JP2010505428A - 癌及び癌転移の治療と診断のための組成物及び方法 - Google Patents

癌及び癌転移の治療と診断のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、癌疾患、癌疾患の転移挙動及び／又は癌の再発の発生を評価する及び／又は予後判定することを可能にする方法に関する。特に、本発明の方法は、癌転移、特に遠隔転移の発生を評価する及び／又は予後判定することを可能にする。好ましくは、本発明の方法は、悪性状態と良性状態を区別することを可能にする。

Description

本発明は、癌及び癌転移の治療と診断のための組成物及び方法に関する。
学際的なアプローチ及び古典的治療法の包括的使用にもかかわらず、癌は現在もなお死亡の主要原因の１つである。
特に、転移は癌治療の失敗の原因となる最も重要な因子の１つである。タンパク質発現のプロファイリング、遺伝子アレイ分析及び腫瘍組織における重要因子の決定は腫瘍の予後分類を改善したが、切除された原発腫瘍を分析して転移の危険度を予測することはまだ困難である。完全な腫瘍切除後の生存率は、通常、転移の発生に依存する。現在のところ、原発腫瘍が転移しているかどうかを予測することは、不可能ではないにせよ、困難である。
腫瘍細胞は、それらの起源の非悪性細胞とは実質上生物学的に異なる。これらの相違は、腫瘍形成の間に獲得される遺伝的変化によるものであり、また中でも特に、癌細胞における定性的又は定量的に変化した分子構造の形成を生じさせる。この種の腫瘍関連構造は、特に、その発現が悪性形質転換の経過中に誘導される又は増強される遺伝子産物である。
転移表現型の獲得を制御する因子はほとんど確定されていない。一部の組織病理学的パラメータ、例えば腫瘍病期及び組織学的グレード分類が、腫瘍のない状態での生存率に関連することは公知である。しかし、腫瘍組織における重要因子の定量化によって転移の危険度を予測することはまだ不可能である。
癌、特に癌転移の診断と治療のための組成物及び方法を提供することが本発明の目的であった。特に、癌の転移挙動の診断のための組成物及び方法を提供することが本発明の目的であった。
これらの目的は特許請求の範囲の対象内容によって達成される。
ここで提示する試験は、ＴＰＴＥ及びＣＸＣＲ４の両方を発現する癌が、これらの分子の少なくとも１つを欠く腫瘍と比較して、転移、特に遠隔転移のほぼ３０倍高い危険度を示すことを明らかにする。これらのマーカーの組合せは、それ故、癌患者の臨床予後の評価のため及び標的治療アプローチのために有用である。
従って、本発明は、癌疾患、癌疾患の転移挙動及び／又は癌の再発の発生を評価する及び／又は予後判定することを可能にする方法に関する。特に、本発明の方法は、癌転移、特に遠隔転移の発生を評価する及び／又は予後判定することを可能にする。好ましくは、本発明の方法は、悪性状態と良性状態を区別することを可能にする。
特定実施形態では、本発明の方法は、施された又は今後施される癌治療の成功を評価する及び／又は予後判定することを可能にする。特に、本発明の方法は、癌治療後、例えば、手術、化学療法及び／又は放射線治療による癌治療後の癌の再発の発生を評価する及び／又は予後判定することを可能にする。
１つの態様では、本発明は、患者において癌、癌の転移挙動及び／又は癌の再発の存在を診断する、観察する、すなわち退行、進行、経過及び／又は発症を判定する、及び／又は予後判定するための方法に関し、前記方法は、前記患者から単離された生物学的試料中のＴＰＴＥの発現のレベルを定量的及び／又は定性的に測定すること、及び前記患者から単離された生物学的試料中のＣＸＣＲ４の発現のレベルを定量的及び／又は定性的に測定することを含む。特に好ましい実施形態では、この態様での本発明は、患者が癌転移、特に遠隔転移を有しているかどうかを診断する方法に関する。
本発明の方法の特定実施形態では、ＴＰＴＥの発現レベルとＣＸＣＲ４の発現レベルは同じ試料において同時に又は連続的に測定される。本発明の方法のさらなる実施形態では、ＴＰＴＥの発現レベルとＣＸＣＲ４の発現レベルは異なる試料において測定され、前記の異なる試料は、同じ種類の試料、例えばどちらも同じか又は異なる時点で、身体の同じか又は異なる領域から、患者より採取された血液試料であり得るか、又は異なる種類の試料、例えば一方は血液試料であり、他方は尿試料であり得る。
好ましくは、癌を有していない、癌の危険性がない、癌の転移がない、癌の転移の危険性がない、癌の再発がない及び／又は癌の再発の危険性がない被験者における発現のレベルに比べて上昇しているＴＰＴＥの発現のレベル及びＣＸＣＲ４の発現のレベルは、癌又は癌の潜在的可能性、癌の転移挙動又は癌の転移挙動の潜在的可能性、及び／又は癌の再発又は癌の再発の潜在的可能性についての指標である。
好ましくは、ＴＰＴＥの発現レベルの定量的及び／又は定性的測定は、患者から単離された生物学的試料において、（ｉ）（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６及び７からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸からなる群より選択される核酸を検出する又は核酸の量を測定すること、及び／又は（ｉｉ）（ｉ）の下にある核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体を検出する又はその量を測定すること、及び／又は（ｉｉｉ）（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的な抗体を検出する又は抗体の量を測定すること、及び／又は（ｉｖ）場合によりＭＨＣ分子との複合体中で、（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的なＴリンパ球を検出する又はＴリンパ球の量を測定することを含む。好ましくは、前記ＴＰＴＥの発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉ）の下での核酸は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含み、及び／又は前記ＴＰＴＥの発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉｉ）の下でのタンパク質又はペプチドは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む。
好ましくは、ＣＸＣＲ４の発現レベルの定量的及び／又は定性的測定は、患者から単離された生物学的試料において、（ｉ）（ａ）配列番号４７及び４８からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸からなる群より選択される核酸を検出する又は核酸の量を測定すること、及び／又は（ｉｉ）（ｉ）の下にある核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体を検出する又はその量を測定すること、及び／又は（ｉｉｉ）（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的な抗体を検出する又は抗体の量を測定すること、及び／又は（ｉｖ）場合によりＭＨＣ分子との複合体中で、（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的なＴリンパ球を検出する又はＴリンパ球の量を測定することを含む。好ましくは、前記ＣＸＣＲ４の発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉ）の下での核酸は、配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含み、及び／又は前記ＣＸＣＲ４の発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉｉ）の下でのタンパク質又はペプチドは、配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む。
前記発現レベルの定量的及び／又は定性的測定を実施するための手段は本明細書で説明され、当業者には明白である。
本発明によれば、核酸の検出又は核酸の量の測定は、前記核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドプローブを用いて実施され得るか、又は前記核酸の選択的増幅によって、例えばＰＣＲ増幅によって実施され得る。１つの実施形態では、プローブは、前記核酸の６〜５０、特に１０〜３０、１５〜３０及び２０〜３０個の連続ヌクレオチドの配列を含み、前記増幅において使用されるプライマーは、各々前記核酸の６〜５０、特に１０〜３０、１５〜３０及び２０〜３０個の連続ヌクレオチドの配列を含む。
好ましくは、本発明の方法における前記核酸の検出又は前記核酸の量の測定は、（ｉ）生物学的試料を核酸に特異的に結合する作用物質と接触させること、及び（ｉｉ）作用物質と核酸の間の複合体の形成を検出する又は複合体の量を測定することを含む。好ましくは、核酸に特異的に結合する作用物質は、前記核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。
本発明によれば、タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体の検出、又はタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体の量の測定は、前記タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的に結合する抗体を使用して実施され得る。特定実施形態では、本発明の方法において検出される又はその量が測定されるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体は、ＭＨＣ分子の複合体中に存在する。
好ましくは、本発明の方法における前記タンパク質又はペプチド若しくはその前記部分又は誘導体の検出又はその量の測定は、（ｉ）生物学的試料を、タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的に結合する作用物質と接触させること、及び（ｉｉ）作用物質とタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体との間の複合体の形成を検出する又は複合体の量を測定することを含む。好ましくは、タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的に結合する作用物質は、前記タンパク質又はペプチド若しくはその前記部分又は誘導体に特異的に結合する抗体である。
本発明によれば、抗体の検出又は抗体の量の測定は、前記抗体に特異的に結合するタンパク質又はペプチドを使用して実施され得る。
好ましくは、本発明の方法における前記抗体の検出又は前記抗体の量の測定は、（ｉ）生物学的試料を抗体に特異的に結合する作用物質と接触させること、及び（ｉｉ）作用物質と抗体の間の複合体の形成を検出する又は複合体の量を測定することを含む。好ましくは、抗体に特異的に結合する作用物質は、前記抗体に特異的に結合するタンパク質又はペプチドである。
本発明によれば、Ｔリンパ球の検出又はＴリンパ球の量の測定は、タンパク質又はペプチドと、Ｔリンパ球がそれに対して特異的であるＭＨＣ分子との間の複合体を提示する細胞を使用して実施され得、細胞は、好ましくは抗原提示細胞である。Ｔリンパ球の検出又はＴリンパ球の量の測定はまた、タンパク質又はペプチドと、Ｔリンパ球がそれに対して特異的であるＭＨＣ分子との間の複合体による特異的刺激によって開始され得るその増殖、サイトカイン産生及び／又は細胞傷害活性を検出することによって実施され得る。Ｔリンパ球の検出又はＴリンパ球の量の測定はまた、組換えＭＨＣ分子若しくは１又はそれ以上のタンパク質又はペプチドと結合した２又はそれ以上のＭＨＣ分子の複合体を用いて実施され得る。
好ましくは、前記Ｔリンパ球の検出又は前記Ｔリンパ球の量の測定は、（ｉ）生物学的試料をＴリンパ球に特異的に結合する作用物質と接触させること、及び（ｉｉ）作用物質とＴリンパ球の間の複合体の形成を検出する又は複合体の量を測定することを含む。好ましくは、Ｔリンパ球に特異的に結合する作用物質は、Ｔリンパ球がそれに対して特異的であるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体とＭＨＣ分子との間の複合体を提示する細胞である。
オリゴ又はポリヌクレオチドプローブ、抗体、タンパク質又はペプチド、又は細胞のような本発明の方法における検出又は量の測定のために使用される作用物質は、好ましくは検出可能に標識され、特に放射性マーカー、蛍光マーカー又は酵素マーカーのような検出可能なマーカー又は診断物質によって標識される。
１つの実施形態では、本発明の方法は、１番目の時点で１番目の試料中の発現レベルを測定し、２番目の時点でさらなる試料中の発現レベルを測定して、２つの試料の比較を行うことを含む。好ましくは、患者からより早期に採取された試料と比較して、試料中でのＴＰＴＥの発現レベル及びＣＸＣＲ４の発現レベルが上昇しているということは、患者が癌及び／又は癌の転移及び／又は癌の再発を発症したこと又は発症しかかっていることを示す。好ましくは、患者からより早期に採取された試料と比較して、試料中でのＴＰＴＥの発現レベル及びＣＸＣＲ４の発現レベルが低下しているということは、前記患者における癌及び／又は癌の転移の退行を示し、それ故、好ましくは癌治療の成功を示す。
さらなる実施形態では、患者から単離された生物学的試料は、同等の正常生物学的試料、例えば健常個人から単離された試料と比較される。好ましくは、健常人から採取された試料と比較して、患者の試料中でのＴＰＴＥの発現レベル及びＣＸＣＲ４の発現レベルの上昇は、患者が癌及び／又は癌の転移及び／又は癌の再発を発症したこと又は発症しかかっていることを示す。
ＴＰＴＥの発現レベルの測定はまた、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６及び７からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸からなる群より選択される核酸に関する、及び／又は、好ましくはその非コード領域内、より好ましくはそのプロモーター領域内に、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含む核酸に関するメチル化パターン及び／又はメチル化の程度の測定を含み得る。
対照、例えば癌を有していない、癌の危険性がない、癌の転移がない、癌の転移の危険性がない、癌の再発がない及び／又は癌の再発の危険性がない被験者と比較してメチル化の程度がより低いこと又はメチル化がないことは、好ましくはＴＰＴＥの発現レベル上昇の指標である。
メチル化パターン及び／又はメチル化の程度の測定は、例えばＰＣＲに基づく方法を使用することによって、制限酵素を用いて又は配列決定によって実施できる。１つの好ましい実施形態では、ゲノムＤＮＡを、重亜硫酸塩含有試薬による処理後に選択的に増幅する。そのような増幅において使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは重亜硫酸塩含有試薬で処理した核酸に結合する配列を有し、好ましくは前記核酸に対して完全に相補的である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは核酸の種々の程度のメチル化に適合し、区別され得る増幅産物を生じさせる。これに適する試験は以下の通りである：（１）例えばパラフィン包埋材料を使用した、患者の組織試料からのＤＮＡの抽出、（２）重亜硫酸塩含有試薬によるＤＮＡの処理（例えばＣｌａｒｋ Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１５）：２９９０−７，１９９４に記載される）、（３）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅、及び（４）配列特異的増幅産物の量の分析（例えば定量的ＰＣＲ、マイクロアレイ法のようなハイブリダイゼーション手法による）。
本発明の方法の特定実施形態では、患者は、癌を有する、癌を有する又は癌を発症することが疑われる、又は癌を発症する危険性を有する。本発明の方法のさらなる実施形態では、患者は、癌の転移を有する、癌転移を有する又は癌転移を発症することが疑われる、又は癌転移を発症する危険性を有する。本発明の方法の特定実施形態では、患者は既に腫瘍切除、放射線治療及び／又は化学療法などによる癌治療を受けているか、又は患者がそのような治療を受けることが予定されている。
本発明に従って癌、癌の転移挙動及び／又は癌の再発の存在を診断する、観察する及び／又は予後判定する方法は、好ましくは疾患の悪性経過の予後判定を可能にし、それにより、中でも特に、より積極的な治療の計画立案を可能にする。この予後判定方法はまた、まだ良性である変化、例えば過形成を、既に好ましくないと評価され、侵襲性腫瘍が形成する以前に既に癌の傾向が予想される腫瘍前駆体から区別することを可能にする。
さらなる態様では、本発明は、患者から単離された生物学的試料においてＴＰＴＥの発現のレベルを定量的及び／又は定性的に測定するための手段及びＣＸＣＲ４の発現のレベルを定量的及び／又は定性的に測定するための手段を含むキットに関する。好ましくは、キットは、本発明の、癌、癌の転移挙動及び／又は癌の再発の存在を診断する、観察する及び／又は予後判定するための方法において有用である。
ＴＰＴＥ及びＣＸＣＲ４の発現のレベルを定量的及び／又は定性的に測定するための手段は上記で論じたとおりである。
好ましくは、患者から単離された生物学的試料において、前記ＴＰＴＥの発現レベルを定量的及び／又は定性的に測定するための手段は、（ｉ）（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６及び７からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸からなる群より選択される核酸を検出する又は核酸の量を測定するための手段、及び／又は（ｉｉ）（ｉ）の下にある核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体を検出する又はその量を測定するための手段、及び／又は（ｉｉｉ）（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的な抗体を検出する又は抗体の量を測定するための手段、及び／又は（ｉｖ）場合によりＭＨＣ分子との複合体中で、（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的なＴリンパ球を検出する又はＴリンパ球の量を測定するための手段からなる群より選択される。好ましくは、前記ＴＰＴＥの発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉ）の下での核酸は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含み、及び／又は前記ＴＰＴＥの発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉｉ）の下でのタンパク質又はペプチドは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む。
好ましくは、患者から単離された生物学的試料において、前記ＣＸＣＲ４の発現レベルを定量的及び／又は定性的に測定するための手段は、（ｉ）（ａ）配列番号４７及び４８からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸からなる群より選択される核酸を検出する又は核酸の量を測定するための手段、及び／又は（ｉｉ）（ｉ）の下にある核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体を検出する又はその量を測定するための手段、及び／又は（ｉｉｉ）（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的な抗体を検出する又は抗体の量を測定するための手段、及び／又は（ｉｖ）場合によりＭＨＣ分子との複合体中で、（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的なＴリンパ球を検出する又はＴリンパ球の量を測定するための手段からなる群より選択される。好ましくは、前記ＣＸＣＲ４の発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉ）の下での核酸は、配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含み、及び／又は前記ＣＸＣＲ４の発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉｉ）の下でのタンパク質又はペプチドは、配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む。
好ましくは、前記核酸を検出する又は前記核酸の量を測定するための前記手段は、核酸に特異的に結合する作用物質を含む。好ましくは、核酸に特異的に結合する作用物質は、前記核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。
好ましくは、前記タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体を検出する又はその量を測定するための前記手段は、タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的に結合する作用物質を含む。好ましくは、タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的に結合する作用物質は、前記タンパク質又はペプチド若しくはその前記部分又は誘導体に特異的に結合する抗体である。
好ましくは、前記抗体を検出する又は前記抗体の量を測定するための前記手段は、抗体に特異的に結合する作用物質を含む。好ましくは、抗体に特異的に結合する作用物質は、前記抗体に特異的に結合するタンパク質又はペプチドである。
好ましくは、前記Ｔリンパ球を検出する又は前記Ｔリンパ球の量を測定するための前記手段は、Ｔリンパ球に特異的に結合する作用物質を含む。好ましくは、Ｔリンパ球に特異的に結合する作用物質は、Ｔリンパ球がそれに対して特異的であるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体とＭＨＣ分子との間の複合体を提示する細胞である。
