CN101505875A - 用于分析扩增的核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在微流体设备中分析核酸的方法。该方法包括下列步骤：a)在微流体设备的第一腔中扩增核酸；b)使扩增的核酸与添加剂接触，该添加剂含有：i)单价阳离子和ii)Mg2+结合剂，其中该添加剂存在于微流体设备的第二腔中；并且c)将扩增的核酸与至少一种探针寡核苷酸杂交。

Description

用于分析扩增的核酸的方法
本发明涉及一种在微流体设备中分析扩增的核酸的方法。本发明还涉及实施这种方法的装置。
现有技术
通过杂交进行DNA分析是分子生物学中已知的方法(参见“Gentechnische Methoden”，G.Gassen和G.Schrimpf，Spektrum Akademischer出版社，Heidelberg，1999，243～261页)。该技术在检测特定核酸中起重要作用，例如，在单点突变(单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)，SNP)的分子鉴定中。这里使用具有如约20个核苷酸的序列的探针寡核苷酸，使之结合到仅在单个核苷酸上有差异的核酸上。需要说明的是，在本文中“核酸”的概念包括核酸序列，如DNA序列或RNA序列。选择合适的杂交条件(特别是温度和盐浓度)，探针寡核苷酸会选择性地结合核酸的非突变的变体，而不结合或者弱结合具有单点突变的核酸变体。由此可以鉴定单点突变。由于无突变变体(即野生型)和突变体之间结合能量差异很小，有关反应溶液的温度及组成和盐浓度等反应条件必须满足精确的规定。
因为在试样(如血液)中通常不足以提供相应核酸的数量或浓度，就很有必要对待研究的核酸进行扩增。可以通过不同的分子生物学已知的方法进行序列特异地扩增，例如通过SDA(链置换扩增(Strand DisplacementAmplification))，记载在Walker GT等，“Strand Displacement Amplification，anisothermal，in vitro DNA Amplification Technique”，Nucleic Acids Research，1992，20，1961～96中；通过TMA(转录介导的扩增(transcription mediatedamplification))，记载在www.gen-probe.com/sci tech/tma.htm中；或者通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，记载在US 4 683 195中。这里所存在的问题是，扩增反应的反应溶液组成以及“扩增粗产物”不具有杂交所需的组成和特别的盐浓度。此外，对于分子鉴定必要的是，选择性分离在通过例如升温而进行的后续步骤(解链)中产生的杂合体。为了使得杂交步骤能具有高产率，还包括需要高浓度的单价阳离子(如Na+离子)。单价阳离子在杂交反应时促进双螺旋结构的形成。
然而，扩增反应如PCR反应的反应混合物包括低浓度的单价阳离子。此外PCR反应缓冲液还具有较高浓度(几个mM)的Mg2+离子，其在与检测探针杂交时不利于探针和互补链结合成完整的杂合体，可通过聚合酶活性延长探针，并且在后续解链步骤中稳定双链且使得解链困难，导致高温时的“模糊”解链曲线。
因此，根据现有技术在杂交反应前要纯化扩增产物，由此除去所有妨碍杂交反应的成分(包括聚合酶、引物、核苷酸、盐)，并提高Na+离子的浓度。该纯化步骤复杂，其通常由下列步骤完成：(通过所谓的纯化柱)将核酸非特异结合在固相中，洗涤柱上的扩增产物并将其从固相中溶解出来，或者通过苯酚/氯仿萃取或类似方法。特别是在微流体设备中进行核酸分析时，所有的反应步骤都整合在微流体设备中并在狭小的空间里运行，由于在这样的条件下实现纯化步骤复杂，现有技术并没有解决该问题。
