CN101495647A - 用于微生物分析的肽核酸探针 - Google Patents
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Classifications
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
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Abstract
本发明提供一种用于侦测、识别和/或是计量微生物的肽核酸(PNA)探针,该微生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、真菌(fungi)、以及不动菌属(Acinetobacter)的菌种。本发明更提供一种使用本发明所述PNA探针的方法,以及一种含有本发明所述PNA探针的试剂盒。
Description
相关申请案
本申请主张于2005年6月2日申请,案号为60/687,178的美国临时申请案,以及2005年8月1日申请,案号为60/704,552的美国临时申请案的优先权,且特别将这两篇的全部内容整合于本文,以作为参考。
发明所属之技术领域
本发明是关于分析任选地出现于样本中的微生物的肽核酸(PNA)探针、PNA探针组与方法。本发明的探针的目标微生物包含大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、不动菌属(Acinetobacter)菌种、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),以及真菌(fungi)。本发明更关于包括所述PNA探针的诊断试剂盒。
先前技术
传染性疾病的诊断仍往往基于传统微生物学方法,例如表现型标识物(marker)的培养与生化测试,其通常需要1-2天至数周、甚至是数月的时间才能取得最终诊断。于此段时间中,通常是凭经验并基于初步测试结果以及临床症状来治疗患者,这样通常导致不必要的抗生素的使用及其所造成的后遗症。
众所周知传统微生物分析的生化方法是缓慢且错误识别的。因此,对于确保最佳抗生素治疗与患者管理,快速且正确的微生物侦测、识别和/或是计量的方法是重要的。尽管其名字为肽核酸,肽核酸(PNA)既不是肽也不是核酸,其甚至不是酸。PNA为非自然产生聚酰胺,根据华生克里克(Watson-Crick)碱基配对规则,其可杂交具有序列特异性的核酸(DNA与RNA)(参见美国专利号第5,539,082以及Egholm et al.,Nature 365:566-568(1993))。然而,与核酸为一种生物性材料,并于活的物种的生命中扮演基因遗传与表达的媒介的重要角色不同,PNA为最近发展出的完全人工分子,其是由化学家所构想出,且其是利用合成有机化学制造。PNA在结构上也与核酸不同。虽然它们都利用常见的核酸碱基(A、C、G、T与U),这些分子的骨架于结构上却是不同。RNA与DNA的骨架是由重复的磷酸二酯核糖与2-去氧核糖单元所构成。相反地,最常见的PNA的骨架是由(氨乙基)-甘氨酸((aminoethyl)-glycin)次单元所构成。另外,于PNA中的核酸碱基是以额外的次甲基羰基(methylene carbonyl)部分(moiety)连接到骨架。所以,PNA不是酸,且其不会含有例如出现于DNA与RNA中的那些带电酸性基。该不带电骨架允许PNA探针可于导致DNA与RNA不稳定的条件下进行杂交,其对于使PNA探针接近已知不为DNA探针(参见Stephano & Hyldig-Nielsen,IBC Library Series Publication #948.International Business Communication,Southborough,MA,pp.19-37(1997))所接近的目标物,例如高度结构化的rRNA以及双股DNA有贡献。于发展以探针为基础的杂交试验时,PNA为有用的调查候选物,这是因为它们杂交序列特异性的核酸。然而,PNA探针与核酸探针于结构与功能上都是不相等的。
核糖体RNA(rRNA)的序列以及对应于该rRNA的基因组DNA(rDNA)的序列的比较性分析已经变成一种广泛认知为建立细菌菌种之间的物种关系的方法(Woese,Microbiol.Rev.51:221-271(1987)),且已基于rRNA或是rDNA序列比对,修订伯吉氏系统细菌学手册(Bergey’sManual of Systematic Bacteriology)。于非常相关物种间的rRNA或是rDNA序列的差异使得设计用于微生物识别的特定探针变得可行,因此使得诊断微生物学可基于单一基因识别物而非基于做为传统微生物学特征的一系列的表现型识别物(Delong et al.,Science342:1360-1363(1989))。