さらなる態様では、本発明は、（ｉ）ＴＰＴＥの発現又は活性を低下させる又は阻害する上で有効である及び／又はＴＰＴＥに結合し、腫瘍破壊又は腫瘍阻害活性を有する作用物質、及び（ｉｉ）ＣＸＣＲ４の発現又は活性を低下させる又は阻害する上で有効である及び／又はＣＸＣＲ４に結合し、腫瘍破壊又は腫瘍阻害活性を有する作用物質を含む医薬組成物に関する。「ＴＰＴＥの活性」及び「ＣＸＣＲ４の活性」という用語は、酵素活性又は調節活性、特に細胞移動調節活性のような細胞又は生物におけるＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４の何らかの活性に関する。好ましくは、ＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４に結合し、腫瘍破壊又は腫瘍阻害活性を有する作用物質は、それぞれＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４を発現する又は異常発現する細胞に特異的である。好ましくは、そのような作用物質は治療物質を含む。
本発明の医薬組成物のある実施形態では、作用物質は、ＴＰＴＥをコードする核酸と選択的にハイブリダイズする及び／又はＣＸＣＲ４をコードする核酸と選択的にハイブリダイズするアンチセンス核酸である。さらなる実施形態では、作用物質は、好ましくはセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を含むｓｉＲＮＡであり、センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、及びセンスＲＮＡ鎖は、ＴＰＴＥ ｍＲＮＡ内及び／又はＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡ内の約１９〜約２５個の連続ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態では、作用物質は、ＴＰＴＥ及び／又はＣＸＣＲ４に選択的に結合する抗体である。上記で論じたアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ及び／又は抗体は、本発明の医薬組成物において組み合わされ得る。
さらなる態様では、本発明は、（Ｉ）（ｉ）ＴＰＴＥ若しくはその部分又は誘導体、（ｉｉ）ＴＰＴＥ若しくはその部分又は誘導体をコードする核酸、（ｉｉｉ）ＴＰＴＥ又はその部分に結合する抗体、（ｉｖ）ＴＰＴＥをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、（ｖ）ＴＰＴＥをコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、（ｖｉ）ＴＰＴＥ若しくはその部分又は誘導体を発現する宿主細胞、及び（ｖｉｉ）ＴＰＴＥ若しくはその部分又は誘導体とＭＨＣ分子との間の単離複合体からなる群より選択される１又はそれ以上の成分、及び（ＩＩ）（ｉ）ＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体、（ｉｉ）ＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体をコードする核酸、（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体に結合する抗体、（ｉｖ）ＣＸＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、（ｖ）ＣＸＣＲ４をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、（ｖｉ）ＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体を発現する宿主細胞、及び（ｖｉｉ）ＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体とＭＨＣ分子との間の単離複合体からなる群より選択される１又はそれ以上の成分、を含む医薬組成物に関する。
１つの実施形態では、ＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体をコードする核酸は、医薬組成物中において、発現ベクターに存在し、プロモーターに機能的に連結されている。
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物中に存在する宿主細胞は、ＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体を分泌し、表面上にそれを発現して、好ましくは、前記ＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体に結合するＭＨＣ分子を付加的に発現する。１つの実施形態では、宿主細胞は、ＭＨＣ分子を内因的に発現する。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ＭＨＣ分子及び／又はＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体を組換えにより発現する。宿主細胞は、好ましくは非増殖性である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球又はマクロファージである。
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、抗体は、キメラ又はヒト化抗体、天然抗体又は合成抗体のフラグメントである。
本発明の医薬組成物中に存在するアンチセンス核酸は、ＴＰＴＥをコードする核酸若しくはその部分又は誘導体、及び／又はＣＸＣＲ４をコードする核酸若しくはその部分又は誘導体の、６〜５０、特に１０〜３０、１５〜３０及び２０〜３０個の連続ヌクレオチドの配列を含み得る。
さらなる実施形態では、直接又は核酸の発現を通して本発明の医薬組成物によって提供されるＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体は、細胞の表面でＭＨＣ分子と結合し、前記結合は、好ましくは細胞溶解応答を引き起こす及び／又はサイトカイン放出を誘導する。
本発明の医薬組成物中に含まれる抗体は、治療物質に結合され得る。
本発明の医薬組成物中に含まれるＴＰＴＥをコードする核酸に対するｓｉＲＮＡの特定実施形態では、標的配列は、配列番号１５のヌクレオチド位置３−２１、配列番号１８のヌクレオチド位置３−２１、配列番号２１のヌクレオチド位置３−２１、配列番号２４のヌクレオチド位置３−２１、配列番号２７のヌクレオチド位置３−２１、配列番号３０のヌクレオチド位置３−２１、及び配列番号３３のヌクレオチド位置３−２１からなる群より選択される核酸配列を有する。ｓｉＲＮＡのさらなる特定実施形態では、センスＲＮＡ鎖は配列番号１６の配列を有し且つアンチセンスＲＮＡ鎖は配列番号１７の配列を有するか、又はセンスＲＮＡ鎖は配列番号１９の配列を有し且つアンチセンスＲＮＡ鎖は配列番号２０の配列を有するか、又はセンスＲＮＡ鎖は配列番号２２の配列を有し、且つアンチセンスＲＮＡ鎖は配列番号２３の配列を有するか、又はセンスＲＮＡ鎖は配列番号２５の配列を有し且つアンチセンスＲＮＡ鎖は配列番号２６の配列を有するか、又はセンスＲＮＡ鎖は配列番号２８の配列を有し、且つアンチセンスＲＮＡ鎖は配列番号２９の配列を有するか、又はセンスＲＮＡ鎖は配列番号３１の配列を有し且つアンチセンスＲＮＡ鎖は配列番号３２の配列を有するか、又はセンスＲＮＡ鎖は配列番号３４の配列を有し且つアンチセンスＲＮＡ鎖は配列番号３５の配列を有する。
本発明の医薬組成物は、医薬適合性の担体及び／又はアジュバントを含み得る。
さらなる態様では、本発明は、（Ｉ）（ｉ）ＴＰＴＥ若しくはその部分又は誘導体、（ｉｉ）ＴＰＴＥ若しくはその部分又は誘導体をコードする核酸、（ｉｉｉ）ＴＰＴＥ又はその部分に結合する抗体、（ｉｖ）ＴＰＴＥをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、（ｖ）ＴＰＴＥをコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、（ｖｉ）ＴＰＴＥ若しくはその部分又は誘導体を発現する宿主細胞、及び（ｖｉｉ）ＴＰＴＥ若しくはその部分又は誘導体とＭＨＣ分子との間の単離複合体からなる群より選択される１又はそれ以上の成分、及び（ＩＩ）（ｉ）ＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体、（ｉｉ）ＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体をコードする核酸、（ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体に結合する抗体、（ｉｖ）ＣＸＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、（ｖ）ＣＸＣＲ４をコードする核酸に対するｓｉＲＮＡ、（ｖｉ）ＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体を発現する宿主細胞、及び（ｖｉｉ）ＣＸＣＲ４若しくはその部分又は誘導体とＭＨＣ分子との間の単離複合体からなる群より選択される１又はそれ以上の成分を患者に投与することを含む、癌、癌の転移又は癌の再発を治療する又は予防する方法に関する。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を投与することを含む、癌、癌の転移又は癌の再発を治療する又は予防する方法に関する。
好ましくは、癌は、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、黒色腫、結腸腫瘍、胃腫瘍、膵腫瘍、ＥＮＴ腫瘍、腎細胞癌又は子宮頸癌、結腸癌又は乳癌である。
好ましくは、癌、癌の転移又は癌の再発は、（ｉ）（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６及び７からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸からなる群より選択される核酸、及び／又は（ｉｉ）（ｉ）の下にある核酸によってコードされるタンパク質又はペプチドの発現又は異常発現を特徴とする。好ましくは、（ｉ）の下にある核酸は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含み、及び／又は（ｉｉ）の下でのタンパク質又はペプチドは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む。
より好ましくは、癌、癌の転移又は癌の再発は、（ｉ）（ａ）配列番号４７及び４８からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸からなる群より選択される核酸、及び／又は（ｉｉ）（ｉ）の下にある核酸によってコードされるタンパク質又はペプチドの発現増強又は異常発現を特徴とする。好ましくは、（ｉ）の下での核酸は、配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含み、及び／又は（ｉｉ）の下でのタンパク質又はペプチドは、配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む。
本発明の方法では、医薬組成物は、好ましくは放射線治療、化学療法又は手術と組み合わせて投与され、化学療法剤は、好ましくはシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン及びタモキシフェンからなる群より選択される。
好ましくは、本発明の方法における被験者又は患者はヒトである。
悪性組織及び癌細胞株におけるＴＰＴＥの選択的転写。ａ、ｂ、正常ヒト組織、ＴＰＴＥ陽性腫瘍標本及び癌細胞株における（ａ）従来のＲＴ−ＰＣＲ及び（ｂ）定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＴＰＴＥ ｍＲＮＡ発現の分析。ｃ、正常組織及び構成的ＴＰＴＥ発現を有する癌細胞株からのタンパク質溶解産物のウエスタンブロット分析。対照は、ＴＰＴＥ ｃＤＮＡ（＋）又は対照プラスミド（−）でトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞であった。ｄ、ＴＰＴＥについての精巣及び悪性組織の免疫組織化学染色。緩衝液対照（−）と比較したとき免疫のために使用した組み換えタンパク質フラグメント（＋）によるブロッキングは、ポリクローナル抗血清ｐＡＫ２０９１の特異性を確認した。ｅ、（左）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって示される、メチル化阻害剤ｄＡＣで処置したＴＰＴＥ陰性ＢＴ−５４９乳癌細胞におけるＴＰＴＥ ｍＲＮＡ発現の誘導。（右）野生型細胞と比較したときのＨＣＴ１１６細胞のＤＮＡメチルトランスフェラーゼノックアウト変異体におけるＴＰＴＥ転写産物の相対量。
ＴＰＴＥは形質膜に局在するホスホイノシトール３'−ホスファターゼである。ａ、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３及びＰＩ（４，５）Ｐ２を基質として使用した組換えタンパク質に関するインビトロホスファターゼアッセイ。ｂ、ポリクローナルウサギ抗血清の特異性の確認のためのＴＰＴＥ−ｅＧＦＰ蛍光とｐＡＫ２０９１染色の共局在。ｃ、ＴＰＴＥの構成的発現を示す癌細胞株の免疫蛍光分析。ｄ、ＰＣ−３前立腺癌細胞の糸状仮足及び仮足における内因性ＴＰＴＥの局在；矢印、細胞突起部の外側縁におけるＴＰＴＥの蓄積；星印、突起部の先端にはＴＰＴＥが存在しない。ｅ、抗ＴＰＴＥでのＰＬＣ−δ１−ＰＨ−ｅＧＦＰトランスフェクト細胞の染色によって視覚化したＰＩＰ２とＰＣ−３細胞において内因的に発現されるＴＰＴＥの共局在。ｆ、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞へのＴＰＴＥのトランスフェクションは構成的ＰＩＰ３シグナル伝達を低下させ、それ故ＡＫＴ−ＰＨ−ｅＧＦＰの細胞質再分布を導くが、触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８ＳのＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞へのトランスフェクションは構成的ＰＩＰ３シグナル伝達を低下させず、ＡＫＴ−ＰＨ−ｅＧＦＰの細胞質再分布を誘導しない。
図３において、ＴＰＴＥは癌細胞において増殖因子依存性表現型を確立する。増殖因子欠乏によって誘導されるＡＫＴリン酸化、細胞増殖及びアポトーシスに対する抵抗性へのＴＰＴＥの影響を、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＴＰＴＥ陽性腫瘍細胞株において（ａ〜ｄ）並びに対照としてＴＰＴＥを異所発現する形質転換細胞又は触媒的に不活性な突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８Ｓ及びｅＧＦＰにおいて（ｅ〜ｉ）分析した。ａ、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞のウエスタンブロット分析。ＴＰＴＥ ｓｉＲＮＡはそれぞれのホスファターゼを特異的に抑制する。ＰＴＥＮタンパク質レベルはＴＰＴＥ ｓｉＲＮＡによって影響を受けないことに留意すべきである。ｂ、ＴＰＴＥ ｓｉＲＮＡ（＋）によるＴＰＴＥの抑制は細胞ホスホ−ＡＫＴレベルの上昇を導くが、スクランブルｓｉＲＮＡ二量体（−）は細胞ホスホ−ＡＫＴレベルの上昇を導かない。ｃ、ｄ、様々な濃度の血清を添加した培地で４８時間培養したＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞及びＭｅｌＪｕｓｏ黒色腫細胞の増殖率（ｃ）及びアポトーシス分画（ｄ）によって実証されるように、ＴＰＴＥの下方制御は、細胞の増殖及び生存を外部増殖因子への依存から切り離す。同様のデータがＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＰＣ−３細胞に関して得られた。ＲＦＵは相対蛍光単位を表わす。
ｅ、野生型及びＨＥＲ２／ｎｅｕ形質転換ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２）におけるＨＥＲ２／ｎｅｕ発現及びＡＫＴリン酸化のウエスタンブロット分析。ｆ、ＴＰＴＥはＨＥＲ２／ｎｅｕ形質転換線維芽細胞において細胞ＰＩＰ３レベルを低下させるが、触媒的に不活性な変異体は細胞ＰＩＰ３レベルを低下させない。細胞ＰＩＰ３レベルは、実施例１で述べたようにＰＩＰ３特異的ＥＬＩＳＡを使用して血清欠如細胞の溶解産物から定量した。ｇ、ＴＰＴＥ−ｅＧＦＰでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞及び対照におけるＡＫＴリン酸化。ｈ、触媒的に活性なＴＰＴＥ−ｅＧＦＰの安定な発現は、フローサイトメトリー細胞周期分析によって測定されたように、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞の自律増殖を無効にする。ｉ、免疫不全マウスにおける安定にトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞の皮下接種後の腫瘍増殖動態。
図４において、ＴＰＴＥは細胞の走化性を促進する。ａ、ｓｉＲＮＡオリゴでの細胞のトランスフェクションの４８時間後の、ＰＤＧＦ−ＢＢ（２００ｎｇ／ｍｌ）及びＳＤＦ−１α／ＣＸＣＬ１２＊（２００ｎｇ／ｍｌ）を化学誘引物質として使用したトランスウエル遊走アッセイ；（＊ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は、ＣＸＣＬ１２についての受容体、ＣＸＣＲ４を発現しない）。ｂ、ｃ、ＦＣＳ又は様々な濃度のＰＤＧＦ−ＢＢを化学誘引物質として使用したトランスウエル遊走アッセイにおいて分析したＮＩＨ−３Ｔ３−ｈｅｒ２トランスフェクタントの走化性。ｄ、ＴＰＴＥ−ｅＧＦＰ又は対照ベクターで安定にトランスフェクトした無血清培養ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞の形態学的特徴。
ｅ、ｆ、ｇ、ＰＴＥＮ及びＴＰＴＥの単一及び複合ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンの腫瘍細胞走化性、細胞ＰＩＰ３レベル及びｐＡＫＴレベルへの影響（＊＊ＰＣ−３細胞はＰＴＥＮを発現しないことに留意すべきである）。
図５において、ＴＰＴＥは腫瘍細胞の転移拡大のために必須である。ａ、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、発蛍光団で標識した乳癌細胞を用いたインビボでの腫瘍細胞の溢出アッセイ。注射の６時間後に肺に溢出した細胞を蛍光顕微鏡検査によって確認し、計数した。ｂ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）又はヌード（ＭＣＦ−７、ＭｅｌＪｕｓｏ）マウスの尾静脈へのＴＰＴＥ ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡで処置した乳癌細胞及び黒色腫細胞の注射に基づく実験的転移アッセイ。転移腫瘍の負荷を、接種の５週間後にヒトマイクロサテライトＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドを使用した定量的ＰＣＲによって測定した。ｃ、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の接種の４週間後にヌードマウスから独立した実験によって得られた代表的肺及びＨＥ染色肺組織切片。ＰＴＥＮ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に関する実験は、転移腫瘍負荷の同様の減少を生じさせたことに留意すべきである。
ｄ、患者の群における転移率の説明のためのベン図。患者を、原発腫瘍試料におけるＴＰＴＥ及びＣＸＣＲ４発現の状態によって分類した。統計は、それぞれの群における総患者数に対する転移を有する症例数を示す。
本発明に従ったＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４に関する「発現のレベルを測定する」という表現は、ＴＰＴＥ遺伝子又はＣＸＣＲ４遺伝子の遺伝子産物（核酸及びタンパク質／ペプチド）の存在又は不在の判定及び／又は絶対的及び／又は相対的定量化に関する。本発明に従った「発現のレベルを測定する」という表現はまた、遺伝子産物が検出されない又は前記遺伝子産物の量が検出限界未満である状況を包含する。
一般に、核酸、タンパク質及び／又はペプチドを検出し、分析するのに適したすべての方法が、本発明の方法において発現のレベルを測定するために使用できる。ＰＣＲ、遺伝子チップ／マイクロアレイシステム、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ（ＲＤＡ）は、例えば、核酸を検出し、分析するために使用できる。タンパク質及び／又はペプチドを検出し、分析するための適切な免疫学的方法は、中でも特に、例えばペプチド又はタンパク質に特異的な抗体、抗体フラグメント、受容体、リガンド又は他の結合物質を使用した、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ、直接、間接又は競合的ＥＬＩＳＡ検定法、酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ＝蛍光活性化セルソーティング）、免疫組織化学、ウエスタンブロット法、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイ、タンパク質チップアッセイが挙げられる。
本発明によれば、「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。「特異的結合」は、抗体のような作用物質が、それが特異的であるエピトープのような標的に対して、別の標的に対する結合と比較してより強く結合することを意味する。ある作用物質がある解離定数（ＫＤ）で１番目の標的に結合し、その解離定数（ＫＤ）が２番目の標的に対する解離定数（ＫＤ）よりも低い場合、作用物質は２番目の標的に比べて１番目の標的により強く結合する。好ましくは、作用物質が特異的に結合する標的についての解離定数（ＫＤ）は、作用物質が特異的に結合しない標的についての解離定数（ＫＤ）よりも１０倍以上、好ましくは２０倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらに一層好ましくは１００倍、２００倍、５００倍又は１０００倍以上低い。