发明目的
本发明的目的是提供一种简单和低成本的方法，其能高效地处理扩增的核酸以用于后续步骤，同时不需要额外的结合和洗涤步骤，并且可用流体学概念方便地实现。
发明详述
本发明思想就总体而言在于，扩增具有核酸的试样以及将含有扩增粗产物的试样与合适的添加剂混合，以处理扩增粗产物用于后续步骤，例如后续的分析步骤。通过加入添加剂可避免对扩增的核酸进行纯化的需求。这种方法特别适用于微流体设备中，其中优选使用简单的流体学概念进行不复杂的方法流程。根据本发明，该添加剂具有单价阳离子和Mg2+离子结合剂。这类添加剂对于处理扩增的核酸用于后续与探针寡核苷酸杂交特别的适合。
本发明的目的特别地通过权利要求1中的方法得以解决。从属权利要求中给出了有利的具体方案。实施本发明方法的相关装置是权利要求17的主题。其从属产品权利要求中给出了该装置的具体方案。
本发明特别提供了一种在微流体设备中分析扩增的核酸的方法，其包括下列步骤：
a)在微流体设备的第一腔中扩增核酸；
b)使扩增的核酸与添加剂接触，该添加剂含有：
i.)单价阳离子和
ii.)Mg2+离子结合剂，
其中该添加剂存在于微流体设备的第二腔中；并且
c)将扩增的核酸与至少一种探针寡核苷酸杂交。
“微流体”的表述指处理体积在微升范围内的流体的方法。优选将所述微流体设备构建成卡式盒(Cartridge)，其具有卡片式平面结构，里面设计有呈通道和室或空腔的凹孔，液体可以根据预设的反应流程或方案通过凹孔流动。
单价阳离子包括例如Li+、Na+、Ka+，本发明添加剂优选为Na+离子的形式。Mg2+离子结合剂可以理解为所有结合Mg2+离子的物质，特别是络合物形成剂，如EGTA或EDTA之类的螯合物形成剂。在本发明方法中使用的添加剂优选含有EDTA。此外该添加剂优选具有结合剂，如聚乙烯吡咯烷酮。也可存在其他助剂如缓冲物质、表面活性剂等。
根据本发明的一个优选方面，在第二腔中的添加剂为干试剂且以贮藏时能保持稳定的形式储存。
探针寡核苷酸优选作为微阵列固载于微流体设备中的载体上。
根据本发明方法的第一实施方式，添加剂从第二腔运送至第一腔(扩增腔)，以使添加剂与扩增的核酸接触。如果在本发明该实施方式中的添加剂在第二腔中为干试剂，则适宜的是将该干试剂溶解在溶剂如水中形成溶液。这样，溶解的添加剂可以从第二腔运送到第一腔，从而在第一腔中与扩增粗产物混合。
根据本发明的第二实施方式，在完成扩增后，反应溶液中扩增的核酸从第一腔运送至第二腔，并与添加剂一起作为混合物导入探针寡核苷酸。如果该添加剂在第二腔中为干试剂，其可以直接溶解在与扩增粗产物一起被泵入第二腔的反应溶液中。
根据本发明，优选通过PCR反应扩增核酸。
根据本发明的另一个方面，接下来优选探测杂交在探针寡核苷酸上的扩增的核酸。这种探测可以例如使用扩增的核酸的标记(Markierung)进行。所述标记例如可为光学标记，也可以是酶标记。通过酶标记可以催化酶反应，这种酶反应例如可由光学检测或者电化学检测到。根据本发明优选进行电化学检测，特别优选包括测量由氧化还原循环增强的电流。
本发明还特别涉及实施本发明方法的装置，其存在于微流体设备中并设有用于扩增核酸的第一腔和储存有上述贮藏时能保持稳定的添加剂的第二腔，其中该第二腔经由与第一腔的连接而可连接在流体通道(Fluidkommunication)中。所述装置优选包括微阵列装置，其具有固载在载体上的探针寡核苷酸。
可以导管或通道的形式连接第一腔和第二腔，并且优选例如通过阀进行选择性打开或闭合，这样可以使流体选择性地由第一腔流入第二腔或者由第二腔流入第一腔。此外，可以设置将溶剂引入第二腔的工具，例如为通往第二腔的输入通道的形式。
