CN101522179A - 增强型广谱uv辐射过滤剂及方法 - Google Patents

Abstract

本发明得自这样的发现：通过将传统的UV颜料、有机化学制品或者这二者与NA相结合会产生广谱的UV吸收添加剂，该添加剂比使用它们本身的任何一种组分更加有效。本发明还包括用于制备作为油漆、玻璃纤维、塑料、聚合物、硅氧烷/硅酸盐/反应性硅烷醇、密封剂或其他膜形成涂料或渗透性流体、以及固体制品的UV保护性添加剂的、经NA涂敷的颗粒的方法，以及涂料、密封剂和其它保护剂，还有经涂敷的和/或制品成品本身。

Description

增强型广谱UV辐射过滤剂及方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2006年8月2日提交的美国临时专利申请60/835,139、以及2007年3月16日提交的美国临时专利申请60/918423的优先权。

关于联邦资助的研究或开发的声明

不适用

提供于光盘上的以引用方式并入的材料

不适用

背景技术

技术领域

本发明总体上涉及保护生活有机体的基因材料免受环境危害的含核酸(NA)材料(例如脱氧核糖核酸和核糖核酸(统称为“NA”))。更具体而言，本公开涉及：将NA与具有UV吸收或阻断性能或网络形成性能的其他材料(例如增强型光谱紫外线辐射过滤剂)相结合；将包含NA和UV吸收材料的液体、半固体或固体屏障形式的屏障插入到UV辐射来源与生活有机体之间；通过涂敷、浸渍，或者采用其他方式将包含核酸和UV吸收材料的屏障插入到UV辐射来源与所述的制品之间来保护该制品免于受到UV的损伤；用于将NA与UV吸收或阻断的化学制品、固体颗粒或颜料(特别是金属氧化物)、以及诸如脂肪酸、氨基酸和酵母提取物之类的其他网络形成有机分子相结合，从而产生增强型UV过滤剂添加剂的方法；使用NA涂敷颗粒(特别是金属氧化物和氧化物的纳米颗粒)的方法；产生液体、半固体或固体UV屏障的方法；以及通过使用NA与颗粒(特别是金属氧化物和氧化物的纳米颗粒、已知吸收或阻断UV的化学制品、其他网络形成有机化学制品、或混合物)的组合来涂敷、浸渍或采用其他方法处理的、具有固有的UV过滤或保护性能的制品。

相关技术的说明

金属氧化物颜料(特别是二氧化钛和氧化锌)以物理方式阻断(反射)UV辐射；多种有机化学制品(包括对氨基苯甲酸(PABA)和其酯类、苯甲酮和肉桂酸酯(cinnemate))最显著地吸收UVB范围(290-320nm)内的UV辐射。最近，美国专利6,117,846(以引用方式并入本文)公开了含核酸材料(例如脱氧核糖核酸和核糖核酸、它们的聚合物和衍生物(下文中均包含在内称为核酸或(NA)))特别通过吸收遗传危害性紫外线辐射而成为优异的紫外线辐射过滤剂。Lyles在US 6,890,912中通过公开具有至少10,000个碱基对的极大尺寸的DNA的用途而对有限版本的Li的846专利进行了教导。

以下摘自由申请人著述并公开的、用于医疗设备510k申请的、标题为“Relationship Between Ozone Depletion and Variations andIncreased Skin Cancer”的文章。

臭氧损耗和变化与每年5％增加的皮肤癌有关。这引起了人们对极短波长的紫外线B辐射(UV-B，280-320nm)的关注，所述的紫外线B辐射是造成增加的皮肤癌速率的主要促成因素。这些具有高能量的短波长UV光子具有高亲和性，从而攻击遗传信息载体分子，脱氧核酸(DNA)。这造成了多种类型的DNA分子损伤。这些损伤的最严重的临床结果为皮肤癌。由于吸收所述这些短波长/高能量UV光子的DNA分子的固有亲和性，使得DNA损伤的程度随着UV-B波长的减小而呈对数增加。对于地球上的活体生物形式而言，通过大气臭氧层的过滤性能，之前已经减小了在短波长UV-B条件下进化出保护能力的必要性。

波长小于300nm的UV辐射发生增加的原因可以归结于人为原因和自然原因。但是，应该注意对于任何一种原因而言，其效果是通过增加危险性的短波长UV-B而产生了“环境诱导的致癌物质”。在中纬度和高纬度地区，臭氧损耗明显，并且可能与增加的皮肤癌有关。在中心维度地区，虽然臭氧稍微损耗，但是大部分的科学家认为历史上曾经达到的名义上的5％至10％的损耗水平目前正在回弹。然而，几乎未知且不可预知的是，与由臭氧损耗所导致的臭氧变化相比，在目前的大气状态下，由锋面气旋和火山活动而导致的自然气候的变化可能会造成大得多的臭氧变化。而且，科学家们还想到了严肃的现实，诸如恶劣的核武器爆炸之类的人为事件可能会使自然变化的效果加倍，并且可能导致甚至更大的臭氧变化。

在二十世纪晚期开始的显著的臭氧损耗之前，极少的波长小于300nm的UV-B会到达地球的表面上，并且在290nm范围内的任何辐射都被认为是不合逻辑的。此外，即使采用目前的技术，由于检测器的灵敏性以及低光子通量，使得对在290至280nm范围内的辐射进行的测量是不可靠的，并且因此在此水平上很少有报道。