本発明によれば、参照試料又は参照生物のような「参照品」は、本発明の方法において試験試料又は試験生物、すなわち患者から得られた結果を相互に関連付け、比較するために使用され得る。典型的には、参照生物は健常生物、特に癌、癌の転移及び／又は癌の再発のない生物である。
「参照値」は、十分に大きな数の参照品を測定することにより、参照品から実験的に決定することができる。好ましくは、参照値は、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、好ましくは少なくとも５０、又は好ましくは少なくとも１００の参照品を測定することによって決定される。
「ＴＰＴＥ」という用語は、「テンシン相同性を有する膜貫通型ホスファターゼ」に関し、細胞によって天然に発現される又はＴＰＴＥ遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現される、ＴＰＴＥのいかなる変異体、特にスプライス変異体、立体配座、アイソフォーム及び種ホモログも包含する。「ＴＰＴＥの発現のレベルを測定する」という表現は、ｍＲＮＡのようなＴＰＴＥの核酸のレベルの測定、及び／又はＴＰＴＥタンパク質のレベルの測定に関する。
好ましくは、「ＴＰＴＥの核酸」、「ＴＰＴＥをコードする核酸」（"ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＴＰＴＥ" "ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ＴＰＴＥ"）又は「ＴＰＴＥ遺伝子」は、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６及び７からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸からなる群より選択される核酸に関する。前記用語はまた、ＴＰＴＥをコードするｍＲＮＡを含み得る。好ましくは、「ＴＰＴＥ」タンパク質又は単に「ＴＰＴＥ」は、前記核酸によってコードされるアミノ酸配列、好ましくは配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む。当業者であれば、上述したようなＴＰＴＥのｃＤＮＡ配列がＴＰＴＥ ｍＲＮＡと等価であり、本明細書で同じ目的のために、すなわちＴＰＴＥの発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの作製のために使用できることを理解する。
「ＴＰＴＥ」という用語はまた、細胞によって天然に発現される又はＴＰＴＥ遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現されるヒトＴＰＴＥの翻訳後修飾された変異体、アイソフォーム及び種ホモログを包含する。
「ＣＸＣＲ４」という用語は、「ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４」に関し、細胞によって天然に発現される又はＣＸＣＲ４遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現される、ＣＸＣＲ４のいかなる変異体、特にスプライス変異体、立体配座、アイソフォーム及び種ホモログも包含する。「ＣＸＣＲ４の発現のレベルを測定する」という表現は、ｍＲＮＡのようなＣＸＣＲ４の核酸のレベルの測定、及び／又はＣＸＣＲ４タンパク質のレベルの測定に関する。
好ましくは、「ＣＸＣＲ４の核酸」、「ＣＸＣＲ４をコードする核酸」（"ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＣＸＣＲ４" "ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ＣＸＣＲ４"）又は「ＣＸＣＲ４遺伝子」は、（ａ）配列番号４７及び４８からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、（ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸からなる群より選択される核酸に関する。前記用語はまた、ＣＸＣＲ４をコードするｍＲＮＡを含み得る。好ましくは、「ＣＸＣＲ４」タンパク質又は単に「ＣＸＣＲ４」は、前記核酸によってコードされるアミノ酸配列、好ましくは配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む。当業者であれば、上述したようなＣＸＣＲ４のｃＤＮＡ配列がＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡと等価であり、ここで同じ目的のために、すなわちＣＸＣＲ４の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡの作製のために使用できることを理解する。
「ＣＸＣＲ４」という用語はまた、細胞によって天然に発現される又はＣＸＣＲ４遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現されるヒトＣＸＣＲ４の翻訳後修飾された変異体、アイソフォーム及び種ホモログを包含する。
本発明によれば、核酸は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である。核酸は、本発明によれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子及び化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖又は二本鎖として及び直鎖状分子又は共有結合閉環分子として存在し得る。
本発明に従った縮重核酸は、遺伝暗号の縮重のためにコドン配列が参照核酸とは異なる核酸である。
本発明に従った「核酸」という用語はまた、核酸の「誘導体」を包含する。核酸の「誘導体」は、本発明によれば、単一又は複数の、例えば少なくとも２、少なくとも４又は少なくとも６、及び好ましくは３まで、４まで、５まで、６まで、１０まで、１５まで又は２０までのヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加が前記核酸内に存在することを意味する。さらに、「誘導体」という用語はまた、ヌクレオチド塩基、糖又はリン酸上の核酸の化学的誘導体化を包含する。「誘導体」という用語はまた、天然では生じないヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含む核酸を包含する。
本発明に従って述べる核酸は、好ましくは単離されている。「単離核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断及びゲル電気泳動による分画によって精製された、又は（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離核酸は、組換えＤＮＡ手法による操作のために使用可能な核酸である。
ここで使用される「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１個のリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２'位置にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡのような単離ＲＮＡ、並びに１又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変化により、天然に生じるＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを包含する。そのような改変は、ＲＮＡの末端又は内部への、例えばＲＮＡの１又はそれ以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子内のヌクレオチドはまた、非天然に生じるヌクレオチド又は化学合成ヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのような、非標準ヌクレオチドを含み得る。これらの改変ＲＮＡは、類似体又は天然に生じるＲＮＡの類似体と称され得る。
ここで使用される「相補性」又は「相補的」という用語は、核酸が、伝統的なワトソン・クリック型又は他の非伝統的な型の相互作用によってもう１つ別の核酸配列と水素結合を形成できることを意味する。本発明に従って述べる核酸分子に関して、核酸分子とその相補的配列についての結合自由エネルギーは、核酸の適切な機能、例えばＲＮＡｉ活性が進行するのを可能にするのに十分である。例えばｓｉＲＮＡ構築物のセンス鎖とアンチセンス鎖の間の相補性の程度は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ＲＮＡ配列の間の相補性の程度と同じであるか又は異なり得る。相補性パーセントは、２番目の核酸配列と水素結合（例えばワトソン・クリック型塩基対合）を形成できる核酸分子内の連続残基のパーセントを示す（例えば１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての連続残基が２番目の核酸配列内の同数の連続残基と水素結合することを意味する。
好ましくは、２つの配列がお互いとハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができる場合、核酸はもう１つ別の核酸に「相補的」であり、ハイブリダイゼーションは、好ましくはポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェント条件）下で実施される。ストリンジェント条件は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの中で述べられており、例えばハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションを参照されたい。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を、例えば室温にて２×ＳＳＣ中で、次に６８℃までの温度で０．１−０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中で洗浄する。
好ましくは、本発明に従った相補性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。
好ましくは、ここで述べる特異的核酸配列と、前記特異的核酸配列の誘導体である、前記特異的核酸配列とハイブリダイズする、及び／又は前記特異的核酸配列に対して縮重性がある核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。同一性の程度は、好ましくは少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、少なくとも約１５００、又は少なくとも約２０００ヌクレオチドの領域に関して与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は、配列表に記載されている核酸配列のような、参照核酸配列の全長に関して与えられる。
「配列類似性」は、同一である又は保存的アミノ酸置換であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのポリペプチド又は核酸配列の間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸又はヌクレオチドのパーセンテージを示す。
「同一性パーセンテージ」という用語は、最良のアラインメント後に得られた、比較する２つの配列の間で同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージを表わすことが意図されており、このパーセンテージは純粋に統計的であって、２つの配列の間の相違は無作為に及びそれらの長さ全体にわたって分布する。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の配列比較は、従来、これらの配列を最適に整列した後比較することによって実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、セグメントによって又は「比較ウインドウ」によって実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手操作による以外に、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索法によって、又はこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラムによって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）作成され得る。
同一性パーセンテージは、比較する２つの配列の間の同一位置の数を決定し、これら２つの配列の間の同一性パーセンテージを得るために、この数を比較する位置の数で除して、得られた結果に１００を乗じることによって算定される。
ここで使用される、標的配列、例えば標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列と「実質的に同一」の核酸配列は、標的配列に同一である若しくは１又はそれ以上のヌクレオチドが標的配列と異なる核酸配列である。標的配列と実質的に同一の核酸配列を含む、本明細書で述べるｓｉＲＮＡのセンス鎖は、そのようなセンス鎖を含むｓｉＲＮＡが、標的配列を含むｍＲＮＡの、ＲＮＡｉを介した分解を誘導することを特徴とする。例えばｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解がｓｉＲＮＡによって誘導される限り、１、２又は３又はそれ以上のヌクレオチドによって標的配列とは異なるセンス鎖を含み得る。
核酸は、本発明によれば、単独で存在し得るか、若しくは相同又は非相同であり得る他の核酸と組み合わされて存在し得る。好ましい実施形態では、核酸は、前記核酸に対して相同又は非相同であり得る発現制御配列に機能的に連結されている。「相同」という用語は、核酸が天然で発現制御配列に機能的に連結されていることを意味し、「非相同」という用語は、核酸が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないことを意味する。
ＲＮＡ及び／又はタンパク質又はペプチドを発現する核酸などの核酸と発現制御配列は、それらが、前記核酸の発現又は転写が前記発現制御配列の制御下又は影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸が機能的タンパク質に翻訳され、発現制御配列がコード配列に機能的に連結されている場合、前記発現制御配列の誘導は、コード配列内のフレームシフトを引き起こすことなく、又は所望タンパク質又はペプチドに翻訳されることができないコード配列となることなく前記核酸の転写を生じさせる。
「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー及び遺伝子の転写又はｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを含む。本発明の特定実施形態では、発現制御配列は調節され得る。発現制御配列の正確な構造は、種又は細胞型の機能に応じて異なり得るが、一般には、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与する５'非転写配列及び５'及び３'非翻訳配列を含む。より詳細には、５'非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を有する。発現制御配列はまた、エンハンサー配列又は上流活性化配列を含み得る。
本発明によれば、「プロモーター」又は「プロモーター領域」という用語は、発現される核酸配列の上流（５'側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼのための認識及び結合部位を提供することによって配列の発現を制御する核酸配列に関する。「プロモーター領域」は、遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識及び結合部位を含み得る。プロモーターは、原核又は真核生物遺伝子の転写を制御し得る。さらに、プロモーターは、「誘導可能」であり、誘導物質に応答して転写を開始し得るか、又は転写が誘導物質によって制御されない場合は「構成的」であり得る。誘導可能なプロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導物質が存在しない場合は発現されないか又は小さな程度にしか発現されない。誘導物質の存在下では、遺伝子のスイッチが入る又は転写のレベルが上昇する。これは、一般に、特異的転写因子の結合によって媒介される。
本発明に従って好ましいプロモーターは、ＳＰ６、Ｔ３及びＴ７ポリメラーゼについてのプロモーター、ヒトＵ６ ＲＮＡプロモーター及びＣＭＶプロモーターを含む。
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの生産又はＲＮＡとタンパク質／ペプチドの生産を含む。この用語はまた、核酸の部分的発現を含む。さらに、発現は一過性に又は安定に実施され得る。
好ましい実施形態では、核酸分子は、適宜に核酸の発現を制御するプロモーターと共に、本発明に従ってベクター内に存在する。「ベクター」という用語は、ここではその最も一般的な意味で使用され、核酸が、例えば原核及び／又は真核細胞に導入され、適宜に、ゲノムに組み込まれることを可能にする、核酸のためのいかなる中間媒体も含む。この種のベクターは、好ましくは細胞内で複製され及び／又は発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ又はウイルスゲノムを含む。ここで使用する「プラスミド」という用語は、一般に染色体外遺伝物質の構築物、通常は、染色体ＤＮＡとは独立して複製し得る環状ＤＮＡ二本鎖に関する。
本発明によれば、「宿主細胞」という用語は、外来性核酸で形質転換又はトランスフェクトされ得る細胞に関する。「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌）又は真核細胞（例えば哺乳動物細胞、特にヒト細胞、酵母細胞及び昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ又は霊長動物からの細胞のような哺乳動物細胞は特に好ましい。細胞は様々な組織型に由来し、一次細胞及び細胞株を含み得る。具体的な例としては、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄の幹細胞及び胚性幹細胞を含む。さらなる実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球又はマクロファージである。核酸は、単一コピー若しくは２又はそれ以上のコピーの形態で宿主細胞内に存在することができ、１つの実施形態では、宿主細胞において発現される。
ＭＨＣ分子がタンパク質又はペプチドを提示する本発明の場合には、発現ベクターはまた、前記ＭＨＣ分子をコードする核酸配列を含み得る。ＭＨＣ分子をコードする核酸配列は、タンパク質又はペプチドをコードする核酸と同じ発現ベクター上に存在し得るか、又は２つの核酸は異なる発現ベクター上に存在し得る。後者の場合は、２つの発現ベクターを１つの細胞に共トランスフェクトし得る。宿主細胞がタンパク質又はペプチド若しくはＭＨＣ分子のいずれも発現しない場合は、それらをコードする両方の核酸を同じ発現ベクター又は異なる発現ベクターで細胞にトランスフェクトし得る。細胞が既にＭＨＣ分子を発現する場合は、タンパク質又はペプチドをコードする核酸配列だけを細胞にトランスフェクトすることができる。
核酸は、増幅によって検出する又はその量を測定することができる。核酸の増幅は、核酸にハイブリダイズする一対の増幅プライマー、すなわちオリゴヌクレオチドを使用して実施できる。プライマーは、好ましくは核酸の６〜５０個、特に１０〜３０、１５〜３０及び２０〜３０個の連続ヌクレオチドの配列を含み、プライマー二量体の形成を避けるために非重複性である。プライマーの一方は、増幅する核酸の１本の鎖にハイブリダイズし、他方のプライマーは、核酸の増幅を可能にする配置で相補鎖にハイブリダイズする。
「アンチセンス分子」又は「アンチセンス核酸」は、核酸の発現を調節する、特に低下させるために使用され得る。「アンチセンス分子」又は「アンチセンス核酸」という用語は、本発明によれば、特定遺伝子を含むＤＮＡ又は前記遺伝子のｍＲＮＡに生理的条件下でハイブリダイズし、それによって前記遺伝子の転写及び／又は前記ｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴヌクレオチドを指す。本発明によれば、「アンチセンス分子」はまた、その天然プロモーターに対して逆方向の核酸又はその部分を含む構築物を含む。核酸又はその部分のアンチセンス転写産物は、タンパク質を規定する天然に生じるｍＲＮＡと二本鎖を形成することができ、それ故ｍＲＮＡの蓄積又はタンパク質への翻訳を妨げ得る。もう１つの可能性は、核酸を不活性化するためのリボザイムの使用である。本発明に従って好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸の６〜５０個、特に１０〜３０、１５〜３０及び２０〜３０個の連続したヌクレオチドの配列を有し、好ましくは標的核酸又はその部分に完全に相補的である。
好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端又は翻訳開始部位、転写開始部位又はプロモーター部位のような５'側上流部位とハイブリダイズする。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３'側非翻訳領域又はｍＲＮＡスプライシング部位とハイブリダイズする。
本発明によれば、オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチド又は修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであり得る。
