽来进行。
优选地，本发明方法中对所述抗体的检测或定量测定包括：(i)将生物样品与特异性结合该抗体的试剂接触，以及(ii)检测或定量测定所述试剂与该抗体之间复合体的形成。优选地，所述与该抗体特异性结合的试剂是与所述抗体特异性结合的蛋白质或肽。
根据本发明，对T淋巴细胞的检测或定量测定可使用呈递蛋白质或肽与MHC分子之间复合体的细胞来进行，其中该T淋巴细胞对所述蛋白质或肽具有特异性，其中所述细胞优选为抗原呈递细胞。对T淋巴细胞的检测或定量测定还可通过检测由蛋白质或肽与MHC分子的复合体的特异性刺激所触发的其增殖、细胞因子产生和/或细胞毒活性来进行，其中该T淋巴细胞对所述蛋白质或肽具有特异性。对T淋巴细胞的检测或定量测定还可借助于载有一种或多种蛋白质或肽的重组MHC分子或者两种或更多种MHC分子的复合体来进行。
优选地，对所述T淋巴细胞的检测或定量测定包括：(i)将生物样品与特异性结合该T淋巴细胞的试剂接触，以及(ii)检测或定量测定所述试剂与该T淋巴细胞之间复合体的形成。优选地，所述与该T淋巴细胞特异性结合的试剂是呈递所述蛋白质或肽或者所述其部分或衍生物与MHC分子之间复合体的细胞，其中该T淋巴细胞对所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性。
本发明方法中用于检测或定量测定的试剂(例如寡核苷酸或多核苷酸探针、抗体、蛋白质或肽或者细胞)优选地以可检测方式标记，特别是以可检测标志物或诊断物质(如放射性标志物、荧光标志物或酶标志物)进行标记。
在一个实施方案中，本发明的方法包括在第一时间点在第一样品中测定表达水平，在第二时间点在另一样品中测定表达水平，并比较这两个样品。优选地，与先前取自患者的样品相比，样品中TPTE表达水平和CXCR4表达水平的提高表示该患者已发生或将要发生癌症和/或癌转移和/或癌症复发。优选地，与先前取自患者的样品相比，样品中TPTE表达水平和CXCR4表达水平的降低表示所述患者中癌症和/或癌转移的消退，并因此优选地表明癌症治疗的成功。
在另一实施方案中，将分离自患者的生物样品与正常生物样品(例如分离自健康个体的样品)进行比较。优选地，与取自健康个体的样品相比，患者样品中TPTE表达水平和CXCR4表达水平的提高表示该患者已发生或将要发生癌症和/或癌转移和/或癌症复发。
对TPTE表达水平的测定还可包括测定选自以下的核酸的甲基化模式和/或甲基化程度：(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，以及(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或包含编码含有选自SEQID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列的蛋白质或肽、其部分或衍生物(优选位于其非编码区中，更优选位于其启动子区中)之核酸序列的核酸。
低于对照(例如无癌症、无癌症风险、无癌转移、无癌转移风险、无癌症复发和/或无癌症复发风险的受试者)的甲基化程度或者无甲基化优选地指示TPTE表达水平的提高。
对甲基化模式和/或甲基化程度的测定可例如通过使用基于PCR的方法、借助于限制性酶或通过测序来进行。在一个优选的实施方案中，在用含有亚硫酸氢盐的试剂进行处理后选择性扩增基因组DNA。用于这些扩增的寡核苷酸优选地具有与经含有亚硫酸氢盐的试剂处理的核酸互补的序列，并优选与其完全互补。优选地，所述寡核苷酸适用于不同程度的核酸甲基化，并产生可区分的扩增产物。适用于此的一种测试可以为：(1)从患者的组织样品中提取DNA，例如使用石蜡包埋的材料，(2)用含有亚硫酸氢盐的试剂处理该DNA(例如Clark S.J.等，Nucleic Acids Res.22(15)：2990-7，1994所述)，(3)通过PCR扩增DNA，以及(4)分析序列特异性扩增产物的量(例如通过定量PCR、杂交技术如微阵列法)。
在本发明方法的一些具体实施方案中，患者患有癌症、怀疑患有癌症或发生了癌症或者有发生癌症的风险。在本发明方法的另一些实施方案中，患者具有癌转移、怀疑具有癌转移或正在发生癌转移，或者有发生癌转移的风险。在本发明方法的一些具体实施方案中，患者已经接受了癌症治疗例如肿瘤切除、放射治疗和/或化学治疗，或者将要接受这些治疗。
本发明对癌症、癌转移行为和/或癌症复发的出现进行诊断、监测和/或预后的方法优选允许对恶化的病程进行预后，从而使得有可能制定更为积极的疗法等。这种预后方法还允许将仍为良性的改变(例如增生)与已被评定为不利的肿瘤前体划分开来，从而在侵袭性肿瘤形成之前预测癌症倾向。
在另一个方面中，本发明涉及试剂盒，其包含用于在分离自患者的生物样品中定量和/或定性测定TPTE表达水平的工具以及定量和/或定性测定CXCR4表达水平的工具。优选地，该试剂盒可用于本发明对癌症、癌转移行为和/或癌症复发的出现进行诊断、监测和/或预后的方法中。
用于定量和/或定性测定TPTE及CXCR4表达水平的工具如上文所述。
优选地，所述用于定量和/或定性测定TPTE表达水平的工具选自在分离自患者的生物样品中：(i)用于检测或定量测定选自以下的核酸的工具：(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，以及(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或(ii)用于检测或定量测定由(i)所述核酸编码的蛋白质或肽或者其部分或衍生物的工具；和/或(iii)用于检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的抗体的工具；和/或(iv)用于检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物(任选地在与MHC分子的复合体中)具有特异性的T淋巴细胞的工具。优选地，所述定量和/或定性测定TPTE表达水平中(i)所述核酸包含编码蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性测定TPTE表达水平中(ii)所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物。
优选地，所述用于定量和/或定性测定CXCR4表达水平的工具选自在分离自患者的生物样品中：(i)用于检测或定量测定选自以下的核酸的工具：(a)包含选自SEQ ID NO：47和48之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，以及(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或(ii)用于检测或定量测定由(i)所述核酸编码的蛋白质或肽或者其部分或衍生物的工具；和/或(iii)用于检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的抗体的工具；和/或(iv)用于检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物(任选地在与MHC分子的复合体中)具有特异性的T淋巴细胞的工具。优选地，所述定量和/或定性测定CXCR4表达水平中(i)所述核酸包含编码蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性测定CXCR4表达水平中(ii)所述蛋白质或肽包含选自SEQID NO：49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物。
优选地，所述用于检测或定量测定所述核酸的工具包括与该核酸特异性结合的试剂。优选地，所述与该核酸特异性结合的试剂是与所述核酸特异性杂交的寡核苷酸或多核苷酸。
优选地，所述用于检测或定量测定蛋白质或肽或者其部分或衍生物的工具包括与所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物特异性结合的试剂。优选地，所述与该蛋白质或肽或者其部分或衍生物特异性结合的试剂是与所述蛋白质或肽或与所述其部分或衍生物特异性结合的抗体。
优选地，所述用于检测或定量测定所述抗体的工具包括与该抗体特异性结合的试剂。优选地，所述与该抗体特异性结合的试剂是与所述抗体特异性结合的蛋白质或肽。
优选地，所述用于检测或定量测定所述T淋巴细胞的工具包括与该T淋巴细胞特异性结合的试剂。优选地，所述与该T淋巴细胞特异性结合的试剂是呈递蛋白质或肽或者其部分或衍生物与MHC分子之间复合体的细胞，其中该T淋巴细胞对于所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物是特异性的。
在另一个方面中，本发明涉及药物组合物，其包含(i)有效降低或抑制TPTE的表达或活性和/或与TPTE结合并具有肿瘤破坏或肿瘤抑制活性的试剂，和(ii)有效降低或抑制CXCR4的表达或活性和/或与CXCR4结合并具有肿瘤破坏或肿瘤抑制活性的试剂。术语“TPTE的活性”和“CXCR4的活性”涉及TPTE或CXCR4在细胞或生物体中的任何活性，例如酶活性或调节活性，特别是细胞迁移调控活性。优选地，所述与TPTE或CXCR4结合并具有肿瘤破坏或肿瘤抑制活性的试剂分别对表达或异常表达TPTE或CXCR4的细胞具有特异性。优选地，这样的试剂包含治疗性物质。
在本发明药物组合物的一些实施方案中，所述试剂是与编码TPTE的核酸选择性杂交和/或与编码CXCR4的核酸选择性杂交的反义核酸。在另一些实施方案中，所述试剂是siRNA，其优选包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义及反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与TPTE mRNA中和/或CXCR4 mRNA中约19至约25个连续核苷酸的靶序列基本一致的核苷酸序列。在另一些实施方案中，所述试剂是与TPTE和/或CXCR4选择性结合的抗体。可以在本发明的药物组合物中组合上述反义核酸、siRNA和/或抗体。
在另一个方面中，本发明涉及药物组合物，其包含(I)一种或多种选自以下的组分：(i)TPTE或其部分或衍生物，(ii)编码TPTE或其部分或衍生物的核酸，(iii)与TPTE或其部分结合的抗体，(iv)与编码TPTE的核酸特异性杂交的反义核酸，(v)针对编码TPTE之核酸的siRNA，(vi)表达TPTE或其部分或衍生物的宿主细胞，和(vii)TPTE或其部分或衍生物与MHC分子之间的分离的复合体；以及(II)一种或多种选自以下的组分：(i)CXCR4或其部分或衍生物，(ii)编码CXCR4或其部分或衍生物的核酸，(iii)与CXCR4或其部分或衍生物结合的抗体，(iv)与编码CXCR4的核酸特异性杂交的反义核酸，(v)针对编码CXCR4之核酸的siRNA，(vi)表达CXCR4或其部分或衍生物的宿主细胞，和(vii)CXCR4或其部分或衍生物与MHC分子之间的分离的复合体。
在一个实施方案中，编码TPTE或CXCR4或其部分或衍生物的核酸在上述药物组合物中存在于表达载体中并与启动子功能性连接。
在另一实施方案中，存在于本发明药物组合物中的宿主细胞分泌TPTE或CXCR4或其部分或衍生物、在表面上表达它们以及优选地还表达与所述TPTE或CXCR4或其部分或衍生物结合的MHC分子。在一个实施方案中，所述宿主细胞内源性表达该MHC分子。在另一实施方案中，所述宿主细胞以重组方式表达该MHC分子和/或TPTE或CXCR4或其部分或衍生物。该宿主细胞优选为非增殖性细胞。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞为抗原呈递细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。
在另一实施方案中，存在于本发明药物组合物中的抗体是单克隆抗体。在另一实施方案中，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体、天然抗体的片段或合成抗体。
存在于本发明药物组合物中的反义核酸可包含编码TPTE或其部分或衍生物的核酸和/或编码CXCR4或其部分或衍生物的核酸中6-50、特别是10-30、15-30和20-30个连续核苷酸的序列。
在另一些实施方案中，本发明药物组合物中直接提供或通过核酸表达而提供的TPTE或CXCR4或其部分或衍生物与细胞表面的MHC分子结合，所述结合优选导致溶胞应答和/或诱导细胞因子的释放。
本发明药物组合物中所包含的抗体可以与治疗性物质偶联。
在本发明药物组合物中包含的针对编码TPTE之核酸的siRNA的一些具体实施方案中，靶序列具有选自以下的核酸序列：SEQ ID NO：15的3-21位核苷酸、SEQ ID NO：18的3-21位核苷酸、SEQ ID NO：21的3-21位核苷酸、SEQ ID NO：24的3-21位核苷酸、SEQ ID NO：27的3-21位核苷酸、SEQ ID NO：30的3-21位核苷酸、SEQ ID NO：33的3-21位核苷酸。在siRNA的另一些具体实施方案中，有义RNA链具有SEQ ID NO：16的序列且反义RNA链具有SEQ ID NO：17的序列，或者有义RNA链具有SEQ ID NO：19的序列且反义RNA链具有SEQID NO：20的序列，或者有义RNA链具有SEQ ID NO：22的序列且反义RNA链具有SEQ ID NO：23的序列，或者有义RNA链具有SEQ IDNO：25的序列且反义RNA链具有SEQ ID NO：26的序列，或者有义RNA链具有SEQ ID NO：28的序列且反义RNA链具有SEQ ID NO：29的序列，或者有义RNA链具有SEQ ID NO：31的序列且反义RNA链具有SEQ ID NO：32的序列，或者有义RNA链具有SEQ ID NO：34的序列且反义RNA链具有SEQ ID NO：35的序列。
本发明的药物组合物可包含药物相容性载体和/或辅药。
