CN101500587A - 抗病毒产品 - Google Patents

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CN101500587A CNA2007800301435A CN200780030143A CN101500587A CN 101500587 A CN101500587 A CN 101500587A CN A2007800301435 A CNA2007800301435 A CN A2007800301435A CN 200780030143 A CN200780030143 A CN 200780030143A CN 101500587 A CN101500587 A CN 101500587A
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Abstract

本发明涉及新型抗病毒产品、其在丙型肝炎治疗中的用途及其制备过程。更具体地说其涉及表现出针对丙型肝炎病毒(HCV)的抗病毒活性的特定产品。在一个实施方案中提供了在丙型肝炎抗病毒治疗中用作抗病毒剂的单一草药黄芪提取物、或其活性级分。

Description

抗病毒产品
发明技术领域
本发明涉及新型抗病毒产品、其在丙型肝炎治疗中的用途及其制备过程。更具体地说其涉及表现出针对丙型肝炎病毒(HCV)的抗病毒活性的特定产品。该产品在复制子测试和尤其是聚合酶测试(NS5B)中均表现出活性，表明其可能具有更广泛的活性，例如抗黄病毒科病毒的活性。
发明背景
HCV慢性感染是常见的，多至1％的英国人口受其影响，世界卫生组织(WHO)估计全球超过2亿人感染HCV。已知慢性HCV感染与广泛多种症状相关，包括乏力、上腹部疼痛和消化不良，从而导致生活质量的整体下降。使用药剂的常规治疗导致病毒载量降低但仅在40％的病人中有效。因此需要降低HCV感染相关症状的有效治疗并因此改善了更大比例的慢性丙型肝炎(CHC)病人的生活质量。
此外需要副作用更小的靶向致病病毒(并抑制其活性)的产品。
申请人的国际申请WO2005079823中公开了四种草药组合产品，该产品除提供症状缓解外，还通过复制子分析法表明其在1/350稀释下表现抗-HCV活性(41.8％的抑制)。
该产品由四种草药提取物组成，如下配制：
草药提取物：
●水飞蓟干提取物             0.200g
●丹参干提取物               0.225g
●五味子干提取物             0.400g
●黄芪干提取物               0.585g
赋形剂：
●Macrogol 6000粉末                                         0.600g
●Ferwogel 30.385(分子量3.5-4.0 x 106)                      0.070g
●甘露醇EZ                                                  0.160g
●气相二氧化硅200                                           0.050g
●阿斯巴甜                                                  0.050g
●焦糖粉末                                                  0.100g
●薄荷芳香粉末                                              0.060g
申请人进一步研究了该产品并意外发现抗-HCV活性似乎仅来自一种植物，其表现出良好活性而检测不到细胞毒性。该植物为黄芪，进一步测定以大于10倍、更具体地大于50倍、更具体地大于75倍和最具体地75倍到200倍纯化的级分具有特别的活性。
可通过下述三步过程有效地高产率产生所述活性级分：
I.酒精抽提(可重复)；
II.乙醇-水沉淀过程(可重复)；以及
III.具有多种不同极性的溶剂的系统性溶剂分馏步骤。