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はその組合せからなり、１つのヌクレオチドの５'末端ともう１つのヌクレオチドの３'末端がホスホジエステル結合によって互いに連結されている。これらのオリゴヌクレオチドは、従来の方法で合成され得るか又は組換えによって生産され得る。
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは「修飾」オリゴヌクレオチドである。ここでは、オリゴヌクレオチドは、例えばその安定性を高めるために、その標的に結合する能力を損なわずに、多種多様な方法で修飾され得る。本発明によれば、「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、（ｉ）そのヌクレオチドの少なくとも２個が合成ヌクレオシド間結合（すなわちホスホジエステル結合ではないヌクレオシド間結合）によって互いに連結されている、及び／又は（ｉｉ）通常は核酸内で認められない化学基がオリゴヌクレオチドに共有結合している、オリゴヌクレオチドを意味する。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カルボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル及びペプチドである。
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語はまた、１又はそれ以上の共有結合修飾された塩基及び／又は１又はそれ以上の共有結合修飾された糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。「修飾オリゴヌクレオチド」は、例えば３'位置のヒドロキシル基及び５'位置のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖残基を有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾オリゴヌクレオチドは、例えば２'−Ｏ−アルキル化リボース残基又はリボースの代わりにアラビノースのようなもう１つ別の糖を含み得る。
ここで使用する「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」とは、標的遺伝子又は分解されるべきｍＲＮＡを同定するために使用される、好ましくは１０ヌクレオチド長より大きく、より好ましくは１５ヌクレオチド長より大きい、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチド長の単離ＲＮＡ分子を意味する。１９−２５ヌクレオチドの範囲がｓｉＲＮＡについての最も好ましい大きさである。
本発明に従ったｓｉＲＮＡは、部分精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、並びに１又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変により、天然に生じるＲＮＡとは異なる変化したＲＮＡを含み得る。そのような改変は、ｓｉＲＮＡの末端若しくはｓｉＲＮＡの１又はそれ以上の内部ヌクレオチドなどへの、非ヌクレオチド物質の付加；ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して抵抗性にする修飾（例えば２'置換リボヌクレオチドの使用又は糖−リン酸骨格への修飾）；又はデオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡ内の１又はそれ以上のヌクレオチドの置換を含み得る。さらに、ｓｉＲＮＡは、修飾オリゴヌクレオチドに関して上述したようにその安定性を高めるために、特に１又はそれ以上のホスホロチオエート結合を導入することによって、修飾され得る。
ｓｉＲＮＡの１本の鎖又は両方の鎖はまた、３'突出末端を含み得る。ここで使用される、「３'突出末端」は、ＲＮＡ鎖の３'末端から伸長している少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを指す。それ故１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを含む）長、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２〜約４ヌクレオチド長の少なくとも１つの３'突出末端を含む。ｓｉＲＮＡ分子の両方の鎖が３'突出末端を含む実施形態では、突出末端の長さは各々の鎖について同じか又は異なり得る。最も好ましい実施形態では、３'突出末端はｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば本発明のｓｉＲＮＡの各々の鎖は、ジデオキシチミジル酸（「ＴＴ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３'突出末端を含み得る。
ｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、３'突出末端を分解に対して安定化することもできる。１つの実施形態では、突出末端は、アデノシン又はグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含むことによって安定化される。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば２'−デオキシチミジンによる３'突出末端内のウリジンヌクレオチドの置換は耐容され、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を及ぼさない。特に、２'−デオキシチミジン内に２'−ヒドロキシルが存在しないことは、組織培養培地における３'突出末端のヌクレアーゼ耐性を有意に増強する。
ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含み得るか、又は２つの相補的部分が塩基対合し、一本鎖「ヘアピン」領域によって共有結合連結されている１個の分子を含み得る。すなわち、センス領域とアンチセンス領域はリンカー分子によって共有結合で連結され得る。リンカー分子は、ポリヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。理論に縛られるのは望むところではないが、後者の型のｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は「ダイサー」タンパク質（又はその等価物）によって細胞内で切断され、２つの個別の塩基が対合したＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成する。
ここで使用される、「標的ｍＲＮＡ」は、下方調節のための標的であるＲＮＡ分子を指す。当業者であれば、ｃＤＮＡ配列はｍＲＮＡ配列と等価であり、本明細書で同じ目的のために、すなわちｓｉＲＮＡの作製のために使用できることを理解する。
ここで使用される、ヒトＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４に「コグネイト」である遺伝子又はｍＲＮＡは、ヒトＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４に相同である他の哺乳動物種からの遺伝子又はｍＲＮＡである。
ヒトＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、当技術分野で周知の手法を用いて選択的スプライシング形態に関して分析することができる。そのような手法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法及びインサイチューハイブリダイゼーションを含む。
「ＲＮアーゼプロテクション」と呼ばれる手法も、選択的スプライシングを受けたＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡを同定するために使用できる。ＲＮアーゼプロテクションは、合成ＲＮＡへの遺伝子配列の転写を含み、合成ＲＮＡを、他の細胞、例えばＴＰＴＥを発現するように誘導される細胞に由来するＲＮＡにハイブリダイズする。ハイブリダイズしたＲＮＡを、次に、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのミスマッチを認識する酵素と共にインキュベートする。予想断片より小さいことは、選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡの存在を指示する。推定上の選択的にスプライシングされたｍＲＮＡを、当業者に周知の方法によってクローニングし、配列決定することができる。
ＲＴ−ＰＣＲも、選択的スプライシングを受けたＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡを同定するために使用できる。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４を発現することが公知の細胞からのｍＲＮＡを、当業者に周知の方法を用いて、逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換する。ｃＤＮＡのコード配列全体を、次に、３'非翻訳領域に位置する正プライマー及び５'非翻訳領域に位置する逆プライマーを使用したＰＣＲによって増幅する。増幅産物は、例えば増幅産物の大きさを正常にスプライシングされたｍＲＮＡからの予想産物の大きさと比較することによって、例えばアガロースゲル電気泳動によって、選択的スプライシング形態に関して分析することができる。増幅産物の大きさの何らかの変化は選択的スプライシングを指示し得る。
突然変異型ＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４遺伝子から生成されたｍＲＮＡも、選択的スプライシング形態を同定するための上述した手法で容易に同定できる。ここで使用される、「突然変異型」ＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４遺伝子又はｍＲＮＡは、本明細書で示すＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４配列と配列において異なるヒトＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４遺伝子又はｍＲＮＡを含む。それ故、ＴＰＴＥ又はＣＸＣＲ４遺伝子の対立遺伝子形態、及びそれらから生成されるｍＲＮＡは、本発明に関して「突然変異型」とみなされる。
ここで使用される「低下させる」又は「阻害する」は、参照試料（例えばｓｉＲＮＡで処置されていない試料）と比較してレベル、例えばタンパク質又はｍＲＮＡのレベルの好ましくは２０％又はそれ以上、より好ましくは５０％又はそれ以上、最も好ましくは７５％又はそれ以上の全体的低下を生じさせる能力を意味する。ＲＮＡ又はタンパク質発現のこの低下又は阻害は、標的ｍＲＮＡの切断又は分解を通して起こり得る。タンパク質発現又は核酸発現に関するアッセイは当技術分野において公知であり、例えばタンパク質発現についてはＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、ＲＮＡについてはノーザンブロット法又はＲＮアーゼプロテクションアッセイを含む。
ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現は、最初の転写ヌクレオチドがプリンであるとき唯一有効であると考えられているので、ｓｉＲＮＡを、標的する部位を変化させずにｐｏｌ ＩＩＩ発現ベクターから発現させることができる。
本発明に従ったｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）のいずれかにおいて一続きの約１９〜２５個の連続ヌクレオチドを標的することができる。ｓｉＲＮＡについての標的配列を選択するための手法は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００２年１０月１１日に修正された、Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ"に述べられている。"Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ"は、ワールドワイドウエブ上のＤｒ．Ｔｈｏｍａｓ Ｔｕｓｃｈｌ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ＲＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡによって維持されているウエブサイトで入手可能であり、ｔｈｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウエブサイトにアクセスし、「ｓｉＲＮＡ」のキーワードで検索することによって見出すことができる。それ故、本発明のｓｉＲＮＡセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ内の連続する一続きの約１９〜約２５ヌクレオチドと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
一般に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、好ましくは開始コドンから５０〜１００ヌクレオチド下流（すなわち３'側方向）の、標的ｍＲＮＡに対応する所与のｃＤＮＡ配列から選択できる。標的配列は、しかしながら、５'又は３'非翻訳領域、又は開始コドンの近くの領域に位置し得る。例えばＴＰＴＥ ｃＤＮＡ配列内の適切な標的配列は、以下の群の標的配列から選択される。
（ｉ）ＴＣＧＧＴＡＣＴＴＧＡＴＡＡＣＡＴＴＡＣＡ（配列番号１５）
（ｉｉ）ＣＡＧＡＣＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＣＴＡＧＣＡ（配列番号１８）
（ｉｉｉ）ＣＴＧＡＡＡＴＡＴＧＴＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡ（配列番号２１）
（ｉｖ）ＣＡＧＡＴＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＧＡＣＴＡＡ（配列番号２４）
（ｖ）ＡＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＡＴＧＴＴＣＡＴＡＴ（配列番号２７）
（ｖｉ）ＡＡＴＧＡＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＧＴ（配列番号３０）
（ｖｉｉ）ＡＡＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＡＧＧＣＧＧＧＴＴ（配列番号３３）
配列（ｉ）を標的し、各々の鎖に３'突出末端を有する（突出末端は太字で示されている）好ましいｓｉＲＮＡは、
ｇｇｕａｃｕｕｇａｕａａｃａｕｕａｃａＴＴ
ＡＧｃｃａｕｇａａｃｕａｕｕｇｕａａｕｇｕ
である。
配列（ｉｉ）を標的し、各々の鎖に３'突出末端を有する（突出末端は太字で示されている）好ましいｓｉＲＮＡは、
ｇａｃｕｕｇｕｇｕｕａｕｕｃｕａｇｃａＴＴ
ＧＴｃｕｇａａｃａｃａａｕａａｇａｕｃｇｕ
である。
配列（ｉｉｉ）を標的し、各々の鎖に３'突出末端を有する（突出末端は太字で示されている）好ましいｓｉＲＮＡは、
ｇａａａｕａｕｇｕｕｃａａｃｕｇｃａａＴＴ
ＧＡｃｕｕｕａｕａｃａａｇｕｕｇａｃｇｕｕ
である。
配列（ｉｖ）を標的し、各々の鎖に３'突出末端を有する（突出末端は太字で示されている）好ましいｓｉＲＮＡは、
ｇａｕｕｇｇｃａａｃｃａａｇａｃｕａａＴＴ
ＧＴｃｕａａｃｃｇｕｕｇｇｕｕｃｕｇａｕｕ
である。
配列（ｖ）を標的し、各々の鎖に３'突出末端を有する（突出末端は太字で示されている）好ましいｓｉＲＮＡは、
ｃｃｃｕｇｃｃａｃａｕｇｕｕｃａｕａｕＴＴ
ＴＴｇｇｇａｃｇｇｕｇｕａｃａａｇｕａｕａ
である。
配列（ｖｉ）を標的し、各々の鎖に３'突出末端を有する（突出末端は太字で示されている）好ましいｓｉＲＮＡは、
ｕｇａｃａｇｕｃｃａｃａｇａｃａａｇｕＴＴ
ＴＴａｃｕｇｕｃａｇｇｕｇｕｃｕｇｕｕｃａ
である。
配列（ｖｉｉ）を標的し、各々の鎖に３'突出末端を有する（突出末端は太字で示されている）好ましいｓｉＲＮＡは、
ｇｃｕｇａｕａａｇａａｇｇｃｇｇｇｕｕＴＴ
ＴＴｃｇａｃｕａｕｕｃｕｕｃｃｇｃｃｃａａ
である。
上記リストにおいて、核酸配列内のすべてのデオキシリボヌクレオチドは大文字で表わされており（例えばデオキシチミジンは「Ｔ」である）、核酸配列内のリボヌクレオチドは小文字で表わされている（例えばウリジンは「ｕ」である）。
本明細書で示す標的配列はヒトＴＰＴＥ ｃＤＮＡを参照したものであり、それ故これらの配列が「Ｔ」で表わされるデオキシチミジンを含むことは了解される。当業者であれば、ＴＰＴＥ ｍＲＮＡの実際の標的配列では、デオキシチミジンがウリジン（「ｕ」）で置換されることを理解する。同様に、本発明のｓｉＲＮＡ内に含まれる標的配列も、デオキシチミジンの代わりにウリジンを含む。
ｓｉＲＮＡは当業者に公知の多くの手法を用いて入手できる。例えばｓｉＲＮＡは化学合成することができ、又は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号に述べられているショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）インビトロ系のような当技術分野で公知の方法を用いて組換え生産することができる。
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイト及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学合成される。ｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として又は２つの相補的領域を有する１個のＲＮＡ分子として合成され得る。
あるいは、ｓｉＲＮＡはまた、何らかの適切なプロモーターを使用して組換え環状又は直鎖状ＤＮＡプラスミドから発現され得る。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現するための適切なプロモーターは、例えばＵ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターを含む。
他の適切なプロモーターの選択は当業者の技術範囲内である。本発明の組換えプラスミドはまた、特定組織又は特定細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導可能な又は調節可能なプロモーターを含み得る。
組換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、培養細胞発現系から標準手法によって単離され得るか、又は細胞内で発現され得る。インビボでｓｉＲＮＡを細胞に送達するための組換えプラスミドの使用は、以下でより詳細に論じる。ｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として又は２つの相補的領域を有する１個のＲＮＡ分子として組換えプラスミドから発現され得る。
ｓｉＲＮＡを発現するのに適したプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列をプラスミドに挿入するための方法、及び組換えプラスミドを対象細胞に送達する方法は、当業者の技術範囲内である。
ｓｉＲＮＡはまた、インビボで組換えウイルスベクターから細胞内で発現され得る。組換えウイルスベクターは、ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ配列を発現するための何らかの適切なプロモーターを含む。組換えウイルスベクターはまた、特定組織又は特定細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導可能な又は調節可能なプロモーターを含み得る。インビボでｓｉＲＮＡを細胞に送達するための組換えウイルスベクターの使用は、以下でより詳細に論じる。ｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として又は２つの相補的領域を有する１個のＲＮＡ分子として組換えウイルスベクターから発現され得る。
本発明によれば、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって共有結合的に連結された２又はそれ以上、好ましくは３又はそれ以上、好ましくは４又はそれ以上、好ましくは６又はそれ以上、好ましくは８又はそれ以上、好ましくは１０又はそれ以上、好ましくは１３又はそれ以上、好ましくは１６又はそれ以上、好ましくは２０又はそれ以上、及び好ましくは８、１０、２０、３０、４０又は５０まで、特に１００までのアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは１００より多くのアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」と「タンパク質」という用語は同義語であり、本出願では交換可能に使用される。
好ましくは、本発明に従って述べるタンパク質とペプチドは単離されている。「単離タンパク質」又は「単離ペプチド」という用語は、タンパク質又はペプチドがその天然環境から分離されていることを意味する。単離タンパク質又はペプチドは、基本的に精製された状態であり得る。「基本的に精製された」という用語は、タンパク質又はペプチドが、天然に又はインビボで結合している他の物質を基本的に含まないことを意味する。
そのようなタンパク質及びペプチドは、例えば抗体を作製するときに及び免疫学的アッセイ又は診断アッセイにおいて使用し得る。本発明に従って述べるタンパク質及びペプチドは、組織又は細胞ホモジネートのような生物学的試料から単離され得、また、多種多様な原核生物又は真核生物発現系において組換え発現され得る。
本発明の目的に関して、タンパク質又はペプチドの「誘導体」又はアミノ酸配列の「誘導体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体及び／又はアミノ酸置換変異体を含む。