在另一个方面中，本发明涉及治疗或预防癌症、癌转移或癌症复发的方法，其包括对患者施用(I)一种或多种选自以下的组分：(i)TPTE或其部分或衍生物，(ii)编码TPTE或其部分或衍生物的核酸，(iii)与TPTE或其部分结合的抗体，(iv)与编码TPTE的核酸特异性杂交的反义核酸，(v)针对编码TPTE之核酸的siRNA，(vi)表达TPTE或其部分或衍生物的宿主细胞，和(vii)TPTE或其部分或衍生物与MHC分子之间的分离的复合体；以及(II)一种或多种选自以下的组分：(i)CXCR4或其部分或衍生物，(ii)编码CXCR4或其部分或衍生物的核酸，(iii)与CXCR4或其部分或衍生物结合的抗体，(iv)与编码CXCR4的核酸特异性杂交的反义核酸，(v)针对编码CXCR4之核酸的siRNA，(vi)表达CXCR4或其部分或衍生物的宿主细胞，和(vii)CXCR4或其部分或衍生物与MHC分子之间的分离的复合体。
本发明还涉及治疗或预防癌症、癌转移或癌症复发的方法，其包括施用本发明的药物组合物。
优选地，所述癌症为肺肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑素瘤、结肠肿瘤、胃肿瘤、胰腺肿瘤、耳鼻喉(ENT)肿瘤、肾细胞癌或宫颈癌、结肠癌或乳腺癌。
优选地，所述癌症、癌转移或癌症复发的特征在于表达或异常表达以下分子：(i)选自以下的核酸：(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，和(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或(ii)由(i)所述核酸编码的蛋白质或肽。优选地，(i)所述核酸包含编码蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其片段或衍生物；和/或(ii)所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其片段或衍生物。
更优选地，所述癌症、癌转移或癌症复发的特征在于还表达或异常表达以下分子：(i)选自以下的核酸：(a)包含选自SEQ ID NO：47和48之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，和(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或(ii)由(i)所述核酸编码的蛋白质或肽。优选地，(i)所述核酸包含编码蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列、其片段或衍生物；和/或(ii)所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列、其片段或衍生物。
在本发明的方法中，所述药物组合物优选与放射疗法、化学疗法或手术组合施用，其中所述化学治疗剂优选地选自顺铂、卡铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素和他莫昔芬。
优选地，本发明方法中的受试者或患者为人。
发明详述
本发明中有关TPTE或CXCR4的表述“测定表达水平”涉及测定TPTE基因或CXCR4基因之基因产物(核酸和蛋白质/肽)的存在与否和/或绝对量和/或相对量。本发明中“测定表达水平”这一表述还包括检测不到基因产物或者所述基因产物的量低于检出限的情况。
一般而言，适于检测和分析核酸、蛋白质和/或肽的所有方法都可用于在本发明方法中测定表达水平。例如，PCR、基因芯片/微阵列系统、Northern印迹、RNA酶保护测定(RDA)可用于检测和分析核酸。用于检测和分析蛋白质和/或肽的合适的免疫学方法包括使用如抗体、抗体片段、受体、配体或对肽或蛋白质具有特异性的其他结合剂进行的酶联免疫吸附测定(ELISA)；夹层、直接、间接或竞争性ELISA测定、酶联免疫斑点测定(ELISPOT)、放射免疫测定(RIA)、流式细胞术测定(FACS，即荧光激活细胞分选)、免疫组织化学、Western印迹、荧光共振能转移(FRET)测定、蛋白质芯片测定等等。
根据本发明，术语“结合”优选涉及特异性结合。“特异性结合”是指试剂(如抗体)与其特异性靶标(如表位)的结合强于与另一靶标的结合。如果试剂与第一靶标结合的解离常数(KD)低于与第二靶标的解离常数，则该试剂与第一靶标的结合强于与第二靶标的结合。优选地，试剂与特异性结合之靶标的解离常数(KD)比该试剂与非特异性结合之靶标的解离常数(KD)低多于10倍，优选多于20倍，更优选多于50倍，更优选多于100倍、200倍、500倍或1000倍。
根据本发明，可使用“参照”如参照样品或参照生物将本发明方法中得自测试样品或测试生物(即患者)的结果进行关联和比较。参照生物一般是健康生物，特别是未患癌症、癌转移和/或癌症复发的生物。
可通过测量足够大量的参照而经验性地从参照中测得“参照值”。优选地，通过测量至少2、优选至少3、优选至少5、优选至少8、优选至少12、优选至少20、优选至少30、优选至少50或优选至少100个参照来测得参照值。
术语“TPTE”涉及“具有张力蛋白同源性的跨膜磷酸酶”，并包括TPTE的任何变体，特别是剪接变体、构象、同工型和物种同源物，它们由细胞天然表达，或者由转染有TPTE基因的细胞表达。“测定TPTE的表达水平”这一表述涉及测定TPTE核酸(如mRNA)的水平和/或测定TPTE蛋白的水平。
优选地，“TPTE的核酸”、“编码TPTE的核酸”或“TPTE基因”涉及选自以下的核酸：(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，和(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸。该术语还可包括编码TPTE的mRNA。优选地，“TPTE”蛋白(或简称为“TPTE”)包含由上述核酸编码的氨基酸序列，优选为选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物。本领域技术人员会理解，如上述的TPTE cDNA序列与TPTE mRNA将是等同的，并可用于本发明的同样目的，即产生抑制TPTE表达的siRNA。
术语“TPTE”还包括人TPTE的翻译后修饰变体、同工型和物种同源物，它们由细胞天然表达，或者由转染有TPTE基因的细胞表达。
术语“CXCR4”涉及“趋化因子(C-X-C基序)受体4”，并包括CXCR4的任何变体，特别是剪接变体、构象、同工型和物种同源物，它们由细胞天然表达，或者由转染有CXCR4基因的细胞表达。“测定CXCR4的表达水平”这一表述涉及测定CXCR4的核酸(如mRNA)的水平和/或测定CXCR4蛋白的水平。
优选地，“CXCR4的核酸”、“编码CXCR4的核酸”或“CXCR4基因”涉及选自以下的核酸：(a)包含选自SEQ ID NO：47和48之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，和(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸。该术语还可包括编码CXCR4的mRNA。优选地，“CXCR4”蛋白(或简称为“CXCR4”)包含由上述核酸编码的氨基酸序列，优选为选自SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物。本领域技术人员会理解，如上述的CXCR4cDNA序列与CXCR4 mRNA将是等同的，并可用于本发明的同样目的，即产生抑制CXCR4表达的siRNA。
术语“CXCR4”还包括人CXCR4的翻译后修饰变体、同工型和物种同源物，它们由细胞天然表达，或者由转染有CXCR4基因的细胞表达。
根据本发明，核酸优选是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。根据本发明，核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的分子及化学合成的分子。根据本发明，核酸可以作为单链或双链的线性或共价环状闭合分子存在。
本发明的简并性核酸是由于遗传密码的简并性而在密码子序列中与参照核酸存在差异的核酸。
本发明的术语“核酸”还包括核酸的“衍生物”。根据本发明，核酸的“衍生物”指所述核酸中存在一个或多个(例如至少2个、至少4个或至少6个)并优选多至3个、多至4个、多至5个、多至6个、多至10个、多至15个或多至20个核苷酸替换、缺失和/或添加。此外，术语“衍生物”还包括在核苷酸碱基、糖或磷酸上对核酸进行化学衍生。术语“衍生物”还包括含有非天然核苷酸及核苷酸类似物的核酸。
本发明所述核酸优选是分离的。根据本发明，术语“分离的核酸”指该核酸是(i)体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过切割和凝胶电泳分级分离，或(iv)合成的，例如通过化学合成。分离的核酸是可用于通过重组DNA技术进行操作的核酸。
本文使用的术语“RNA”指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”指β-D-呋喃糖部分的2’位带有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA、基本纯化的RNA、合成RNA、重组产生的RNA)以及由于一个或多个核苷酸的添加、缺失、替换和/或改变而不同于天然RNA的改变的RNA。这样的改变可包括添加非核苷酸的物质，例如向RNA的末端或内部添加，例如在RNA的一个或多个核苷酸处添加。RNA分子中的核苷酸还可包括非标准核苷酸，例如非天然核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为天然RNA的类似物。
本文使用的术语“互补性”或“互补”指核酸可通过常规的Watson-Crick相互作用或其他非常规类型的相互作用而与另一核酸形成氢键。就本发明所述核酸分子而言，核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许该核酸发挥相关功能，例如RNAi活性。例如，siRNA构建体中有义链与反义链之间的互补性程度可以与该siRNA反义链与靶标RNA序列之间的互补性程度相同或不同。互补性百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如Watson-Crick碱基配对)的连续残基的百分比(例如10个中有5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”指核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中相同数目的连续残基形成氢键。
优选地，如果两序列能彼此杂交并形成稳定双链体，杂交优选在允许多核苷酸间发生特异性杂交的条件(严格条件)下进行，则核酸与另一核酸“互补”。严格条件描述于例如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，J.Sambrook等编辑，第二版，Cold Spring Harbor Laboratorypress，Cold Spring Harbor，New York，1989或者Current Protocols inMolecular Biology，F.M.Ausubel等编辑，John Wiley & Sons，Inc.，NewYork，其是指例如在65℃在杂交缓冲液(3.5×SSC、0.02％ Ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5mM NaH2PO4(pH 7)、0.5％ SDS、2mM EDTA)中杂交。SSC为0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠(pH 7)。杂交后，清洗已转移有DNA的膜，例如在室温下用2×SSC清洗，接着在高至68℃的温度用0.1-0.5×SSC/0.1×SDS清洗。
优选地，本发明的互补性程度为至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。
优选地，本文所述特定核酸序列与作为该特定核酸序列之衍生物的核酸序列、与该特定核酸序列杂交和/或与该特定核酸序列具有简并性的核酸序列之间的同一性程度将为至少70％，优选至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％或最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。同一性程度优选在至少约30个、至少约50个、至少约70个、至少约90个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约1000个、至少约1500个或至少约2000个核苷酸的区域中给出。在一些优选的实施方案中，同一性程度在参照核酸序列(例如序列表中给出的核酸序列)的全长中给出。
“序列相似性”表示相同氨基酸或代表保守性氨基酸替换的氨基酸的百分比。两多肽或两核酸序列间的“序列同一性”表示在所述序列之间相同的氨基酸或核苷酸的百分比。
术语“同一性百分比”旨在表示待比较的两序列之间在最佳比对后获得的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比纯粹是统计学意义上的，两序列间的差异随机分布并分布在其全长上。两核苷酸或氨基酸序列之间的序列比较常规地通过在将其最优比对后比较其序列来进行，所述比较在区段或在“比较窗”中进行，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。除了手动进行比较以外，还可通过以下方法来为比较进行最优序列比对：Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法、Neddleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法、Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444的相似性检索法或者使用这些算法的计算机程序(Wisconsin GeneticsSoftware Package中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis)。
同一性百分比如下计算：测定两个所比较序列之间相同位置数，用该数除以所比较的位置数并将所得结果乘以100，以获得这两个序列之间的同一性百分比。