所述系统性溶剂分馏优选采用多种不同溶剂，以最小的极性起始以最大的极性终止。所述活性级分为二氯甲烷级分或相似极性的溶剂。
所述活性级分(及亚级分)依据一种或多种标记物进行表征，所述活性级分的一种或组合可造成抗-HCV活性和聚合酶抑制。鉴定的具体标记物包括：
●黄芪苷I、
●芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷、以及
●3’-羟基-芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷。
另外，它们可通过详述的说明书所示的TLC指纹的方法鉴定。
表现出所述活性的植物是豆科成员，更具体地说就是黄芪：
药用名：黄芪(Radix Astragali Membranaceous)；
植物名：膜荚黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.)或蒙古黄芪(Astragalus membranaceus Bge var.Mongholicus Hsiao)(下文称黄芪)。
该植物在欧洲称为紫云英(Milkvetch)，使用的是其根部。
传统中草药中使用剂量为9-30g(基于干的原材料)，偶尔高至60g。其一般是煎煮服用。根据《中华人民共和国药典》(英文版2000)卷一，一种冷水抽提法得到不少于17％的水溶性提取物。
根据《中草药，药物学》修订版，通过化学方法已知黄芪的根所含主要成分为D-β天冬酰胺、2’4’-二羟基-5，6-二甲氧基异黄酮、毛蕊异黄酮、芒柄花素、环黄芪醇(cycloastragenol)、黄芪苷、胆碱、甜菜碱、熊竹素(kumatakenin)、蔗糖、葡萄糖醛酸和β-谷甾醇。
其化学组分在Springer-Verlag出版的《植物源中药(ChineseDrugs of Plant origin)》有深入讨论，讨论了其药理学以及在慢性肝炎治疗中的症状缓解。
根据世界科学出版社出版的Chang HM和But PP(1987)的《中药学到药理学和应用(Pharmacology and a pplications of ChineseMateria Medica》(卷二)，黄芪可增强免疫功能。更具体地说是参考采用每日0.4ml的100％汤剂以“保护”肝脏和注射黄芪的临床试验使80％的病人GPT水平达到正常。(此为对症治疗。)
上述参考文献或其他发表著作中均未教授采用单一草药黄芪、或其限定级分作为丙型肝炎治疗的抗病毒剂。
已明确的其他现有技术包括：
CN1616097，其公开了含减毒新城疫病毒疫苗或灭活新城疫病毒疫苗、10-120血凝单位、黄芪1-20000mg、甘草素(Liquiritigenin)1-1000mg、辅助材料和稳定剂的锭剂。声称其适合用于预防SARS和其他病毒性感染的呼吸道疾病并对乙型和丙型肝炎具有辅助治疗作用。
CN1607003，其公开了含冬虫夏草(占5-9成)和黄芪(占1-5成)的组合物作为丙型肝炎的辅助治疗剂的用途。声称其调节免疫功能并提高疗效。
US2005/0074428，其公开了含50-90wt％冬虫夏草和10-50wt％黄芪的佐剂与干扰素和利巴韦林组合使用用来治疗丙型肝炎。
CN 1448163，其公开了用以治疗包括丙型肝炎在内的多种疾病的含黄芪等11种草药的中国处方。
CN1393255，其公开了用以治疗丙型肝炎的含黄芪的19种草药的混合。
CN1593586，其公开了用以治疗丙型肝炎的含15种草药的药丸，其中一味是生黄芪。
US2005/0147699，其公开了黄芪和党参混合提取物用于抑制癌症发生和转移的用途。其声称传统药典中曾记载黄芪用以治疗慢性肾炎、蛋白尿、肌炎、抗高血压、冠状动脉疾病、脑梗死、消化性溃疡(十二指肠和胃溃疡)、肾脏疾病和糖尿病。该专利未提及其作为抗病毒试剂的可能用途。
实际上没有任何一篇文献提出单一草药黄芪提取物可单独用作抗病毒剂以治疗肝炎、尤其是丙型肝炎。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了在丙型肝炎治疗中用作抗病毒剂的单一草药黄芪提取物或其活性级分。