对于微阵列装置，优选配置探测杂交的核酸的工具(means)，这种工具使得能够进行例如光学或电化学探测。特别优选的是用于测量电流和/或电势的电化学探测的工具。光学探测的工具包括例如设备的透明区域，通过该区域可进行光吸收或荧光激发和读取荧光探测的数据。电化学探测的工具优选使得能够进行电势和/或电流的测量，并且可包括电极系统，在该系统上探针寡核苷酸固载(点样)于各探测点，正如在专利DE 101 26 341 A1或DE 100 58 397 A1中所记载的。
此外，为了储存和/或传递探测用的试剂如酶或酶基底，可以在微流体设备中设置相应的工具，如为相应的腔和/或通道的形式。
在第一腔(也为扩增腔)中优选设置有供热和/或散热的工具。在微流体设备中，该工具可以包括高热导率的区域，例如通过在该区域将微流体设备特别构建成薄壁而实现高热导率。但是也要考虑微流体设备自身中能产生或者散发热量的元件(Element)。
实施例
本发明的其他特征和优势可根据下文的附图描述和实施例以及附图得出，但是仅为例证性和说明性的。
附图说明：
图1：本发明方法的图示；
图2：根据第一实施方式实施本发明方法的装置的示意图；
图3：根据第二实施方式实施本发明方法的装置的示意图；
图4：带有图2装置的卡式盒的截面的示意图；
图5：没有使用本发明方法时，杂交的核酸的解链曲线的对比图；和
图6：使用本发明方法时，杂交的核酸的解链曲线的对比图。
图1示意性描述了本发明中用于微流体设备中分析核酸的方法的基本思想。根据现有技术已知，在杂交前需要纯化扩增粗产物，这体现一种减法性方法，即从含有扩增粗产物的溶液中除去干扰性成分(聚合酶、引物、核苷酸)。本发明方法与此相反，是一种加法性方法，即向扩增粗产物中加入添加剂，其能改进杂交反应或能接着改进杂合体的选择性分离。将添加剂加入扩增粗产物或将扩增粗产物加入添加剂在这里是无关紧要的，起决定作用的首先是使用扩增粗产物和添加剂的混合物进行杂交反应。
图2表示根据第一实施方式实施本发明方法的装置，其具有第一腔10a和第二腔20a。扩增反应结束后，将存在于溶液中的添加剂从第二腔20a(添加剂腔)泵入第一腔10a(扩增反应腔)。如果第二腔中的添加剂为干试剂，则首先向第二腔20a中泵入溶剂(水)使干试剂溶解，然后将该溶液输送到第一腔10a(扩增反应腔)。
图3表示根据第二实施方式实施本发明方法的装置，其具有第一腔10b和第二腔20b。此处以与上文记载的处理过程相反的方式进行：扩增反应结束后，扩增粗产物从第一腔10b(扩增反应腔)导入第二腔20b(添加剂腔)，并在第二腔20b中与添加剂充分混合。当添加剂为干试剂时，则将扩增粗产物泵至干试剂并将其溶解。
在两种实施方式中都将扩增粗产物与添加剂的混合物输送至微阵列进行杂交。
图4显示了根据图2所示实施方式的装置。图4所示的卡式盒101是由塑料材料制成。在卡式盒101中有通道130、通道150、通道160、腔110、腔120、腔140和凹孔121。可以方便地在塑料卡式盒上设置上开式通道、凹孔和腔，并在试剂点样后用膜封盖，这样可以封闭嵌入卡式盒表面的通道、凹孔和腔。由输入通道160可填充第一腔110，在该第一腔110中，例如可通过PCR反应扩增核酸。这可以通过将卡式盒插入相应设备来实现，从而能通过例如该设备中存在的珀耳帖(Peltier)元件加热或冷却腔110。含有EDTA和氯化钠的添加剂作为干试剂位于通道形式的第二腔120中的凹孔121里。腔120的末端处可由阀122闭合，例如可以构建成简单的挤压式阀。在完成PCR反应之后，向腔120中输入水，就会溶解作为干试剂储存的添加剂，接着打开阀122，溶解的添加剂就能输入扩增腔110。