本文所述与靶序列(例如靶mRNA中含有的靶序列)“基本一致”的核酸序列是与该靶序列相同的核酸序列或者与该靶序列存在一个或多个核苷酸差异的序列。本文所述包含与靶序列基本一致之核酸序列的siRNA有义链的特征在于含有这样有义链的siRNA诱导含有该靶序列的mRNA发生RNAi介导的降解。例如，siRNA可包含与靶序列存在一个、两个、三个或更多个核苷酸差异的有义链，只要该siRNA诱导该靶mRNA发生RNAi介导的降解即可。
根据本发明，核酸可单独存在或者与同源或异源的其他核酸组合存在。在一些优选的实施方案中，核酸与表达调控序列功能性连接，所述表达调控序列对于所述核酸而言可以是同源或异源的。术语“同源”指核酸还与表达调控序列具有天然的功能性连接，术语“异源”指核酸与表达调控序列不具有天然的功能性连接。
如果核酸(例如表达RNA和/或蛋白质或肽的核酸)与表达调控序列以所述核酸的表达或转录处于所述表达调控序列的调控或影响之下的方式彼此共价连接，则它们是“功能性”连接的。如果核酸待翻译成功能性蛋白，则使用与编码序列功能性连接的表达调控序列时，所述表达调控序列的诱导引起所述核酸的转录，而不导致该编码序列的移码或不导致所述编码序列不能翻译成期望的蛋白质或肽。
根据本发明，术语“表达调控序列”包括启动子、核糖体结合位点、增强子以及调节基因转录或mRNA翻译的其他调控元件。在本发明的一些具体实施方案中，所述表达调控序列可受到调节。表达调控序列的确切结构可作为物种或细胞类型的函数而变化，但一般包含分别参与转录起始及翻译起始的5’非转录序列以及5’和3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5’非转录表达调控序列包括启动子区，其包含与核酸功能性连接的用于转录调控的启动子序列。表达调控序列还可包含增强子序列或上游激活子序列。
根据本发明，术语“启动子”或“启动子区”涉及这样的核酸序列，其位于所表达核酸序列的上游(5’)，并通过提供RNA聚合酶的识别及结合位点来调控该序列的表达。“启动子区”还可包含参与基因转录调节的另一些因子的识别及结合位点。启动子可调控原核或真核基因的转录。此外，启动子可以为“诱导型”，可应答于诱导剂而起始转录；或者可以为“组成型”，即转录不受诱导剂的调控。如果不存在诱导剂，则诱导型启动子调控下的基因不表达或仅少量表达。在诱导剂存在时，基因被启动，或者转录水平提高。这通常通过特定转录因子的结合来介导。
本发明优选的启动子包括SP6、T3和T7聚合酶的启动子；人U6RNA启动子和CMV启动子。
根据本发明，术语“表达”以其最广泛的含义使用，其包括产生RNA或者RNA和蛋白质/肽。还包括核酸的部分表达。此外，表达可以瞬时进行或稳定进行。
在一个优选的实施方案中，核酸分子根据本发明存在于载体中，其中适当时带有调控该核酸表达的启动子。本文使用的术语“载体”以其最广泛的含义使用，包括用于核酸的任何中间载体，其使得所述核酸可以例如引入原核和/或真核细胞中并在适当时整合进基因组中。这类载体优选在所述细胞中复制和/或表达。载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。本文使用的术语“质粒”一般涉及可独立于染色体DNA复制的染色体外遗传物质构建体，通常为环状DNA双链体。
根据本发明，术语“宿主细胞”涉及可用外源核酸转化或转染的任何细胞。本发明的术语“宿主细胞”包括原核细胞(如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如哺乳动物细胞，特别是人细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类的细胞。细胞可来自多种组织类型，并包括灵长类细胞和细胞系。具体实例包括角质形成细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞及胚胎干细胞。在另一些实施方案中，宿主细胞为抗原呈递细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。核酸可以以单拷贝或者两个或更多拷贝的形式存在于宿主细胞中，在一个实施方案中，其在宿主细胞中表达。
在本发明中MHC分子呈递蛋白质或肽的情况下，表达载体还可包含编码所述MHC分子的核酸序列。编码所述MHC分子的核酸序列可与编码所述蛋白质或肽的核酸存在于同一表达载体中，或者这两种核酸可存在于不同的表达载体中。在后一种情况下，可将这两种表达载体共转染进细胞中。如果宿主细胞既不表达所述蛋白质或肽也不表达MHC分子，则可在同一表达载体中或不同表达载体中将编码它们的两种核酸转染进该细胞中。如果细胞已表达MHC分子，则可以仅将编码所述蛋白质或肽的核酸序列转染进该细胞中。
可通过扩增核酸来检测或定量测定所述核酸。核酸扩增可使用与该核酸杂交的一对扩增引物(即寡核苷酸)来进行。引物优选包含该核酸中6-50、特别是10-30、15-30和20-30个连续核苷酸的序列并且不重叠，以避免形成引物二聚体。其中一条引物将与待扩增核酸的一条链杂交，而另一引物将以允许该核酸扩增的方式与互补链杂交。
可使用“反义分子”或“反义核酸”来调节(特别是降低)核酸表达。本发明的术语“反义分子”或“反义核酸”指在生理条件下与包含特定基因的DNA或与所述基因的mRNA杂交从而抑制所述基因转录和/或所述mRNA翻译的寡核苷酸。根据本发明，“反义分子”还包括含有相对于其天然启动子而言为倒置取向的核酸或其部分的构建体。核酸或其部分的反义转录物可与特定蛋白质的天然mRNA形成双链体，从而阻止mRNA累积或翻译成蛋白质。另一种可能是使用使核酸失活的核酶。本发明优选的反义寡核苷酸具有靶核酸中6-50、特别是10-30、15-30和20-30个连续核苷酸的序列，并优选与靶核酸或与其部分完全互补。
在一些优选的实施方案中，反义寡核苷酸与N端或5’上游位点(如翻译起始位点、转录起始位点或启动子位点)杂交。在另一些实施方案中，反义寡核苷酸与3’非翻译区或mRNA剪接位点杂交。
根据本发明，寡核苷酸可以是寡核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸、修饰的寡核糖核苷酸或修饰的寡脱氧核糖核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸由核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其组合组成，其中一个核苷酸的5’末端与另一核苷酸的3’末端通过磷酸二酯键彼此连接。这些寡核苷酸可以常规方式合成，或者可以重组产生。
在一些优选的实施方案中，寡核苷酸为“修饰的”寡核苷酸。这时，可以不同的方式来修饰寡核苷酸而不破坏其结合其靶标的能力，从而提高例如其稳定性。根据本发明，术语“修饰的寡核苷酸”指这样的寡核苷酸，其中(i)其至少两个核苷酸通过合成的核苷间键(即并非磷酸二酯键的核苷间键)彼此连接，和/或(ii)通常不存在于核酸中的化学基团与该寡核苷酸连接。优选的合成的核苷间键为硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯(acetamidate)、羧甲基酯和肽。
术语“修饰的寡核苷酸”还包括具有一个或多个共价修饰的碱基和/或一个或多个共价修饰的糖的寡核苷酸。例如，“修饰的寡核苷酸”包括带有这样的糖残基的寡核苷酸，所述糖残基与低分子量有机基团共价连接，而非在3’位与羟基共价连接并在5’位与磷酸基共价连接。例如，修饰的寡核苷酸可包括2’-O-烷基化核糖残基或者代替核糖的另一种糖(如阿拉伯糖)。
本文使用的“小干扰RNA”或“siRNA”指用于识别待降解的靶基因或mRNA的分离的RNA分子，优选长度大于10个核苷酸，更优选长度大于15个核苷酸，最优选长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。19-25个核苷酸对于siRNA来说是最优选的。
本发明的siRNA可包括部分纯化的RNA、基本纯化的RNA、合成RNA或重组产生的RNA以及由于一个或多个核苷酸的添加、缺失、替换和/或改变而区别于天然RNA的改变的RNA。这样的改变可包括添加非核苷酸的物质，例如向siRNA的末端或者向siRNA的一个或多个内部核苷酸添加；修饰以使siRNA抵抗核酸酶消化(例如，使用2’-取代的核糖核苷酸或修饰糖-磷酸骨架)；或者用脱氧核糖核苷酸替换该siRNA中的一个或多个核苷酸。此外，可以如上文修饰寡核苷酸所述修饰siRNA以提高其稳定性，特别是引入一个或多个硫代磷酸酯键。
siRNA的一条或两条链可包含3’突出端。本文使用的“3’突出端”是指RNA链3’末端伸出的至少一个未配对核苷酸。因此在一个实施方案中，siRNA包含至少一个3’突出端，其长度为1至约6个核苷酸(包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，优选长度为1至约5个核苷酸，更优选长度为1至约4个核苷酸，尤其优选长度为约2至约4个核苷酸。在siRNA分子的两条链均包含3’突出端的实施方案中，每条链的突出端长度可以相同或不同。在一个最优选的实施方案中，siRNA的两条链上均存在3’突出端，并且长度为2个核苷酸。例如，本发明siRNA的每条链可包含二脱氧胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3’突出端。
为了增强siRNA的稳定性，还可以对3’突出端进行稳定以避免降解。在一个实施方案中，通过包含嘌呤核苷酸(如腺苷或鸟苷核苷酸)来稳定突出端。或者，用经修饰的类似物替换嘧啶核苷酸(例如用2’-脱氧胸苷替换3’突出端中的尿苷核苷酸)是可以耐受的，并且不影响RNAi降解的效率。特别地，2’-脱氧胸苷中缺少2’-羟基显著增强了该3’突出端在组织培养基中的核酸酶抗性。
siRNA的有义及反义链可包含两个互补的单链RNA分子，或者可包含单个分子，其中两个互补区碱基配对并通过单链“发夹”区共价连接。也就是说，有义区和反义区可通过连接分子共价连接。该连接分子可以是多核苷酸或非核苷酸连接。不限于任何理论，相信后一类型siRNA分子的发夹区在细胞内被“Dicer”蛋白(或其等价物)切割形成两条单独碱基配对RNA分子的siRNA。
本文使用的“靶mRNA”是指作为下调靶标的RNA分子。本领域技术人员会理解，cDNA序列等同于mRNA序列，并且可用于本文的相同目的，例如产生siRNA。
本文使用的与人TPTE或CXCR4“同系(cognate)”的基因或mRNA是来自其他哺乳动物物种的与人TPTE或CXCR4同源的基因或mRNA。
可以使用本领域熟知的技术来分析转录自人TPTE或CXCR4基因的mRNA的选择性剪接形式。这些技术包括逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、northern印迹和原位杂交。
称为“RNA酶保护”的技术也可用于鉴定选择性剪接的TPTEmRNA或CXCR4mRNA。RNA酶保护涉及将基因序列转录成与来自其他细胞(例如诱导表达TPTE的细胞)之RNA杂交的合成RNA。接着，将杂交的RNA与识别RNA:RNA杂交错配的酶一起孵育。比预计的片段更小表示存在选择性剪接的mRNA。可以通过本领域技术人员熟知的方法克隆并测序推定的选择性剪接mRNA。
也可使用RT-PCR来鉴定选择性剪接的TPTE mRNA或CXCR4mRNA。在RT-PCR中，使用本领域技术人员熟知的方法，通过逆转录酶将来自已知表达TPTE或CXCR4的细胞的mRNA转化成cDNA。接着使用位于3’非翻译区的正向引物和位于5’非翻译区的反向引物，通过PCR扩增该cDNA的完整编码序列。可分析扩增产物的选择性剪接形式，例如通过将扩增产物的大小与正常剪接mRNA的预计产物的大小进行比较(例如通过琼脂糖凝胶电泳来实现)。扩增产物大小的任何改变都可能指示选择性剪接。
还可以使用上述用于鉴定选择性剪接形式的技术来容易地鉴定突变体TPTE或CXCR4基因产生的mRNA。本文使用的“突变体”TPTE或CXCR4基因或mRNA包括序列不同于本文所述TPTE或CXCR4序列的人TPTE或CXCR4基因或mRNA。因此，TPTE或CXCR4的等位基因形式以及由它们产生的mRNA都认为是用于本发明目的的“突变体”。
本文使用的“降低”或“抑制”指导致蛋白质或mRNA的水平与参照样品(如未经siRNA处理的样品)相比总体降低的能力，优选降低20％或更多，更优选降低50％或更多，最优选降低75％或更多。这种RNA或蛋白质表达的降低或抑制可通过靶向mRNA切割或降解而发生。蛋白质表达或核酸表达的测定为本领域已知，包括例如用于蛋白质表达的ELISA、western印迹分析以及用于RNA的northern印迹或RNA酶保护测定。
可以从聚合酶III(pol III)来表达载体表达siRNA而不改变靶位点，因为认为从聚合酶III启动子开始的RNA表达仅在第一个转录的核苷酸是嘌呤时才有效。
本发明的siRNA可靶向任何靶mRNA序列(“靶序列”)中任何约19-25个连续核苷酸的节段。选择siRNA靶序列的技术在例如TuschlT.等，“The siRNA User Guide(siRNA用户指南)”，2002年10月11日修订版中给出，其全部公开内容均以参考方式并入本文。“siRNA用户指南”在互联网上由Thomas Tuschl博士，RNA分子生物学实验室，Rockefeller University，New York，USA维护的站点上提供，并可通过进入Rockefeller University网站并搜索关键词“siRNA”而找到。因此，本发明siRNA的有义链包含与靶mRNA中任何约19至约25个核苷酸的连续节段基本一致的核苷酸序列。
一般而言，靶mRNA中的靶序列可从对应于该靶mRNA的给定cDNA序列中选择，优选从起始密码子下游(即3’方向)50至100nt开始。然而，靶序列可以位于5’或3’非翻译区中，或者位于起始密码子附近的区域中。例如，TPTE eDNA中合适的靶序列选自以下靶序列组：
(i)TCGGTACTTGATAACATTACA(SEQ ID NO：15)
(ii)CAGACTTGTGTTATTCTAGCA(SEQ ID NO：18)
(iii)CTGAAATATGTTCAACTGCAA(SEQ ID NO：21)