活性级分优选为相对于干植物原材料至少10倍纯化的黄芪提取物，其特征在于它含有至少一种下列标记物：
●黄芪苷I；
●芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷；以及
●3’-羟基-芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷。
优选地，其含有所有三种标记物。
在一个特别优选实施方案中，所述提取物以至少50倍纯化，最优选75至200倍纯化，并通过上文鉴定的三种标记物的存在加以表征。实际上，该级分中可鉴定出至少6个特定的峰。
在一个优选实施方案中，该提取物用作或配制成植物药。
在一个备选实施方案中，该提取物可用作食品、膳食补充剂或食品添加剂。术语食品包括食物或饮料以及用于上述物品的组分的物品。
本文中使用的植物学术语旨在具有与FDA在其指导文件《植物药物产品生产指南(Guidance of Industry-Botanical Drug Products)》(2004年6月)中使用的意思，该指导文件通过参考引入本文。但是，本领域技术人员会理解在不同国家可能使用不同的命名法。对FDA指南中命名法的参考系基于一致性考虑，不应作为限制。因此，技术人员理解本文中所使用术语包括例如EMEA在其《草药产品/传统草药产品质量指导原则(Guidelines on Quality of Herbal MedicinalProducts/Traditional Herbal Medicinal Products)》(CHMP/THMP2006年3月采纳)所使用的不同的但等同的术语。
根据本发明第二方面，提供了以表明其适合并旨在用作治疗丙型肝炎的抗病毒剂的方式包装或另外销售的黄芪原材料。
所述原材料优选从指定产地在规范农业操作下种植和收获。
根据本发明的第三方面，提供了黄芪或其单一草药提取物在制备用于丙型肝炎的抗病毒治疗的药物的用途。
根据本发明的第四方面，提供了黄芪或其单一草药提取物在制备用于丙型肝炎的抗病毒治疗的食品、膳食补充剂或食品添加剂的用途。
根据本发明第五方面，提供了生产黄芪提取物的方法，该提取物在复制子分析法中表现出抗-HCV活性，其以相对于植物原材料至少10倍纯化，并且其特征在于它含有至少一种下列标记物：
●黄芪苷I、
●芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷、以及
●3’-羟基-芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷
所述方法包括：
1)酒精抽提(可重复)；
2)乙醇-水沉淀过程(可重复)；以及
3)具用多种不同极性的溶剂的系统性溶剂分馏步骤。
酒精抽提优选为乙醇抽提。乙醇抽提优选在回流下进行。最优选重复抽提。优选使用高浓度乙醇(浓度大于50％)。
酒精抽提之后进行乙醇-水沉淀，收集上清。去除乙醇剩下浓缩物。
随后将浓缩物溶于水以得到水溶液，将其进行使用不同极性溶剂的系统性溶剂分馏。优选溶剂为：石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯。
活性级分为二氯甲烷抽提物AS-C。
根据本发明的第六方面，提供了治疗丙型肝炎的方法，其包括施用有效量的单一草药黄芪提取物或其活性级分。
因此单一草药黄芪、或其活性级分优选以单位剂量形式提供。最优选其以适合口腔递送的形式例如填充的胶囊提供。本领域技术人员理解可备选地以其他剂量形式。
所述提取物优选使用等同于9到60g干原材料/天的量。
在一个实施方案中，以与至少一种其他免疫调节或抗病毒药物，例如干扰素和/或利巴韦林的组合治疗的方式施用黄芪或其活性级分。
所述药物可一起同时施用或依次施用。
根据本发明的第七方面，提供了含有黄芪提取物的植物药、食品、膳食补充剂或食品添加剂，该提取物以相对于干植物原材料至少10倍纯化，并且其特征在于它含有至少一种下列标记物：
●黄芪苷I；
●芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷；以及
