CN101497608B - 一类hiv蛋白酶抑制剂衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类HIV蛋白酶抑制剂衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药中的应用；该类HIV蛋白抑制剂衍生物具有如通式X所示的结构，制备本发明的该类HIV蛋白酶抑制剂衍生物采用价廉易得的茚为起始原料，经双羟基化，保护后，苄位氧化引入羰基，再将羰基转化成氨基，得到需要的反应中间体CH05-05。另外一个分子砌块由茚地那韦(CH05-06)制备，先进行水解反应，再将羟基保护，再和CH05-05进行一个酸胺的缩合，去保护，得到了目标产物。本发明的HIV蛋白酶抑制剂衍生物在微摩尔级具有抑制肿瘤细胞活性、抑制多种肿瘤细胞株的生长，能用于开发广谱抗肿瘤药物，应用前景广阔。

Description

一类HIV蛋白酶抑制剂衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药中的应用

技术领域

本发明涉及化学合成、医药领域，具体涉及一类HIV蛋白酶抑制剂衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类生命的疾病，其死亡率仅次于心脑血管疾病，且发生率有逐年上升的趋势。因此，肿瘤防治受到社会各界的普遍关注。肿瘤化学治疗(以下简称化疗)是肿瘤治疗的三个基本手段之一，经过50多年的发展，用于肿瘤治疗的药物已取得了巨大的成就，获得了一大批具有不同作用机制的临床抗肿瘤药物；遗憾的是这些抗肿瘤药物都有不同程度的毒副作用，因而在临床上使许多病人不能坚持连续接受治疗；另外，化疗耐药和肿瘤转移性的产生常常使肿瘤治疗达不到预期的效果。因此，寻找新的毒副作用小、没有耐药性的药物具有重要的意义。

人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶抑制剂通过抑制HIV病毒的蛋白酶，可以抑制HIV病毒在体内的复制。HIV蛋白酶抑制剂在艾滋病(AIDS)的高效抗逆转录病毒治疗(HAART)疗法中起着重要的作用。有证据表明，随着HAART疗法的广泛使用，与艾滋病相关的恶性肿瘤，如卡波氏肉瘤的发病率显著减少。从而激发人们开始研究HIV蛋白酶抑制剂是否能够抑制肿瘤。有研究表明，HIV蛋白酶抑制剂利托那韦(Ritonavir)、沙奎那维(Saquinavir)、萘非那韦(Nelfinavir)、茚地那韦(Indinavir)等均能在体内抑制肿瘤的生长。

这些HIV蛋白酶抑制剂作为HAART疗法的药物，具有类药性质和毒性小等特点。但是，HIV蛋白酶抑制剂的抗肿瘤活性较低。。

发明内容

本发明的目的在于提供一类HIV蛋白酶抑制剂衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药中的应用；该类化合物对人肿瘤细胞的生长具有抑制作用，可以作为活性成分用于抗肿瘤药物中。

为实现上述目的，采用如下技术方案：

本发明的一类HIV蛋白抑制剂衍生物(C₃₉H₅₁N₅O₅-(1(1S，2R)，5(S))-2，3，5-三脱氧-N-(2，3-二氢-2，3-丙酮叉氧基-1H-茚-1-基)-5-[2-[[(1，1-二甲基乙基)氨基]羰基]-4-(3-吡啶甲基)-1-哌嗪基]-2-(苯甲基)-D-赤式-戊酰胺)具有如通式X所示的结构：