(iv)CAGATTGGCAACCAAGACTAA(SEQ ID NO：24)
(v)AACCCTGCCACATGTTCATAT(SEQ ID NO：27)
(vi)AATGACAGTCCACAGACAAGT(SEQ ID NO：30)
(vii)AAGCTGATAAGAAGGCGGGTT(SEQ ID NO：33)
靶向序列(i)并在每条链上具有3’突出端(突出端以粗体显示)的优选siRNA为：
gguacuugauaacauuacaTT
AGccaugaacuauuguaaugu
靶向序列(ii)并在每条链上具有3’突出端(突出端以粗体显示)的优选siRNA为：
gacuuguguuauucuagcaTT
GTcugaacacaauaagaucgu
靶向序列(iii)并在每条链上具有3’突出端(突出端以粗体显示)的优选siRNA为：
gaaauauguucaacugcaaTT
GAcuuuauacaaguugacguu
靶向序列(iv)并在每条链上具有3’突出端(突出端以粗体显示)的优选siRNA为：
gauuggcaaccaagacuaaTT
GTcuaaccguugguucugauu
靶向序列(v)并在每条链上具有3’突出端(突出端以粗体显示)的优选siRNA为：
cccugccacauguucauauTT
TTgggacgguguacaaguaua
靶向序列(vi)并在每条链上具有3’突出端(突出端以粗体显示)的优选siRNA为：
ugacaguccacagacaaguTT
TTacugucaggugucuguuca
靶向序列(vii)并在每条链上具有3’突出端(突出端以粗体显示)的优选siRNA为：
gcugauaagaaggcggguuTT
TTcgacuauucuuccgcccaa
在以上列表中，核酸序列中的所有脱氧核糖核苷酸均以大写字母表示(例如脱氧胸苷为“T”)，核酸序列中的核糖核苷酸以小写字母表示(例如尿苷为“u”)。
应该理解，本文给出的靶序列是参考人TPTE cDNA给出的，因此这些序列含有以“T”表示的脱氧胸苷。本领域技术人员会理解，在TPTE mRNA的实际靶序列中，脱氧胸苷将被尿苷(“u”)替代。同样，本发明siRNA中包含的靶序列也将含有替代脱氧胸苷的尿苷。
可使用本领域技术人员已知的多种技术来获得siRNA。例如，可使用本领域技术人员已知的方法来化学合成或重组产生siRNA，例如Tuschl等的美国公开申请2002/0086356中描述的果蝇体外系统，其全部公开内容以参考方式并入本文。
优选地，使用经适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪来化学合成siRNA。siRNA可以作为两个独立的互补RNA分子而合成，或者作为带有两个互补区的单个RNA分子而合成。
或者，还可以使用任何合适的启动子从重组的环状或线性DNA质粒中表达siRNA。用于从质粒中表达本发明siRNA的合适的启动子包括例如U6或H1RNA聚合酶III的启动子序列以及巨细胞病毒启动子。
选择其他合适的启动子在本领域技术范围之内。本发明的重组质粒还可包含用于在特定组织或在特定的胞内环境中表达siRNA的诱导型或调节型启动子。
从重组质粒中表达的siRNA可通过标准技术从培养的细胞表达系统中分离，或者可以胞内表达。下文将更详细地讨论使用重组质粒将siRNA体内递送至细胞。siRNA可以作为两个独立的互补RNA分子或作为带有两个互补区的单个RNA分子从重组载体中表达。
选择适于表达siRNA的质粒、用于将表达siRNA的核酸序列插入该质粒的方法以及将重组质粒递送至目的细胞的方法在本领域技术范围之内。
还可以在体内从重组病毒载体胞内表达siRNA。所述重组病毒载体包含编码该siRNA的序列以及用于表达该siRNA的任何适当的启动子。所述重组病毒载体还可包含用于在特定组织或在特定胞内环境中表达siRNA的诱导型或调节型启动子。下文更详细地讨论了使用重组病毒载体将siRNA体内递送至细胞。siRNA可以作为两个独立的互补RNA分子或作为带有两个互补区的单个RNA分子从重组病毒载体中表达。
根据本发明，术语“肽”是指包含通过肽键共价连接的两个或更多个(优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选20个或更多个，直至优选8、10、20、30、40或50特别是100个)氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大的肽，优选具有多于100个氨基酸残基的肽，但一般而言，术语“肽”和“蛋白质”在本申请中是同义的并可互换使用。
优选地，本发明所述的蛋白质和肽已被分离。术语“分离的蛋白质”或“分离的肽”指该蛋白质或肽已从其天然环境中分离出来。分离的蛋白质或肽可以为基本纯化的状态。术语“基本纯化的”指该蛋白质或肽基本不含在自然界或体内与其相关的其他物质。
例如，这样的蛋白质和肽可用于产生抗体以及用于免疫和诊断测定。本发明所述的蛋白质和肽可从生物样品(如组织或细胞匀浆)中分离，也可在多种原核或真核表达系统中重组表达。
就本发明的目的而言，蛋白质或肽或者氨基酸序列的“衍生物”包括氨基酸插入变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。
氨基酸插入变体包括氨基和/或羧基端融合以及在特定氨基酸序列中一个、两个或多个氨基酸的插入。对于含有插入的氨基酸序列变体的情形，一个或多个氨基酸残基被插入氨基酸序列的特定位点中，但也可以随机插入并对所得产物进行适当筛选。
氨基酸缺失变体的特征在于从该序列中去除了一个或多个氨基酸。
氨基酸替换变体的特征在于去除了该序列中至少一个残基并在其位置插入另一残基。优选地，该修饰位于氨基酸序列中在同源蛋白质或肽之间不保守的位置中和/或将氨基酸替换为具有相似特性(如疏水性、亲水性、电负性、侧链体积等)的其他氨基酸(保守性替换)。例如，保守性替换涉及将一个氨基酸替换为下表中与该待替换氨基酸在同一组中的氨基酸。
1.非极性或弱极性的小脂肪残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)
2.带负电的残基及其酰胺：Asn、Asp、Glu、Gln
3.带正电的残基：His、Arg、Lys
4.非极性的大脂肪残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)
5.大芳香残基：Phe、Tyr、Trp。
由于在蛋白质结构中的特殊作用，三种残基在括号中显示。Gly是惟一没有侧链并因而赋予链以柔性的残基。Pro具有对链产生很大限制的不常见的几何构造。Cys可形成二硫桥。
优选地，本文所述特定氨基酸序列与作为所述特定氨基酸序列之衍生物的序列之间的相似性程度为至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。相似性或同一性的程度优选针对至少约10、至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400或500个氨基酸的区域而给出。在一些优选的实施方案中，相似性或同一性程度针对参照氨基酸序列的全长而给出。
上述氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术(例如固相合成(Merrifield，1964)及类似技术)或通过重组DNA操作而容易地制备。用于制备含有替换、插入或缺失的蛋白质和肽的DNA序列操作详细描述于例如Sambrook等(1989)。
根据本发明，蛋白质和肽的“衍生物”还包括该蛋白质或肽中任意相关分子(例如碳水化合物、脂质和/或蛋白质或肽)的一个或多个替换、缺失和/或添加。术语“衍生物”还扩展至所述蛋白质和肽的所有功能性化学等同物，它们不仅含有氨基酸组分，还含有非氨基酸组分如糖和磷酸结构；还扩展至含有诸如酯键、硫醚键和二硫键等键的物质。
根据本发明，蛋白质或肽的部分或片段优选具有其来源蛋白质或肽的功能特性。这样的功能特性包括与抗体相互作用以及与其他肽或蛋白质相互作用。一个具体特性是能与MHC分子形成复合体，并且适当时产生免疫应答，优选通过刺激细胞毒细胞或T辅助细胞来产生。蛋白质或肽的部分或片段优选包含该蛋白质或肽中至少6个、特别是至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个并优选多至8个，特别是多至10个、多至12个、多至15个、多至20个、多至30个或多至50个连续氨基酸的序列。
编码蛋白质或肽的核酸的部分或片段优选涉及该核酸中至少编码上述蛋白质或肽和/或所述蛋白质或肽的部分或片段的部分。编码蛋白质或肽之核酸的部分或片段优选为该核酸中对应于开放读码框的部分。
可以通过多种标准方法来制备含有特异性结合靶蛋白的特异性抗体的抗血清，参阅例如“Monoclonal Antibodies：A Practical Approach”Philip Shepherd，Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9；“Antibodies：ALaboratory Manual”Ed Harlow，David Lane，ISBN：0879693142以及“Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO”Edward Harlow，David Lane，Ed Harlow ISBN 0879695447。由此还可以产生识别天然形式复杂膜蛋白的亲合(affine)的特异性抗体(Azorsa等，J.Immunol.Methods 229：35-48，1999；Anderson等，J.Immunol.143：1899-1904，1989；Gardsvoll，J.Immunol.Methods 234：107-116，2000)。这不仅特别适用于制备治疗性应用的抗体，也适用于许多诊断性应用。就此而言，可以用完整蛋白质、胞外部分序列以及用表达生理折叠形式的靶分子的细胞来进行免疫。
常规地使用杂交瘤技术来制备单克隆抗体(技术细节参阅“Monoclonal Antibodies：A Practical Approach”Philip Shepherd，Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9；“Antibodies：A LaboratoryManual”Ed Harlow，David Lane ISBN：0879693142；“UsingAntibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO”EdwardHarlow，David Lane，Ed Harlow ISBN：0879695447)。
已知抗体分子中仅有一小部分(互补位(paratope))参与该抗体与其表位的结合(参阅Clark，W.R.(1986)，The ExperimentalFoundations of Modern Immunology，Wiley & Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)，Essential Immunology，第七版，Blackwell ScientificPublications，Oxford)。例如，pFc’和Fc区是补体级联的效应物，但不参与抗原结合。已酶促去除pFc’区或以无pFc’区方式产生的抗体(称为F(ab’)2片段)带有完整抗体的两个抗原结合位点。类似地，已酶促去除Fc区或以无所述Fc区方式产生的抗体(称为Fab片段)带有完整抗体分子的一个抗原结合位点。此外，Fab片段由共价结合的抗体轻链和所述抗体的部分重链(称为Fd)组成。Fd片段是抗体特异性的主要决定簇(一个Fd片段可与多达10种不同轻链相关联，而不改变抗体的特异性)，分离的Fd片段保留了与表位结合的能力。
位于抗体的抗原结合部分中的是与抗原表位直接相互作用的互补决定区(CDR)以及维持该互补位三级结构的构架区(FR)。IgG免疫球蛋白的重链Fd片段及轻链都包含4个构架区(FR1至FR4)，它们各自被3个互补决定区(CDR1至CDR3)分隔开。CDR特别是CDR3区(更特别地为重链的CDR3区)在很大程度上决定了抗体特异性。
已知哺乳动物抗体的非CDR区可以替换为具有相同或不同特异性的抗体的相似区域，而保留原始抗体的表位特异性。这使得有可能开发出“人源化”抗体，其中非人CDR与人FR和/或Fc/pFc’区共价连接而产生功能性抗体。
作为另一实例，WO 92/04381描述了人源化小鼠RSV抗体的产生和使用，其中至少一部分小鼠FR区被替换为人源的FR区。这类抗体(包括具有抗原结合能力的完整抗体之片段)常称为“嵌合”抗体。
根据本发明，术语“抗体”还包括抗体的F(ab’)2、Fab、Fv以及Fd片段；Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已替换为同源的人或非人序列的嵌合抗体；FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已替换为同源的人或非人序列的嵌合F(ab’)2片段抗体；FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已替换为同源的人或非人序列的嵌合Fab片段抗体；以及FR和/或CDR1和/或CDR2区已替换为同源的人或非人序列的嵌合Fd片段抗体。术语“抗体”还包括“单链”抗体。
抗体还可以与用于展示表达特定蛋白质或肽的细胞及组织的特定诊断性物质偶联。
诊断性物质包括发挥以下功能的任何标记：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用以改变该第一或第二标记所提供的可检测信号，例如FRET(荧光共振能转移)；(iii)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数而影响迁移率，例如电泳迁移率；或(iv)提供捕获部分，例如亲和力、抗体/抗原或离子络合。适于作为标记的是诸如以下的结构：荧光标记、发光标记、生色团标记、放射性同位素标记、同位素标记(优选稳定同位素标记)、同量异位标记、酶标记、颗粒标记(特别是金属颗粒标记、磁性颗粒标记、聚合物颗粒标记)、有机小分子如生物素、受体的配体或结合分子(如细胞粘附蛋白或凝集素)、包含可使用结合剂检测的核酸和/或氨基酸残基的标记序列等。诊断性物质包括但不仅限于硫酸钡、碘西他酸(iocetamic acid)、碘番酸、碘泊酸钙(calcium ipodate)、泛影酸钠、泛影葡胺、甲泛葡胺、酪泮酸钠以及放射性诊断剂包括正电子发射体如氟-18和碳-11、γ发射体如碘-123、锝-99m、碘-131和铟-111，用于核磁共振的核素如氟和钆。