●3’-羟基-芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷。
可通过如图4-6中任一项所示的TLC指纹呈现的特征点的存在进一步对其进行表征。
本发明将参考下列方法和数据仅以举例的方式进一步示例说明，其中：
图1显示SMA和AMR两者的抗-丙型肝炎病毒活性以及毒性数据；
图2为生成含少于15％起始原材料重量的初级抽提物的酒精抽提过程的流程图；
图3为生成更加浓缩的活性组分或二级提取物的初级提取物分馏的流程图；
图4为多种不同级分的TLC指纹(UV254nm)；
图5为多种不同级分的TLC指纹(UV365nm)；
图6为多种不同级分的TLC指纹(日光)；
图7为显示复制子分析中不同组分的活性的图；
图8为显示不同浓度ASC 705(14)的活性的图；
图9为二级提取物的进一步分馏的流程图；
图10为氯仿/甲醇9:1中AS-C-I到AS-C-V5个级分的TLC指纹；
图11为氯仿/甲醇/水8:2:02中AS-C-I到AS-C-V5个级分的TLC指纹；
图12为显示存在于不同AS-C-I亚级分中的成分的分离、纯化和化学鉴定的流程图；
图13为氯仿/乙醇/水85:15:1中“ASC-I-1”的TLC指纹；
图14为氯仿/乙醇/水85:15:1(UV 254nm)中“ASC-I-2”和“ASC-I-3”的TLC指纹；以及
图15为氯仿/乙醇/水85:15:1(碘)中“ASC-I-2”和“ASC-I-3”的TLC指纹。
发明详述
方法
实施例1
草药组分级分的活性
在发现四种草药组合表现出抗丙型肝炎活性(通过复制子分析)后，申请人调查了个别草药的活性。图1显示Pyn 17组分的活性：
●AMR-黄芪；
●SCF-五味子；
●SMR-丹参；以及
●SMF-水飞蓟果
与对照比较：
●PYN17-四种草药组合(阳性对照)；以及
●BCSMRO404-无植物提取物(阴性对照)。
AMR和SMR在HCV复制子分析中似乎都表现出抑制活性。这在高浓度时尤其明显，如图1中左边的板所示。图1中右边的板显示同一批复制子细胞中的细胞毒性数据。这表明AMR无可观测到的细胞毒性而SMR在高浓度时有细胞毒性。
在已确定黄芪具有活性而无毒性之后，他们试图鉴定特定活性级分。
实施例2。
黄芪提取过程
将根材料在烘箱中于60℃干燥3个小时，粉碎成粗粉再用筛网(10目)筛过。然后将其如图2所示用酒精提取。
简单来说这包括以下步骤：
1.向100g黄芪粗粉末(1)中加入70％的乙醇(10倍于原材料)。将其回流1.5小时再将溶液(2a)与残渣(3a)分开；
2.向残渣中加入70％的乙醇(8倍于原材料)。将其回流1小时再将溶液(2b)与残渣(3b)分开；
3.将溶液(2a和2b)合并，在真空0.08MPa压力下回收乙醇得到50ml的浓缩物(4)；
4.向浓缩物中加入95％的乙醇。将溶液放置过夜再通过过滤将沉淀与上清(5)分离。
5.再次在真空0.08Mpa压力下回收乙醇获得浓缩物(6)。
6.浓缩物在真空0.08Mpa压力下于60-70℃干燥得到固体提取物(7)。
7.随后将固体提取物研磨成粉末(8)。此粉末状初级抽提物具有相对于起始材料干重11.7％到13％重量比的固体产率。即其经过了8倍纯化。
黄芪的标准化学标记物-黄芪苷IV的含量超过0.4％。
实施例3
将如图2所示方法获得的初级提取物以图3所示进行分馏。简单来说这包括以下步骤：
1.向初级提取物(8)中加入95％的乙醇达到80％，再次放置过夜。通过过滤将沉淀(9)“AS-F”与上清(10)“AS-A”分离；
2.在真空0.08MPa压力下回收乙醇获得浓缩溶液(11)。
3.向浓缩溶液(11)中加入水以形成水溶液(12)，用如下对其依次分配：
a.用石油醚以获得级分(13)“AS-B”；
b.用二氯甲烷以获得级分(14)“AS-C”；以及
c.用乙酸乙酯以获得级分(15)“AS-D”；和
d.水级分(16)“AS-E”。
将级分(9)、(10)、(13)、(14)、(15)和(16)如下面表1所述进行进一步的活性检测。
表1.