其包括所有可能的立体异构体及药学上可接受的盐；

其中，

R¹选自H、C_1-10的直链或支链烷基、带有一个或多个羟基、氨基或卤原子的C_1-3的烷基和苄基中的任一种；

R²选自H、OCH₃、CF₃、卤素或五元杂环；

R³和R⁴选自C_1-4的直链或支链烷基或相连的与醛酮生成的缩醛或缩酮。

优选的，当所述R¹和所述R²选自H时，所述R³和所述R⁴为丙酮叉基。

本发明的一种药物组合物，其特征在于，包含有效量的至少一种上述化合物。

上述的具有通式X结构的化合物的制备方法，其制备过程的反应式如下：

其中式I化合物CH05-SM1从上海达瑞精细化学品公司购得和式VI化合物CH05-06从浙江华海药业股份有限公司购得。

所述制备过程进一步包括在充分条件下经过下列步骤将式I化合物

转变为式V化合物

(1)将式I化合物通过与甲酸和双氧水及氢氧化钠反应，进行双羟基化；

(2)将步骤(1)所得的化合物通过与浓硫酸和丙酮反应，保护羟基；

(3)将步骤(2)得到的化合物通过与三氧化镉、二氯甲烷和过氧叔丁醇反应，在苄位氧化引入羰基；

(4)将步骤(3)得到的化合物通过与盐酸羟胺反应，以及与氯化镍和甲醇反应，将羰基转化成氨基，得到式V化合物。

所述制备过程进一步包括在充分条件下经过下列步骤将式VI化合物

转变为式X化合物

(1)将式VI化合物通过与乙醇和氢氧化钾进行水解反应；

(2)将步骤(1)得到的化合物与咪唑、无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)反应，保护羟基；

(3)将步骤(2)得到的化合物与1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基-苯并-三氮唑(HOBT)、三乙胺(Et3N)、无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和式V化合物进行酸胺缩合反应；

(4)将步骤(3)得到的化合物与二氯甲烷和三氟乙酸反应，去保护得到式X化合物。

上述的一类HIV蛋白酶抑制剂衍生物在制备抗肿瘤药中的应用。

本发明的该类HIV蛋白酶抑制剂衍生物的制备方法采用价廉易得的茚为起始原料，经双羟基化，保护后，苄位氧化引入羰基，再将羰基转化成氨基，得到需要的式V的化合物CH05-05，CH05-05位该反应的中间体。另外一个分子砌块由式VI的化合物茚地那韦(CH05-06)制备，先进行水解反应，再将羟基保护，再和CH05-05进行一个酸胺的缩合，去保护，得到了目标产物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的HIV蛋白酶抑制剂衍生物在微摩尔级具有抑制肿瘤细胞活性、抑制多种肿瘤细胞株的生长，能用于开发广谱抗肿瘤药物，应用前景广阔。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明的HIV蛋白抑制剂衍生物的合成反应式如下：

为便于实施例的描述，将式I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X的化合物分别称之为CH05-SM1、CH05-01、CH05-02、CH05-03、CH05-05、CH05-06、CH05-07、CH05-08、CH05-09、CH05-10，因此，本发明的HIV蛋白抑制剂衍生物的合成反应过程可以如下表示：

实施例1：化合物CH05-05的合成

化合物CH05-01的合成(C₉H₁₀O₂)

在500ml的三口圆底烧瓶中加入180ml88％的甲酸溶液，搅拌下，将H₂O₂(30％)42ml滴入，滴毕，在35℃搅拌15min。然后，34.8g茚(CH05-SM1)被缓慢加入，控制滴加速度，保持温度在35-40℃。滴完，40℃搅拌1h后，反应过夜。减压浓缩，去掉甲酸和水，加入50mlNaOH水溶液(10mol/L)，搅拌10min后，用乙酸乙酯趁热萃取6次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。去掉溶剂，重结晶，得白色粉末状固体22.6g，产率为50％。CH05-01：

ESI-MS：151(M+H)⁺；

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)d：2.26(brs，2H)，2.93-2.99(m，1H)，3.10-3.16(m，1H)，4.49-4.54(m，1H)，5.02(d，1H，J＝5.2Hz)，7.26-7.29(m，3H)，7.43(m，1H)。

化合物CH05-02的合成(C₁₂H₁₄O₂)

在500ml圆底烧瓶中，加入15g化合物CH05-01，300ml丙酮和15ml浓硫酸，加热至回流，反应5min，冷至室温，加入10g NaHCO₃搅拌20分钟，旋蒸去除丙酮，残留物溶于1L乙醚中，水洗涤两次，有机相干燥后，浓缩，得到淡黄色固体17.5g，产率为92％。CH05-02：