抗体还可以与特定的治疗性物质偶联。
根据本发明，术语“治疗性物质”指发挥治疗效果的任何分子。根据本发明，治疗性物质优选地选择性导向至患病细胞，并包括抗癌剂、放射性碘标记的化合物、毒素、细胞抑制药物或细胞裂解药物等。例如，抗癌剂包括氨鲁米特(aminoglutethimide)、硫唑嘌呤、硫酸博来霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环孢菌素、阿糖胞苷(cytarabidine)、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素(daunorubin)、多柔比星、紫杉醇、依托泊苷、氟尿嘧啶、干扰素-α、洛莫司汀、巯嘌呤、氨甲喋呤、米托坦、盐酸丙卡巴肼、硫鸟嘌呤、硫酸长春碱和硫酸长春新碱。其他抗癌剂描述于例如Goodman和Gilman，“ThePharmacological Basis of Therapeutics”，第八版，1990，McGraw-Hill，Inc.，特别是第52章(Antineoplastic Agents(Paul Calabresi and BruceA.Chabner)。毒素可以是蛋白质如美洲商陆抗病毒蛋白、霍乱毒素、百日咳毒素、蓖麻毒素、白树毒素、相思豆毒素、白喉外毒素或假单胞菌(Pseudomonas)外毒素。毒素残基(toxin residue)还可以是高能发射的放射性核素，例如钴-60。
术语“主要组织相容性复合体”或“MHC”涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。MHC蛋白或分子在正常免疫反应中通过与肽结合并呈递它们用于T细胞受体(TCR)识别而参与淋巴细胞与抗原呈递细胞之间的信号传导。MHC分子结合胞内加工区室内的肽并将这些肽呈递于抗原呈递细胞的表面以用于T细胞识别。人MHC区也称为HLA，其位于6号染色体上，包括I类和II类区。在本发明所有方面的一个优选实施方案中，MHC分子为HLA分子。
本发明的术语“患者”或“受试者”指人、非人灵长类或其他动物，特别是哺乳动物如牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物(如小鼠和大鼠)。在一个特别优选的实施方案中，患者为人。
本发明的“异常表达”指与健康个体中的情况相比表达发生了改变，优选为提高。
根据本发明，术语“提高的”或“量增加的”优选指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％或至少100％。如果物质在测试样品中可检测到而在参照样品中不存在或检测不到，则测试样品中该物质的量(例如生物样品)与参照样品相比也是提高的。
根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状况，特别是包括癌症，其中本发明的术语“癌症”包括白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移癌。其实例为肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌或者上述癌症类型或肿瘤的转移癌。本发明的术语“癌症”还包括癌转移癌。
“肿瘤”指通过失控的快速细胞增殖而生长并在起始该新生长的刺激停止后继续生长的异常细胞或组织群。肿瘤显示部分或完全缺少结构组织以及与正常组织的功能协调，并且通常形成可为良性或恶性的独立的组织块。
“转移”是指癌细胞从其原始部位扩散到机体的其他部位。转移的形成是非常复杂的过程，其依赖于恶性细胞从原发肿瘤上脱落，侵入细胞外基质，穿透内皮基底膜进入体腔和血管，然后通过血液转运，渗入靶器官。最后，靶部位新肿瘤的生长依赖于血管发生。即使在已移除原发肿瘤后仍常常发生肿瘤转移，这是因为肿瘤细胞或组分可能保留并产生转移的潜力。在一个实施方案中，本发明的术语“转移”涉及“远处转移”，其表示距离原发肿瘤和局部淋巴结系统很远的转移。
术语“复发”涉及患者在病情好转后(例如在诸如肿瘤切除、化学治疗和/或放射治疗后)再次出现疾病的体征和症状。具体而言，术语“复发”涉及在无疾病期之后再次出现癌症。例如，在接受癌症治疗后，患者的癌症消退，无肿瘤的体征或症状，消退保持一段时间，但接着复发，只得再次进行癌症治疗。
根据本发明，生物样品可以是组织样品(包括体液)和/或细胞样品，并可以常规方式获得，例如组织活检(包括穿刺活检)以及收集血、支气管抽吸物、痰、尿、粪便或其他体液。根据本发明，术语“生物样品”还包括生物样品的级分。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，包括T辅助细胞和溶细胞性T细胞(其包括细胞毒T细胞)。
本发明所述药物组合物和治疗方法还可用于预防本文所述疾病的免疫或疫苗接种。
在本发明的方法中，核酸可作为裸核酸、与递送试剂结合或作为可表达该核酸的重组质粒或病毒载体而施用于受试者。本发明还提供了通过使用靶标受控性脂质体在体内施用核酸。
例如，可以使用来自腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒(如慢病毒(LV)、弹状病毒、小鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。可通过以来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原对载体进行假型化或通过在适当时替换不同的病毒衣壳蛋白来改变病毒载体的向性。
脂质体可帮助将核酸递送至特定组织(如肿瘤组织)，并且还可提高核酸在血中的半衰期。适用于本发明的脂质体由标准的囊泡形成脂质而形成，它们一般包括中性或带负电的磷脂和甾醇(如胆固醇)。脂质的选择通常考虑诸如期望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期等因素来进行。已知多种方法用于制备脂质体，例如Szoka等(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467以及美国专利No.4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所述，其全部公开内容均以参考方式并入本文。
在一些具体实施方案中，优选将核酸导向至特定细胞。在这样的实施方案中，用于将核酸施用至细胞的载体(例如逆转录病毒或脂质体)可与靶标控制分子结合。例如，可将诸如特异性针对靶细胞表面膜蛋白的抗体或者针对靶细胞上受体的配体的分子掺入所述核酸载体中或附着于其上。优选的抗体包括与肿瘤细胞相关抗原选择性结合的抗体。如果期望通过脂质体施用核酸，则可将与胞吞作用相关表面膜蛋白结合的蛋白质掺入该脂质体配方中，以使靶标控制和/或摄取成为可能。这样的蛋白质包括对特定细胞类型具有特异性的衣壳蛋白或其片段、针对内化蛋白的抗体、可进入胞内位点的蛋白质等。
RNAi介导的靶mRNA降解可通过测量靶mRNA或蛋白质的水平来检测，其中使用用于分离和定量mRNA的标准技术，例如Northern印迹或点印迹技术或者定量RT-PCR，或使用用于分离和定量蛋白质的标准技术，如ELISA或Western印迹。
本发明的治疗性组合物可在药物相容性制剂中施用。这样的制剂通常可包含药物相容性浓度的盐、缓冲物质、防腐剂、载体、补充性免疫增强物质如佐剂(例如CpG寡核苷酸、细胞因子、趋化因子、皂苷、GM-CSF和/或RNA)并在适当时包含其他治疗活性化合物。
本发明的治疗活性化合物可通过任何常规途径施用，包括注射或输注。例如，可以经口、静脉内、腹膜内、肌内、皮下或透皮施用。
用于将核酸递送至细胞的合适技术包括通过基因枪、电穿孔、纳米颗粒、微囊化等或者通过肠胃外及肠给药途径将核酸施用于受试者。
合适的肠给药途径包括经口、直肠或鼻内递送。
合适的肠胃外给药途径包括血管内给药(例如静脉内团注(intravenous bolus injection)、静脉内输注、动脉内团注(intra-arterialbolus injection)、动脉内输注和导管滴注进脉管系统)；组织周围及组织内给药(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵进行)；在患病区域处或其附近直接(例如局部)应用，例如利用导管或其他安放装置(如包含多孔、非多孔或凝胶状材料的栓剂或植入物)进行；以及吸入。
本发明的组合物以有效量施用。“有效量”是指单独或与其他给药一起获得期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病或特定病症的情形中，期望的反应优选涉及抑制该疾病的病程。这包括减缓该疾病的发展，特别是中断或逆转该疾病的发展。疾病或病症治疗中期望的反应还可以是延缓或预防所述疾病或所述病症的发病。本文使用的siRNA的“有效量”优选为足以在受试者中导致RNAi介导的靶mRNA降解的量。
本发明组合物的有效量将取决于诸如以下的因素：待治疗的疾病；该疾病的严重程度；患者的个体参数，包括年龄、生理状况、身高和体重；治疗的持续时间；联合治疗(如果有的话)的类型；具体的给药途径以及类似的因素。
本发明的组合物可以与设计用于治疗该疾病的其他治疗方法组合施用于受试者。例如，它们可以与目前用于治疗癌症或预防肿瘤转移的治疗方法(例如放射疗法、化学疗法和手术)组合施用。就治疗肿瘤而言，本发明的组合物优选与放射疗法组合或者与化学治疗剂(如顺铂、卡铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素或他莫昔芬)组合施用于受试者。
本发明的药物组合物优选为无菌的并含有有效量的治疗活性物质，以产生期望的反应或期望的效果。
所施用的本发明组合物的剂量可取决于多种参数，例如给药类型、患者的状况、期望的给药周期等。对于起始剂量不足以在患者中获得反应的情况，可以使用更高的剂量(或通过不同的更加局部的给药途径实现的更有效剂量)。
本发明的药物组合物一般以药物相容性的量在药物相容性组合物中施用。术语“药物相容性”是指不与该药物组合物中活性成分的作用发生相互作用的无毒物质。这类制剂通常可含有盐、缓冲物质、防腐剂、载体，适当时还含有其他治疗活性化合物。药用时，盐应当是药物相容性的。然而，非药物相容性的盐可用于制备药物相容性盐，并包括在本发明中。这类药理学及药物相容性盐包括但不仅限于由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药物相容性盐也可制备成碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。
本发明的药物组合物可包含药物相容性载体。根据本发明，术语“药物相容性载体”是指适于对人施用的一种或多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。术语“载体”是指与活性成分组合以利于施用的天然或合成性质的有机或无机组分。本发明药物组合物的成分通常使得不发生显著损害所期望药效的相互作用。
本发明的药物组合物可包含合适的缓冲物质，例如盐形式的乙酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸和盐形式的磷酸。
适当时，所述药物组合物还可包含合适的防腐剂，例如苯扎氯铵、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
所述药物组合物通常以均一剂型提供，并可以已知的方式制备。本发明的药物组合物可采用例如胶囊剂、片剂、锭剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、酏剂的形式，或者采用乳剂的形式。
适于肠胃外给药的组合物通常包含活性化合物的无菌含水或非水制剂，其优选与受试者的血液等渗。相容性载体和溶剂的实例为林格液和等渗氯化钠溶液。此外，通常使用无菌的不挥发油作为溶液或悬液的介质。
通过以下附图和实施例详细描述本发明，它们仅用于说明目的，并不意在限制。由于这些描述和实施例，本领域技术人员易于理解同样包括在本发明中的其他实施方案。
附图：
图1.在恶性组织和癌细胞系中选择性转录TPTE。
a、b，通过(a)常规RT-PCR和(b)定量实时RT-PCR分析正常人组织、TPTE阳性的肿瘤样品及癌细胞系中的TPTE mRNA表达。c，来自正常组织和组成型表达TPTE的癌细胞系的蛋白裂解物的Western印迹分析。对照为转染有TPTE cDNA(+)或对照质粒(-)的NIH3T3细胞。d，TPTE的睾丸及恶性组织免疫组织化学染色。与缓冲液对照(-)相比，以用于免疫的重组蛋白片段(+)进行封闭证实了多克隆抗血清pAK2091的特异性。e，(左)通过实时RT-PCR分析显示经甲基化抑制剂dAC处理的TPTE阴性BT-549乳腺癌细胞中TPTE mRNA表达的诱导。(右)与野生型细胞相比，在HCT116细胞的DNA甲基转移酶敲除变体中TPTE转录物的相对量。
图2.TPTE是定位于质膜的磷酸肌醇3’-磷酸酶。
a，使用PI(3，4，5)P3和PI(4，5)P2作为底物的重组蛋白体外磷酸酶测定。b，TPTE-eGFP荧光与pAK2091染色共定位，用于证实多克隆兔抗血清的特异性。c，显示组成型表达TPTE的癌细胞系的免疫荧光分析。d，内源性TPTE在PC-3前列腺癌细胞的丝足和伪足中的定位；箭头：细胞突起物侧缘的TPTE累积；星号：突起物的尖端无TPTE。e，通过用抗TPTE染色转染有PLC-δ1-PH-eGFP的细胞来显示PC-3细胞中内源表达的TPTE与PIP2共定位。f，将TPTE(但不是无催化活性的突变体TPTEC338S)转染进NIH3T3-her2细胞中减少了组成型的PIP3信号传导，从而导致AKT-PH-eGFP的胞质重新分布。
图3.TPTE在癌细胞中建立生长因子依赖性表型。
