CN101519699A - B型肝炎病毒dna捕捉用探针和探针固定化固相载体 - Google Patents
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Abstract
提供了一种即使是病毒浓度极少的检测对象也可以准确地捕捉HBV－DNA的B型肝炎病毒DNA捕捉用探针和探针固定化固相载体。B型肝炎病毒DNA捕捉用探针含有与选自序列号1～12所示的任一个序列中的连续的10个以上碱基具有80％以上序列同源性的碱基序列，且为碱基数15～80的寡核苷酸。
Description
技术领域
本发明涉及B型肝炎病毒(本发明说明书中也称为“HBV”)DNA捕捉用探针和固定有所述探针的固相载体。
背景技术
HBV的定量，作为用于观察HBV感染者的治疗效果，以及为了防止通过输血用血液或移植用器官介导的受者的HBV感染而检查供体有无感染HBV的手段，是十分重要的。
作为定量血清等试样中的HBV的方法，可以举出如下方法，例如用磁性颗粒等载体捕捉试样中的HBV-DNA，通过TaqMan(商标)法等实时检测PCR法定量所捕捉的HBV-DNA的方法。此时优选的是，即使是病毒浓度极低的检测对象，也可以准确地捕捉HBV-DNA。
发明内容
本发明提供一种即使是病毒浓度极低的检测对象，也可以准确地捕捉HBV-DNA的B型肝炎病毒DNA捕捉用探针和探针固定化固相载体。
本发明的一个方式中所述的B型肝炎病毒DNA捕捉用探针为，含有与选自序列号1～12所示的任一个序列中的连续的10个以上碱基具有80％以上序列同源性的碱基序列，且为碱基数15～80的寡核苷酸。
本发明的一个方式中所述的探针固定化固相载体固定有上述B型肝炎病毒DNA捕捉用探针。
通过使用上述B型肝炎病毒DNA捕捉用探针，即使在病毒浓度极低的检测对象中也可以准确地捕捉HBV-DNA。
更具体而言，通过使用固定有上述B型肝炎病毒DNA捕捉用探针的探针固定化固相载体来捕捉HBV-DNA，即使在病毒浓度极低的检测对象中也可以准确地捕捉HBV-DNA。
具体实施方式
1.B型肝炎病毒DNA捕捉用探针
本发明的一个实施方式中所述的B型肝炎病毒DNA捕捉用探针(以下也称为“HBV-DNA捕捉用探针”)含有与选自序列号1～12所示的任一个序列中的连续的10个以上碱基具有80％以上(优选90％以上)的序列同源性的碱基序列，且碱基数为15～80(优选25-45)的寡核苷酸。HBV-DNA捕捉用探针可以使用市售品，也可以通过公知的合成方法合成。
探针B A：5’-T C C T A G G A C C C C T G C T C G T G T T A C A G G C G GG G T T T T T C T-3’(序列号1)
探针B B：5’-C C C C T G C T C G T G T T A C A G G C G G G G T T T T T CT T G T T G A C A A-3’(序列号2)
探针B C：5’-G T C T A G A C T C G T G G T G G A C T T C T C T C A A T TT T C T A G G G G-3’(序列号3)
探针B D：5’-T A T C G C T G G A T G T G T C T G C G G C G T T TT A T CA T A T T C C T C T-3’(序列号4)
探针B E：5’-C A T C C T G C T G C T A T G C C T C A T C T T C T T G T TG G T T C T T C T G G A-3’(序列号5)
探针B F：5’-C C T A T G G G A G T G G G C C T C A G T C C G T T T C TCT T G G C T C A G T T T A C T A G-3’(序列号6)
探针B G：5’-G G C T T T C C C C C A C T G T T T G G C T T T C A G C T AT A T G G A T G A T-3’(序列号7)
探针B H：5’-T G C C A A G T G T T T G C T G A C G C A A C C C C C A C TG G C T G G G G C T T-3’(序列号8)
探针B I：5’-C T C C T C T G C C G A T C C A T A C T G C G G A A C T C CT A G C C G C T T G-3’(序列号9)
探针B J：5’-C C G T G T G C A C T T C G C T T C A C C T C T G C A C G TT G C A T G G A G A-3’(序列号10)
探针B K：5’-T G T T C A A G C C T C C A A G C T G T G C C T T G G G T GG C T T T G G G G C-3’(序列号11)
探针B L：5’-G C A G G T C C C C T A G A A G A A G A A C T C C C T C G CC T C G C A G A C G A A G-3’(序列号12)