ESI-MS：191(M+H)⁺；

¹H NMR(400MHz，

δ：1.13(s，3H)，1.34(s，3H)，3.06(d，2H，J＝4.4Hz)，4.86-4.90(m，1H)，5.45(d，1H，J＝5.6Hz)，7.12-7.21(m，3H)，7.34(d，1H，J＝7.2Hz)。

化合物CH05-03的合成(C₁₂H₁₂O₃)

500ml的圆底烧瓶中分别加入274mg CrO₃，350ml二氯甲烷，22.1g 65％过氧叔丁醇，冰浴搅拌下缓慢滴加5g CH05-02，溶于40mL二氯甲烷制成的溶液，滴加完后撤去冰浴，继续搅拌24小时。TLC(薄层层析，石油醚∶乙酸乙酯＝10∶2，v/v)显示原料消失，混合溶液用饱和食盐水洗涤，直至有机目变为无色，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸去二氯甲烷，得到浅黄色固体，经过硅胶柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶2，v/v)分离提纯得到白色固体2.85g，产率为53％。CH05-03：

ESI-MS：205(M+H)⁺；

¹H NMR(400MHz，

δ：1.20(s，3H)，1.49(s，3H)，4.82(d，1H，J＝5.6Hz)，4.70(d，1H，J＝6.0Hz)，7.53-7.58(m，1H)，7.68-7.74(m，2H)，7.76(d，1H，J＝1.2Hz)。

化合物CH05-04的合成(C₁₂H₁₃NO₃)

在25ml的圆底烧瓶中加入1g盐酸羟胺和2ml水，再加入3ml 20％NaOH，最后加入2.5g CH05-03，所得混合物在0-5℃下搅拌2小时。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶4，v/v)跟踪显示原料消失，过滤收集白色固体，烘干，得白色固体2.2g，产率为82％。CH05-4：

ESI-MS：210(M+H)⁺；

¹H NMR(400MHz，δ：1.29(s，3H)，1.52(s，3H)，5.60(s，2H)，7.42-7.69(m，4H)，8.03(s，1H)。

化合物CH05-05的合成(C₁₂H₁₅NO₂)

在50ml圆底烧瓶中，加入1.5g化合物CH05-04，35mg NiCl₂.6H₂O和20mL甲醇，冰浴下分批加入2.6g NaBH₄，室温反应2天。旋干溶剂，柱色谱纯化，得白色固体0.85g，产率为60％。CH05-05：

ESI-MS：206(M+H)⁺；

¹H NMR(400MHz，

δ：1.07(s，3H)，1.38(s，3H)，3.54-3.60(m，2H)，4.20(d，1H，J＝4.8Hz)，4.78(m，1H)，5.39(d，1H，J＝5.2Hz)，7.22-7.39(m，4H)。

实施例2：化合物CH05-08的合成

化合物的CH05-07的合成(C₂₇H₃₈N₄O₄)

在100ml圆底烧瓶中加入2.4g茚地那韦(CH05-06)，30ml乙醇，2g KOH，加热回流3h，TLC(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，v/v)显示原料消失。浓缩，加入水和乙酸乙酯，分液，水层乙酸乙酯萃取3次，合并的溶液经无水硫酸钠干燥后浓缩，再经过硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，v/v)分离提纯得到1.2g白色固体(化合物CH05-07)，产率为75％。CH05-07：

ESI-MS：505(M+H)⁺；

¹H NMR(400MHz，MeOD)d：1.09(s，9H)，1.63(m，1H，)，2.01-2.30(m，5H)，2.31-2.51(m，3H)，2.52-2.62(m，2H)，2.63-2.74(m，1H)，2.75-2.88(m，3H)，2.89-2.94(m，2H)，3.29(s，2H)，3.65(d，1H，J＝8.0Hz)，6.83-6.92(m，1H)，6.95-7.10(m，4H)，7.15-7.23(m，2H)，7.57(d，1H，J＝7.6Hz)，8.19-8.29(m，2H)；¹³C NMR(100MHz，

δ：27.67，35.98，38.91，40.57，50.55，51.77，56.97，57.84，59.09，61.95，66.45，68.46，71.79，124.60，125.06，126.82，128.38，128.81，133.88，137.89，147.68，149.46，172.00，182.87。