在转染有siRNA的TPTE阳性肿瘤细胞系(a-d)以及外源表达TPTE或无催化活性突变体TPTEC338S和eGFP(作为对照)的转化细胞(e-i)中，分析了TPTE对AKT磷酸化、细胞增殖以及对由生长因子剥夺所诱导凋亡的抗性的影响。a，转染有siRNA的细胞的Western印迹分析。TPTEsiRNA特异性抑制相应的磷酸酶。值得注意的是，PTEN蛋白水平不受TPTE siRNA的影响。b，TPTE siRNA(+)对TPTE的抑制(乱序siRNA双链体(-)则不抑制)导致细胞磷酸化-AKT水平提高。c、d，在补充有多种浓度血清的培养基中培养48小时的MDA-MB-435乳腺癌及MelJuso黑素瘤细胞的增殖速率(c)和凋亡分数(d)证明，TPTE的下调使细胞增殖及存活与外部生长因子依赖性解偶联。对MDA-MB-231和PC-3细胞获得了类似的数据。RFU代表相对荧光单位。e，野生型及转化有HER2/neu的NIH3T3成纤维细胞(NIH3T3-her2)中HER2/neu表达和AKT磷酸化的Western印迹分析。f，TPTE降低了转化有Her2/neu的成纤维细胞中细胞PIP3水平，无催化活性的变体则不然。如实施例1所述，使用PIP3特异性ELISA在血清剥夺细胞的裂解物中定量细胞PIP3水平。g，转染有TPTE-eGFP的NIH3T3-her2细胞和对照中的AKT磷酸化。h，通过流式细胞术细胞周期分析确定，稳定表达具有催化活性的TPTE-eGFP消除了NIH3T3-her2细胞的自主生长。i，免疫受损小鼠中皮下接种稳定转染的NIH3T3-her2细胞后的肿瘤生长动力学情况。
图4.TPTE促进细胞的趋化作用。
a，用siRNA寡聚物转染细胞48小时后使用PDGF-BB(200ng/ml)和SDF-1α/CXCL12＊(200ng/ml)作为化学诱导物进行Transwell迁移测定，(＊MDA-MB-435细胞不表达CXCL12的受体CXCR4)。b、c，在使用FCS或多种浓度的PDGF-BB作为化学诱导物的transwell迁移测定中分析NIH-3T3-her2转染子的趋化作用。d，无血清培养的稳定转染有TPTE-eGFP或对照载体的NIH3T3-her2细胞的形态学特征。e、f、g，单独及组合的siRNA介导的PTEN及TPTE敲低对肿瘤细胞趋化作用、细胞PIP3水平和pAKT水平的影响(＊＊表示PC-3细胞不表达PTEN)。
图5.TPTE对于肿瘤细胞的转移扩散是必需的。
a，使用转染有siRNA并以荧光团标记的乳腺癌细胞进行体内肿瘤细胞外渗测定。在注射6小时后通过荧光显微术记录细胞向肺中的外渗并计数。b，基于将经TPTE siRNA或对照siRNA处理的乳腺癌和黑素瘤细胞注射进NOD/SCID小鼠(MDA-MB-231)或裸鼠(MCF-7，MelJuso)尾静脉而进行的实验性转移测定。使用特异性针对人微卫星DNA的寡核苷酸，在接种后5周通过定量PCR测定转移肿瘤负荷。c，通过独立实验从接种转染有siRNA的MDA-MB-231细胞4周后的裸鼠获得的代表性肺和HE染色的肺组织切片。值得注意的是，以转染有PTEN siRNA的MDA-MB-231细胞进行的实验导致类似的转移肿瘤负荷降低。d，用于说明患者组中转移率的文氏图。根据原发肿瘤样品中TPTE和CXCR4表达状况对患者进行分组。统计学数据显示了各组中的转移病例数和患者总数。
实施例1：材料和方法
组织和细胞系
本研究由当地的伦理评审委员会(“Ethikkommission der
Figure A200780037690D0044135413QIETU
 des Landes Rheinland-Pfalz”)批准。重组DNA工作得到了Rheinland-Pfalz州政府的官方许可并按照其规定进行。组织作为常规诊断或治疗操作中人类剩余材料获得，并保存于-80℃待用。如果没有另外指明，则细胞系均得自商品供应商。对于去甲基化研究，将细胞分散为20-30％汇合并与2μM或10μM 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-dC)(Sigma-Aldrich)一起培养72小时。结肠癌细胞系HCT116WT、HCT116DNMT1-/-、HCT116DNMT3b-/-和HCT116DKO由Bert Vogelstein惠赠。
RNA分离、RT-PCR和实时RT-PCR
如前所述进行RNA提取、第一链cDNA合成、RT-PCR和实时RT-PCR(Koslowski，M.等，Cancer Res.62，6750-6755(2002)，Koslowski，M.等，Cancer Res.64，5988-5993(2004))。对所有同源成员和假基因进行比对，以设计TPTE的特异性引物对。通过对随机选择的扩增产物进行测序来证实特异性。对于终点分析，在35个循环的RT-PCR中使用TPTE特异性寡核苷酸(有义：5’-TGG ATG TCA CTC TCA TCC TTG-3’，反义：5’-CCATAG TTC CTG TTC TAT CTG-3’，63℃退火)。使用TPTE特异性寡核苷酸(有义：5’-GAG TCT ACA ATC TAT GCA GTG-3’，反义：5’-CCA TAGTTC CTG TTC TAT CTG-3’，63℃退火)在40个循环的PCR中一式三份进行实时定量表达分析。以18sRNA(有义：5’-CGA TGC TCT TAG CTGAGT GTC-3’；反义：5’-TAA CCA GAC AAA TCG CTC CAC-3’，65℃退火)归一化后，使用AACT计算相对于正常组织定量肿瘤样品中的TPTE转录物。
抗血清、免疫化学实验和Western印迹
通过定制的抗体设备(SeqLab)产生针对TPTE n端(1-51位氨基酸)的多克隆抗血清pAK2091。通过将载玻片在柠檬酸盐缓冲液(pH 6)中煮沸15分钟然后室温冷却15分钟来修复抗原后，对经甲醛固定石蜡包埋的组织切片进行免疫组织化学实验。就Western印迹分析而言，使用从以Triton-X裂解的细胞中提取的60μg总蛋白。用还原样品缓冲液(Roth)稀释提取物，进行SDS-PAGE，随后电转至PVDF膜(Pall)上。对于免疫染色来说，使用对HER2/neu(Abcam)、pAKT(Cell Signaling)、AKT(Cell Signaling)和β-肌动蛋白(Abcam)具有反应性的抗体，其后使用与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠和山羊抗兔第二抗体(Dako)。根据生产商的说明，使用抗兔Envision+System(Dako)进行抗TPTE pAK2091第一抗体的检测。
在真核细胞中表达以eGFP标记的TPTE
扩增TPTE的开放读码框(有义引物：5’-GAG AGA AAG CTT CCACCA TGA ATG AAA GTC CTG ATC CCA CTG ACC T-3’，反义引物：5’-GAG AGA AAG CTT GAT CGG ATC CAG CTA CAA CAT CAC TGCAAG TC-3’)，引入两个HindIII位点。将扩增片段连接进载体pEGFP-C1和pEGFP-N3(BD Biosciences)中。通过PCR介导的定点诱变产生磷酸酶结构域活性位点中带有突变的变体TPTEC338S。
免疫荧光和共定位研究
将内源表达或在转染载体构建体后异源表达TPTE的细胞在载玻片上培养12-24小时，并用2％多聚甲醛/0.1％皂苷/PBS固定。使用pAK2091多克隆兔抗血清和荧光标记的第二抗兔IgG抗体进行TPTE的间接免疫荧光染色。为了分析TPTE与F-肌动蛋白的共定位，我们用罗丹明-鬼笔环肽(Molecular Probes)染色经透化处理的已固定细胞。针对PLC-δ1和AKT的eGFP标记PH结构域、以观察通过蛋白质-蛋白质相互作用使膜结合PIP2和PIP3的表达质粒分别由Mario.J.Rebecchi和JulianDownward惠赠。将盖玻片盖在Slow-Fade(Molecular Probes)中的载玻片上，并通过免疫荧光显微术进行分析。
eGFP融合蛋白的免疫纯化
在含有1％ Triton X-100和蛋白酶抑制剂(8μM亮抑酶肽、3.3μM胰凝乳蛋白酶抑制剂、2.9μM胃酶抑素A，1mM盐酸AEBSF)的缓冲液中裂解表达eGFP融合蛋白的细胞。将裂解物在4℃离心5分钟。为进行预清除(preclearing)，在4℃将裂解物与A蛋白琼脂糖凝胶CL-4B(Sigma-Aldrich)孵育1小时。将经过预清除的裂解物在4℃与抗eGFP抗体(Delta Biolabs)孵育2小时，然后在4℃与A蛋白琼脂糖凝胶CL-4B孵育1小时，并离心2分钟进行沉淀。用IP缓冲液(50mM HEPES(pH7.5)，150mM NaCl)清洗免疫复合物，并重悬于反应缓冲液(100mMHEPES(pH 7.5)，150mM NaCL，10mM DTT)中。通过SDS-PAGE分离蛋白质并通过免疫印迹进行分析。
体外磷酸酶测定
为了测量磷酸酶活性，将PTEN和TPTE融合蛋白在37℃在含有110μM水溶性磷脂酰肌醇磷酸(Echelon)的反应缓冲液中免疫沉淀并孵育90分钟。使用孔雀绿测定(Echelon)来测定从底物中释放出来的磷酸量。显色15分钟后，在Tecan Safire读数仪上测量620nm的样品吸光度。每种样品一式三份进行分析。
siRNA双链体
根据常用规则设计以及从Ambion购得siRNA双链体。TPTE siRNA双链体(有义：5’-r(GGU ACU UGA UAA CAU UAC A)dTdT-3’，反义：5’-r(UGU AAU GUU AUC AAG UAC C)dGdA-3’)靶向TPTE mRNA序列(NM_013315)的1722-1742位核苷酸。使用乱序siRNA双链体(有义：5’-r(UAA CUG UAU AAU CGA CUA G)dTdT-5’，反义：5’-r(CUA GUCGAU UAU ACA GUU A)dGdA-3’)作为对照。为进行TPTE沉默研究，根据生产商的说明，使用RNAiFect转染试剂(Qiagen)以100nm siRNA双链体转染细胞。所有功能测定均在转染siRNA双链体后24小时进行。使用靶向2487-2505位核苷酸的第二组TPTE siRNA双链体(有义：5’-r(GAUUGG CAA CCA AGA CUA A)dTdT-3’，反义：5’-r(UAA GUC UUG GUUGCC AAU C)dTdG-3’)重现了所有结果。用于PTEN沉默的双链体(5’-r(GGC GUA UAC AGG AAC AAU A)dTdT-3’，反义：5’-r(UAU UGUUCC UGU AUA CGC C)dTdT-3’)针对1161-1179位核苷酸(NM_000314)。
细胞迁移
细胞迁移测定在8.0μm孔膜的transwell腔室(BD Biosciences)中进行，细胞在实验前在无血清培养基中培养12小时。对于siRNA实验，在如上述转染siRNA双链体后24小时将细胞转移至无血清条件中。向上层室中加入400μl无血清培养基中的4×104个细胞。下层室中含有补充了作为化学诱导物的FCS、PDGF-BB(Sigma-Aldrich)或SDF-1α/CXCL12(R&D Systems)的800μl培养基。24小时后，用冰冷的甲醇将迁移至膜下侧的细胞固定，将膜剪下，置于显微镜载片上并用Hoechst(Dako)封片以进行荧光显微术。对每个膜计数5个随机视野(100倍放大)中的细胞。所有实验均一式三份进行。使用(i)上层室和下层室中不添加化学诱导物和(ii)上层室和下层室中均加入化学诱导物的同样实验设置来分析对细胞化学动态的影响。
细胞增殖分析
转染siRNA双链体后24小时，将1×104个细胞在补充有不同浓度FCS的培养基中培养48小时。根据生产商的说明，使用DELFIA细胞增殖试剂盒(Perkin Elmer)在Wallac Victor2多标记计数器(Perkin Elmer)上测量新合成DNA链中的BrdU掺入，以分析增殖。
细胞周期分析和凋亡
将细胞在补充有不同浓度FCS的培养基中培养，48小时后收获并用碘化丙锭染色，然后进行流式细胞术DNA含量分析。使用CellQuest软件(Becton Dickinson)定量凋亡细胞和处于细胞周期中S/G2/M期的细胞。
体内肿瘤生长分析和实验性转移测定
为分析体内肿瘤生长，将5×106个细胞(NIH3T3-her2、NIH3T3-her2-eGFP、NIH3T3-her2-TPTE-eGFP和NIH3T3-her2--TPTEC338S-eGFP)皮下注射进NOD/SCID小鼠的侧部(每组5只动物)。以卡尺定期测量肿瘤，并计算肿瘤体积(V＝a×b×b/2)。为了评估肿瘤细胞外渗，将1×106个以CFSE(Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit；Molecularprobes)标记的细胞注射进NOD/SCID小鼠的尾静脉中(每组3只动物)。6小时后处死小鼠，通过荧光显微术分析肺的Hoechst 33258标记冷冻切片(20μM)的外渗肿瘤细胞。每个肺计数50个随机视野中的肿瘤细胞。
在静脉内注射2×106个MDA-MB-231细胞后5周，使用实时PCR对NOD/SCID小鼠(每组4只动物)肺中的肿瘤负荷进行定量。使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)提取DNA，并从1μg DNA中扩增人17号染色体α卫星区的226bp片段(有义：5’-CAG CTG ACT AAA CAG AAGCAG-3’；反义：5’-GAG TTG AAT GCA GTC ATC ACA G-3’)。参照由NIH3T3小鼠成纤维细胞中MDA-MB-231细胞连续稀释所产生的标准曲线来定量肿瘤负荷。
统计学分析
使用SPSS软件(Fisher精确检验)将肿瘤中TPTE和CXCR4的表达相对于患者的转移率进行统计学分析。
实施例2：TPTE在人肿瘤中异位表达
在大量正常及赘生组织样品的组中研究TPTE mRNA表达。TPTE表达局限在睾丸中，所有其他正常组织样品中转录物的量在均低于高灵敏度RT-PCR的检出限(图1a、b)。相反，在涵盖了不同癌症类型(包括恶性黑素瘤(50％)、乳腺癌(47％)和肺癌(55％))的155个肿瘤样品中有59个(38％)以及大量癌细胞系的组(62％)中检测到了强TPTE表达(表1)。