アミノ酸挿入変異体は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合、及びまた特定アミノ酸配列内の単一アミノ酸若しくは２又はそれ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合は、１又はそれ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列内の特定部位に挿入されるが、生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１又はそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。
アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、もう１つ別の残基がその位置に挿入されることを特徴とする。修飾が、相同なタンパク質又はペプチドの間で保存されないアミノ酸配列内の位置であること及び／又はアミノ酸が、疎水性、親水性、電気陰性度、側鎖の容積等のような類似の性質を有する他のアミノ酸で置換されること（保存的置換）が好ましい。保存的置換は、例えば１個のアミノ酸と、置換されるアミノ酸と同じ群の中の以下に列挙されるもう１つ別のアミノ酸との交換に関する：
１．低分子脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）
２．負の電荷を有する残基及びそれらのアミド：Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．正の電荷を有する残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．高分子脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）
５．高分子芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
タンパク質構造内の特定部分であるため、３個の残基を括弧内に示している。Ｇｌｙは側鎖を持たない唯一の残基であり、それ故鎖に柔軟性を与える。Ｐｒｏは、鎖を大きく制限する独特の形状を有する。Ｃｙｓはジスルフィド結合を形成できる。
好ましくは、本明細書で述べる特定アミノ酸配列と前記特定アミノ酸配列の誘導体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。類似性又は同一性の程度は、好ましくは少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００又は５００アミノ酸の領域に関して与えられる。好ましい実施形態では、類似性又は同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長に関して与えられる。
上述したアミノ酸変異体は、例えば固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４）及び類似の方法又は組換えＤＮＡ操作のような、公知のペプチド合成手法によって容易に調製され得る。置換、挿入又は欠失を有するタンパク質及びペプチドを調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）の中で詳細に述べられている。
本発明によれば、タンパク質及びペプチドの「誘導体」はまた、炭水化物、脂質及び／又はタンパク質又はペプチドのような、前記タンパク質又はペプチドに関連する何らかの分子の単一又は複数の置換、欠失及び／又は付加を含む。「誘導体」という用語はまた、アミノ酸成分だけでなく糖及びリン酸構造のような非アミノ酸成分も含有する、前記タンパク質及びペプチドのすべての機能的な化学的等価物にまで及び、またエステル、チオエーテル及びジスルフィド結合のような結合を含有する物質にまで及ぶ。
本発明によれば、タンパク質又はペプチドの部分又はフラグメントは、好ましくはそれが由来するタンパク質又はペプチドの機能的性質を有する。そのような機能的性質は、抗体との相互作用、及び他のペプチド又はタンパク質との相互作用を含む。特定の性質は、ＭＨＣ分子と複合体を形成し、適宜に、好ましくは細胞傷害性細胞又はＴヘルパー細胞を刺激することによって、免疫応答を生じる能力である。タンパク質又はペプチドの部分又はフラグメントは、好ましくはタンパク質又はペプチドの少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、及び好ましくは８まで、特に１０まで、１２まで、１５まで、２０まで、３０まで又は５０までの連続アミノ酸の配列を含む。
タンパク質又はペプチドをコードする核酸の部分又はフラグメントは、好ましくは、上記で定義されるような、少なくともタンパク質又はペプチド及び／又は前記タンパク質又はペプチドの部分又はフラグメントをコードする、核酸の部分に関する。タンパク質又はペプチドをコードする核酸の部分又はフラグメントは、好ましくはオープンリーディングフレームに対応する核酸の部分である。
標的タンパク質に特異的に結合する特異的抗体を含む抗血清は、様々な標準工程によって調製され得る。例えば"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ"ｂｙ Ｐｈｉｌｉｐ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｄｅａｎ ＩＳＢＮ ０−１９−９６３７２２−９；"Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"ｂｙ Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２及び"Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ"ｂｙ Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ＩＳＢＮ ０８７９６９５４４７参照。それにより、複合体膜タンパク質をそれらの天然形態で認識するアフィン（ａｆｆｉｎｅ）及び特異的抗体を作製することも可能である（Ａｚｏｒｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２９：３５−４８，１９９９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８９９−１９０４，１９８９；Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３４：１０７−１１６，２０００）。これは、治療的に使用される予定の抗体の調製のため及び多くの診断適用のために特に適切である。これに関して、標的分子を生理的に折りたたまれた形態で発現する全長タンパク質、細胞外部分配列並びに標的分子を発現する細胞で免疫することが可能である。
モノクローナル抗体は、伝統的にハイブリドーマ技術を用いて調製される（技術的詳細については："Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ"ｂｙ Ｐｈｉｌｉｐ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｄｅａｎ ＩＳＢＮ ０−１９−９６３７２２−９；"Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"ｂｙ Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２；"Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ"ｂｙ Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ＩＳＢＮ：０８７９６９５４４７参照）。
抗体分子の小さな部分であるパラトープだけが、抗体のそのエピトープへの結合に関与することは公知である（Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６），Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ参照）。ｐＦｃ'及びＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ'領域が酵素的に除去された又はｐＦｃ'領域なしで生成された、Ｆ（ａｂ'）２フラグメントと称される抗体は、完全抗体の両方の抗原結合部位を担持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に除去された又は前記Ｆｃ領域なしで生成された、Ｆａｂフラグメントと称される抗体は、無傷抗体分子の一方の抗原結合部位を担持する。さらに、Ｆａｂフラグメントは、抗体の共有結合軽鎖及びＦｄと称される前記抗体の重鎖の一部からなる。Ｆｄフラグメントは抗体特異性の主要決定基であり（１つのＦｄフラグメントは、抗体の特異性を変化させずに１０までの異なる軽鎖と結合できる）、Ｆｄフラグメントは、単離されたとき、エピトープに結合する能力を保持する。
抗体の抗原結合部分内に位置するのは、抗原エピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）及びパラトープの三次構造を保持するフレームワーク領域（ＦＲ）である。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖のＦｄフラグメント及び軽鎖の両方が、各々の場合に３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によって分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）を含む。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、さらに一層特定すると重鎖のＣＤＲ３領域は、かなりの程度まで抗体特異性の責任を担う。
哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域が、もとの抗体のエピトープに対する特異性を保持しながら、同じか又は異なる特異性を有する抗体の類似領域によって置換され得ることは公知である。これは、機能的抗体を生産するために、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ'領域に共有結合連結されている「ヒト化」抗体の開発を可能にした。
もう１つの例として、国際公開広報第ＷＯ９２／０４３８１号は、マウスＦＲ領域の少なくとも一部がヒト起源のＦＲ領域で置換されたヒト化マウスＲＳＶ抗体の生産と使用を述べている。抗原結合能力を有する無傷抗体のフラグメントを含む、この種の抗体は、しばしば「キメラ」抗体と称される。
本発明によれば、「抗体」という用語はまた、抗体のＦ（ａｂ'）２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄフラグメント、Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト又は非ヒト配列で置換されているキメラ抗体、ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト又は非ヒト配列で置換されているキメラＦ（ａｂ'）２フラグメント抗体、ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒト又は非ヒト配列で置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体、ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が相同なヒト又は非ヒト配列で置換されているキメラＦｄフラグメント抗体を包含する。「抗体」という用語はまた、「一本鎖」抗体を含む。
抗体はまた、特定タンパク質又はペプチドを発現する細胞及び組織を示すために特異的診断物質に結合され得る。
診断物質は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）１番目又は２番目の標識によって提供される検出可能なシグナルを修飾するように２番目の標識と相互作用する、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状又は他の物理的パラメータによって、運動性、例えば電気泳動移動度に影響を及ぼす；又は（ｉｖ）捕捉部分、例えば親和性、抗体／抗原又はイオン錯体形成を提供する、ように機能する何らかの標識を含む。標識として適切であるのは、蛍光標識、発光標識、発色団標識、放射性同位体標識、同位体標識、好ましくは安定な同位体標識、同重体標識（ｉｓｏｂａｒｉｃ ｌａｂｅｌｓ）、酵素標識、粒子標識、特に金属粒子標識、磁気粒子標識、ポリマー粒子標識、ビオチンのような有機小分子、受容体のリガンド、又は細胞接着タンパク質又はレクチンのような結合分子、結合物質の使用によって検出され得る核酸及び／又はアミノ酸残基を含む標識配列等のような構造である。診断物質は、非限定的に、硫酸バリウム、イオセタム酸、イオパノ酸、イポダートカルシウム、ナトリウムジアトリゾエート、メグルミンジアトリゾエート、メトリザミド、チロパノ酸ナトリウム、及びフッ素−１８及び炭素−１１のような陽電子放出核種、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１及びインジウム−１１１のようなガンマ放射体、フッ素及びガドリニウムのような核磁気共鳴のための核種を含む放射性診断物質を含む。
抗体はまた、特定治療物質に結合され得る。
本発明によれば、「治療物質」という用語は、治療効果を及ぼし得る何らかの分子を意味する。本発明によれば、治療物質は、好ましくは疾患細胞へと選択的に誘導され、抗癌剤、放射性ヨウ素標識化合物、毒素、細胞増殖抑制性又は細胞溶解性薬剤等を含む。抗癌剤は、例えばアミノグルテチミド、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロン−α、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトタン、塩酸プロカルバジン、チオグアニン、硫酸ビンブラスチン及び硫酸ビンクリスチンを含む。他の抗癌剤は、例えばＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．， 特にＣｈａｐｔｅｒ ５２（Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ａｎｄ Ｂｒｕｃｅ Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）に述べられている。毒素は、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素又はシュードモナス外毒素のようなタンパク質であり得る。毒素残基はまた、コバルト−６０のような高エネルギー放出放射性核種であり得る。
「主要組織適合遺伝子複合体」又は「ＭＨＣ」という用語は、すべての脊椎動物において存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質又は分子は、ペプチドに結合して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識のためにそれらを提示することにより、正常免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞の間のシグナル伝達に関与する。ＭＨＣ分子は、細胞内プロセシング画分内のペプチドに結合し、これらのペプチドをＴ細胞による認識のために抗原提示細胞の表面に提示する。ＨＬＡとも称されるヒトＭＨＣ領域は、第６番染色体上に位置し、クラスＩ及びクラスＩＩ領域を含む。本発明のすべての態様の１つの好ましい実施形態では、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。
「患者」又は「被験者」という用語は、本発明によれば、ヒト、非ヒト霊長動物又は別の動物、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコのような哺乳動物又はマウス及びラットのようなげっ歯動物を意味する。特に好ましい実施形態では、患者はヒトである。
「異常発現」は、本発明によれば、健常個体における状態と比較して、発現が変化している、好ましくは上昇していることを意味する。
本発明によれば、「上昇している」又は「上昇した量」という用語は、好ましくは少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％又は少なくとも１００％の上昇を指す。物質の量はまた、それが試験試料では検出可能であるが参照試料においては存在しない又は検出不能である場合も、参照試料と比較して生物学的試料のような試験試料において上昇している。
本発明によれば、「疾患」という用語は、特に癌を含む、何らかの病的状態を指し、本発明に従った「癌」という用語は、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸癌、肝癌、結腸癌、胃癌、腸管癌、頭頸部癌、消化器癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮の癌、卵巣癌及び肺癌及びそれらの転移を含む。その例は、肺癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、腎細胞癌腫、子宮頸癌腫、又は上述した癌の種類又は腫瘍の転移である。本発明に従った癌という用語はまた、癌の転移を含む。
「腫瘍」とは、急速な制御されない細胞増殖によって成長し、新たな増殖を開始させた刺激が停止した後も増殖し続ける異常な細胞の群又は組織を意味する。腫瘍は、構造機構及び正常組織との機能調整の部分的又は完全な欠如を示し、通常、良性又は悪性であり得る明確な組織塊を形成する。
「転移」とは、そのもとの部位から身体の別の部分への癌細胞の広がりを意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔及び脈管に入るための内皮基底膜の貫入、及び次に、血液によって輸送された後、標的器官に浸潤すること、に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移はしばしば原発腫瘍の除去後にも起こり、これは、腫瘍細胞又は成分は残存し、転移の潜在的可能性を発現し得るからである。１つの実施形態では、本発明に従った「転移」という用語は、原発腫瘍及び局部リンパ節系から離れた転移に関連する「遠隔転移」に関する。
「再発」という用語は、患者が寛解を享受した後、例えば腫瘍切除、化学療法及び／又は放射線治療後に、疾患の徴候及び症状がぶり返すことに関する。特に、「再発」という用語は、疾患のない期間後の癌の再出現に関する。例えば治療後、癌を有する患者は、腫瘍の徴候又は症状を伴わない寛解状態に入り、しばらくの間寛解のままであったが、その後再発し、癌のために再び治療を受けなければならなくなる。
本発明によれば、生物学的試料は、体液を含む組織試料及び／又は細胞試料であり得、従来の方法で、例えばパンチ生検を含む組織生検によって、及び血液、気管支吸引物、痰、尿、糞便又は他の体液を採取することによって入手し得る。本発明によれば、「生物学的試料」という用語はまた、生物学的試料の分画を包含する。
「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴヘルパー細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞を包含する。
本発明に従って述べる医薬組成物及び治療方法はまた、本明細書で述べる疾患を予防するための免疫又はワクチン接種に使用され得る。
本方法では、核酸は、送達試薬と共に裸の核酸として又は核酸を発現し得る組換えプラスミド又はウイルスベクターとして被験者に投与され得る。本発明はまた、標的制御リポソームを使用することによってインビボで核酸を投与することを提供する。
例えばアデノウイルス（ＡＶ）；アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えばレンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクターが使用できる。ウイルスベクターの親和性は、適宜に、他のウイルスからのエンベロープタンパク質又は他の表面抗原でベクターを偽型化することによって、又は異なるウイルスキャプシドタンパク質に置き換えることによって修飾できる。
リポソームは、腫瘍組織のような特定組織への核酸の送達を助けることができ、また核酸の血中半減期を上昇させ得る。本発明における使用に適するリポソームは、一般に中性又は負に荷電したリン脂質及びコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般に所望リポソームの大きさ及び血流中でのリポソームの半減期などの因子を考慮して導かれる。例えばその開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；及び米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号及び同第５，０１９，３６９号に述べられているような、リポソームを調製するための様々な方法が公知である。
特定実施形態では、核酸を特定細胞に差し向けることが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために使用される担体（例えばレトロウイルス又はリポソーム）は、結合標的制御分子を有し得る。例えば標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞の受容体についてのリガンドのような分子を核酸担体に組み込み得る又は結合し得る。好ましい抗体は、腫瘍細胞に関連した抗原に選択的に結合する抗体を含む。リポソームによる核酸の投与を所望する場合は、標的の制御及び／又は取込みを可能にするために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込み得る。そのようなタンパク質は、特定細胞型に特異的なキャプシドタンパク質又はそのフラグメント、インターナライズされるタンパク質に対する抗体、細胞内部位に向かうタンパク質等を含む。