高能量、低波长的UV-B的作用已经得以证明。同温层臭氧的损耗使得小于300nm的UV(紫外)光增多，并对生物系统产生明显的作用。波长为300nm或更小的光子十分强烈的，科学家们已经证明暴露于这些波长的UVR会使人和其他有机物易于发生诸如突变、癌发生和细胞死亡之类的情况。这些生物结果的发生是由于DNA遭到了损伤。由于吸收这些高能量波长的DNA分子的固有亲和性，使得DNA损伤的程度随着UV-B波长的减小而呈对数增加。这就是为什么产生254nm UV的UV灭菌灯会有效地杀死有机物的原因。一个较少知道的事实是，当DNA损伤曲线在波长低于300nm的条件下呈对数增加时，红斑作用光谱变平并保持恒定，从而区分出DNA损伤及红斑狼疮。

在全世界范围内，UVR是人们在每天的生活中所暴露的最常见的诱变剂。UVR或者通过干扰遗传编码系统而使基因的DNA发生变化，或者直接造成染色体损伤，并且UVR抑制了我们天然的DNA修复机制的功能。目前，在所有UV诱导的损伤形式中，对人类而言最迫切的问题是UV造成的皮肤细胞中的DNA损伤。明显地，DNA损伤是突变、癌发生和皮肤老化的病理基础。

用于300nm和更长波长的包含体系是可以利用的。防晒系数(SPF)评定用于对由商业遮光产品提供的相对保护程度进行定量，其是以红斑标准为基础的，所述的红斑标准是一种生物形式和形态的标准，其未对由UVR(特别是300nm以下的UVR光谱部分)导致的DNA损伤提供保护的能力进行判断。目前市售的遮光剂为300nm及300nm以上导致的红斑狼疮提供了保护。

还不具有目前可利用的、可在低于300nm的较高能量UV波长下提供保护的实际且广泛的保护性辅助设备或医疗设备，其中在所述的低于300nm的较高能量UV波长下，非常少的剂量就可以产生与较大剂量的大于300nm波长的UV相同的细胞程序性死亡或突变效应。附加文件“Results of Combining Nucleic Acids with Marine CollagenFibers to Produce a Composite Ultraviolet Filter”详细描述了所建议的医疗设备，其可以保护皮肤免受小波长的UV-B的作用，还保护皮肤免受UV-C波长的作用，而这种UV-C可能会由UV灯或在高纬度下的暴露而遭遇到。

非常有利的是提供可以选择性并特异性地阻断诱导DNA损伤的UV辐射的天然基因UV辐射过滤剂。本文中提出的医疗设备是基于这样的理念，其中将经修饰的核酸用于选择性地过滤可以对植物、动物和人类产生危害的核酸损伤UVR。已经针对新的标准(称为基因保护系数或GPF)进行了测试和测定。

发明概述

将传统的UV颜料、有机化学制品或这二者与NA相结合，产生广谱的UV吸收添加剂，该添加剂比使用它们本身的任何一种组分更加有效。NA链似乎沿着该链形成了以规则的间隔连接某种颗粒和化学制品的网络。由于有机NA网络是软质的，所以NA添加剂复合物容易变平滑，从而形成其中其他添加剂沿着链均匀分散的均匀的膜，与NA或颗粒、或者UV吸收化学制品简单地分散在液体、悬浮物或凝胶中形成的膜相比，所述的均匀的膜更高效地吸收UV辐射。此外，据信，通过将NA、颗粒、UV吸收化学制品或混合物与诸如酵母提取物、氨基酸或脂肪酸之类的其他网络形成有机分子相结合可得到相似的效果。记录并呈现在穿越由UVA至UVC整个范围的各种频率下的UV吸收效率。

本发明得自这样的发现：通过将传统的UV颜料、有机化学制品或者这二者与NA相结合会产生广谱的UV吸收添加剂，该添加剂比使用它们本身的任何一种组分更加有效。本发明包括了用于制备作为油漆、玻璃纤维、塑料、聚合物、硅氧烷/硅酸盐/反应性硅烷醇、密封剂或其他膜形成涂料或渗透性流体、以及固体制品的UV保护性添加剂的、经NA涂敷的颗粒的方法，以及涂料、密封剂和其它保护剂，还有经涂敷的和/或制品成品本身。

实施例1

示例性的实施方案包括将NA和氧化锌颗粒(优选为经NA涂敷的纳米颗粒)加入到包含网络形成胶原“纤维”(由Englehard公司出售，产品名为MICROPATCH)的其他惰性乳剂中。可以局部地施加所得的混合物，从而在人或动物的皮肤与UV辐射的天然或人工来源之间插入UV吸收/阻断屏障。可以对NA涂敷的颗粒的量、该颗粒的尺寸以及其他UV吸收化学制品的加入情况进行调节，从而过滤由VUA至UVC的生物学显著的UV辐射。可以对MICROPATCH添加剂、其他网络形成有机化学制品和其他惰性组分的水平进行调节，从而赋予针对水分的不同水平的抗性和寿命。由于NA吸收了UV、然后以热的形式释放出吸收的能量而没有被破坏，所以从理论上而言对使用者(wearer)会提供UV保护直到NA被洗掉或擦掉为止。

其他实施例

本发明所包括的经NA涂敷的纳米颗粒的另一优点是能够使所述的颗粒悬浮于粘性低的流体中。所包括的经NA涂敷的纳米颗粒的另一优点是能够产生澄清的透明或半透明的屏障霜剂、乳剂或涂料。颗粒的种类以及优选的浓度范围包括(但不限于)：1-20％的氧化锌、1-20％的二氧化钛、氧化铁、氧化锆和/或氧化铈。