已经有数篇文章揭露用于侦测特定微生物的PNA萤光原位杂交(PNA FISH)技术(例如参见Stender et al.,J Clin Microbiol.1999Sep;37(9):2760-5;Rigby et al.J Clin Microbiol.2002Jun;40(6):2182-6;以及Oliveira et al.J Clin Microbiol.2002Jan;40(1):247-51),且已有数种可购买的试剂盒(AdvanDx,Inc,Wobum MA)。PNA FISH如同其名字所指,是使用经萤光标记的PNA探针,而基于PNA探针对存在于样本中的核酸目标物的特异性杂交来使样本发光。通常PNA探针是设计来侦测具有高套数的目标物,例如rRNA。该PNA FISH方法以其具有提供快速且正确识别微生物达种的层级的潜力,而被公认是一种比传统微生物侦测更重要的技术。PNA FISH技术的一个限制因素在于已验证探针序列的取得性。由于制造与测试新颖的探针需要一些花费,且只有一些设计探针的技艺,不常见到具有已验证价值的新的探针序列。
发明内容
本发明是针对PNA探针及其用途,以及关于用于分析任选地出现于样本中的关注微生物的试剂盒。根据本发明,该PNA探针是针对rRNA或是对应于该rRNA的基因组序列(rDNA),或其互补物。于优选的实施例中,本发明的探针用于对任选地出现于样本中的微生物的原位杂交分析,优选的,该原位杂交分析为萤光原位杂交分析。
于一个实施例中,本发明是针对侦测、识别和/或是计量微生物的PNA探针,该微生物例如、大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌、克雷伯氏菌、无乳链球菌、真菌以及不动菌属的菌种。
与核酸探针相比,这些PNA探针具有PNA探针天生的物理/化学特性,使得可以只使用单一个PNA探针来实施快速且正确的分析。再者,于具有相对较硬的细胞壁的许多微生物中,应用具有较核酸探针的穿透性为优的PNA探针于萤光原位杂交试验时也具有好处。而对于核酸探针需要以交联剂和/或是酶进行固定与穿透(例如参见Kempf et al.,J.CHn.Microbiol 38:830-838(2000))的那些例子,这些PNA探针则是可如同例1所示范般地于制备抹片后直接施用。
于一优选的实施例中,这些PNA探针具有相对较短的核酸碱基序列,例如8-17碱基,优选的,例1中描述它们为15个核酸碱基。由于Tm值较低,自然产生的核酸探针典型具有至少18个核酸碱基(例如参见Kempf et al.,J.Clin.Microbiol 38:830-838(2000))。这个差异使得这些PNA探针对于如同分析来自微生物的rRNA或是rDNA所需要的只具有一个或是很少的核酸碱基差异的非常相关非目标物序列具有优选的区别性。
根据本发明的PNA探针的核酸碱基序列选自下列所组成的群组:ACA-CAC-ACT-GAT-TCA(SEQ ID NO:1)、CAC-CTA-CAC-ACC-AGC(SEQ IDNO:2)、CAC-TTA-CCA-TCA-GCG(SEQ ID NO:3)、ACA-CCA-AAC-CTC-AGC(SEQ ID NO:4).、ACA-CCA-AAC-ATC-AGC(SEQ IDNO:5)、CCC-TAG-TCG-GCA-TAG(SEQ ID NO:6)、CCA-AGA-GAT-CCG-TTG(SEQ ID NO:7)、CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C(SEQ IDNO:8)、以及GCT-CAC-CAG-TAT-CG(SEQ ID NO:9)。这些探针中的一种或是多种,或是它们的互补物是包含于本发明的多个最佳探针组中。
优选的以至少一种可侦测部分来标记本发明的探针,其中该可侦测部分选自下列所组成的群组:偶合物(conjugate)、支链侦测系统、发色团、萤光团、自旋标记、放射性同位素、酶、半抗原、吖啶酯(acridinium ester)以及发光(luminescent)化合物。本发明的萤光标记探针可为自我报告(self-reporting)的。优选的,本发明的自我报告萤光探针是PNA线性信标(Linear Beacon)。本发明的探针可含有二种或是更多种的萤光标记,其为独立可侦测或是可通过符合(coincidental)的萤光侦测。
本发明的其他概念中,包含含有增加该探针功能的部分的PNA探针。该部分包含但不受限于间隔子与连接子(linker)。同样的,本发明的PNA探针包含附着至固体载体上的探针,例如但不受限于膜、载片、阵列、珠子或是粒子。