標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解は、ノーザンブロット法又はドットブロット法又は定量的ＲＴ−ＰＣＲのようなｍＲＮＡを、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット法のようなタンパク質を、単離し、定量するための標準手法を用いて標的ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを測定することによって検出できる。
本発明の治療組成物は、医薬適合性を有する製剤中で投与され得る。そのような製剤は、通常、医薬適合性を有する濃度の塩、緩衝物質、防腐剤、担体、アジュバントのような補足的免疫増強物質、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＲＮＡ及び、適宜に、他の治療効果のある化合物を含み得る。
本発明の治療的効果のある化合物は、注射又は点滴を含む何らかの従来経路によって投与され得る。投与は、例えば経口的、静脈内、腹腔内、筋肉内経路、皮下的又は経皮的に実施され得る。
核酸を細胞に送達するための適切な手法は、遺伝子銃、電気穿孔、ナノ粒子、マイクロカプセル化等による、又は非経口的及び経腸的投与経路による被験者への核酸の投与を含む。
適切な経腸的投与経路は、経口的、経直腸的又は鼻内送達を含む。
適切な非経口的投与経路は、血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内点滴、動脈内ボーラス注射、動脈内点滴及び血管系へのカテーテルによる点滴注入）；組織周囲及び組織内投与（例えば腫瘍周囲及び腫瘍内注射）；皮下注射又は皮下注入（浸透圧ポンプなどによる）を含む埋め込み（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）；例えばカテーテル又は他の配置手段（例えば坐薬又は多孔性、無孔性又はゼラチン状物質を含むインプラント）による、疾患領域の部位又は前記部位の付近への直接（例えば局所）適用；及び吸入を含む。
本発明の組成物は有効量で投与される。「有効量」は、単独で又はさらなる投与量と合わせて、所望反応又は所望効果を達成する量を指す。特定疾患又は特定状態の治療の場合には、所望反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を緩慢にすること、特に疾患の進行を妨げる又は逆行させることを含む。疾患又は状態の治療における所望反応はまた、前記疾患又は前記状態の発症の遅延又は発症の予防であり得る。ここで使用される、ｓｉＲＮＡの「有効量」は、好ましくは被験者において標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを介した分解を生じさせるのに十分な量である。
本発明の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理的状態、サイズ及び体重を含む患者の個体別パラメータ、治療期間、（もしあれば）併用療法の種類、具体的な投与経路および同様の因子などの探査因子に依存する。
本発明の組成物は、疾病を治療するために設計された別の治療法と組み合わせて被験者に投与することができる。例えばそれらは、癌を治療するため又は腫瘍転移を予防するために現在用いられている治療方法（例えば放射線治療、化学療法及び手術）と組み合わせて投与できる。腫瘍を治療するために、本発明の組成物は、好ましくは放射線治療と組み合わせて、又はシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン又はタモキシフェンのような化学療法剤と組み合わせて被験者に投与される。
本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望反応又は所望効果を生じさせるための治療効果のある物質の有効量を含有する。
本発明の組成物の投与される用量は、投与の種類、患者の状態、所望投与期間等のような様々なパラメータに依存し得る。患者における反応が初期用量で不十分である場合は、より高用量（又は異なる、より限局された投与経路によってより高い効果が達成される用量）を使用し得る。
本発明の医薬組成物は、一般に医薬適合性の量で及び医薬適合性の組成物中で投与される。「医薬適合性」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない非毒性物質を指す。この種の製剤は、通常、塩、緩衝物質、防腐剤、担体及び、適宜に、他の治療効果のある化合物を含み得る。医薬品に使用される場合、塩は医薬適合性でなければならない。しかし、医薬適合性ではない塩が、医薬適合性の塩を調製するために使用されてもよく、本発明に包含される。この種の薬理的及び医薬適合性の塩は、非限定的に、以下の酸から調製されるものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。医薬適合性の塩はまた、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のような、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩としても調製され得る。
本発明の医薬組成物は、医薬適合性の担体を含有し得る。本発明によれば、「医薬適合性の担体」という用語は、ヒトへの投与に適する、１又はそれ以上の適合性固体又は液体充填剤、希釈剤又は被包物質を指す。「担体」という用語は、適用を容易にするために活性成分が組み合わされた天然又は合成の有機又は無機成分を指す。本発明の医薬組成物の成分は、通常は所望医薬効果を実質的に損なう相互作用が起こらない成分である。
本発明の医薬組成物は、塩の中の酢酸、塩の中のクエン酸、塩の中のホウ酸及び塩の中のリン酸のような適切な緩衝物質を含み得る。
医薬組成物はまた、適宜に、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン及びチメロサールのような適切な防腐剤を含み得る。
医薬組成物は、通常は均一投与形態で提供され、それ自体公知のように調製され得る。本発明の医薬組成物は、例えばカプセル、錠剤、ロゼンジ、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシルの形態、又は乳剤の形態であり得る。
非経口投与に適する組成物は、通常、好ましくは受容者の血液と等張である、活性化合物の滅菌水性又は非水性製剤を含む。適合性担体及び溶媒の例は、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常は滅菌固定油が溶液又は懸濁媒質として使用される。
本発明を以下の図面及び実施例によって詳細に説明するが、それらは例示のためにのみ使用されるものであり、限定を意図されない。図面の説明及び実施例により、同様に本発明に包含されるさらなる実施形態が当業者に理解され得る。
試験材料及び方法
組織及び細胞株
この試験は地域の倫理委員会（"Ｅｔｈｉｋｋｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｄｅｒ Aｒｚｔｅｋａｍｍｅｒ ｄｅｓ Ｌａｎｄｅｓ Ｒｈｅｉｎｌａｎｄ−Ｐｆａｌｚ"）によって承認された。組換えＤＮＡ作業は、正式な許可を得て、Ｒｈｅｉｎｌａｎｄ−Ｐｆａｌｚの州政府の規則に従って実施された。組織は、常套的な診断又は治療手順の間のヒト余剰材料から入手し、使用時まで−８０℃で保存した。異なる記載がない場合、細胞株は商業的供給業者から入手した。脱メチル化試験のために、細胞を２０−３０％の集密度に分け、２μＭ又は１０μＭ ５−アザ−２'−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に７２時間培養した。結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６ＷＴ、ＨＣＴ１１６ＤＮＭＴ１−／−、ＨＣＴ１１６ＤＮＭＴ３ｂ−／−及びＨＣＴ１１６ＤＫＯはＢｅｒｔ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎの好意によって提供された。
ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡの抽出、一本鎖ｃＤＮＡの合成、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは以前に述べられているように実施した（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２，６７５０−６７５５（２００２），Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３（２００４））。ＴＰＴＥについての特異的プライマー対を設計するため、すべての相同体及び偽遺伝子を整列させた。無作為に選択した増幅産物の配列決定によって特異性を確認した。最終的な分析のために、ＴＰＴＥ特異的オリゴヌクレオチド（センス５'−ＴＧＧ ＡＴＧ ＴＣＡ ＣＴＣ ＴＣＡ ＴＣＣ ＴＴＧ−３'；アンチセンス５'−ＣＣＡ ＴＡＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＴＡＴ ＣＴＧ−３'、６３°Ｃアニーリング）を３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲにおいて使用した。リアルタイム定量的発現分析は、ＴＰＴＥ特異的オリゴヌクレオチド（センス５'−ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＣＡ ＡＴＣ ＴＡＴ ＧＣＡ ＧＴＧ−３'；アンチセンス５'−ＣＣＡ ＴＡＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＴＡＴ ＣＴＧ−３'、６３°Ｃアニーリング）を４０サイクルのＰＣＲで使用して３回実施した。１８ｓＲＮＡ（センス５'−ＣＧＡ ＴＧＣ ＴＣＴ ＴＡＧ ＣＴＧ ＡＧＴ ＧＴＣ−３'；アンチセンス５'−ＴＡＡ ＣＣＡ ＧＡＣ ＡＡＡ ＴＣＧ ＣＴＣ ＣＡＣ−３'、６５°Ｃアニーリング）に対して正規化した後、腫瘍試料中のＴＰＴＥ転写産物をΔΔＣＴ法の計算を用いて正常組織と比較して数量化した。
抗血清、免疫化学及びウエスタンブロット法
ＴＰＴＥのＮ末端（アミノ酸１〜５１）に対して惹起したポリクローナル抗血清ｐＡＫ２０９１を、カスタム抗体サービス（ＳｅｑＬａｂ）によって作製した。スライドをクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で１５分間煮沸し、次に室温で１５分間冷却することによる抗原の回収後、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織切片に関して免疫組織化学を実施した。ウエスタンブロット分析のために、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解した細胞から抽出した全タンパク質６０μｇを使用した。抽出物を還元試料緩衝液（Ｒｏｔｈ）に希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、その後ＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ）に電気移動させた。ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ａｂｃａｍ）に対して反応性の抗体を免疫染色するため、ｐＡＫＴ（細胞シグナル伝達）、ＡＫＴ（細胞シグナル伝達）及びβ−アクチン（Ａｂｃａｍ）を使用し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス及びヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｄａｋｏ）を使用した。抗ウサギＥｎｖｉｓｉｏｎ＋ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏ）を製造者の指示に従って使用して、抗ＴＰＴＥ ｐＡＫ２０９１一次抗体の検出を実施した。
真核細胞におけるｅＧＦＰ標識ＴＰＴＥの発現
２つのＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入してＴＰＴＥのオープンリーディングフレームを増幅した（センスプライマー５'−ＧＡＧ ＡＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＡ ＡＴＧ ＡＡＡ ＧＴＣ ＣＴＧ ＡＴＣ ＣＣＡ ＣＴＧ ＡＣＣ Ｔ−３'、アンチセンスプライマー５'−ＧＡＧ ＡＧＡ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＡＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＡＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＣ−３'）。増幅したフラグメントをベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１及びｐＥＧＦＰ−Ｎ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に連結した。ホスファターゼドメインの活性部位に突然変異を担持する変異体ＴＰＴＥＣ３３８Ｓを、ＰＣＲを介した部位指定突然変異誘発によって生成した。
免疫蛍光及び共局在試験
ベクター構築物でのトランスフェクション後、内因性に又は外因性にＴＰＴＥを発現する細胞をスライド上で１２〜２４時間増殖させ、２％パラホルムアルデヒド／０．１％サポニン／ＰＢＳで固定した。ＴＰＴＥについての間接免疫蛍光染色を、ｐＡＫ２０９１ポリクローナルウサギ抗血清及び蛍光標識二次抗ウサギＩｇＧ抗体で実施した。Ｆ−アクチンとＴＰＴＥの共局在を分析するため、透過処理し固定した細胞をローダミン−ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。タンパク質−タンパク質相互作用による膜結合ＰＩＰ２及びＰＩＰ３の視覚化のためのＰＬＣ−δ１及びＡＫＴのｅＧＦＰ標識ＰＨドメインについての発現プラスミドは、それぞれＭａｒｉｏ．Ｊ．Ｒｅｂｅｃｃｈｉ及びＪｕｌｉａｎ Ｄｏｗｎｗａｒｄの好意によって提供された。カバースリップをＳｌｏｗ−Ｆａｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）のスライドに載せ、免疫蛍光顕微鏡検査によって分析した。
ｅＧＦＰ融合タンパク質の免疫精製
ｅＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びプロテアーゼ阻害剤（８μＭロイペプチン、３．３μＭキモスタチン２．９μＭペプスタチンＡ、１ｍＭ ＡＥＢＳＦ塩酸塩）を含む緩衝液に溶解した。溶解産物を４℃で５分間遠心沈殿させた。プレクリアのために、溶解産物をプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に４℃で１時間インキュベートした。プレクリアした溶解産物を抗ｅＧＦＰ抗体（Ｄｅｌｔａ Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に４℃で２時間インキュベートし、次いでプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂと共に４℃で１時間インキュベートして、２分間の遠心分離によって沈殿させた。免疫複合体をＩＰ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、反応緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫ブロット法によって分析した。
インビトロホスファターゼアッセイ
ホスファターゼ活性を測定するため、ＰＴＥＮとＴＰＴＥの融合タンパク質を免疫沈降させ、１１０μＭの水溶性リン酸ホスファチジルイノシトール（Ｅｃｈｅｌｏｎ）を含む反応緩衝液中、３７℃で９０分間インキュベートした。基質から放出されたリン酸塩の量を、マラカイトグリーンアッセイ（Ｅｃｈｅｌｏｎ）を用いて測定した。１５分間の呈色後、試料の吸光度をＴｅｃａｎ Ｓａｆｉｒｅリーダーにて６２０ｎｍで測定した。各々の試料を３回ずつ分析した。
ｓｉＲＮＡ二量体
ｓｉＲＮＡ二量体を共通規則に従って設計し、Ａｍｂｉｏｎより購入した。ＴＰＴＥ ｓｉＲＮＡ二量体（センス５'−ｒ（ＧＧＵ ＡＣＵ ＵＧＡ ＵＡＡ ＣＡＵ ＵＡＣ Ａ）ｄＴｄＴ−３'、アンチセンス５'−ｒ（ＵＧＵ ＡＡＵ ＧＵＵ ＡＵＣ ＡＡＧ ＵＡＣ Ｃ）ｄＧｄＡ−３'）は、ＴＰＴＥ ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド１７２２−１７４２（ＮＭ＿０１３３１５）を標的した。対照として、スクランブルｓｉＲＮＡ二量体（センス５'−ｒ（ＵＡＡ ＣＵＧ ＵＡＵ ＡＡＵ ＣＧＡ ＣＵＡ Ｇ）ｄＴｄＴ−５'、アンチセンス５'−ｒ（ＣＵＡ ＧＵＣ ＧＡＵ ＵＡＵ ＡＣＡ ＧＵＵ Ａ）ｄＧｄＡ−３'）を使用した。ＴＰＴＥサイレンシング試験のために、ＲＮＡｉＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して、細胞を１００ｎｍ ｓｉＲＮＡ二量体でトランスフェクトした。すべての機能的アッセイを、ｓｉＲＮＡ二量体でのトランスフェクションの２４時間後に実施した。すべての結果を、ヌクレオチド２４８７−２５０５を標的する２番目のセットのＴＰＴＥ ｓｉＲＮＡ二量体（センス５'−ｒ（ＧＡＵ ＵＧＧ ＣＡＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＵＡ Ａ）ｄＴｄＴ−３'、アンチセンス５'−ｒ（ＵＡＡ ＧＵＣ ＵＵＧ ＧＵＵ ＧＣＣ ＡＡＵ Ｃ）ｄＴｄＧ−３'）で再現した。ＰＴＥＮサイレンシングのための二量体（５'−ｒ（ＧＧＣ ＧＵＡ ＵＡＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ＡＡＵ Ａ）ｄＴｄＴ−３'、アンチセンス５'−ｒ（ＵＡＵ ＵＧＵ ＵＣＣ ＵＧＵ ＡＵＡ ＣＧＣ Ｃ）ｄＴｄＴ−３'）は、ヌクレオチド１１６１−１１７９（ＮＭ＿０００３１４）を対象とした。
細胞移動
実験の前に無血清培地で１２時間培養した細胞を使用して、８．０μｍ多孔膜を備えるトランスウエルチェンバー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において細胞移動アッセイを実施した。ｓｉＲＮＡ実験のために、上述したようなｓｉＲＮＡ二量体でのトランスフェクションの２４時間後に細胞を無血清条件に移した。無血清培地４００μｌ中の４×１０４細胞をチェンバー上部に加えた。チェンバー下部には、ＦＣＳ、ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）又はＳＤＦ−１α／ＣＸＣＬ１２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを化学誘引物質として添加した培地８００μｌを入れた。２４時間後、膜の底部側に移動した細胞を氷冷メタノール中で固定した；膜を切り出し、顕微鏡のスライド上に置いて、蛍光顕微鏡検査のためにＨｏｅｃｈｓｔ（Ｄａｋｏ）で標本を作製した。５つの無作為な視野内の細胞を（１００×倍率）各々の膜について計数した。すべての実験を３回ずつ実施した。細胞のケモキネシスへの作用を、（ｉ）チェンバーの上部及び下部に化学誘引物質を添加せずに、及び（ｉｉ）チェンバーの上部と下部の両方に化学誘引物質を添加して、同じ実験設定を用いて分析した。
細胞増殖分析
ｓｉＲＮＡ二量体でのトランスフェクションの２４時間後に１×１０４細胞を、様々な濃度のＦＣＳを添加した培地で４８時間培養した。Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で、ＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造者に指示に従って使用して、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの組込みを測定することによって増殖を分析した。
細胞周期分析及びアポトーシス
様々な濃度のＦＣＳを添加した培地で細胞を培養し、４８時間後に採取して、ヨウ化プロピジウムで染色した後、フローサイトメトリーＤＮＡ含量分析に供した。アポトーシス細胞及び細胞周期のＳ／Ｇ２／Ｍ期の細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ−Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて定量した。
インビボでの腫瘍増殖分析及び実験的転移アッセイ
インビボでの腫瘍増殖の分析のために、５×１０６細胞（ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２−ｅＧＦＰ、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２−ＴＰＴＥ−ｅＧＦＰ及びＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２−ＴＰＴＥＣ３３８Ｓ−ｅＧＦＰ）をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの側腹部に皮下注射した（各群につき５匹）。腫瘍をカリパス定規で定期的に測定し、腫瘍容積を計算した（Ｖ＝ａ×ｂ×ｂ／２）。腫瘍細胞溢出の評価のために、ＣＦＳＥ（Ｖｙｂｒａｎｔ ＣＦＤＡ ＳＥ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅｒ Ｋｉｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）で標識した１×１０６細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの尾静脈に注入した（各群につき３匹）。６時間後にマウスを犠死させ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８で標識した肺の凍結切片（２０μＭ）を、蛍光顕微鏡検査によって溢出腫瘍細胞に関して分析した。各肺につき５０の無作為な視野内の腫瘍細胞を計数した。