表1  通过RT-PCR和实时PCR分析的人组织和细胞系中TPTE的表达
 
正常组织 阳性/测试数
睾丸 3/3
小肠 0/2
结肠 0/3
肝 0/2
肺 0/3
淋巴结 0/2
胃 0/2
脾 0/2
肾上腺 0/1
肾 0/3
食管 0/1
卵巢 0/2
胸腺 0/1
皮肤 0/2
乳腺 0/3
胰腺 0/2
静息的PBMC 0/3
增殖的PBMC 0/3
前列腺 0/2
甲状腺 0/2
子宫内膜 0/3
小脑 0/1
脑 0/2
肿瘤组织 阳性/测试数
乳腺癌 17/36(47％)
肺癌 25/45(55％)
恶性黑素瘤 9/18(50％)
结肠癌 0/20
前列腺癌 3/8
卵巢癌 2/7
宫颈癌 1/6
肿瘤细胞系 阳性/测试数
乳腺癌细胞系 4/5
肺癌细胞系 2/6
黑素瘤细胞系 5/8
前列腺癌细胞系 2/2
对来自所有测试细胞系和来自任意选择的肿瘤来源样品的扩增产物进行克隆和测序，证明它们是来自染色体21p11上的TPTE的转录物。
使用针对TPTE N端(1-51位氨基酸)的多克隆兔抗体(pAK2091)在蛋白质水平验证表达数据。通过Western印迹分析在睾丸组织、通过RT-PCR分类为组成型TPTE表达阳性的大量肿瘤细胞系以及用TPTE-cDNA转染的细胞中检测到了与预期TPTE大小一致的65kDa条带，证明了该抗体的特异性(图1c，左图)。与RT-PCR数据一致，正常组织在Western印迹中的TPTE评分为阴性，而TPTE RT-PCR阳性癌组织含有显著量的TPTE蛋白(图1c，右图)。
用pAK2091对睾丸组织进行的免疫组织化学实验显示出在II型精原细胞和前精细胞中的特异性免疫反应性，这与最近针对小鼠直系同源物描述的原位杂交数据一致(Wu，Y.等，J.Biol.Chem.276，21745-21753(2001))(图1d)。来自肺癌、乳腺癌和前列腺癌以及恶性黑素瘤的组织样品在免疫组织化学实验中显示出肿瘤细胞特异性染色。相反，相邻的基质细胞和非赘生上皮细胞(图1d)以及与患者匹配的正常组织则无反应性(未示出)。确立TPTE作为分子肿瘤标志物之后，研究了导致其在癌细胞中异位活化(ectopic activation)的机制。已有报道称富含CpG的启动子中的DNA甲基化是沉默体细胞组织中种系特异性基因的一个亚组的主要机制。由此看来，基因组去甲基化似乎足以使肿瘤细胞中的这些基因异常活化(Koslowski，M.等，Cancer Res.64，5988-5993(2004)，De Smet，C.等，Mol.Cell Biol.19，7327-7335(1999))。TPTE启动子的序列分析显示出从第一个外显子上游延伸至第一个外显子和内含子的经典CpG岛。由于7号染色体和20号染色体上存在几乎相同的启动子序列，因此无法应用基因座特异性亚硫酸氢盐测序来直接分析肿瘤细胞中TPTE启动子的甲基化状态。因此，研究了总体甲基化改变对TPTE表达的影响。用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(dAC)处理几种非表达癌细胞系后，强烈诱导了TPTE转录(图1e)。在野生型HCT116结肠癌细胞和含有受损的DNA甲基转移酶(DNMT)的子代中进一步评估了TPTE转录的甲基化依赖性调节。HCT116WT细胞以及已知显示几乎正常或仅稍有降低的总体DNA甲基化的DNMT3b-/-和DNMT1-/-单敲除变体(Rhee，I.等，Nature 416，552-556(2002))不表达TPTE。相反，同时缺少这两种甲基转移酶并显示强烈降低的总体DNA甲基化的HCT116DKO细胞导致TPTE的强表达(图1e)。这两个实验独立地证实，DNA甲基化是TPTE沉默所必需的，并且在肿瘤中经常观察到的基因组去甲基化(Ehrlich，M.，Oncogene 21，5400-5413(2002)，Feinberg，A.P.& Vogelstein，B.，Nature 301，89-92(1983))足以实现其活化。
实施例3：TPTE是质膜PIP3磷酸酶
TPTE含有磷酸酶结构域以及与脂质结合的C2结构域，它们已显示对于其同源物PTEN的脂质磷酸酶活性是必要且充分的(Lee，J.O.等，Cell99，323-334(1999))。尽管先前已显示TPTE的小鼠直系同源物在体外具有PIP3和PI(3，4)P2底物特异性的脂质磷酸酶活性(Wu，Y.等，J.Biol.Chem.276，21745-21753(2001))，但其人对应物却未检测到酶活性(Walker，S.M.等，Biochem.J.360，277-283(2001))，这使得PTEN成为迄今惟一已知的人PIP3磷酸酶。由于后一研究使用了细菌来源的重组蛋白，因此用真核产生的蛋白质重新评估了人TPTE的酶活性。在HEK293细胞中表达与eGFP融合的TPTE及PTEN的磷酸酶及C2结构域，用与A蛋白珠偶联的抗eGFP抗体通过免疫沉淀纯化蛋白质，并用于孔雀绿测定。使用从转染有eGFP或TPTEC338S-eGFP(在推定磷酸酶活性的关键位点处突变的TPTE变体)的细胞获得的等摩尔量的免疫沉淀物作为对照，以排除共纯化的磷酸酶的污染。意想不到的是，发现TPTE以与PTEN相当的速率特异性地从PIP3释放磷酸，相应的对照则不然(图2a)。这一发现与人类癌症中TPTE的异常活化共同表明，TPTE参与肿瘤细胞中磷酸肌醇介导的质膜信号传导事件。
用抗TPTE抗体对转染有TPTE-eGFP的TPTE阴性细胞以及组成型表达TPTE的癌细胞系进行染色，并通过免疫荧光显微术进行研究。除了先前所述在高尔基体和内质网中的定位(Wu，Y.等，J.Biol.Chem.276，21745-21753(2001))以外，在质膜处发现了TPTE的重要部分(图2b、2c)。TPTE似乎在膜的褶皱处以及膜突起物(包括伪足和丝足)的侧缘富集，而在这些结构的尖端则不然(图2d)。为了研究TPTE与质膜磷酸肌醇的空间相关性，使用分别选择性结合PIP(4，5)P2(PIP2)或3’-磷酸化磷脂的PLC-δ1-PH(磷脂酶C-δi普列克底物蛋白同源性(phosholipase C-δ1pleckstrin homology))(Tall，E.G.等，Curr.Biol.10，743-746(2000))和AKT-PH(Watton，S.J.& Downward，J.，Curr.Biol.9，433-436(1999))结构域，用普列克底物蛋白结构域-eGFP融合蛋白进行共定位研究。值得注意的是，用pAK2091对共表达TPTE cDNA和eGFP标记之PH结构域的细胞进行的染色显示，TPTE与PLC-δ1-PH-eGFP几乎完全重合(图2f)，但不与AKT-PH-eGFP重合，表明TPTE与PIP2共定位(图2e)。
允许间接测定膜PIP3水平的运输测定(Halet，G.，Biol.Cell 97，501-518(2005))表明，在由于HER-2/neu转化造成PI3K过度活化的成纤维细胞中，TPTE cDNA与AKT-PH-eGFP的共转染导致AKT-PH-eGFP从质膜完全重新分布到胞质溶胶中，而TPTEC338S-cDNA则不然(图2f)，证明TPTE降低了质膜的PIP3水平。总之，这些观察证明，TPTE代谢PIP3，并暗示TPTE可能参与肿瘤细胞中质膜磷酸肌醇的空间调控。
实施例4：使用siRNA沉默TPTE表达
分析了内源性表达肿瘤相关磷酸酶TPTE的乳腺癌、前列腺癌和恶性黑素瘤细胞系中小干扰RNA(siRNA)所诱导的TPTE基因沉默的效果。定量RT-PCR和Western印迹表明，TPTE特异性的siRNA双链体诱导了TPTE转录物和蛋白质的强烈敲低，而不影响细胞的PTEN水平(图3a)。
首先，定量测定Ser473被磷酸化的AKT(pAKT)的水平作为细胞PIP3信号传导的度量。siRNA介导的TPTE下调在所有测试的肿瘤细胞系中均导致细胞pAKT的显著上调(图3b)，证明TPTE在癌细胞中对抗PI3K信号传导。TPTE沉默使pAKT上调在缺乏PTEN的PC-3细胞中最为明显，这提示内源性TPTE可能在肿瘤细胞中至少部分补偿PTEN活性的丧失。最重要的是，TPTE沉默后pAKT的上调在所有测试的TPTE阳性肿瘤细胞系中都转变成了相应肿瘤细胞中生长因子依赖性的降低，导致持续的增殖速率(图3c)并且即便在血清饥饿条件下仍保护其免于发生凋亡(图3d)。
为了阐明TPTE磷酸酶活性直接介导的效应，使用稳定转染了TPTE或无催化活性的变体TPTEC338S的Her2/neu转化成纤维细胞。
Her2/neu转化的成纤维细胞(NIH3T3-her2)显示出持久的AKT活化(图3e)，这是由于与细胞PIP3水平提高(图3f)相关的组成型PI3K过度活化所导致的。因此，这些细胞对凋亡有抗性，并在生长因子饥饿条件下持续增殖(图3h)。TPTE(而非突变的TPTEC338S)的表达下调了细胞中的PIP3(图3f)，降低了pAKT水平(图3g)，重设了增殖和存活的自主性，并在去除生长因子后诱导严格的血清依赖性增殖并迅速发生G0/G1细胞周期阻滞(图3h)。值得注意的是，在免疫受损小鼠中表达TPTE的NIH3T3-her2细胞的生长与缺乏磷酸酶活性但仍可致瘤的对照相比显著降低(图3g)。这些发现表明，TPTE通过代谢PIP3而对抗上游癌基因诱导的PI3K过度活化，并使肿瘤细胞的生长和存活依赖于外部生长因子，而不消除致瘤性。
实施例5：TPTE促进肿瘤细胞的趋化作用
在transwell迁移测定和基于趋化因子的侵袭测定中，TPTE特异性siRNA双链体(而非对照双链体)在所有测试的肿瘤细胞系中均降低肿瘤细胞向PDGF或SDF-1/CXCL12梯度的迁移(图4a)。
为了排除siRNA的脱靶活性(off target activity)，用第二组TPTE特异性siRNA双链体和对照来验证这些发现。此外，观察到TPTE(而非其无催化活性的突变体变体)加强了HER-2/neu对细胞迁移的影响。NIH3T3-her2细胞由于转化了该癌基因而提高的基线迁移率(Dittmar，T.等，FASEB J.16，1823-1825(2002))在共表达TPTE后进一步增强(图4b)。这样的双阳性细胞甚至向最低的化学诱导物梯度有效迁移(图4c)，表明PI3K过度活化与TPTE表达的组合促进了趋化因子感知和有效的趋化性迁移。与此一致，TPTE(而非TPTEC338S)的表达导致显著的形态学改变，即由圆形细胞转变成有极性的带有伪足和丝足的多形表型(图4d)。如组成型表达的癌细胞系所示(图2d)，TPTE在这些突起物中强烈富集，提示该脂质磷酸酶直接参与丝足伸出物的产生。
TPTE所观察到的趋化作用促进活性是出人意料的，特别是鉴于之前PTEN的数据(其显示与TPTE相同的催化性PIP3磷酸酶活性，但报道其抑制迁移)(Tamura，M.等，Science 280，1614-1617(1998))。然而，这些研究是基于转染有PTEN cDNA的肿瘤细胞。相反，最近一项使用siRNA敲低PTEN的报道(Li，Z.等，Nat.Cell Biol.7，399-404(2005)；Meili，R.，Sasaki，A.T.& Firtel，R.A.，Nat.Cell Biol.7，334-335(2005))清楚表明，PTEN对于转化Jurkat细胞中SDF-1所介导的趋化作用是必需的。
在所有研究的PTEN阳性肿瘤细胞系中，特异性siRNA双链体对PTEN表达的强烈降低导致趋化作用显著且选择性的降低(图4e)，而化学动态(chemokinesis)则不然。PTEN siRNA在PTEN缺陷型PC-3细胞中无效果，这排除了所观察到的趋化性迁移抑制由siRNA脱靶活性介导的可能。重要的是，将两种磷酸酶同时进行抑制导致趋化作用的几乎完全消除。对经siRNA处理的细胞中细胞PIP3水平的分析表明，通过组合siRNA同时消除TPTE和PTEN导致了与单siRNA处理细胞中提高的PIP3水平相比更强烈的细胞PIP3上调(图4f)。这与抑制这两种磷酸酶导致更强的细胞pAKT提高(图4g)一起表明，TPTE和PTEN的活性在促进肿瘤细胞趋化作用和降低PIP3/AKT信号传导方面是加和性的。
实施例6：TPTE促进转移癌扩散
由生长因子受体(如EGF和PDGF)或趋化因子受体(如CXCR4和CCR7)介导的趋化作用促进肿瘤侵袭和转移(Muller，A.等，Nature 410，50-56(2001)；Staller，P.等，Nature 425，307-311(2003))。为了研究TPTE对转移的影响，研究了肿瘤细胞外渗，这是趋化作用所介导的癌细胞转移性扩散中的关键步骤(Chambers，A.F.，Groom，A.C.& MacDonald，I.C.，Nat.Rev.Cancer 2，563-572(2002))。将经siRNA处理的荧光团标记的MDA-MB-231或MCF-7乳腺癌细胞注射进NOD/SCID小鼠的尾静脉中。6小时后处死动物，并通过荧光显微术在全标本包埋的肺切片中定量外渗至肺中的肿瘤细胞数。对于这两种肿瘤细胞系，siRNA介导的TPTE敲低均显著减少外渗的细胞数(图5a)。在接种形成转移的乳腺癌(MDA-MB-231、MCF-7)或恶性黑素瘤细胞(MelJuso)后数周，通过人微卫星特异性PCR对小鼠肺中亚目视水平(submacroscopic)转移瘤损伤的定量证明，在接受已瞬时转染TPTE siRNA的肿瘤细胞的动物中，肿瘤负荷减少100-1000倍(图5b)。
另外，使用MDA-MB-231在裸鼠中进行的实验性转移测定引起目视水平的(macroscopic)损伤，这证实了这些惊人的发现，并证明了TPTE在转移性扩散中的关键作用(图5c)。
实施例7：TPTE和CXCR4是肿瘤转移的标志物
评估了TPTE的强迁移促进及转移促进活性是否与肿瘤的转移性扩散相关。为此，通过实时RT-PCR对从充分表征的群体中独立收集34名乳腺癌患者的样品(Ahr，A.等，Lancet 359，131-132(2002))以及24个非小细胞肺癌样品进行TPTE表达分型。TPTE表达与肿瘤阶段或分化分级之间无显著相关性。然而，TPTE阳性肿瘤在诊断时显示比TPTE阴性原发瘤(37％和0％)明显更多的局部淋巴转移(76％)和远处转移(21％)(表2a)。CXCR4表达也是多种癌症的转移预测标志物。因此，同一组样品也用于测试CXCR4表达。事实上，CXCR4阳性癌症(n＝23)与CXCR4阴性癌症(3％)相比显示出明显更高的远处转移率(26％)。重要的是，TPTE和CXCR4表达不相关，并且这两种分子代表了独立的转移预测因子(图5c)。组合表达TPTE和CXCR4的癌症显示大大提高的转移率(60％)，而缺少TPTE、CXCR4或同时缺少这两种分子的肿瘤显示出甚至降低的转移发生风险(2％，p<0.00005，表2c)，这表明这两种分子的共表达对于癌症(特别是乳腺癌和肺癌)的转移性扩散非常重要。