使用和制备方法

用于制备流体、洗剂、乳剂、霜剂、经涂敷的塑料和聚合物、以及经涂敷的纤维和织物的非限定性方法在美国专利6,117,846中有所公开。就制备其中NA与颗粒、UV吸收化学制品、网络形成分子或混合物相结合的流体、凝胶、乳剂和经涂敷的固体材料而言，类似的方法可用于本发明中。包含NA或者使用NA涂敷的示例性制品以及它们的应用在美国专利6,117,846中有所公开，并适用于本发明。

本发明包括用于制备作为油漆、玻璃纤维、塑料、聚合物、硅氧烷/硅酸盐/反应性硅烷醇、密封剂或其他膜形成涂料或渗透性流体、以及固体制品中的UV保护性添加剂的、经NA涂敷的颗粒的非限定性方法，以及涂料、密封剂和其他保护剂还有经涂敷的和/或制品成品本身。例如，优选的实施方案包括加入到硅烷混合物中的经NA涂敷的氧化锌纳米颗粒，其中所述的硅烷混合物随后与其他添加剂一起水解，从而形成硅烷醇溶胶，该硅烷醇溶胶可以作为涂料施加，从而形成减少对经涂敷制品的UV损伤的澄清的薄涂层。可以将类似的涂料施加到光学透镜、玻璃或UV灯泡上，从而在涂层的寿命期限内过滤出遗传损伤的UV辐射。可以将类似的涂料或密封剂施加到有色帆布、织物、油漆或木头上，从而赋予它们防褪色(由于暴露于UV辐射而造成)的性质。

联系系统、工具和方法来描述以下实施方案及其方面，并进行图示说明，其是示例性的和说明的，没有限定本发明的范围。在各种实施方案中，已经减少或消除了一个或多个上文所述的问题，而其他的实施方案针对于其他的改善。除了上文所述的示例性方面和实施方案以外，通过参照附图并对以下描述进行研究，本发明的其他方面和实施方案将变得显而易见。

附图说明

图1示出了在UV波长220-325nm之间测量的、具有不同稀释度的1％-NA/胶原纤维复合产品的透射率。

图1A示出了在UV波长325-400nm之间测量的、具有不同稀释度的1％-NA/胶原纤维复合产品的透射率。

图2示出了不同稀释度的1％-NA/胶原纤维复合产品在四种选择的UV波长点的透射率。

图3示出了对于某些代表性的离散UV波长，透射率与稀释度的散点图。

图4示出了照射质粒DNA，转染入大肠杆菌，平板接种大肠杆菌和氨苄青霉素并温育24小时后的典型琼脂平板。

图5示出了在高剂量和低剂量的UVB，无屏障质粒DNA/大肠杆菌、只具有塑料包裹的质粒DNA/大肠杆菌以及具有NA/纤维复合屏障的质粒DNA/大肠杆菌的相对平均菌落计数。

图6示出了在照射强度和屏障对UV诱导的质粒DNA损伤的相对效果。

图7示出了阻断不同波长UV能量的核酸嵌入式过滤剂。

图8示出了海洋胶原大型共聚物的形成以及在电子扫描显微镜下所形成的纳米结构图像。

发明详述

中心概念的逻辑分析图

本公开的中心概念包括大型共聚物网络，该大型共聚物网络过滤了物理和化学危害因素，从而保护动物、人和对象表面中的基因材料。所述的物理和化学因素包括：UV，高能量辐射(α、β和γ射线)，以及神经、细胞和DNA毒素化学制品，例如吸烟衍生物成分以及其他DNA、RNA的高亲和性结合成分。

所述的组合物包含大型共聚物网络，该大型共聚物网络在纳米水平上具有高度有序的三维结构。在二价离子(例如Ca2+、Zn2+、Ba2+、SR2+等)、电磁辐射屏蔽纳米颗粒(包括氧化铅，含铜铅，硼10，氮化硼，碳化硼，聚乙烯/硼，金属氧化物/碳，铝，锂，钇，锆，钛，氢化锂，铀和超顺磁性氧化铁)以及其他有机成分中，所述的大型共聚物网络的优选构型为宿主小分子提供了合适的位点。所述的大型共聚物网络可以由天然存在的生物分子(包括碳水化合物、蛋白质、脂质和核酸)以及其他有机分子(例如硅氧烷、硅酸盐、反应性硅烷醇、密封剂、聚乙烯、碳丝和纤维聚合物)形成。

所述的碳水化合物包括藻酸盐、琼脂糖、蔗糖、纤维素和树脂。所述的蛋白质或肽包括胶原、酵母提取物、胰蛋白胨、弹性蛋白以及植物和海洋micropatches。所述的脂质或脂肪酸包括C20-40酸、聚乙烯和Performacid 350酸、以及维生素和视黄酸。所述的核酸包括天然或合成的DNA、RNA(尺寸为1-5000bp，单链或双链)、聚脱氧核糖核酸、聚核糖核酸、以及腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤和它们经修饰的衍生物(例如聚胸腺嘧啶或二胸腺嘧啶)。

所述的小成分包括氧化物颜料(例如氧化锌、二氧化钛、氧化铁、氧化铈)和核酸。所形成的大型共聚物网络可由单一一种分子或者多种分子的组合产生。所形成的大型共聚物网络可以为物理形式，其包括纳米构造结构、霜剂、洗剂和凝胶、以及流体、半固体或固体状态。

所形成的大型共聚物网络吸收了损伤DNA的UV粒子，该粒子具有由天然或人工来源产生的、高能量的220-300nm的短波长。所形成的大型共聚物网络还吸收了损伤DNA的UV粒子，该粒子具有由天然或人工来源产生的300-400nm的波长。