２×１０６のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の静脈内注射の５週間後に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの肺における腫瘍負荷の定量のためにリアルタイムＰＣＲを使用した（各群につき４匹）。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを抽出し、ヒト第１７番染色体のα−サテライト領域の２２６ｂｐフラグメント（センス５'−ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＡＧ−３'；アンチセンス５'−ＧＡＧ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＣＡ Ｇ−３'）をＤＮＡ １μｇから増幅した。ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞へのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の連続希釈によって作成した標準曲線を参照して腫瘍負荷を定量した。
統計分析
患者の転移率に関する腫瘍内でのＴＰＴＥ及びＣＸＣＲ４発現の統計分析を、ＳＰＳＳソフトウエア（フィッシャーの直接確率検定）を用いて実施した。
ＴＰＴＥはヒト腫瘍において異所性発現される
ＴＰＴＥ ｍＲＮＡ発現を多数の正常及び新生物組織標本セットにおいて検討した。ＴＰＴＥ発現は精巣に限定され、他のすべての正常組織標本では、転写産物の量は高感度ＲＴ−ＰＣＲの検出限界未満である（図１ａ、ｂ）。これに対し、１５５の腫瘍試料のうち５９（３８％）では悪性黒色腫（５０％）、乳癌腫（４７％）及び肺癌腫（５５％）を含む種々の型の癌にわたって、並びに多数の癌細胞株セットにおいて（６２％）、強いＴＰＴＥ発現が検出された（表１）。
Figure 2010505428
試験したすべての細胞株から及び任意に選択した腫瘍由来試料からの増幅産物のクローニング及び配列決定は、それらが第２１番染色体ｐ１１上のＴＰＴＥに由来する転写産物であることを確認した。
ＴＰＴＥのＮ末端（ａａ１〜５１）に対するポリクローナルウサギ抗体（ｐＡＫ２０９１）を使用して発現データをタンパク質レベルで確認した。ＴＰＴＥの予測サイズに一致して、精巣組織、ＲＴ−ＰＣＲにより構成的ＴＰＴＥ発現に関して陽性と分類された多くの腫瘍細胞系、並びにＴＰＴＥ−ｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞において、ウエスタンブロット分析により６５ｋＤａのバンドが検出され、抗体の特異性を確認した（図１ｃ、左側）。ＲＴ−ＰＣＲデータと一致して、正常体組織はウエスタンブロット法においてＴＰＴＥに関して陰性と評価されたが、ＴＰＴＥ ＲＴ−ＰＣＲ陽性癌組織は有意の量のＴＰＴＥタンパク質を含む（図１ｃ、右側）。
精巣組織に関するｐＡＫ２０９１での免疫組織化学は、最近マウスオーソログに関して記述されたインサイチューハイブリダイゼーションデータと一致して、ＩＩ型精母細胞及び前精子細胞における特異的免疫反応性を示した（Ｗｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２１７４５−２１７５３（２００１））（図１ｄ）。肺癌、乳癌及び前立腺癌並びに悪性黒色腫から得た組織標本は、免疫組織化学において腫瘍細胞特異的染色を示した。これに対し、隣接する間質細胞及び非新生物上皮細胞（図１ｄ）並びに患者の対応する正常組織は、反応性ではなかった（図示せず）。ＴＰＴＥが分子腫瘍マーカーとして確立されたので、癌細胞におけるその異所性活性化の原因となる機構を検討した。ＣｐＧリッチプロモーターにおけるＤＮＡメチル化が、体組織における生殖細胞系特異的遺伝子のサブセットのサイレンシングに関する一次機構であることが報告されている。次に、ゲノム脱メチル化は、腫瘍細胞におけるこれらの遺伝子の異常活性化に十分であると思われる（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３（２００４），Ｄｅ Ｓｍｅｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９，７３２７−７３３５（１９９９））。ＴＰＴＥプロモーターの配列解析は、第１エクソンの上流から第１エクソン及びイントロンにわたって伸びる古典的ＣｐＧアイランドを明らかにした。第７番染色体と第２０番染色体上にほぼ同一のプロモーター配列が存在するため、腫瘍細胞におけるＴＰＴＥプロモーターのメチル化状態の直接分析のための遺伝子座特異的重亜硫酸塩配列決定法は適用できなかった。それ故、ＴＰＴＥ発現への包括的メチル化変化の影響を検討した。ＤＮＡメチル化阻害剤、５−アザ−２'−デオキシシチジン（ｄＡＣ）によるいくつかの非発現癌細胞株の処理により、ＴＰＴＥ転写が確実に誘導された（図１ｅ）。ＴＰＴＥ転写のメチル化依存性調節を、野生型ＨＣＴ１１６結腸癌細胞及び破壊されたＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）遺伝子を有する子孫においてさらに評価した。ＨＣＴ１１６ＷＴ細胞並びに、ほぼ正常な又は少しだけ低下した包括的ＤＮＡメチル化を示すことが公知のＤＮＭＴ３ｂ−／−及びＤＮＭＴ１−／−単一ノックアウト変異体（Ｒｈｅｅ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１６，５５２−５５６（２００２））は、ＴＰＴＥを発現しない。これに対し、メチルトランスフェラーゼを欠き、大きく低下した全体的ＤＮＡメチル化を示すＨＣＴ１１６ＤＫＯ細胞は、ＴＰＴＥの堅固な発現を生じた（図１ｅ）。両方のアッセイは、独立して、ＤＮＡメチル化がＴＰＴＥサイレンシングのために必要であること及び腫瘍においてしばしば認められるゲノム脱メチル化（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｍ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１，５４００−５４１３（２００２），Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０１，８９−９２（１９８３））がその活性化のために十分であることを確認した。
ＴＰＴＥは形質膜ＰＩＰ３ホスファターゼである
ＴＰＴＥは、そのホモログであるＰＴＥＮの脂質ホスファターゼ活性のために必須であり、十分であることが示されている、ホスファターゼ並びに脂質結合Ｃ２ドメインを含む（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９９，３２３−３３４（１９９９））。ＰＩＰ３及びＰＩ（３，４）Ｐ２に対して基質特異性を有する脂質ホスファターゼ活性が以前にＴＰＴＥのマウスオーソログに関してインビトロで示されたが（Ｗｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２１７４５−２１７５３（２００１））、ヒト対応物については酵素活性が検出されず（Ｗａｌｋｅｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６０，２７７−２８３（２００１））、ＰＴＥＮがこれまでのところ唯一の公知のヒトＰＩＰ３−ホスファターゼである。後者の試験は細菌起源の組換えタンパク質を使用したので、真核生物によってタンパク質を生産してヒトＴＰＴＥの酵素活性を再評価した。ｅＧＦＰに融合したＴＰＴＥ及びＰＴＥＮのホスファターゼ及びＣ２ドメインをＨＥＫ−２９３細胞において発現させ、抗ｅＧＦＰ抗体結合プロテインＡビーズでの免疫沈降によってタンパク質を精製し、マラカイトグリーンアッセイにおいて使用した。ｅＧＦＰ又は、推定上のホスファターゼ活性のために必須の部位で突然変異したＴＰＴＥ変異体であるＴＰＴＥＣ３３８Ｓ−ｅＧＦＰでトランスフェクトした細胞から得た等モル量の免疫沈降物を、同時精製ホスファターゼによる汚染を排除するための対照として使用した。驚くべきことに、ＴＰＴＥはＰＴＥＮに匹敵し得る割合でＰＩＰ３からリン酸塩を特異的に放出するが、それぞれの対照は放出しないことが認められた（図２ａ）。ヒト癌におけるＴＰＴＥの異常活性化と合わせてこの所見は、ＴＰＴＥが腫瘍細胞におけるホスホイノシチドを介した形質膜シグナル伝達に関与することを示す。
ＴＰＴＥ−ｅＧＦＰでトランスフェクトしたＴＰＴＥ陰性細胞並びにＴＰＴＥを構成的に発現する癌細胞株を抗ＴＰＴＥ抗体で染色し、免疫蛍光顕微鏡検査によって検討した。これまでに記述されているゴルジ装置及び小胞体における局在（Ｗｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２１７４５−２１７５３（２００１））に加えて、ＴＰＴＥの主要部分が形質膜で認められた（図２ｂ、２ｃ）。ＴＰＴＥは、膜ラッフル及び仮足及び糸状仮足を含む膜突起の外側縁で増強されるが、そのような構造の先端では増強されないと思われる（図２ｄ）。形質膜ホスホイノシチドとＴＰＴＥの空間的結びつきを分析するため、それぞれＰＩＰ（４，５）Ｐ２（ＰＩＰ２）又は３'リン酸化リン脂質に選択的に結合する、ＰＬＣ−δ１−ＰＨ（ホスホリパーゼＣ−δ１プレクストリン相同性）（Ｔａｌｌ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０，７４３−７４６（２０００））ドメイン及びＡＫＴ−ＰＨ（Ｗａｔｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．＆ Ｄｏｗｎｗａｒｄ，Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９，４３３−４３６（１９９９））ドメインを使用してプレクストリンドメイン−ｅＧＦＰ融合タンパク質との共局在試験を実施した。注目すべき点として、ＴＰＴＥ ｃＤＮＡとｅＧＦＰ標識ＰＨドメインを共発現する細胞のｐＡＫ２０９１での染色は、ＴＰＴＥとＰＬＣ−δ１−ＰＨ−ｅＧＦＰのほぼ完全な重複を明らかにした（図２ｆ）が、ＡＫＴ−ＰＨ−ｅＧＦＰとの重複を示さず、ＴＰＴＥがＰＩＰ２と共局在することを確認した（図２ｅ）。
膜ＰＩＰ３レベルを間接的に測定することを可能にするトラフィッキングアッセイ（Ｈａｌｅｔ，Ｇ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ９７，５０１−５１８（２００５））は、ＡＫＴ−ＰＨ−ｅＧＦＰとＴＰＴＥ ｃＤＮＡの共トランスフェクションが、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ形質転換によるＰＩ３Ｋ過剰活性化を有する線維芽細胞においてＡＫＴ−ＰＨ−ｅＧＦＰの形質膜からサイトゾルへの完全な再分布を生じさせるが、ＴＰＴＥＣ３３８Ｓ−ｃＤＮＡの共トランスフェクションは再分布を生じさせないことを明らかにし（図２ｆ）、ＴＰＴＥが形質膜ＰＩＰ３レベルを低下させることを証明した。これらの所見全体が、ＴＰＴＥがＰＩＰ３を代謝することを証明し、ＴＰＴＥが腫瘍細胞における形質膜ホスホイノシチドの空間的制御に関与し得ることを暗示した。
ＴＰＴＥ発現をサイレンシングする上でのｓｉＲＮＡの使用
腫瘍関連ホスファターゼＴＰＴＥを内因性発現する乳癌、前立腺癌及び悪性黒色腫細胞株において、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が誘導するＴＰＴＥの遺伝子サイレンシングの作用を分析した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びウエスタンブロット法は、ＴＰＴＥ特異的ｓｉＲＮＡ二量体が、細胞ＰＴＥＮレベルには影響を及ぼさずにＴＰＴＥ転写産物及びタンパク質の堅固なノックダウンを誘導することを明らかにした（図３ａ）。
第一に、Ｓｅｒ４７３リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）のレベルを、細胞ＰＩＰ３シグナル伝達の尺度として定量した。ｓｉＲＮＡを介したＴＰＴＥの下方調節は、試験したすべての腫瘍系統において細胞ｐＡＫＴの実質的上方調節を生じさせ（図３ｂ）、ＴＰＴＥが癌細胞におけるＰＩ３Ｋシグナル伝達を妨げることを確認した。ＴＰＴＥサイレンシングによるｐＡＫＴの上方調節は、ＰＴＥＮを欠くＰＣ−３細胞において最も著明であり、内因性ＴＰＴＥが腫瘍細胞におけるＰＴＥＮ活性の損失を少なくとも部分的に代償し得ることを示唆した。最も重要な点として、ＴＰＴＥサイレンシング後のｐＡＫＴの上方調節は、試験したすべてのＴＰＴＥ陽性腫瘍系統において血清飢餓下でさえも持続的な増殖率（図３ｃ）及びアポトーシスからの保護（図３ｄ）を生じさせる、それぞれの腫瘍細胞の増殖因子依存性低下につながる。
ＴＰＴＥのホスファターゼ活性によって直接媒介される作用を明らかにするため、ＴＰＴＥ又は触媒的に不活性なＴＰＴＥＣ３３８Ｓ変異体のいずれかで安定にトランスフェクトしたＨｅｒ２／ｎｅｕ形質転換線維芽細胞を使用した。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ形質転換線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２）は、高い細胞ＰＩＰ３レベルの増加（図３ｆ）と結びついた構成的なＰＩ３Ｋ過剰活性化から生じる永続的なＡＫＴ活性化を示す（図３ｅ）。結果として、これらの細胞はアポトーシスに対して抵抗性であり、増殖因子飢餓状態の下で増殖を維持する（図３ｈ）。ＴＰＴＥの発現は、細胞ＰＩＰ３を下方調節し（図３ｆ）、ｐＡＫＴレベルを低下させ（図３ｇ）、増殖と生存の自律性をリセットして、厳密に血清依存性の増殖及び増殖因子除去後のＧ０／Ｇ１細胞周期ブロックの迅速な開始を誘導する（図３ｈ）が、突然変異型ＴＰＴＥＣ３３８Ｓではこれらの事象は起こらない。特に、免疫不全マウスでのＴＰＴＥを発現するＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞の増殖は、ホスファターゼ活性を欠く対照と比較して著明に低下したが、まだ腫瘍形成性であった（図３ｇ）。これらの所見は、ＴＰＴＥが、ＰＩＰ３を代謝することによって上流の癌遺伝子誘導性のＰＩ３Ｋ過剰活性化を妨げ、腫瘍形成性を廃することなく腫瘍細胞の増殖及び生存を外部増殖因子依存性にすることを明らかにする。
ＴＰＴＥは腫瘍細胞の走化性を促進する
ＴＰＴＥ特異的ｓｉＲＮＡ二量体は、トランスウエル遊走アッセイ及びケモカインに基づく浸潤アッセイにおいて試験したすべての腫瘍細胞株においてＰＤＧＦ又はＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２勾配への腫瘍細胞遊走を低下させるが、対照二量体は低下させない（図４ａ）。
ｓｉＲＮＡのオフターゲット作用を排除するため、これらの所見を２番目のセットのＴＰＴＥ特異的ｓｉＲＮＡ二量体と対照で確認した。さらに、ＴＰＴＥは細胞遊走へのＨｅｒ−２／ｎｅｕ作用を増強したが、その触媒的に不活性な突然変異体は前記作用を増強しなかった。この癌遺伝子による形質転換のおかげで上昇したＮＩＨ３Ｔ３−ｈｅｒ２細胞の基線遊走率（Ｄｉｔｔｍａｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１６，１８２３−１８２５（２００２））は、ＴＰＴＥの共発現後さらに上昇する（図４ｂ）。そのような二重陽性細胞は最も低い勾配の化学誘引物質に向かってさえも効率的に移動し（図４ｃ）、ＰＩ３Ｋ過剰活性化とＴＰＴＥ発現の組合せがケモカインの感知と効率的な走化性遊走の両方を促進することを示している。これと一致して、ＴＰＴＥの発現は著しい形態学的変化、すなわち丸い細胞形状から仮足及び糸状仮足を有する分極された多型表現型への移行を生じさせるが、ＴＰＴＥＣ３３８Ｓはこれを生じさせない（図４ｄ）。構成的に発現する癌細胞株について示したように（図２ｄ）、ＴＰＴＥはこれらの突起部において強く濃縮され、脂質ホスファターゼが糸状仮足伸長の生成に直接関与することを示唆する。
ＴＰＴＥに関して認められた走化性促進作用は、ＴＰＴＥと同じ触媒的ＰＩＰ３ホスファターゼ活性を示すが、遊走を阻害することが報告された、ＰＴＥＮについての以前のデータ（Ｔａｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０，１６１４−１６１７（１９９８））に照らすと特に意外である。しかし、これらの試験はＰＴＥＮ ｃＤＮＡでトランスフェクトした腫瘍細胞に基づくものであった。これに対し、ＰＴＥＮノックダウンのためにｓｉＲＮＡを使用した最近の報告（Ｌｉ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７，３９９−４０４（２００５），Ｍｅｉｌｉ，Ｒ．，Ｓａｓａｋｉ，Ａ．Ｔ．＆ Ｆｉｒｔｅｌ，Ｒ．Ａ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７，３３４−３３５（２００５））は、ＰＴＥＮが、形質転換ジャーカット細胞におけるＳＤＦ−１を介した走化性のために必須であることを明らかに示した。
特異的ｓｉＲＮＡ二量体によるＰＴＥＮ発現の確実な低下は、試験したすべてのＰＴＥＮ陽性腫瘍細胞株において走化性の著明で選択的な低下をもたらした（図４ｅ）が、ケモキネシスの低下を生じさせなかった。ＰＴＥＮ欠損ＰＣ−３細胞におけるＰＴＥＮ ｓｉＲＮＡの作用の欠如は、認められた走化性遊走への阻害がｓｉＲＮＡのオフターゲット作用によって媒介されることを排除した。重要な点として、両方のホスファターゼの阻害は走化性のほぼ完全な廃止を生じさせた。ｓｉＲＮＡ処置細胞における細胞ＰＩＰ３レベルの分析は、複合ｓｉＲＮＡによるＴＰＴＥとＰＴＥＮの両方の無効化が、単一ｓｉＲＮＡ処置細胞におけるＰＩＰ３レベルの上昇と比較してより著しい細胞ＰＩＰ３の上方調節を生じさせることを明らかにする（図４ｆ）。これは、両方のホスファターゼの阻害が細胞ｐＡＫＴのより強い上昇を生じさせた（図４ｇ）という所見と合わせて、ＴＰＴＥとＰＴＥＮの活性が腫瘍細胞走化性の促進及びＰＩＰ３／ＡＫＴシグナル伝達の低下のために付加的であることを強調する。
ＴＰＴＥは転移拡大を促進する
ＥＧＦ及びＰＤＧＦのような増殖因子受容体又はＣＸＣＲ４及びＣＣＲ７などのケモカイン受容体によって媒介される走化性は、腫瘍の浸潤及び転移を促進する（Ｍｕｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１０，５０−５６（２００１），Ｓｔａｌｌｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２５，３０７−３１１（２００３））。転移におけるＴＰＴＥの影響を検討するため、走化性によって媒介される癌細胞の転移播種のための重要な工程である、腫瘍細胞の溢出（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ａ．Ｆ．，Ｇｒｏｏｍ，Ａ．Ｃ．＆ ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｉ．Ｃ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２，５６３−５７２（２００２））を検討した。ｓｉＲＮＡで処置した発蛍光団標識ＭＤＡ−ＭＢ−２３１又はＭＣＦ−７乳癌細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの尾静脈に注射した。６時間後に動物を犠死させ、肺に溢出した腫瘍細胞の数を全載肺切片において蛍光顕微鏡検査によって定量した。両方の腫瘍細胞株について、ｓｉＲＮＡを介したＴＰＴＥのノックダウンは溢出細胞の数を有意に低下させた（図５ａ）。ヒトマイクロサテライト特異的ＰＣＲによる、転移形成性乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７）又は悪性黒色腫（ＭｅｌＪｕｓｏ）細胞の接種から数週間後のマウスの肺における肉眼で見えない転移性腫瘍病変の定量は、ＴＰＴＥ ｓｉＲＮＡで一過性にトランスフェクトした腫瘍細胞を受容した動物において腫瘍負荷の１００〜１０００倍の低下を明らかにした（図５ｂ）。
独立して、肉眼で見える病原を生じさせる、ヌードマウスでのＭＤＡ−ＭＢ−２３１による実験的転移アッセイは、これらの特筆すべき所見を確認し、転移播種のためのＴＰＴＥの重要な役割を証明した（図５ｃ）。
ＴＰＴＥ及びＣＸＣＲ４は腫瘍転移についてのマーカーである
ＴＰＴＥの強い前遊走及び転移促進作用が腫瘍の転移拡大に関連するかどうかを評価した。このために、十分に特性決定されたコホートからの３４名の乳癌患者から独立して収集された試料（Ａｈｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５９，１３１−１３２（２００２））及び２４の非小細胞肺癌標本をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＴＰＴＥ発現に関して分類した。ＴＰＴＥ発現と腫瘍病期又は分化グレード分類の間で有意な相関はなかった。しかし、ＴＰＴＥ陽性腫瘍は、診断の時点でＴＰＴＥ陰性原発腫瘍（３７％及び０％）よりも有意に局所的なリンパ行性転移（７６％）及び遠隔転移（２１％）を示した（表２ａ）。ＣＸＣＲ４発現も、様々な癌についての転移予測マーカーである。それ故、同じセットの試料をＣＸＣＲ４発現に関して試験した。実際に、ＣＸＣＲ４陽性癌（ｎ＝２３）は、ＣＸＣＲ４陰性癌（３％）と比較して有意に高い割合の遠隔転移（２６％）を示した。重要な点として、ＴＰＴＥ発現とＣＸＣＲ４発現は相関せず、両方の分子は独立した転移予測因子である（図５ｃ）。ＴＰＴＥとＣＸＣＲ４の複合発現を有する癌は極めて高い転移率（６０％）を示すが、ＴＰＴＥ、ＣＸＣＲ４のいずれか又は両方の分子を欠く腫瘍はより一層低い転移の危険度を示し（２％、ｐ＜０．００００５、表２ｃ）、両方の分子の共発現が、癌、特に乳癌及び肺癌、の転移拡大のために重要であることを示唆している。
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Claims (40)

  1. 患者において癌、癌の転移挙動及び／又は癌の再発の存在を診断する、観察する及び／又は予後判定するための方法であって、前記患者から単離された生物学的試料中のＴＰＴＥの発現のレベルを定量的及び／又は定性的に測定すること、及び前記患者から単離された生物学的試料中のＣＸＣＲ４の発現のレベルを定量的及び／又は定性的に測定することを含む方法。
  2. 癌を有していない、癌の危険性がない、癌の転移がない、癌の転移の危険性がない、癌の再発がない及び／又は癌の再発の危険性がない被験者における発現のレベルに比べて上昇しているＴＰＴＥの発現のレベル及びＣＸＣＲ４の発現のレベルが、癌又は癌の潜在的可能性、癌の転移挙動又は癌の転移挙動の潜在的可能性、及び／又は癌の再発又は癌の再発の潜在的可能性についての指標である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＴＰＴＥの発現レベルの定量的及び／又は定性的測定が、患者から単離された生物学的試料において、