Figure A200780030143D00131
图4-6为TLC板，从左到右显示级分(9)、(10)、(13)、(14)、(15)、和(16)。TLC板为硅胶，显影系统是氯仿/甲醇/水(8:2:0.2)。
图4显示用UV在254nm下检测；
图5显示用UV在365nm下检测；
图6为以含10％硫酸的乙醇处理，然后加热之后，在日光下观察。
级分(14)显示出多个不同的点。至少有6个在254nm下清晰可见。
在复制子分析中发现级分14AS-C具有显著活性(实施例4-表5)。其具有相对于起始材料干重的1.1％重量比的固体产率。实际上其经过了约90倍纯化。
此级分层析图谱如图4-6所示。
实施例4
为了测试级分ASA-ASF的活性，每个样品取10mg溶于1ml DMSO中并超声处理15分钟。另外两个样品PA(WO2005079823所述黄芪粗提取物)和INF α(标准处理)作为对比物进行处理。样品的溶解度列于下面表2中：
表2.
 
样品编号 样品名称 溶解度
1 PA 0705 未完全溶于DMSO
2 ASA 0705 完全溶解
3 ASB 0705 溶于DMSO，当进一步稀释于培养液时形成细小沉淀
4 ASC 0705 完全溶解
5 ASD 0705 完全溶解
6 ASE 0705 完全溶解
7 ASF 0705 完全溶解
8 IFN α
随后将DMSO溶液以1/10稀释于组织培养液并过滤。此浓度称为NEAT。每孔使用10μl，检测孔中总体积为100μl。所有浓度设置5次重复。DMSO同一稀释液设置3次重复。
抽提物样品的稀释度列于下面的表3中，IFN α的稀释度列于表4中。
表3.
 
稀释度 终浓度μg/ml
未稀释 100
1/2 50
1/4 25
1/8 12.5
1/10 10
1/25 4
1/50 2
1/100 1
表4.
 
终浓度IU/ml 终浓度pg/ml
200 1000
100 500
50 250
10 50
5 25
2.5 12.5
1 5
0.5 2.5
在第一项分析中，将复制子细胞以5 x 103/孔的密度植于90μl溶液中。第二天加入10μl待测样品。平板继续培养72小时，然后收集并采用Dual Luciferase Assay Promega分析。复制子细胞系表达Renilla荧光素酶。
通过设置一个具有一式两份的每个样品和浓度的独立96孔板就细胞毒性测试样品。细胞用氚化的胸腺嘧啶核苷标记24小时并收集。
在第二项分析中，设置一个具有前5个高浓度的独立平板并以wst-1(Roche)标记2个小时，然后在450nm和630nm下读取OD值。Wst-1是一种活细胞染色剂。
结果
分析1：未加任何药物的细胞的读数平均值198906。
结果列于表5中。
表5.
Renilla荧光酶表达的抑制％
 
浓度μg/ml PA0705 ASA0705 ASB0705 ASC0705 ASD0705 ASE0705 ASF0705 浓度pg/ml IFN α
100 6 0 77 98.2 60.5 0 46 1000 85
50 0 0 98 0 0 0 500 67.5
25 0 97 0 0 0 250 46.1
12.5 1 91.6 0 0 0 50 26
10 52 0 0 0 25 22
4 12.5
2 5
未加药物获得的读数很高。
就该分析而言，在上述浓度而含有干扰素获得的结果具有代表性。
这些结果似乎显示一些样品在较高浓度时可产生抑制作用，因此重复了该分析。
分析2.
结果列于表6中。
表6.