本发明的探针组包含二种或是更多种的PNA探针,其用于分析任选地出现于样本中的微生物。优选的,以可侦测部分来标记探针组。可能以相同的可侦测部分来标记多个探针组,或是可为了独立的探针信号的分析而相异地标记多个探针组。通过符合的萤光,一个探针组的二种或是更多种经不同标记的萤光探针可用以产生一个第三信号,这也是包含于本发明的概念中。
根据本发明的方法包含将样本与一种或是更多种上述PNA探针接触。根据该方法,接着侦测、识别和/或是计量于该样本中微生物的出现、没出现、和/或是其数目,和/或是通过关联该探针的探索核酸碱基序列对该目标物序列于适当杂交条件下的杂交而决定对抗生素的敏感性。因此,该分析是基于具有可靠结果的单一试验。相反地,目前微生物分析的例行方法是基于涉及多重测试的多重表现型特性。
于优选的实施例中,本发明的方法用于对任选地出现于样本中的微生物的原位杂交分析,最优选,该原位杂交分析是萤光原位杂交分析。于本发明的优选的方法中,该样本是生物样本,其包含但不受限为血液、尿液、分泌液、汗水、唾液、粪便、黏液或是它们的培养物。
本发明的优选方法任选地包含非标记阻隔探针,以降低或是排除PNA探针对非目标物序列的杂交。本发明的方法不包含于杂交前使用交联剂或是酶。
本发明方法也可用来侦测于反应中所产生、合成或是扩增的核酸目标物。产生、合成或是扩增该目标物的优选方法包含PCR、LCR、SDA、TMA、RCA以及Q-beta复制脢。
本发明的方法包含于其中该目标物是固定至表面或是另可为阵列的组份者,其中该表面例如膜、载片、珠子粒子。任选地,该方法可包含固定至表面或是另可为阵列的组份的PNA探针,其中该表面例如膜、载片、珠子或是粒子。
于本发明的极优选实施例中,患者的医学治疗包含i.)取得来自患者的样本,ii.)决定该样本中微生物出现与否、量和/或是其身分,以及iii.)任选地投药至少一种治疗该感染的抗生素化合物。
于另一实施例中,本发明是针对适于实施侦测、识别和/或是计量任选地出现于样本中的微生物的试验,和/或是决定抗生素敏感性的试剂盒。本发明的所述试剂盒包括一种或是更多种的PNA探针,以及被选择来执行试验或是简化试验的表现的其他试剂或是组合物。优选的试剂盒形式包含设计用以执行原位杂交试验的试剂盒,以及设计用以执行实时PCR试验的试剂盒。优选的试剂盒是用来检验例如为临床标本,或是其培养物的样本。
本领域的技术人员将能领会适当的PNA探针并不需要具有确切这些有效的探索核酸碱基序列(probing nucleobase sequence),而是通常根据特定试验条件而修改。例如,如果需要经由修改该杂交的稳定度来降低Tm和/或是调整严格度的话,可通过截断该核酸碱基序列而制备较短的PNA探针。相似地,只要是该差别性核酸碱基仍保留于该PNA探针的序列中,可在该核酸碱基序列一端将其截断并在另一端延长。落于本文所描述的参数中的这些探索核酸碱基序列的这些变形皆视为本发明的实施例。
已证实本发明的PNA探针、方法以及试剂盒对于其所针对的微生物是敏感且特异的。再者,本文所描述的该些试验是快速(少于3小时)且能够于单一试验中分析微生物。本领域的技术人员将也能领会互补探索序列同样适用于试验,例如但不受限于使用rDNA作为目标物的实时PCR。
发明详细说明
I.定义:
a.如本文所使用的,名词“核酸碱基”意指那些自然产生以及那些非自然产生杂环部分,其已为那些利用核酸技术或是那些利用肽核酸技术者所知,并可经由它产生可序列特异结合到核酸的聚合物。
适当核酸碱基的非限制性例子包含但不受限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫代-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假等轴胞嘧啶、2-硫代尿嘧啶以及2-硫代胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黄嘌呤、N9-(7-去氮-鸟嘌呤)、N9-(7-去氮-8-氮-鸟嘌呤)以及N8-(7-去氮-8-氮-腺嘌呤)。适当核酸碱基的其他非限制性例子包含例示于Buchardt et al.的图2(A)与2(B)中的那些核酸碱基(美国专利号第6,357,163或是WO92/20702或是WO92/20703,于此并入参考)。
b.如本文所使用的,名词“核酸碱基序列”意指任何包括含有核酸碱基次单元的聚合物的片段。适当的聚合物或是聚合物片段的非限制性例子包含寡去氧核苷酸、寡核醣核苷酸、肽核酸、核酸类似物、核酸模拟物、和/或是嵌合体。
c.如本文所使用的,名词“目标物序列”意指试验中待侦测的核酸碱基序列。
d.如本文所使用的,名词“探针”意指聚合物(亦即,DNA、RNA、PNA、嵌合体或是经连接聚合物),其具有设计来序列特异地杂交关注生物的目标分子的目标序列的探索核酸碱基序列。