通过将HBV-DNA捕捉用探针固定化在例如探针固定化固相载体(例如磁性颗粒)的表面，在包含检测对象的试样中使该捕捉用探针与HBV-DNA杂交，在极低浓度下也可以捕捉检测对象中的HBV-DNA。作为检出对象的HBV-DNA包含于怀疑含有HBV的某种检测对象中，例如血清，血浆等体液中。
而且，使用HBV-DNA捕捉用探针捕捉到的HBV-DNA可以通过例如实时检测PCR法进行定量。例如，在含有捕捉到HBV-DNA的磁性颗粒和正向侧引物和反向侧引物和荧光探针(3’末端被供体荧光色素标识化且5’末端被受体荧光色素标识化的寡核苷酸(TaqMan(商标)探针))的系统中进行PCR反应，可以基于获得的荧光强度测定检测对象中的B型肝炎病毒DNA量。该实时检测PCR法本身是公知的，这种用途的装置和试剂盒也是市售的，因此使用这种市售的装置和试剂盒可以进行实时检测PCR法。
2.探针固定化固相载体
本发明的一个实施方式中所述的探针固定化固相载体固定有上述HBV-DNA捕捉用探针。
作为固相载体，可以举出，例如可以作为色谱载体、诊断试剂而使用的载体颗粒，例如可以作为DNA芯片、DNA微阵列而使用的芯片(基板)等。
本实施方式中所述的探针固定化固相载体，更优选为用于检测HBV的固相载体(更具体的是在表面固定有HBV-DNA捕捉用探针的磁性颗粒)。作为在磁性颗粒上将HBV-DNA捕捉用探针固定化的方法，可以举出，例如使3’末端被氨基修饰的HBV-DNA捕捉用探针与含有羧基的磁性颗粒反应的方法，使3’末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探针与抗生物素蛋白化磁性颗粒反应的方法。
3.实施例
以下，基于实施例对本发明进行更具体的说明。不过，本发明并不限于下述实施例。
3.1 具有HBV-DNA捕捉用探针的磁性颗粒的制作
3.1.1.HBV-DNA捕捉用探针
作为HBV-DNA捕捉用探针，使用上述序列号1～12所示的序列BA～BL。
3.1.2.HBV-DNA捕捉用探针向磁性颗粒的固定化
通过使3’末端被氨基修饰的HBV-DNA捕捉用探针与含有羧基的磁性颗粒反应的方法、和使3’末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探针与抗生物素蛋白化磁性颗粒反应的方法这两种方法，制作固定有HBV-DNA捕捉用探针的磁性颗粒。
(a)通过使3’末端被氨基修饰的HBV-DNA捕捉用探针与含有羧基的磁性颗粒反应，HBV-DNA捕捉用探针向磁性颗粒固定化
将含有羧基的磁性颗粒(Magnosphere(商标)M300/Carboxyl(JSR株式会社制))1wt％分散液500μl取至管中，通过磁力架进行磁力分离，除去上清。用0.0001N盐酸清洗3次后，分散于500μl的0.0001N盐酸中，加入5μl的3’末端被氨基化的HBV-DNA捕捉用探针(探针BA)100μM溶液、和0.25mg EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)，在设定于10℃的恒温槽中搅拌15小时。然后，通过磁力架进行磁力分离，除去上清。用含有0.5mM EDTA和1.0M NaCl的5mMtris-HCl(pH7.4)清洗3次后，分散于50μl的5mM tris-HCl缓冲液中，获得了通过酰胺键结合有HBV-DNA捕捉用探针(探针BA)的探针固定化磁性颗粒(am-BA)的分散液(10％重量)。
而且，用同样的方法获得了通过酰胺键结合有HBV-DNA捕捉用探针(探针BB，BC，BD，BE，BF，BG，BH，BI，BJ，BK，BL)的探针固定化磁性颗粒(am-BB，am-BC，am-BD，am-BE，am-BF，am-BG，am-BH，am-BI，am-BJ，am-BK，am-BL)。
(b)通过使3’末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探针与抗生物素蛋白化磁性颗粒反应，HBV-DNA捕捉用探针向磁性颗粒的固定化
将生物素化磁性颗粒(Magnosphere(商标)M300/Streptavidin(JSR株式会社制))1wt％分散液500μl取至管中，通过磁力架进行磁力分离，除去上清。用含有0.5mM EDTA和1.0M NaCl的5mM Tris-HCl(pH7.4)清洗3次后，分散于500μl的含有0.5mM EDTA和1.0M NaCl的5mMTris-HCl(pH7.4)中，加入5μl的3’末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探针(探针BA)100μM溶液，室温下搅拌30分钟。然后，通过磁力架进行磁力分离，除去上清。用含有0.5mM EDTA和1.0M NaCl的5mMtris-HCl(pH7.4)清洗3次后，分散于50μl的5mM tris-HCl缓冲液中，获得了通过生物素-抗生物素蛋白结合而结合了HBV-DNA捕捉用探针(探针BA)的磁性颗粒(bi-BA)分散液(10％重量)。
而且，用同样的方法获得了通过生物素-抗生物素蛋白结合而分别结合了探针BB、BC、BD、BE、BF、BG、BH、BI、BJ、BK、BL的探针固定化磁性颗粒(bi-BB、bi-BC、bi-BD、bi-BE、bi-BF、bi-BG、bi-BH、bi-BI、bi-BJ、bi-BK、bi-BL)。