未加药物的细胞的读数平均值。71676。
Renilla荧光酶表达的抑制％
 
浓度μg/ml PA0705 ASA0705 ASB0705 ASC0705 ASD0705 ASE0705 ASF0705 浓度pg/ml IFN α
100 7 64.1 58 99 79 36 89 1000 98
50 0 00 0 98.8 0 0 12 500 95
25 0 0 0 96 0 0 19 250 981
12.5 0 0 0 73 0 0 30 50 70
10 0 0 0 71.2 0 0 38 25 64
4 0 0 0 46.6 0 0 35 12.5 45
2 0 0 0 40.6 0 0 5 58
1 0 0 0 15.4 0 0
用wst-1分析法检测稀释度的细胞毒性，此平板也在显微镜下进行检查。该分析不检测细胞生长抑制剂。
样品4的前2个稀释度杀死了细胞；在第三浓度下，它们看上去不太健康。所有其他样品具有看上去健康的细胞。这体现于wst-1结果中。
分析2 wst-1结果。
结果列于表7中
表7.
450nm下OD值平均数
 
浓度μg/ml 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 浓度pg/ml IFN α
100 0.443 0.522 0.802 0.306 0.713 0.520 0.619 1000 0.728
50 0.455 0.546 0.836 0.445 0.839 0.736 0.821 500 0.740
25 0.585 0.532 0.756 0.683 0.750 0.875 0.590 250 0.650
12.5 0.561 0.507 0.539 0.602 0.567 1.020 0.967 50 0.772
10 0.542 0.747 0.507 0.884 0.705 0.888 0.887 25 0.527
需要指出的是IFN α的浓度单位是pg/ml。
此结果图示在图7和8中。
图7显示样品对比浓度的原始复制子评分。ASC-0705无疑是表现最好的，胜过IFN α(标准处理)。其也表明最高活性位于10μg/ml以上的浓度。
图8显示活性对比浓度。显然最佳浓度是大于约1.36μM。
实施例5
将级分(14AS-C)如图9所示和如下所述进行层析分离步骤处理。简单地说这包含以下步骤：
1.将来自黄芪的6.2g二氯甲烷抽提物(14)“AS-C”通过硅胶柱层析进行分离并用氯仿、氯仿/甲醇(100:5)、氯仿/甲醇(100:10)、氯仿/甲醇(100:15)、以及甲醇进行梯度洗脱，获得的25个级分，将其先分成6组(17、18、19、20、21和22)；
2.合并的级分1-14(17)不含重要化合物；
3.级分15(18)的重量是241mg，用交联葡聚糖柱层析进一步纯化两次并用甲醇洗脱得到级分(23)“AS-C-II”，其显示有活性却也表现出毒性。
4.级分17(19)的重量是231mg，用硅胶柱层析和氯仿/甲醇(94:6)洗脱进一步分离成两个级分。这两个级分为重13mg的级分(24)“AS-C-III”和重14mg的(25)“AS-C-IV”；
5.将第18级分(20)静置，沉淀的649mg白色粉末作为AS-C-I。发现该级分表现出活性而无毒性。
6.第22级分(21)重219mg，以交联葡聚糖柱和硅胶柱分离得到18mg的级分(26)“AS-C-V”。
进行测试的提取物于下面的表8中明确列出：
表8
Figure A200780030143D00181
*基于以下方式计算：100g初级提取物(8)含12.85％的起始材料，因此相当于778.2g重的干原材料。
对5个参考亚级分中的每一个样品进行TLC分析，结果如图10和11所示。
图10显示在氯仿/甲醇(9:1)中显影的硅胶板。左边的板是在254nm UV下观察，右边的板是在日光下观察(以含10％硫酸的乙醇喷涂然后加热平板直至斑点清晰可见)。
图11显示在氯仿/甲醇/水(8:2:0.2)中显影的硅胶板。左边的板是在254nm UV下观察，右边的板是在日光下观察(以含10％硫酸的乙醇喷涂然后加热平板直至斑点清晰可见)。
这两种情况下，样品从左至右依次为：AS-C-I、AS-C-II、AS-C-III、AS-C-IV、AS-C-V。