    （ｉ）（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６及び７からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、
    （ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
    （ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸
    からなる群より選択される核酸を検出する又は核酸の量を測定すること、及び／又は
    （ｉｉ）（ｉ）の下にある核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体を検出する又はその量を測定すること、及び／又は
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的な抗体を検出する又は抗体の量を測定すること、及び／又は
    （ｉｖ）場合によりＭＨＣ分子との複合体中で、（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的なＴリンパ球を検出する又はＴリンパ球の量を測定すること
    を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ＣＸＣＲ４の発現レベルの定量的及び／又は定性的測定が、患者から単離された生物学的試料において、
    （ｉ）（ａ）配列番号４７及び４８からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、
    （ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
    （ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸
    からなる群より選択される核酸を検出する又は核酸の量を測定すること、及び／又は
    （ｉｉ）（ｉ）の下にある核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体を検出する又はその量を測定すること、及び／又は
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的な抗体を検出する又は抗体の量を測定すること、及び／又は
    （ｉｖ）場合によりＭＨＣ分子との複合体中で、（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的なＴリンパ球を検出する又はＴリンパ球の量を測定すること
    を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記ＴＰＴＥの発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉ）の下での核酸が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含む、及び／又は前記ＴＰＴＥの発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉｉ）の下でのタンパク質又はペプチドが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 前記ＣＸＣＲ４の発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉ）の下での核酸が、配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含む、及び／又は前記ＣＸＣＲ４の発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉｉ）の下でのタンパク質又はペプチドが、配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 前記核酸の検出又は核酸の量の測定が、
    （ｉ）生物学的試料を核酸に特異的に結合する作用物質と接触させること、及び
    （ｉｉ）作用物質と核酸の間の複合体の形成を検出する又は複合体の量を測定すること
    を含む、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記タンパク質又はペプチド若しくはその前記部分又は誘導体の検出又はその量の測定が、
    （ｉ）生物学的試料を、タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的に結合する作用物質と接触させること、及び
    （ｉｉ）作用物質とタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体との間の複合体の形成を検出する又は複合体の量を測定すること
    を含む、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
  9. 前記抗体の検出又は抗体の量の測定が、
    （ｉ）生物学的試料を抗体に特異的に結合する作用物質と接触させること、及び
    （ｉｉ）作用物質と抗体の間の複合体の形成を検出する又は複合体の量を測定すること
    を含む、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
  10. 前記Ｔリンパ球の検出又はＴリンパ球の量の測定が、
    （ｉ）生物学的試料をＴリンパ球に特異的に結合する作用物質と接触させること、及び
    （ｉｉ）作用物質とＴリンパ球の間の複合体の形成を検出する又は複合体の量を測定すること
    を含む、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
  11. 核酸に特異的に結合する作用物質が、前記核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
  12. タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的に結合する作用物質が、前記タンパク質又はペプチド若しくはその前記部分又は誘導体に特異的に結合する抗体である、請求項８に記載の方法。
  13. 抗体に特異的に結合する作用物質が、前記抗体に特異的に結合するタンパク質又はペプチドである、請求項９に記載の方法。
  14. Ｔリンパ球に特異的に結合する作用物質が、Ｔリンパ球がそれに対して特異的であるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体とＭＨＣ分子との間の複合体を提示する細胞である、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記観察が、前記癌、前記癌の転移挙動及び／又は前記癌の再発の存在の退行、経過又は発症を測定することを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. １番目の時点で１番目の試料中の発現レベルを測定し、２番目の時点でさらなる試料中の発現レベルを測定して、２つの試料の比較を行うことを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記患者が、癌、癌の転移及び／又は癌の再発を有する、又は癌の罹患、癌の転移及び／又は癌の再発が疑われる、又は危険性を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記作用物質が検出可能に標識されている、請求項７〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 前記生物学的試料が体液及び／又は体組織を含む、請求項１〜１８のいずれかの記載の方法。
  20. 患者から単離された生物学的試料においてＴＰＴＥの発現のレベルを定量的及び／又は定性的に測定するための手段及びＣＸＣＲ４の発現のレベルを定量的及び／又は定性的に測定するための手段を含むキット。
  21. 患者から単離された生物学的試料において、前記ＴＰＴＥの発現レベルを定量的及び／又は定性的に測定するための手段が、
    （ｉ）（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６及び７からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、
    （ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
    （ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸
    からなる群より選択される核酸を検出する又は核酸の量を測定するための手段、及び／又は
    （ｉｉ）（ｉ）の下にある核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体を検出する又はその量を測定するための手段、及び／又は
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的な抗体を検出する又は抗体の量を測定するための手段、及び／又は
    （ｉｖ）場合によりＭＨＣ分子との複合体中で、（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的なＴリンパ球を検出する又はＴリンパ球の量を測定するための手段
    からなる群より選択される、請求項２０に記載のキット。
  22. 患者から単離された生物学的試料において、前記ＣＸＣＲ４の発現レベルを定量的及び／又は定性的に測定するための手段が、
    （ｉ）（ａ）配列番号４７及び４８からなる群より選択される核酸配列、その部分又は誘導体を含む核酸、
    （ｂ）ストリンジェント条件下で（ａ）の核酸とハイブリダイズする核酸、
    （ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して縮重性がある核酸、及び
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的である核酸
    からなる群より選択される核酸を検出する又は核酸の量を測定するための手段、及び／又は
    （ｉｉ）（ｉ）の下にある核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体を検出する又はその量を測定するための手段、及び／又は
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的な抗体を検出する又は抗体の量を測定するための手段、及び／又は
    （ｉｖ）場合によりＭＨＣ分子との複合体中で、（ｉｉ）の下にあるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的なＴリンパ球を検出する又はＴリンパ球の量を測定するための手段
    からなる群より選択される、請求項２０又は２１に記載のキット。
  23. 前記ＴＰＴＥの発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉ）の下での核酸が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含む、及び／又は前記ＴＰＴＥの発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉｉ）の下でのタンパク質又はペプチドが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３及び１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む、請求項２１又は２２に記載のキット。
  24. 前記ＣＸＣＲ４の発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉ）の下での核酸が、配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドをコードする核酸配列を含む、及び／又は前記ＣＸＣＲ４の発現レベルの定量的及び／又は定性的測定における（ｉｉ）の下でのタンパク質又はペプチドが、配列番号４９及び５０からなる群より選択されるアミノ酸配列、その部分又は誘導体を含む、請求項２２又は２３に記載のキット。
  25. 前記核酸を検出する又は前記核酸の量を測定するための前記手段が、核酸に特異的に結合する作用物質を含む、請求項２１〜２４のいずれかに記載のキット。
  26. 前記タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体を検出する又はその量を測定するための前記手段が、タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的に結合する作用物質を含む、請求項２１〜２５のいずれかに記載のキット。
  27. 前記抗体を検出する又は前記抗体の量を測定するための前記手段が、抗体に特異的に結合する作用物質を含む、請求項２１〜２６のいずれかに記載のキット。
  28. 前記Ｔリンパ球を検出する又は前記Ｔリンパ球の量を測定するための前記手段が、Ｔリンパ球に特異的に結合する作用物質を含む、請求項２１〜２７のいずれかに記載のキット。
  29. 核酸に特異的に結合する作用物質が、前記核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである、請求項２５に記載のキット。
  30. タンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体に特異的に結合する作用物質が、前記タンパク質又はペプチド若しくはその前記部分又は誘導体に特異的に結合する抗体である、請求項２６に記載のキット。
  31. 抗体に特異的に結合する作用物質が、前記抗体に特異的に結合するタンパク質又はペプチドである、請求項２７に記載のキット。
  32. Ｔリンパ球に特異的に結合する作用物質が、Ｔリンパ球がそれに対して特異的であるタンパク質又はペプチド若しくはその部分又は誘導体とＭＨＣ分子との間の複合体を提示する細胞である、請求項２８に記載のキット。
  33. 患者に投与したとき、（ｉ）ＴＰＴＥの発現又は活性を低下させる又は阻害する上で有効である及び／又はＴＰＴＥに結合し、腫瘍破壊又は腫瘍阻害活性を有する作用物質、及び（ｉｉ）ＣＸＣＲ４の発現又は活性を低下させる又は阻害する上で有効である及び／又はＣＸＣＲ４に結合し、腫瘍破壊又は腫瘍阻害活性を有する作用物質を含む医薬組成物。
  34. 作用物質が、ＴＰＴＥ及び／又はＣＸＣＲ４をコードする核酸と選択的にハイブリダイズするアンチセンス核酸である、請求項３３の医薬組成物。
  35. 作用物質がセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖を含むｓｉＲＮＡであり、センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖がＲＮＡ二本鎖を形成し、及びセンスＲＮＡ鎖が、ＴＰＴＥ ｍＲＮＡ内及び／又はＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡ内の約１９〜約２５個の連続ヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の医薬組成物。
  36. 作用物質がＴＰＴＥ及び／又はＣＸＣＲ４に選択的に結合する抗体である、請求項３３に記載の医薬組成物。
  37. （Ｉ）（ｉ）ＴＰＴＥ又はその部分、
    （ｉｉ）ＴＰＴＥ又はその部分をコードする核酸、
    （ｉｉｉ）ＴＰＴＥ又はその部分に結合する抗体、
    （ｉｖ）ＴＰＴＥをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、
    （ｖ）ＴＰＴＥに対するｓｉＲＮＡ、
    （ｖｉ）ＴＰＴＥ又はその部分を発現する宿主細胞、及び
    （ｖｉｉ）ＴＰＴＥ又はその部分とＭＨＣ分子との間の単離複合体
    からなる群より選択される１又はそれ以上の成分、及び
    （ＩＩ）（ｉ）ＣＸＣＲ４又はその部分、
    （ｉｉ）ＣＸＣＲ４又はその部分をコードする核酸、
    （ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４又はその部分に結合する抗体、
    （ｉｖ）ＣＸＣＲ４をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、
    （ｖ）ＣＸＣＲ４に対するｓｉＲＮＡ、
    （ｖｉ）ＣＸＣＲ４又はその部分を発現する宿主細胞、及び
    （ｖｉｉ）ＣＸＣＲ４又はその部分とＭＨＣ分子との間の単離複合体
    からなる群より選択される１又はそれ以上の成分
    を含有する医薬組成物。
  38. 抗体が治療物質に結合している、請求項３６又は３７に記載の医薬組成物。
  39. 請求項３３〜３８のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、癌、癌の転移又は癌の再発を治療する方法。
  40. 癌が、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、黒色腫、結腸腫瘍、胃腫瘍、膵腫瘍、ＥＮＴ腫瘍、腎細胞癌又は子宮頸癌、結腸癌又は乳癌である、請求項３５に記載の方法。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2184273A1 (de) * 2008-11-05 2010-05-12 Bayer CropScience AG Halogen-substituierte Verbindungen als Pestizide
WO2018184768A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Qiagen Gmbh Method for analyzing the expression of one or more biomarker rna molecules
CN114058623B (zh) * 2020-08-06 2023-12-12 中国科学院化学研究所 一种核酸适体识别并结合整合素α3亚基及其相关功能

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005026205A2 (de) * 2003-09-10 2005-03-24 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in tumoren exprimierte genprodukte und deren verwendung
WO2006091112A1 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Genesis Reasearch And Development Corporation Limited Compositions for the delivery of rna interference molecules and methods for their use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
JP5500750B2 (ja) 2000-03-30 2014-05-21 ホワイトヘッド インスチチュート フォアー バイオメディカル リサーチ Ｒｎａ干渉のｒｎａ配列特異的メディエータ

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005026205A2 (de) * 2003-09-10 2005-03-24 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in tumoren exprimierte genprodukte und deren verwendung
WO2006091112A1 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Genesis Reasearch And Development Corporation Limited Compositions for the delivery of rna interference molecules and methods for their use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012056054; Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ．２３８, 200607, ｐｐ．３０-４１ *
JPN6012056055; Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　３ｒｄ．　Ｅｄ． Ｖｏｌ．２, 2001, １０．４７ *
JPN6012056057; Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｅｓｉｇｎ Ｖｏｌ．１０, 2004, ｐｐ．１２４５-１２５９ *

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Publication number Publication date
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US9061007B2 (en) 2015-06-23
AU2007306598A1 (en) 2008-04-17
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NZ576082A (en) 2012-05-25
US20150247206A1 (en) 2015-09-03
EP2069538A1 (en) 2009-06-17
CA2660810A1 (en) 2008-04-17
JP5732195B2 (ja) 2015-06-10
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