所形成的大型共聚物网络在体内和体外保护了DNA损伤以及基因突变。所述的体内保护被应用于动物以及人。所述的体外保护被应用于材料上，从而用于纤维、纸、金属、玻璃和任何表面的UV过滤。

通用测试过程

使用基于美国专利6,117,846的过程来生产由核酸(NA)构成的添加剂，已经发现该添加剂表现出吸收生物有害性紫外线(UV)辐射并将吸收的能量转化为热的突出能力。将所述的NA添加剂加入到含有海洋胶原纤维的典型的皮肤霜剂基础物中。使用UV光照射连续稀释的NA/纤维复合物，并将穿过该复合物的UV透射率相对于波长绘图。将这些测量值与穿过蒸馏水(对照)和穿过FDA认可的UV阻断大型纤维(macro-fiber)织物(K920240)的透射率测量值进行比较。使用质粒DNA和细菌转化测定来产生其他的测量值，从而测量出未被过滤的UV和使用NA/纤维复合物过滤的UV所产生的生物学作用。

全部的研究表明，NA/纤维复合物阻断了大约99％的UV辐射(220-305nm波长)，该值与FDA认可的大型纤维织物相当。在251-252nm下，稀释至多300倍使得透射率仅增加1-2％。由转化测试所观察的情况显示，在0.15J/cm²照射剂量下，UV波长220-325nm损伤了所有的质粒DNA，而在0.015J/cm²下，则损伤了大约80％的质粒DNA。通过NA/纤维复合物过滤UV使存活率分别增加超过46％和90％。建议使用加速方法(accelerated method)，其与对生物损伤的UV透射率的物理测量值有关。

原型NA/纤维复合物霜剂

用于制备NA添加剂的过程如下：

(1)将得自鲑鱼鱼精的双链DNA(OD260/OD280的比值介于1.5-2.0之间)在121℃下高压灭菌30分钟；然后(2)通过0.2μm的过滤器进行过滤，以进行灭菌。接着，(3)通过将所述的DNA在98-100℃下温育5分钟使得该双链DNA变性形成单链DNA；然后(4)立刻将上述溶液浸入冰水中。(5)然后使所得的单链DNA溶液在TE缓冲剂(10mM Tris.Cl，pH7.0，EDTA1mM)中的浓度为5％重量比(W/V)。(6)然后使1体积的这种DNA溶液与4体积的如下溶液混合，其中所述的溶液由50％重量比的、溶于0.2M2-(N-吗啉基)乙磺酸钠中的1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸酯(CMC)(pH6.0)构成。(7)采用专利方法使浓缩的NA附着在大的细颗粒上。通过将NA添加剂与蒸馏水混合制备出以下两种原溶液：

原溶液A  5.8％w/载体(2.5克，43ml)

原溶液B  2.91％w/载体(1.25克，43ml)

A.I.G.Technologies(AIG)使用通常在护肤产品中找到的组分制备出半透明霜剂基础物(当施加到皮肤上时是澄清的)。然后，AIG加入了12.5盎司(5％的最终样品)1％的海洋胶原纤维溶液(EnglehardMoisturizing Marine 

 Composition Sheet #1，日期为2006年4月25日)。将43ml的各种原溶液与所述的基础物共混，从而制得两种250ml的NA/纤维复合材料霜剂样品，其中NA添加剂的含量分别为约1％和0.5％。

分光光度法

使用Beckman DU-65型分光光度计测量穿过稀释样品的透射率值。在两个独立的范围内，以1nm为间隔，所述装置形成了透射率与波长的图：

部分I测试：220-325nm

部分II测试：325-400nm

光学密度(OD)为每单位距离下，光学元件对给定波长λ的吸光率。

${\mathrm{OD}}_{\mathrm{\λ}}=\frac{A_{\mathrm{\λ}}}{l}=-\frac{1}{l}{\log }_{10}$   $T=\frac{1}{l}{\log }_{10}\left(\frac{I_0}{I}\right)$

其中：

1＝光传播穿过样品的距离(即，样品的厚度)，以cm为单位进行测量

A_λ＝在波长为λ下的吸光率

T＝每单位透射率

I₀＝入射光束的强度

I＝透射光束的强度

透射率：在光学和光谱学中，透射率为以特定波长传播穿过样品的入射光的部分。

$T=\frac{I}{I_0}$

其中，I₀为入射光的强度，而I为穿出样品的光的强度。通常，样品的透射率以百分率的形式给出，其被定义为：

$T\%=\frac{I}{I_0}*100\%$

透射率与吸光率A有关，吸光率为：

A＝-log₁₀  $T=-{\log }_{10}\frac{I}{I_0}$

或者

A＝2-log T％

其中，T％为百分比透射率，而T为“每一个”的透射率。

注意：术语传播是指光穿过样品的物理过程，而透射率是指数学定量。

稀释样品，使得光学密度(OD)在0.1-3.0OD，其中OD＝1是指50％的可见光透射过样品。通过向eppendorf管中加入10-40mg的霜剂样品、加入1000ml的蒸馏水、并使用Vortex-genie 2(ScientificIndustries)混合1-3分钟，制备样品。通过连续稀释得到较高的稀释倍数或稀释比率。使用移液管将50μl的溶液转移至样品刮匙中，然后将该刮匙放置到分光光度计中用于测量。针对各UV范围，生成测量图。对代表了特定稀释度的不同样品进行重复测量。校准Beckman装置，并以装有蒸馏水(设定OD＝0(100％透射率))的刮匙进行标准化。在所有测试进行(部分I-III)的尾声，对水进行测量以作为最终的校准核查。