实施例6
“AS-C”、“AS-C-I”、“AS-C-II”、“AS-C-III”、“AS-C-IV”和“AS-C-V”六个样品都各自溶于DMSO中得到10mg/ml的储备液。样品进行：
1.纯度和性质分析；以及
2.抗HCV活性测试。
1.纯度和性质
使用LC-UV和LC-MS对AS-C、AS-C-I、AS-C-II、AS-C-III、AS-C-IV、AS-C-V六个样品就纯度和性质进行分析。该分析得到以下数据
●AS-C级分含几个(>6)小峰(m/z 269、301、303等)
●AS-C-I两个主峰(m/z 269、301)
●AS-C-II一个峰(m/z 301)
●AS-C-III一个峰(m/z 303)
●AS-C-IV一个峰(m/z 269)
●AS-C-V没有峰
在此阶段，对应于峰的成分还未鉴定，因此可以做的唯一估算就是比较峰面积与DMSO峰面积：
I.“AS-C-II”和“AS-C-IV”含比DMSO峰高的单个峰。
II.“AS-C”和“AS-C-I”为混合物；
III.“AS-C-III”含比DMSO峰低的单个峰。
IV.“AS-C-V”不含UV下可见的任何峰。
需要指出的是纯度是通过UV检测分析的，任何在UV中不吸收的物质不会被检测到。通过MS分析来自峰的材料以测定其m/z(上文中已给出)。
2.抗-HCV活性
如下就抗-HCV活性测试样品：
a)复制子分析(Reblikon)、
b)NS5B分析以及
c)NS3/NS4A全长蛋白酶分析。
为了评估复制子分析中任何“命中(hit)”的选择性，也在Huh7细胞中就细胞毒性测试样品。
结果列于下面的表9中，另外还包括纯度、峰面积和性质数据。
表9
Figure A200780030143D00201
Figure A200780030143D00211
从此表可确定以下几项：
样品、“AS-C”(混合物)
●a)抑制复制子细胞中的HCV复制，显示EC50＝3.7μg/ml；
●b)在9.2μg/ml抑制NS5B；m
●c)在NS3/NS4分析中于100μg/ml产生95％抑制。
●d)浓度高至100μg/ml不表现出细胞毒性。
AS-C-I和AS-C-II
●a)也在复制子分析中表现出一定的活性，但仅在更高浓度时，测定的EC50值分别为36和17μg/ml
实施例7
为了进一步表征表现最强活性的“AS-C”级分(14)，将其与级分“AS-C-I”(20)进行比较，因为后者也表现活性。因此结论为其含有一个或多个造成该活性的活性物，后者可作为标记物。
因此，参考图12，进行了以下操作：
1.将6.2g(14)AS-C通过硅胶柱层析分离并用氯仿/甲醇(100:15)洗脱。来自第18级分(20)的沉淀白色粉末称为“AS-C-1”(649mg)。
2.将ASC-1(20)通过超声处理溶于甲醇，再过滤。滤出液通过交联葡聚糖LH-20柱分离得到如图13-15所示的TLC板所示的三种主要化合物。
3.合并的级分4-6(28)在喷涂硫酸并加热后显示一个点。
4.当把平板置于碘蒸气中并在UV254nm下观察时，合并的级分9-11(30)显示两个点。
5.合并的级分4-6(28)在通过硅胶柱纯化和氯仿/甲醇：9:1(32)洗脱后含有痕量的色素。
6.将该样品(32)溶于丙酮，冷冻并再结晶，得到“AS-C-1-1”(33)。
7.合并的级分9-11(30)通过胶柱(34)纯化和随后的TLC方法(35)后显示荧光点。分离这两个荧光条带。将更高Rf值的条带洗脱获得“AS-C-I-2”(36)；而更低Rf值的条带则通过交联葡聚糖LH-20柱纯化得到“AS-C-I-3”(37)。
鉴定出的三个化合物分别通过质谱和核磁共振谱进行分析。通过将所得数据与关于化学结构的已知文献比较来确定这三个化合物的结构并列于表10中。
表10
Figure A200780030143D00221
这些化合物具有以下结构：
结构式1黄芪苷I(AS-C-I-1)
                       R1＝R2＝AC、R3＝Glc
结构式2：芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷(AS-C-I-2)
结构式3：3’-羟基-芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷(AS-C-I-3)