3.2.通过HBV-DNA捕捉用探针固定化磁性颗粒进行的HBV-DNA的提取和检测
3.2.1.HBV-DNA的提取
用上述工序制备的HBV-DNA捕捉用探针固定化磁性颗粒，从人血浆中提取HBV-DNA。用正常的人血浆稀释含有浓度已知的HBV的人血浆的检测对象，制备出10倍阶的稀释系列。从各0.1ml的这些稀释的血浆中提取HBV-DNA。
首先，将0.1ml血浆取至管中，加入380μl检测对象稀释液(1％N-月桂酰肌氨酸钠，10mM EDTA，200mM NaCl，2％ 2-巯基乙醇，200mM Tris-HCl(pH7.5))和5μl的10％葡聚糖T2000(Amersham公司制)进行搅拌后，于55℃静置30分钟。接着，加入250μl的8M胍基盐酸盐进行搅拌后，于55℃静置15分钟。然后，于95℃静置10分钟后冷却到室温。然后，加入10μl具有上述工序中制备的HBV-DNA捕捉用探针的磁性颗粒分散液(10重量％)，于室温下搅拌10分钟后，通过磁力架进行磁力分离除去液体。然后，用0.01％tritonX-100和含有0.1M NaCl的10mM tris-HCl(pH7.5)溶液清洗颗粒1次后，分散于40μl的无脱氧核糖核酸酶的水中，获得了含有HBV-DNA的磁性颗粒分散液。以该磁性颗粒分散液作为模板，直接进行实时检测PCR扩增反应处理。
3.2.2.通过实时检测PCR进行的扩增和检测
每一个反应管中制备下表1所示的反应液，加入40μl含有上述提取的HBV-DNA的磁性颗粒分散液，进行实时检测PCR。
反应液的组成
PCR等级的蒸馏水 32.2μl
10×缓冲液 10μl
MgCl2(25mM) 10μl
dATP(10mM) 1μl
dGTP(10mM) 1μl
dCTP(10mM) 1μl
dTTP(10mM) 1μl
正向侧引物(100μM) 1μl
反向侧引物(100μM) 1μl
TaqMan(商标)探针(25μM) 0.4μl
FastStart Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.4μl
ROX Reference Dye(Invitrogen公司制) 1μl
总计 60μl
正向侧引物、反向侧引物和TaqMan(商标)探针使用具有特表2005-505289记载的下述序列。
正向侧引物的序列：5’-A T C T T A T C A A C A C T T C C G G A-3’
(序列号13)
反向侧引物的序列：5’-A G A T T G A G A T C T T C T G C G A C-3’
(序列号14)
TaqMan(商标)探针的序列：5’-[FAM]A G G T C C C C T A G A A GA A G A A C T C C C T[T A M R A]-3’(序列号15)
FastStart Taq DNA聚合酶和10×缓冲液使用FastStart Taq DNA聚合酶(Roche diagnostic公司制)所附的试剂。
将反应管置于实时检测PCR装置Prism 7700(商品名，AppliedBiosystems公司)，在以下条件下进行定量PCR反应。
初期活性化步骤 95℃ 15分钟
PCR变性 95℃ 15秒
PCR延伸 60℃ 60秒
重复进行50个这样的PCR循环。
到达50个循环时，将荧光强度以指数函数性增加的判断为阳性，不增加的判断为阴性。使用各磁性颗粒获得的实验结果示于下表1。根据表1可知，具有上述HBV-DNA捕捉用探针的磁性颗粒可以从含有至少10个/0.1ml血浆的病毒的试样中捕捉B型肝炎病毒。
表1
使用HBV-DNA固定化磁性颗粒的HBV-DNA的分离和检测结果
(阳性检测对象数/试验检测对象数)
序列表
<110>JSR株式会社
<120>B型肝炎病毒DNA捕捉用探针和探针固定化固相载体
<130>IP0817294
<160>15
<210>1
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
<210>5
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
<210>6
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
<210>8
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
<210>12
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
Claims (2)
1.一种B型肝炎病毒DNA捕捉用探针，其特征在于，含有与选自序列号1～12所示的任一个序列中的连续的10个以上碱基具有80％以上序列同源性的碱基序列，且为碱基数15～80的寡核苷酸。
2.一种探针固定化固相载体，其特征在于，固定有权利要求1所述的B型肝炎病毒DNA捕捉用探针。
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