由购自Sun Precaution公司的白色遮巾(shade scarf)切下FDA认可的UV阻断织物样品。将样品切割成适合的大小，并放置在样品刮匙后方的UV光通路上。将50μl的蒸馏水加入到刮匙中，并测量透射率。测量三种不同的样品，以用于与穿过经稀释的1％NA/纤维复合霜剂样品、蒸馏水对照和水-纤维刮匙的透射率进行比较。

备选测试方法

质粒DNA在UV下的暴露以及大肠杆菌的转化测定过程

根据美国专利6,117,846中公开的过程设计出用于评价多种材料所提供的生物保护的方法。采用生物学效果的测量方法来确定这些效果是否与分光光度计得到的结果有关。下文中的附录A详细描述了所使用的方法：

●制备质粒DNA，该质粒DNA产生出赋予大肠杆菌细菌以氨苄青霉素抗性的酶，

●产生多组质粒DNA，其中这些质粒DNA未被暴露，暴露于UV，或者具有插入屏障而暴露于UV，

●使用所述的质粒DNA转染目标大肠杆菌细菌，

●将经转化的大肠杆菌接种到含有氨苄青霉素的琼脂平板上，以及

●将所述琼脂平板在37℃下温育24小时，并计数所得的菌落数量。

在UV-stratalinker 2400(Stratagen，La Jolla，CA)中，在公称254nm下照射包含质粒DNA的96孔组织培养板，其中所述的UV-stratalinker 2400的峰值能量为4000微瓦容量。计数经照射的质粒DNA转化的大肠杆菌菌落，并与同时制备的、未经照射的质粒转化的大肠杆菌培养板(对照)比较。

测量和观察

分光光度法

针对用水稀释(以稀释倍数表示)的多种NA/纤维复合霜剂样品生成在220-325nm范围内的示例性Beckman分光光度计输出图，从而得到可测量的光学密度(OD)。在大多数情况下，对代表相同稀释度的至少两种不同的样品进行绘图。图1示出了原始数据的实例，其示出了在200-325nm下，具有不同稀释度的4种测试样品的部分UV光谱的透射率。图1A示出了原始数据的其他实例，其示出了在325-400nm下，具有不同稀释度的4种测试样品的UV光谱的透射率。

为了显示和比较结果。对每个图都进行目视检查，并由原始图形测量透射率与波长的数据对。表1示出了整个测量波长区域(220-305nm)中的4个点，并描述了从Beckman图摘取出的手工数据。图2概括出在220-305nm区域内4个所选点的透射率数据。

表1

多种稀释度的1％-NA/胶原纤维复合霜剂在一些离散UV波长的透射率

记录三个显著的图形意味着比表1中的数据更加精确。每个数据对包括：与样品的实际稀释度与计算稀释度有关的误差、与得自Beckman图的手工读取波长值(y轴)和透射率值(x轴)有关的误差、以及在Beckman分光光度计的每次运行之间及每次运行过程中在测量中的变动误差。尽管累积了这些误差，但是数据对表现出可接受的一致性。与图2中所示的所有数据有关的柱状图表明，在整个稀释范围内，多个Beckman图具有相对一致性。

对于稀释度超过500倍的样品而言，所测量的UV透射率达到了相当难以接受的高度。使用

 EXCEL软件生成由45-511稀释倍数得到的数据的散点图，并示于图3中。此外，还使用所述的软件生成针对251nm和355nm波长的趋势线。

质粒DNA在UV下的暴露以及大肠杆菌的转化测定过程

根据附录A制备代表经过照射和未经过照射的质粒DNA/大肠杆菌接种物的琼脂培养板。仅仅受到保护而免于受到UV辐射的损伤或者未受到免于UV辐射损伤的保护的质粒DNA能够转染具有产生抗氨苄青霉素酶的能力的大肠杆菌。因此，存在于包含氨苄青霉素的琼脂培养板上的经转染大肠杆菌菌落的数量与质粒DNA所吸收的遗传损伤UV的量呈反比。

发现，塑料膜的UV阻断能力与组织培养板的UV阻断能力遮盖了UV吸收性NA/危险复合霜剂溶液的作用。将UVB的剂量强度由0.015J/cm2增大到0.15J/cm2。将培养物在上述剂量下暴露大约1分钟。较高的剂量足以损伤质粒DNA至没有大肠杆菌菌落能够在暴露于氨苄青霉素的条件下存活。所述剂量代表了美国成人年平均剂量的约1/20，但还可能为更高的强度(大约500倍)。

在24小时的温育时间后，检查琼脂培养板，并计数菌落。一组原始试验的琼脂培养板成像于图4中。表2核对了各检测运行中的菌落数量。

表2

照射质粒DNA，转染大肠杆菌，平板接种大肠杆菌和氨苄青霉素并温育24小时后对琼脂平板进行菌落计数

                培养板1     培养板2  培养板3   培养板4  培养板5 培养板6

UV254nm J/cm2    0          0.15     0.015     0.15     0.15    0.015

Sara塑料膜       无         无       无        有       有      有

Sara+NA/纤维     无         无       无        有       有      有

复合物

试验1a           108        1        18        0        56      98

试验1b           89         1        19        1        57      94

试验2a           94         1        19        1        58      89

试验2b           90         1        20        2        59      91

平均             95.25      1        19        1        57.5    93

SE               4.39       0        0.41      0.41     0.65    1.96

％               100.000％  1.0％    19.9％    1.0％    60.4％  97.6％

SE               4.6％      0.0％    0.4％     0.4％    0.7％   2.1％

图5示出了表2的数据。使用培养板1作为对照，图5表明，低的UVB剂量(0.015J/cm2-培养板3)可以使大约20％的质粒DNA发挥作用，而高的UVB剂量(0.15J/cm2)实际上破坏了所有的质粒DNA，而且与是否存在任何塑料包裹无关(培养板2和4)。在高强度/高剂量的UVB(培养板5)下，以2mg/cm2加入1％的NA/纤维复合屏障将保护由0增大至60％。增大在单独的测试培养板上使用的屏障霜剂的稀释倍数产生了与在未经稀释的霜剂看到的相同的保护率(60％)。增大经照射的质粒DNA的浓度并进行检查，以确定测试的灵敏性。增大质粒DNA的浓度5倍，从而在所有照射水平和屏障下增大相对效率。