表2a  TPTE表达与转移性扩散相关。
Figure A200780037690D00551
表2b  CXCR4表达与远处转移相关
表2c  TPTE与CXCR4同时表达与远处转移高度相关
Figure A200780037690D00561
序列表
<110>加尼梅德药物公司等
<120>用于治疗和诊断癌症及癌转移的组合物及方法
<130>342-33 PCT
<150>EP 06 021 434.3
<151>2006-10-12
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<223>核糖核苷酸碱基
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Claims (40)

1.用于对患者中的癌症、癌转移行为和/或癌症复发的出现进行诊断、监测和/或预后的方法，该方法包括定量和/或定性测定分离自所述患者的生物样品中TPTE的表达水平以及定量和/或定性测定分离自所述患者的生物样品中CXCR4的表达水平。
2.权利要求1的方法，其中与无癌症、无癌症风险、无癌转移、无癌转移风险、无癌症复发和/或无癌症复发风险的受试者中的表达水平相比，提高的TPTE表达水平和CXCR4表达水平指示癌症或癌症可能性、癌转移行为或癌转移行为可能性和/或癌症复发或癌症复发可能性。
3.权利要求1或2的方法，其中所述定量和/或定性测定TPTE的表达水平包括在分离自患者的生物样品中：
(i)检测或定量测定选自以下的核酸：
(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，
(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，
(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，以及
(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或(ii)检测或定量测定由(i)所述核酸编码的蛋白质或肽或者其部分或衍生物；和/或
(iii)检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的抗体；和/或
(iv)检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的T淋巴细胞，所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物任选地在与MHC分子的复合体中。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述定量和/或定性测定CXCR4的表达水平包括在分离自患者的生物样品中：
(i)检测或定量测定选自以下的核酸：
(a)包含选自SEQ ID NO：47和48之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，
(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，
(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，以及
(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或
(ii)检测或定量测定由(i)所述核酸编码的蛋白质或肽或者其部分或衍生物；和/或
(iii)检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的抗体；和/或
(iv)检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的T淋巴细胞，所述蛋白质或肽或其部分或衍生物任选地在与MHC分子的复合体中。
5.权利要求3或4的方法，其中在所述定量和/或定性测定TPTE表达水平中(i)所述核酸包含编码蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性测定TPTE表达水平中(ii)所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物。
6.权利要求4或5的方法，其中所述定量和/或定性测定CXCR4表达水平中(i)所述核酸包含编码蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性测定CXCR4表达水平中(ii)所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物。
7.权利要求3至6中任一项的方法，其中检测或定量测定所述核酸包括：
(i)将所述生物样品与特异性结合该核酸的试剂接触，以及
(ii)检测或定量测定所述试剂与该核酸之间复合体的形成。
8.权利要求3至6中任一项的方法，其中检测或定量测定所述蛋白质或肽或者所述其部分或衍生物包括：
(i)将所述生物样品与特异性结合该蛋白质或肽或者其部分或衍生物的试剂接触，以及
(ii)检测或定量测定所述试剂与该蛋白质或肽或者其部分或衍生物之间复合体的形成。
9.权利要求3至6中任一项的方法，其中检测或定量测定所述抗体包括：
(i)将所述生物样品与特异性结合该抗体的试剂接触，以及
(ii)检测或定量测定所述试剂与该抗体之间复合体的形成。
10.权利要求3至6中任一项的方法，其中检测或定量测定所述T淋巴细胞包括：
(i)将所述生物样品与特异性结合该T淋巴细胞的试剂接触，以及
(ii)检测或定量测定所述试剂与该T淋巴细胞之间复合体的形成。
11.权利要求7的方法，其中特异性结合所述核酸的试剂是与该核酸特异性杂交的寡核苷酸或多核苷酸。
12.权利要求8的方法，其中特异性结合所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物的试剂是特异性结合该蛋白质或肽或者其部分或衍生物的抗体。
13.权利要求9的方法，其中特异性结合所述抗体的试剂是特异性结合该抗体的蛋白质或肽。
14.权利要求10的方法，其中特异性结合所述T淋巴细胞的试剂是呈递该蛋白质或肽或者其部分或衍生物与MHC分子之间复合体的细胞，其中所述T淋巴细胞对该蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述监测包括确定所述癌症、所述癌转移行为和/或所述癌症复发出现的消退、病程或发病。
16.权利要求15的方法，其包括在第一时间点在第一样品中测定表达水平，在第二时间点在另一样品中测定表达水平，并比较这两个样品。
17.权利要求1至16中任一项的方法，其中所述患者患有癌症、癌转移和/或癌症复发或者怀疑或有风险发生癌症、癌转移和/或癌症复发。
18.权利要求7至17中任一项的方法，其中所述试剂以可检测的方式进行标记。
19.权利要求1至18中任一项的方法，其中所述生物样品包括体液和/或机体组织。
20.试剂盒，其包含用于在分离自患者的生物样品中定量和/或定性测定TPTE表达水平的工具以及定量和/或定性测定CXCR4表达水平的工具。
21.权利要求20的试剂盒，其中所述用于定量和/或定性测定TPTE表达水平的工具选自在分离自患者的生物样品中：
(i)用于检测或定量测定选自以下的核酸的工具：
(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，
(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，
(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，以及
(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或
(ii)用于检测或定量测定由(i)所述核酸编码的蛋白质或肽或者其部分或衍生物的工具；和/或
(iii)用于检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的抗体的工具；和/或
(iv)用于检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的T淋巴细胞的工具，所述蛋白质或肽或其部分或衍生物任选地在与MHC分子的复合体中。
22.权利要求20或21的试剂盒，其中所述用于定量和/或定性测定CXCR4表达水平的工具选自在分离自患者的生物样品中：
(i)用于检测或定量测定选自以下的核酸的工具：
(a)包含选自SEQ ID NO：47和48之核酸序列、其部分或衍生物的核酸，
(b)在严格条件下与(a)中核酸杂交的核酸，
(c)与(a)或(b)中核酸具有简并性的核酸，以及
(d)与(a)、(b)或(c)中核酸互补的核酸；和/或
(ii)用于检测或定量测定由(i)所述核酸编码的蛋白质或肽或者其部分或衍生物的工具；和/或
(iii)用于检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的抗体的工具；和/或
(iv)用于检测或定量测定对(ii)所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物具有特异性的T淋巴细胞的工具，所述蛋白质或肽或其部分或衍生物任选地在与MHC分子的复合体中。
23.权利要求21或22的试剂盒，其中所述定量和/或定性测定TPTE表达水平中(i)所述核酸包含编码蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性测定TPTE表达水平中(ii)所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列、其部分或衍生物。
24.权利要求22或23的试剂盒，其中所述定量和/或定性测定CXCR4表达水平中(i)所述核酸包含编码蛋白质或肽的核酸序列，所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物；和/或所述定量和/或定性测定CXCR4表达水平中(ii)所述蛋白质或肽包含选自SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列、其部分或衍生物。
25.权利要求21至24中任一项的试剂盒，其中所述用于检测或定量测定所述核酸的工具包括特异性结合该核酸的试剂。
26.权利要求21至25中任一项的试剂盒，其中所述用于检测或定量测定所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物的工具包括特异性结合该蛋白质或肽或者其部分或衍生物的试剂。
27.权利要求21至26中任一项的试剂盒，其中所述用于检测或定量测定所述抗体的工具包括特异性结合该抗体的试剂。
28.权利要求21至27中任一项的试剂盒，其中所述用于检测或定量测定所述T淋巴细胞的工具包括特异性结合该淋巴细胞的试剂。
29.权利要求25的试剂盒，其中所述特异性结合所述核酸的试剂是与该核酸特异性杂交的寡核苷酸或多核苷酸。
30.权利要求26的试剂盒，其中所述特异性结合所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物的试剂是特异性结合该蛋白质或肽或者其部分或衍生物的抗体。
31.权利要求27的试剂盒，其中所述特异性结合所述抗体的试剂是特异性结合该抗体的蛋白质或肽。
32.权利要求28的试剂盒，其中所述特异性结合所述T淋巴细胞的试剂是呈递所述蛋白质或肽或者其部分或衍生物与MHC分子之间复合体的细胞，其中所述T淋巴细胞对该蛋白质或肽或其部分或衍生物具有特异性。
33.药物组合物，其包含当施用于患者时(i)有效降低或抑制TPTE的表达或活性和/或与TPTE结合并具有肿瘤破坏或肿瘤抑制活性的试剂，和(ii)有效降低或抑制CXCR4的表达或活性和/或与CXCR4结合并具有肿瘤破坏或肿瘤抑制活性的试剂。
34.权利要求33的药物组合物，其中所述试剂是与编码TPTE和/或CXCR4的核酸选择性杂交的反义核酸。
35.权利要求33的药物组合物，其中所述试剂是包含有义RNA链和反义RNA链的siRNA，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与TPTE mRNA和/或CXCR4mRNA中约19至约25个连续核苷酸的靶序列基本一致的核苷酸序列。
36.权利要求33的药物组合物，其中所述试剂是与TPTE和/或CXCR4选择性结合的抗体。
37.药物组合物，其包含
(I)一种或多种选自以下的组分：
(i)TPTE或其部分，
(ii)编码TPTE或其部分的核酸，
(iii)与TPTE或其部分结合的抗体，
(iv)与编码TPTE的核酸特异性杂交的反义核酸，
(v)针对TPTE的siRNA，
(vi)表达TPTE或其部分的宿主细胞，和
(vii)TPTE或其部分与MHC分子之间的分离的复合体；以及(II)一种或多种选自以下的组分：
(i)CXCR4或其部分，
(ii)编码CXCR4或其部分的核酸，
(iii)与CXCR4或其部分结合的抗体，
(iv)与编码CXCR4的核酸特异性杂交的反义核酸，
(v)针对CXCR4的siRNA，
(vi)表达CXCR4或其部分的宿主细胞，和
(vii)CXCR4或其部分与MHC分子之间的分离的复合体。
38.权利要求36或37的药物组合物，其中所述抗体与治疗性物质偶联。
39.用于治疗癌症、癌转移或癌症复发的方法，其包括施用权利要求33至38中任一项的药物组合物。
40.权利要求35的方法，其中所述癌症为肺肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、黑素瘤、结肠肿瘤、胃肿瘤、胰腺肿瘤、ENT肿瘤、肾细胞癌或宫颈癌、结肠癌或乳腺癌。
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