Figure A200780030143D00233

Claims (23)

1.在丙型肝炎治疗中用作抗病毒剂的单一草药黄芪提取物、或其活性级分。
2.如权利要求1中所述的单一草药黄芪提取物、或其活性级分，其中所述活性级分为相对于干植物原材料至少10倍纯化的黄芪提取物，并且其特征在于它含有至少一种下列标记物：
·黄芪苷I；
·芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷；以及
·3’-羟基-芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷。
3.如权利要求2中所述的单一草药黄芪提取物、或其活性级分，其中所述活性级分为相对于干植物原材料50倍纯化的黄芪提取物。
4.如权利要求3中所述的单一草药黄芪提取物、或其活性级分，其中所述活性级分为相对于干植物原材料75到200倍纯化的黄芪提取物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的单一草药黄芪提取物、或其活性级分，其源自酒精抽提物。
6.如权利要求5中所述的单一草药黄芪提取物、或其活性级分，其中所述提取物已经经过乙醇-水沉淀过程。
7.如权利要求5或6中所述的单一草药黄芪提取物、或其活性级分，其中所述提取物已经经过具有多种不同极性溶剂的系统性溶剂分馏步骤。
8.如权利要求7中所述的单一草药黄芪提取物、或其活性级分，其中所述活性级分由二氯甲烷级分或相似极性的溶剂得到。
9.如以上权利要求中任一项所述的单一草药黄芪提取物、或其活性级分，其中黄芪为膜荚黄芪或蒙古黄芪。
10.以表明其适合并旨在用作抗病毒剂以治疗丙型肝炎的方式包装或另外销售的黄芪原材料。
11.黄芪或其单一草药提取物在制备用于丙型肝炎的抗病毒治疗的药物中的用途。
12.黄芪或其单一草药提取物在制备用于丙型肝炎的抗病毒治疗的食品、膳食补充剂或食品添加剂中的用途。
13.生产黄芪提取物的方法，该提取物在复制子分析中表现出抗-HCV活性，并且其相对于干植物原材料至少10倍纯化，其特征在于它含有至少一种下列标记物：
·黄芪苷I；
·芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷；以及
·3’-羟基-芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷所述方法包括：
a.酒精抽提(可重复)；
b.乙醇-水沉淀过程(可重复)；以及
c.具有多种不同极性的溶剂的系统性溶剂分馏步骤。
14.如权利要求13中所述的方法，其中所述酒精抽提为乙醇抽提。
15.如权利要求14中所述的方法，其中具有多种不同极性溶剂的系统性溶剂分馏步骤包括二氯甲烷分馏或使用与二氯甲烷具有相似极性的溶剂的分馏。
16.治疗丙型肝炎的方法，其包括施用有效量的单一草药黄芪、或其活性级分。
17.如权利要求16中所述的方法，其中黄芪提取物、或其活性级分以单位剂量形式提供。
18.如权利要求17中所述的方法，其中所述单位剂量形式用于口腔递送。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中日剂量相当于9-60g原材料。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中与至少一种其他免疫调节或抗病毒药物联合施用。
21.如权利要求20中所述的方法，其中所述其他药物为干扰素和/或利巴韦林。
22.含有相对于干植物原材料至少10倍纯化的黄芪提取物的植物药物、食品、膳食补充剂或食品添加剂，并且其特征在于它含有至少一种下列标记物：
·黄芪苷I；
·芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷；以及
·3’-羟基-芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷。
23.具有实质上如图4、5、6中任一项所示的TLC指纹的黄芪提取物级分。
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