在扩增腔110中溶解的添加剂与扩增粗产物充分混合，然后该混合物经由通道130输入杂交腔140，里面有微阵列和固载于载体上的探针寡核苷酸。通过选择合适的流体学(Fluidik)，如几何形状和流速，可先在输入开始时提供未发生变化的扩增产物，然后在继续输入时能越来越多地混合添加剂物质。这样就可以向杂交腔中输入可能有利的、浓度递增的添加剂物质。在该腔中就可以发生杂交反应。过量的溶液将通过输出通道150流入废物容器(wastecontainer)。卡式盒上还可以存在其他腔和通道(未示出)，以便例如存储即将用于探测结合的核酸的试剂，如酶或酶的底物。
实施例
使用图4所示形式的压铸塑料卡片，将干试剂点样于卡片的凹孔121中，得到图5和图6所示曲线。为了评估本发明方法，通过PCR扩增凝血因子V野生型(FcV-野生型)和单突变的凝血因子V Leiden(FcV-Leiden)的基因，以得到168bp大的PCR产物。凝血因子V的基因产物是凝血级联(Blutgerinnungskaskade)的蛋白质，而所述突变记载在Bertima et al.，Nature，1994；369(6475)：64-7中。
将DNA试样引入第一腔(扩增腔)110进行PCR反应。将带有凹孔121的通道120充满水，由此溶解干试剂。将干试剂形式的添加剂点样，加入约25μl的水，形成具有0.23M NaCl、0.1M EDTA的溶液。这样通过络合就确保了足量浓度的单价阳离子以及游离Mg2+浓度的最小化。此外，向添加剂中加入缓冲物质，调节溶液的pH值为pH＝8。PCR反应结束后，使已溶解的添加剂流入第一腔110中，混合PCR粗产物和添加剂，将该混合物继续导入微阵列所在的腔140。在PCR反应时使用生物素化的引物可以得到生物素化的PCR产物。在微阵列装置中点样有探针寡核苷酸，可以通过它来区别FcV野生型和FcV-Leiden。按如下方式选择所述探针寡核苷酸，即一些点载有完全匹配FcV野生型的探针寡核苷酸，而另一些点载有完全匹配FcV-Leiden的探针寡核苷酸。例如，当FcV野生型序列位于PCR产物中时，这样的序列与野生型探针形成“完美匹配”(链与反链(Gegenstrand)完全匹配)，而与FcV-Leiden探针形成弱结合强度的“单碱基错配”。用洗液冲洗结合在探针分子上的PCR产物，所述洗液含有与链酶抗生物素蛋白偶联的酶(碱性磷酸酶)，这种酶能够结合微阵列上的生物素化PCR产物。然后用含有p-氨基苯基磷酸酯的底物溶液冲洗微阵列装置，该p-氨基苯基磷酸酯被碱性磷酸酶转变成p-氨基苯酚，所得p-氨基苯酚在微阵列装置的电极上发生氧化还原反应，被氧化成醌亚胺，这种p-氨基苯酚/醌亚胺氧化还原对是循环的，因此可以在电极上测量电流梯度。这种电流梯度(dI/dT)与PCR产物的结合量成比例关系。然后在约20℃～约60℃范围内逐步提高温度，在高温(约25℃以上)时杂交物会逐渐解链，其中带有单点突变的PCR产物因在杂交体中有错配(mismatch)而解链速度明显快于“完美匹配”的杂交体如野生型。由此得到了野生型(完美匹配)与单点突变体(单碱基错配)之间的可检测到的信号差异。在图5和图6中所示的曲线31a、31b、32a、32b总结了多个实验。信号强度表示为温度的函数。曲线31a、31b是FcV野生型的解链曲线，曲线32a、32b是FcV-Leiden的解链曲线。可以清楚的看出，相比于没有使用本发明方法的31a、32a(图5)，使用本发明加入添加剂的方法可以明显更好地重复解链曲线31b、32b(图6)(即，FcV野生型和FcV-Leiden的解链曲线分别靠的更近)，并且产生了更清晰的信号差异。重要的是，在高温下(T>35℃)明显更好地解链杂合体。本方法的一个有利性质是，杂交时腔140(探测腔)中的NaCl和EDTA的浓度增加。