e.如本文所使用的,名词“分析”意指为了侦测、识别和/或是计量和/或是为了决定对抗生素的抗性(抗微生物敏感性)而标识个别细菌。
f.如本文所使用的,名词“肽核酸”或是“PNA”意指包括二种或是更多种PNA次单元(残余物)的任何寡聚物或是聚合物片段,包含但不受限于在任何一种或是更多种下列美国专利号中称为或是请求为肽核酸的任何寡聚物或是聚合物片段:5,539,082、5,527,675、5,623,049、5,714,331、5,718,262、5,736,336、5,773,571、5,766,855、5,786,461、5,837,459、5,891,625、5,972,610、5,986,053、6,107,470、6,201,103、6,350,853、6,357,163、6,395,474、6,414,112、6,441,130、6,451,968、6969766、以及7022851所有这些专利并入本文参考。该名词″肽核酸″或是″PNA″也应适用于包括二种或是更多种描述于下列公开案中的那些核酸模拟物的次单元的任何寡聚物或是聚合物片段:Lagriffoul et al.,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,4:1081-1082(1994);Petersen et al.,Bioorganic & MedicinalChemistry Letters,6:793-796(1996);Diderichsen et al.,Tett.Lett.37:475-478(1996);Fujii et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.7:637-627(1997);Jordan et al.Bioorg.Med.Chem.Lett.7:687-690(1997);Krotz et al.,Tett.Lett.36:6941-6944(1995);Lagriffoul et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.4:1081-1082(1994);Diederichsen,U.,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,7:1743-1746(1997);Lowe et al.,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1,(1997)1:539-546;Lowe et al.,J.Chem.Soc.Perkin Trans.11:547-554(1997);Lowe et al.,J.Chem.Soc.Perkin Trans.11:5 55-560(1997);Howarth et al.,J.Org.Chem.62:5441-5450(1997);Altmann,K-H et al.,Bioorganic & MedicinalChemistry Letters,7:1119-1122(1997);Diederichsen,U.,Bioorganic & Med.Chem.Lett.,8:165-168(1998);Diederichsenet al.,Angew.Chem.Int.Ed.,37:302-305(1998);Cantin et al.,Tett.Lett,38:4211-4214(1997);Ciapetti et al.,Tetrahedron,53:1167-1176(1997);Lagriffoule et al.,Chem.Eur.J.,3:912-919(1997);Kumar et al.,Organic Letters 3(9):1269-1272(2001);以及如同Shah et al.于WO96/04000所揭露的以肽为基础的核酸模拟物(PENAMs)。于最优选实施例中,PNA次单元是由自然产生或是非自然产生的核酸碱基所组成,其中该核酸碱基透过次甲基羰基连结而附着至该N-[2-(氨乙基)]甘氨酸的骨架的氮基的氮原子上。
g.如本文所使用的,名词“标记(label)”与“可侦测部分”是可互相替换,且应指可附着至探针并因此使得该探针通过仪器或是方法成为可侦测的部分。
h.如本文所使用的,名词“符合的萤光(conincidentialfluoresence)”是用以描述所察觉到的一种颜色,其通过同步侦测二种或是更多种于空间位置够近而使其不可分的标记所发射的光束所产生。该符合的萤光的侦测可通过眼睛或是光敏装置。
2.说明
1.一般:
PNA合成:
PNA的化学合成方法为已知(参见美国专利号第5,539,082、5,527,675、5,623,049、5,714,331、5,718,262、5,736,336、5,773,571、5,766,855、5,786,461、5,837,459、5,891,625、5,972,610、5,986,053、6,107,470、6,201,103、6,350,853、6,357,163、6,395,474、6,414,112、6,441,130、6,451,968、6,969,766以及7,022,851,所有这些专利并入本文参考(同时也请参见透视生物系统和/或是应用生物系统产品文献)。PNA合成方法学的一般性参考也请参见Nielsen et al.,Polypeptide Nucleic Acids;Protocols and Applications,HorizonScientific Press,Norfolk England(1999)。
肽核酸的载体键结自动化学组装的化学物与仪器目前为商业上可取得,标记与未标记PNA寡聚物同样地也可由客制PNA寡聚物的贩售商取得。PNA的化学合成类近于固相肽合成,其中于组装的各周期中,寡聚物具有反应性烷基氨基端,其与下一个将被加到正在增长的聚合物的合成子缩合。
可以任何规模合成PNA,从次微莫耳到千莫耳或是更多。可在加速合成仪(Expedite Synthesizer,Applied Biosystems)上使用Fmoc(Bhoc)保护基单体,使用XAL、PAL或是许多其他适当的商业上可取得肽合成载体而方便地以2μmole的规模合成PNA。取代地,可使用具有适当固体载体(例如MBHA载体)的433A形号的合成仪(AppliedBiosystems)。再者,可利用许多其他自动化合成仪与合成载体。可使用连续流式方法和/或是批次方法来执行合成。也可手动合成PNA。
PNA标记:
用来标记PNA的优选非限制性方法是如同美国专利号第6,110,676、6,361,942、6,355,421、6,969,766以及7,022,851所描述者、本说明书实施例部分或是其他本领域已知的PNA合成与肽合成者。
标记:
实现本发明且适于标记PNA探针的可侦测部分(标记)的非限制例子将包含葡聚糖偶合物、支链侦测系统、发色团、萤光团、自旋标记、放射性同位素、酶、半抗原、吖啶酯以及发光化合物。
熟习PNA、多肽或是核酸合成领域技术人员能够认出其他适当的标记试剂与优选的附加方法。
优选的半抗原包含5(6)-羧基萤光素、2,4-二硝基苯基、长叶毛地黄配质以及生物素。
优选的萤光物质(萤光团)包含5(6)-羧基萤光素(Flu)、6-((7-氨基-4-甲基熏草素-S-乙醯)氨基)已酸(Cou)、5(以及6)-羧-X-若丹明(Rox)、花青素2(Cy2)染料、花青素3(Cy3)染料、花青素3.5(Cy3.5)染料、花青素5(Cy5)染料、花青素5.5(Cy5.5)染料、花青素7(Cy7)染料、花青素9(Cy9)染料(花青素染料2、3、3.5、5及5.5可以NHS酯形式由Amersham,Arlington Heights,IL公司取得)、JOE、Tamara或是Alexa染料系列(Molecular Probes,Eugene,OR)。
优选的酶包含聚合酶(例如Taq聚合酶、补平PNA聚合酶、T7DNA聚合酶、测序酶(Sequenase)、DNA聚合酶1、以及phi29聚合酶)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)以及最优选的大豆过氧化物酶(SBP)。
未标记探针:
用于实现本发明的探针于本发明的方法作用并不一定需要以可侦测部分将其标记,举例来说,当附着至固体载体时。
自我表示(self-indicating)探针:
信标探针为自我表示探针的例子,其包含供给者部分以及接受者部分。该供给者与接受者部分的运作方式为使得该接受者部分接收从该供给者部分来的能量或是其他从该供给者部分来的淬熄信号。虽然前述所列的萤光团(具有适当的光谱性质)也可作为能量转移接受者,优选的该接受者部分为淬灭体部分。优选的,该淬灭体部分为非萤光芳香或是异芳香部分。优选的该淬灭体部分为4-((-4-(二甲基氨基)苯基)氮)苯甲酸(dabcyl)。于一优选的实施例中该自我表示信标探针为如同于US 6,485,901中具有更多描述的PNA线性信标。
于另一实施例中,本发明的该自我表示探针具有如WIPO专利申请案第WO97/45539号所描述的那种。与信标探针相比时,这些自我表示探针主要不同在于该接受者必须与该核酸反应以产生信号。
间隔子/连接子部分:
通常,间隔子是用来最小化巨大标记试剂可能对于探针杂交性质的副作用。本发明的该核酸碱基聚合物的优选间隔子/连接子部分是由一种或是一种以上的下列物所构成:氨基烷基羧酸(例如氨基己酸)、氨基酸的侧链(例如离氨酸或鸟氨酸的侧链)、自然氨基酸(例如甘氨酸)、氨烷基酸(例如8-氨基-3,6-二氧辛烷基酸、烷类双酸(例如琥珀酸)、烷氧类双酸(例如缩二羟乙酸)或是烷二氨(alkyldiamines)(例如1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷)。