化合物CH05-08的合成(C₃₃H₅₂N₄O₄Si)

在干燥的50ml三口圆底烧瓶中加入1.0g化合物CH05-07，1.4g咪唑，10ml无水DMF，瓶口密封并插上氮气球进行氮气保护，在冰浴搅拌下，加入TBSC11.25g溶于2mlDMF的溶液，室温反应5h，TLC(二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，v/v)显示原料消失。反应体系中加入10ml无水甲醇反应2h，旋转蒸去溶剂，加入40ml乙酸乙酯，20ml10％柠檬酸水溶液，分离有机相，水相用20ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，旋转蒸去溶剂，所得的固体经硅胶柱色谱(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，v/v)提纯得到0.87g泡沫状灰白色固体(化合物CH05-08)，产率为70％。CH05-08：

ESI-MS：597(M+H)⁺；

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)d：0.06(s，3H)，0.08(s，3H)，0.82(s，9H)，1.31(s，9H)，2.11-2.39(m，6H)，2.46-2.50(m，1H)，2.71-3.06(m，6H)，3.14-3.18(m，1H)，3.36-3.39(d，1H)，3.56-3.59(d，1H)，3.80-3.91(m，1H)，6.73(s，1H)，7.18-7.31(m，6H)，7.70(d，1H)，8.49(s，2H)。

实施例3：化合物CH05-10的合成

化合物CH05-09的合成(C₄₅H₆₅N₅O₅Si)

在25ml的圆底烧瓶中分别加入200mg化合物CH05-08，77mg化合物CH05-05，84mg EDCI，59mg HOBT，101mg Et₃N，2mL无水DMF，室温下搅拌3小时，TLC(石油醚∶THF＝1.5∶1，v/v)跟踪显示原料消失。旋转蒸去溶剂，加入40mL二氯甲烷，20mL饱和NaHCO₃洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸去溶剂，所得固体经过硅胶柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1，v/v)提纯得到泡沫状灰白色固体(化合物CH05-09)160mg，产率61％。

CH05-09：

ESI-MS：784(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)d：0.07(s，3H)，0.09(s，3H)，0.88(s，9H)，1.01(s，3H)，1.26(s，3H)，1.32(s，9H)，2.18-3.02(m，14H)，3.47(d，2H)，3.82-3.96(m，4H)，4.80-4.86(m，1H)，5.41(d，1H)，6.62(d，1H)，6.77(s，1H)，7.12-7.41(m，10H)，7.61(d，1H，J＝7.6Hz)，8.51(s，2H)。

化合物CH05-10(C₃₉H₅₁N₅O₅-(1(1S，2R)，5(S))-2，3，5-三脱氧-N-(2，3-二氢-2，3-丙酮叉氧基-1H-茚-1-基)-5-[2-[[(1，1-二甲基乙基)氨基]羰基]-4-(3-吡啶甲基)-1-哌嗪基]-2-(苯甲基)-D-赤式-戊酰胺)的合成

在50ml圆底烧瓶中加入100mg化合物CH05-09和20ml二氯甲烷，冰浴下，滴加1ml三氟乙酸，所得混合物在冰浴下反应过夜，加入40ml二氯甲烷，用饱和NaHCO₃洗涤，干燥，浓缩，经过硅胶薄层色谱(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，v/v)提纯得到白色固体(化合物CH05-10)30mg，产率为35％。CH05-10：

ESI-MS：670(M+H)⁺；

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)d：1.01(s，3H)，1.28(s，3H)，1.33(s，9H)，2.21-3.05(m，14H)，3.31(d，2H)，3.81-4.11(m，4H)，4.66(m，1H)，5.11-5.15(m，1H)，7.12-7.45(m，10H)，7.61(d，1H)，8.53(d，2H)。

实施例4：MTT还原法检测化合物CH05-10A和CH05-10B的抗肿瘤活性实验

1、材料：

(1)细胞培养基(1640完全培养基)：RPMI 1640培养基(HyClone)、10％小牛血清(HyClone)、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。