对图5中的培养板1和6进行比较表明，以2mg/cm2施加1％的NA/纤维复合屏障保护了98％的质粒DNA免受低剂量UVB的损伤；或者与根本不具有澄清的屏障(培养板3)相比，所述的1％的NA/纤维复合屏障提供了5倍的保护。在高和低UV照射强度下，插入1％的NA/纤维复合屏障对质粒DNA转化的相对效率的影响如图6所示。

结论总结

1.通过分光光度计测量以及生物学作用的测量验证美国专利6,117,846中公开的核酸(NA)和NA衍生物的UV屏障作用。

2.证明了将NA与海洋胶原纤维结合在局部霜剂载体中的可行性。

3.证明了使用质粒DNA在UV中的暴露以及与生物学作用测量相似的大肠杆菌转化测定来验证物理透射测量的可行性。

4.即使当将1％的NA/纤维复合霜剂由64倍稀释成300倍时，仍能够阻断98％的UVB透射。

5.这些结果本质上与由FDA认可的大型织物(表2中标记的纤维1、纤维2和纤维3)阻断的UV的量相当。

讨论

分光光度计测试成功地分辨出低稀释度和高稀释度的1％NA/海洋胶原纤维复合霜剂。如所预期的那样，在所有波长下，减小流体中UV吸收性NA的密度增大UV的透射率。当由64倍稀释至300倍时，98％的UVB透射率被阻断。

对于至多100倍的稀释度而言，由UVB(特别是生物学显著的254nm波长)中吸收的UV高于99％。这种性能与FDA认可的UV阻断性织物医疗设备所提供的保护水平相同。

质粒DNA在UV中的暴露以及大肠杆菌转化测定结果验证了分光光度计的结果。在剂量为0.015J/cm²的UVB(在UV stratalinker中，峰值为250nm，照射1分钟)下，与无保护条件下仅有20％的质粒DNA未被损伤相比，在塑料包裹上以2mg/cm²的量施加的1％NA/纤维复合霜剂防止了98％的质粒DNA被损伤。除非将1％NA/纤维复合霜剂作为保护屏障插入，否则施加10倍于这种UV的剂量损伤所有的质粒DNA。

这种方法作为用于评价辐射对活体有机体的作用的加速测试方法提供了希望。表2所示的测量一致性表明所述的方法产生了可重复的结果。

如所预计的那样，增加UV(峰值为254nm)的强度会增大DNA的损伤。通过使UVB的强度足够高，可以克服塑料或塑料包裹的屏障作用，但是使对插入的UV屏障材料的评估变复杂。然而，增大在单独的测试培养板上使用的屏障霜剂的稀释倍数(稀释比例)产生了与在未经稀释的霜剂看到的相同的保护率(60％)。增大经照射的质粒DNA的浓度并进行检查，以确定测试的灵敏性。增大质粒DNA的浓度5倍，从而在所有照射水平和屏障下增大相对效率。然而，这可能是由于较高浓度的质粒DNA屏蔽了小瓶中心处的部分质粒。上述过程在验证NA装置的理论的同时，还表明附录A中所述的质粒DNA的浓度适用于屏蔽测试。

基于将人在UV中的暴露与过早老化、皱纹和皮肤癌相联系的大量文献，采用UV保护是明智的。然而，FDA仅仅认可了一种基于大型织物屏障的医疗设备。在某些情况下，单独的织物屏障是不实用的，并且甚至在使用时，这些织物不能保护身体未被覆盖的部分(特别是脸、手和眼睛)免受被反射的UV的损伤。本公开证明了将海洋胶原大型纤维与NA相结合的可行性，以及使用霜剂基础物来传递NA/纤维复合材料的可行性。此外，显示NA/纤维复合物提供了与由FDA认可的大型织物相当的UVB保护，从而提供了相同的医疗优点。

通过质粒DNA在UV中的暴露以及大肠杆菌转化测定过程验证了对屏障效率的物理分光光度测量。换言之，物理测量与生物学作用的测量类似。可以合理地假设，在体内测试中能够观察到由1％的NA/纤维复合霜剂对有机体提供的UV保护。

实施例2

将琼脂糖作为第二种活性UV吸收剂与核酸一起进行测试，得到了表4所示的结果。将核酸包埋入1-2％的琼脂糖形成的澄清过滤剂中。在过滤剂#1、#2、#3和#4中核酸的浓度分别为0.0005％、0.005％、0.01％和0.02％。表4为用于阻断室内晒黑床(tanning bed)UV灯CF26W(在UVB和UVA范围内)以及形成红斑和黑素生成所需UV能量(uW)的测量数据的总结。

表4

 

	UVB(至320nm)	UVA(至400nm)	红斑	黑素生成
					过滤剂#0(不具有NA涂层)	185.1	5030	35.3	102.9
过滤剂#1	135.3	4420	47.1	136.4
					过滤剂#2	33.2	2590	239.8	617.2
过滤剂#3	26.1	1910	239.6	650.3
					过滤剂#4	0.6	550	2840.1	6375.1