需要强调的是，上述实施例仅为示例性的，关于添加剂种类和浓度、探测方式以及实施反应的多种变化方案是可以预见的。

Claims (30)

1.在微流体设备中分析核酸的方法，包括下列步骤：
a)在微流体设备的第一腔中扩增核酸；
b)使扩增的核酸与添加剂接触，该添加剂含有：
i)单价阳离子和
ii)Mg2+离子结合剂，
其中该添加剂存在于微流体设备的第二腔中；并且
c)将扩增的核酸与至少一种探针寡核苷酸杂交。
2.权利要求1的方法，其中单价阳离子以Na+离子的形式存在。
3.权利要求1或2的方法，其中Mg2+离子结合剂是EDTA。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中第二腔中的添加剂为干试剂。
5.权利要求4的方法，其中在使添加剂与扩增的核酸接触之前，向第二腔中引入溶剂。
6.权利要求5的方法，其中将添加剂以溶解的形式从第二腔输送至第一腔，使得添加剂与扩增的核酸接触。
7.权利要求1～4中任一项的方法，其中将扩增的核酸从第一腔输送入第二腔，使得添加剂与扩增的核酸接触。
8.权利要求7的方法，其中将溶液中扩增的核酸作为扩增粗产物输入第二腔，然后与添加剂一起作为混合物导入至少一种探针寡核苷酸。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中通过PCR反应扩增核酸。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中至少一种探针寡核苷酸以微阵列装置的形式固载于载体上。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中对杂交的扩增的核酸进行探测。
12.权利要求11的方法，其中使用扩增的核酸的标记进行探测。
13.权利要求12的方法，其中所述标记为光学标记。
14.权利要求12的方法，其中所述标记为酶标记。
15.权利要求14的方法，其中所述标记催化光学可探测的酶反应。
16.权利要求14的方法，其中所述标记催化电化学可检测的酶反应
17.权利要求16的方法，其中在电化学检测时，探测通过氧化还原循环增强的电流。
18.上述权利要求中任一项的方法，其中所述添加剂含有结合剂。
19.实施权利要求1～18之任一项方法的装置，其存在于微流体设备中，该微流体设备具有：
a)用于扩增核酸的第一腔；和
b)储藏有存贮期间保持稳定的添加剂的第二腔，该添加剂具有：
i)单价阳离子和
ii)Mg2+离子结合剂，
其中所述第二腔经由与第一腔的连接而能连接在流体通道中。
20.权利要求19的装置，其中单价阳离子以Na+离子的形式存在。
21.权利要求19或20的装置，其中Mg2+离子结合剂是EDTA。
22.权利要求19～21之任一项的装置，其中存在使流体选择性从第一腔输送至第二腔的工具。
23.权利要求19～21之任一项的装置，其中存在使流体选择性从第二腔输送至第一腔的措施。
24.权利要求19～23之任一项的装置，其中第二腔中的添加剂以干试剂形式储存。
25.权利要求24的装置，其中存在向第二腔中引入溶剂的工具。
26.权利要求19～25中任一项的装置，还具有微阵列装置，该装置具有固载于载体上的探针寡核苷酸。
27.权利要求19～26中任一项的装置，还具有光学探测杂交核酸的工具。
28.权利要求19～26中任一项的装置，还具有电化学探测杂交核酸的工具。
29.权利要求28的装置，其中所述电化学检测工具用于测量电流或电势。
30.权利要求19～29中任一项的装置，其中在第一腔中设置有供热和散热的工具。
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