(2)细胞株：人乳腺癌细胞系MCF-7、人脑胶质母细胞瘤细胞系U251，人结肠癌细胞系HT-29，人肺癌细胞系A549、NCI-H460，慢性粒细胞白血病细胞系K562，人急性淋巴细胞白血病Molt-4，人黑色素瘤细胞系A375，人卵巢癌细胞系OVCAR-3，人前列腺癌细胞系DU-145、PC-3，人肾癌OS-RC-2，人宫颈癌细胞系Hela，上述细胞均购自美国典型培养物中心ATCC。

(3)其他：0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索莱宝科技有限公司)；MTT(四脞盐)溶液：用0.0lmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，浓度为2.5mg/ml，过滤除菌，分装后4℃避光保存。

2、方法：

(1)细胞贴壁：取对数生长期的MCF-7、U251、HT-29、A549、NCI-H460、K562、Molt-4、A375、OVCAR-3、DU-145、PC-3、OS-RC-2、Hela细胞，胰蛋白酶消化后，用1640完全培养基稀释至2×10⁵cell/ml；以100μl/well接种至96孔细胞培养板，至于细胞培养箱，37℃(5％CO₂)培养24小时。

(2)待测化合物的配制：用DMSO(二甲基亚砜)溶解化合物CH05-10A和CH05-10B，浓度为20mM；用1640培养基完全培养基稀释至200μM；用1640完全培养基以1∶3进行梯度稀释。

(3)去除培养液，以100μl/well加入配好的待测化合物，每个浓度设三个复孔；对照组，以100μl/well加入1640完全培养基；至于细胞培养箱，37℃(5％CO₂)培养48小时。

(4)MTT检测：以10μl/well将MTT溶液加至上述细胞，37℃(5％CO₂)培养4小时，去除培养液；每孔加入100μl DMSO，充分振荡3-5分钟，溶解；采用酶联免疫检测仪(Bio-Tek Synergy HT)检测每孔的吸光度(OD值)，设定波长570nm、参比波长630nm。

(5)计算抑制率：肿瘤细胞抑制率％＝[(对照组OD570值-加药组OD570值)/对照组OD570值]×100％。

(6)计算IC50：以抑制率对药物浓度的对数作图(Sigmaplot软件)，求得IC50值。

3、结果：

试验结果显示化合物CH05-10对13株人癌细胞系均有抑制，IC50为3.99～40.58μM。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一类HⅣ蛋白酶抑制剂衍生物，其为具有如式X所示的结构及其药学上可接受的盐：

其中，

R¹和R²选自H，R³和R⁴为丙酮叉基。

2.一种药物组合物，其特征在于，包含有效量的至少一种权利要求1中任一的化合物。

3.一种如权利要求1所述的具有式X结构的化合物的制备方法，其特征在于，制备过程的反应式如下：

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备过程进一步包括在充分条件下经过下列步骤将式I化合物

转变为式V化合物

(1)将式I化合物通过与甲酸和双氧水及氢氧化钠反应，进行双羟基化；

(2)将步骤(1)所得的化合物通过与浓硫酸和丙酮反应，保护羟基；

(3)将步骤(2)得到的化合物通过与三氧化镉、二氯甲烷和过氧叔丁醇反应，在苄位氧化引入羰基；

(4)将步骤(3)得到的化合物通过与盐酸羟胺反应，以及与氯化镍和甲醇反应，将羰基转化成氨基，得到式V化合物。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备过程进一步包括在充分条件下经过下列步骤将式Ⅵ化合物

转变为式X化合物

(1)将式VI化合物通过与乙醇和氢氧化钾进行水解反应；

(2)将步骤(1)得到的化合物与咪唑、无水N，N-二甲基甲酰胺和叔丁基二甲基氯硅烷反应，保护羟基；

(3)将步骤(2)得到的化合物与1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-羟基-苯并-三氮唑、三乙胺、无水N，N-二甲基甲酰胺和式V化合物进行酸胺缩合反应；

(4)将步骤(3)得到的化合物与二氯甲烷和三氟乙酸反应，去保护得到式X化合物。

6.如权利要求1所述的一类HIV蛋白酶抑制剂衍生物在制备抗肿瘤药中的应用。