实施例3

表3示出了已经研发出以及准备制造的完全优选的配方。

表3

UV过滤性织物

          商品名                            w/w％

A1        去离子水                          59.225

A2        Plantaren 2000                    0.500

A3        甘油                              1.000

A4        BioVera 200x Aloe Powder          0.100

A5        三乙醇胺                          0.400

A6        Versene Na                        0.100

B1        Sensanov WR                       2.000

B2        Jeechem CTG                       3.000

B3        Permethyl 99A                     2.000

B4        醋酸维生素E                       0.250

B5        Crodamul SS                       2.000

B6        Polawax                           1.000

B7        DC 556 Fluid                      2.000

C         核酸                              1.000

D         氧化锌                            2.5

E         Simulgel NS                       3.600

F         Microcare MTG                     0.500

G         薄荷油AA-P2663                    0.125

          海洋Micropatch                    5.000

制造过程

1.将组分A1-A6加入到尺寸合适的不锈钢釜中，该不锈钢釜能够盛装全部批料并装配有旁侧扫除(sidesweep)和发光型混合器。

2.加热至70-75℃。混合至均匀。

3.将组分B1-B7加入到装配有发光型混合器的尺寸合适的不锈钢釜中。

4.加热至70-75℃。混合至均匀。

5.当两相达到均匀时，在一定温度下，将相A加入到相B的底部。

6.混合至均匀。

7.加入组分C。混合至均匀。

8.匀质化，直至均匀。

9.加入组分D。混合至完全分散。

10.匀质化，直至均匀。

11.使用城市用水开始冷却至30℃。

12.在40℃下，加入组分E和f。在加入操作之间混合至均匀。

13.在35℃下，降低混合器的速度，并缓慢加入组分G。

14.混合至均匀。持续混合直至30℃。

上文中，在对大量的示例性方面和实施方案进行讨论的同时，本领域的技术人员将认识到某些修改、透过、增加和它们的亚组合。因此，用意为将以下所附的权利要求以及下文引入的权利要求解释为在本发明的真正精神和范围内，包括所有这些修改、透过、增加和亚组合。

附录A

质粒DNA在UV中的暴露以及大肠杆菌转化测定的过程

选择质粒DNA pEGFP-N1和PUC19作为用于UV损伤研究的生物传感器的靶DNA。pUC19(GenBank/EMBL，编号为L09137)为一种常用的大肠杆菌克隆载体。其为小的双链DNA环，长度为2686个碱基对，并具有高拷贝数。PUC19在宿主中表达氨苄青霉素抗性基因。质粒DNApEGFP-N1pEGFP-N1(Clontech，目录编号6085-1)编码了野生型GFP的红移型变体，该变体已经被优化成在哺乳动物中具有更亮的荧光和更高的表达(激发峰＝488nm；发射峰＝507nm)。pEGFP-N1编码GFPmutl变体(4)，该变体包含Phe-64变为Leu、Ser-65变为Thr的双氨基酸取代。

EGFP基因的编码序列包含多于190个的沉默碱基变化，这符合人的密码子使用偏好性。EGFP旁侧的序列已经被转变为Kozak共有翻译起始位点，从而进一步增加在真核细胞中的翻译效率。载体主链还包含用于在表达SV40T抗原的哺乳动物细胞中进行复制的SV40起始点。新霉素抗性盒(neor)使得可以使用G418选择稳定地转染的真核细胞，其中所述的新霉素抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的新霉素/卡那霉素抗性基因、以及得自单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的聚腺苷酸化信号构成。该盒上游的细菌启动子(P_amp)在大肠杆菌中表达卡那霉素的抗性。

将浓度为50-100ng/μl的质粒DNA以每孔50μl的量加入到96孔组织培养板中。将所得的培养板直接放入到UV stratalinker2400(Stratagen，La Jolla，CA)中，或者用织物试样覆盖，其中所述的织物样品涂敷有核酸或未涂敷核酸。对于液体或半液体状态的目标样品而言，将整个培养板用购得的塑料膜(例如Saranwrap)覆盖，然后将塑料膜涂敷目标样品，使得公称覆盖率为2mg/cm2。在Stratalinker 2400中，使用UV光在各种UV能量(范围为125至150,000μJ/m2)下照射质粒DNA。在UV照射后，将质粒DNA稀释成1ng/μl的浓度以用于转化测定。将DH5化学感受态大肠杆菌(目录编号no.18265-017，Invitrogen Life Technologies)选作宿主细胞。

该过程的步骤如下：

1.在UV中暴露后，将质粒DNA简单地离心。

2.取出一小管的DH5大肠杆菌细胞(500μl)，并在湿冰上解冻。

3.将所需数量的无菌1.5ml的微离心管放置在湿冰上。

4.用移液管末端温和混合细胞，并将等分量的50或100μl的细胞移入每个微离心管中。

5.将任何未使用的细胞在干冰/乙醇浴中再次冷冻5分钟，然后将小管重新放置到-70℃的冰箱中。

6.将1μl每种试验DNA(1ng DNA)直接移入到感受态细胞中，并通过温和的拍击进行混合。不要通过吸入吸出进行混合。将剩余的DNA样品储存于-20℃。

7.将小瓶在冰中温育30分钟。

8.将50μl体积的所得物在37℃的水浴中热休克恰好30秒(对于100μl所得物的转化而言，热休克45秒)。不要进行混合或震动。

9.将小瓶由37℃的水浴中取出，并在冰上放置2分钟。

10.将900至950μl的经过预先温热的S.O.B培养基(0.5％的酵母提取物，2.0％的胰蛋白胨，10mM的NaCl，2.5mM的KCl，10mM的MgCl₂，10mM的MgSO₄)加入到各小瓶中。

11.将小瓶放置在微离心架的一侧上，并用胶带进行保护以防止小瓶损失。将小瓶在震荡培养箱中，在37℃、225rpm下震动恰好1小时。

12.将得自各转化小瓶中的20至200μl(优选为100μl)的所得物铺展在LB琼脂培养板上，其中所述的LB琼脂培养板中包含用于pEGFP-N1转化的25mg/ml卡那霉素，或者用于pUC19转化的100ug/ml氨苄青霉素。

13.将所述的培养板倒置，并在37℃下温育过夜。

14.计数各培养板中的菌落数量并照像。

Claims (21)

1.一种用于保护遗传材料免于受到遗传危害性电磁/紫外线辐射诱导的损伤、以及细胞DNA攻击性化学制品诱导的损伤的方法，该方法包括：

将遗传危害性紫外线辐射过滤型屏障放置于紫外线辐射来源与包含电磁/紫外线辐射敏感性遗传材料的靶标之间，其中所述的屏障包含：位于核酸基聚合物网络中的有效量的电磁/紫外线辐射过滤性核酸，以及活性电磁/紫外线吸收和/或阻断材料。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的核酸得自：多脱氧核糖核酸、多核糖核酸、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、它们的衍生物以及混合物。

3.权利要求1所述的方法，其中：所述的活性材料包括UVA和/或UVB亲水性有机UV屏蔽剂、和/或亲脂性有机UV屏蔽剂、和/或矿物UV屏蔽纳米颜料。

4.权利要求1所述的方法，其中所述的活性材料得自：二氧化钛、氧化铁、二氧化锆、氧化锌、氧化铈、甲氧肉桂酸辛酯、二苯甲酮-3、氰双苯丙烯酸异辛酯(octocrylene)、水杨酸辛酯、酵母提取物、trypone、琼脂糖、C20-40、蔗糖、胶原、纤维素、弹性蛋白、视黄酸、氨基酸、聚乙烯、perform acid 35D acid、L-丝氨酸、藻酸钠、褐藻酸、硅氧烷、硅酸盐、反应性硅烷醇和密封剂。

5.权利要求1所述的方法，其中所述的活性电磁辐射阻断材料得自：氧化铅，含铜铅，硼10，氮化硼，碳化硼，聚乙烯/硼，金属氧化物/碳，铝，锂，钇，锆，钛，氢化锂，铀和超顺磁性氧化铁。

6.权利要求1所述的方法，其中：所述的聚合物包括有序的3维网络。

7.权利要求3所述的方法，其中：所述核酸的存在量至多为约20％(W/V)。

8.权利要求1所述的方法，其中：将所述的核酸稀释成浓度为约0.01％(W/V)，而同时保持UV透射率不大于约8％。

9.权利要求1所述的方法，其中：将所述的核酸稀释成浓度为约0.015％(W/V)，而同时保持UV透射率不大于约3％。

10.权利要求1所述的方法，其中：将所述的核酸稀释成浓度为约0.03％(W/V)，而同时保持基本上所有UV的UV透射率。

11.权利要求2所述的方法，其进一步包括以下步骤：照射所述的经涂敷或经浸渍的表面，从而诱导多脱氧核糖核酸或多核糖核酸与所述的聚合物网络交联。

12.一种用于保护遗传材料免于受到遗传危害性紫外线辐射诱导的损伤的组合物，其包含：位于核酸基聚合物网络中的有效量的紫外线辐射过滤性核酸，以及活性UV吸收和/或阻断材料。

13.权利要求12所述的组合物，其中所述的核酸选自：多脱氧核糖核酸、多核糖核酸、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、它们的修饰衍生物以及混合物。

14.权利要求12所述的组合物，其中：所述的活性材料包括UVA和/或UVB亲水性有机UV屏蔽剂、和/或亲脂性有机UV屏蔽剂、和/或矿物UV屏蔽纳米颜料。

15.权利要求12所述的组合物，其中所述的活性材料得自：二氧化钛、氧化铁、二氧化锆、氧化锌、氧化铈、甲氧肉桂酸辛酯、二苯甲酮-3、氰双苯丙烯酸异辛酯、水杨酸辛酯、酵母提取物、trypone、琼脂糖、C20-40、蔗糖、纤维素、胶原、弹性蛋白、视黄酸、氨基酸、聚乙烯、perform acid 35D acid、L-丝氨酸、藻酸钠、褐藻酸、硅氧烷、硅酸盐、反应性硅烷醇和密封剂。

16.权利要求12所述的组合物，其中：所述的聚合物包括有序的3维网络。

17.权利要求12所述的组合物，其中：所述核酸的存在量至多为约20％(W/V)。

18.权利要求12所述的组合物，其中：将所述的核酸稀释成浓度为约0.01％(W/V)，而同时保持UV透射率不大于约8％。

19.权利要求12所述的组合物，其中：将所述的核酸稀释成浓度为约0.015％(W/V)，而同时保持UV透射率不大于约3％。

20.权利要求12所述的组合物，其中：将所述的核酸稀释成浓度为约0.03％(W/V)，而同时保持基本上所有UV的UV透射率。

21.权利要求12所述的组合物，其进一步包括以下步骤：照射所述的屏障，从而诱导所述的多脱氧核糖核酸或多核糖核酸与所述的聚合物网络交联。

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