杂交条件/严格度:
那些熟习核酸杂交领域技艺者将承认常用于加诸或是控制杂交严格度的因数包含甲醯胺的浓度(或是其他化学变性试剂)、盐的浓度(亦即离子强度)、杂交温度、清洁剂的浓度、pH值以及离液剂的出现与否。通常可由已知技术固定数个前述严格度因数然后决定改变单一严格度因数的效果来找出探针/目标物序列结合的最理想严格度。PNA的杂交除了完全独立于离子强度之外,可调节相同严格度因数以藉此控制PNA对核酸的杂交严格度。一种试验的最理想严格度可经由实验决定,其通过检验各严格度因数直到达到所欲识别程度。
适当杂交条件:
通常,当造成背景值的核酸序列越相关于目标物序列时需要越小心控制严格度。也可使用阻断探针以作为改善超出最理想化严格度因数可行限度的差别度的方法。因此,适当杂交条件将包括于该条件下达到所欲的差别程度使得试验产生正确(落于该试验的所欲容忍度中)且可重复的结果。PNA探针的使用表现出本发明相对于使用DNA探针的传统方法的显著好处。PNA的部分好处在于其在对于DNA探针来说为非优选的或不稳定的条件下杂交。这样条件的例子包含低离子强度(低盐)条件、以及高浓度的较低分子量醇,亦即50%乙醇的条件。
通過只有例行实验以及本文所提供的说明的帮助,本领域熟习技艺者将可决定利用该方法以及如本文所描述的组合物实施试验的适当杂交条件。适当原位杂交或PCR条件包括适于实施原位杂交或是PCR程序的条件。因此,对于本领域熟习技艺者而言利用本文所提供的描述在有或是没有额外例行实验下,适当原位杂交或是PCR的条件将明显易懂。
阻断探针:
阻断探针为核酸或非核酸探针,其可用来抑制探索聚合物的探索核酸碱基序列对非目标序列的结合。优选的阻断探针是PNA探针(参见US 6,110,676)。一般相信阻断探针的运作是藉由与非目标物序列杂交,以藉此形成相较于探索核酸碱基序列与非目标物序列的杂交于热动力上较为稳定的偶合物。该较稳定且优选的偶合物的形成能阻断较不稳定且非优选的该探索核酸碱基序列与非目标物序列的偶合物的形成。所以阻断探针可与方法本发明的试剂盒与组合物一起使用,以抑制探针对非目标物序列的结合,该结合可能出现并干扰试验的表现。阻断探针特别有利于系统发生上非常相关物种间的辨识。
探索核酸碱基序列:
本发明的探针的探索核酸碱基序列为建构的特定序列辨识部分。所以探索核酸碱基序列为设计来杂交特定目标物序列的核酸碱基序列,其中目标物序列出现、没出现以及量可用来直接或间接侦测样品中兴趣生物的出现、没出现以及数目。因此,考量对于所选定试验的形式的探针的需求,一般将选择探针的探索核酸碱基序列的长度与序列组成为使得于适当杂交条件下与目标物序列形成适当偶合物者。
本发明适于侦测、识别和/或是计数大肠杆菌的探针的优选探索核酸碱基序列包括ACA-CAC-ACT-GAT-TCA(SEQ ID NO:1)的核酸碱基序列,及其互补物。
本发明适于侦测、识别和/或是计数无乳链球菌的探针的优选的探索核酸碱基序列包括ACA-CCA-AAC-CTC-AGC(SEQ ID NO:4)、ACA-CCA-AAC-ATC-AGC(SEQ ID NO:SEQ ID NO:5)的核酸碱基序列,及其互补物。基于序列号码为SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5仅相差一个碱基对所设计的探针是用以侦测无乳链球菌的自然发生的变异株(Kempf et al 2003)。
本发明适于侦测、识别和/或是计数克雷伯氏肺炎菌的探针的优选探索核酸碱基序列包括:CAC-CTA-CAC-ACC-AGC(SEQ ID NO:2)的核酸碱基序列,及其互补物。本发明适于侦测、识别和/或是计数克雷伯氏菌的探针的优选探索核酸碱基序列包括:CAC-TTA-CCA-TCA-GCG(SEQID NO:3)的核酸碱基序列,及其互补物。
本发明适于侦测、识别和/或是计数真菌的探针的优选探索核酸碱基序列包括:CCC-TAG-TCG-GCA-TAG(SEQ ID NO:6)、CCA-AGA-GAT-CCG-TTG(SEQ ID NO:7)的核酸碱基序列,及其互补物。序列号码6与7相当于泛真菌探针,其分别相当于18S与5.8S rRNA序列。通过序列比对,预计这些泛真菌探针侦测广泛真菌家族。预计该泛真菌探针于真菌种子囊菌门与担子菌门具有特别广泛覆盖范围。
本发明适于侦测、识别和/或是计数不动菌种的探针的优选探索核酸碱基序列包括:CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C(SEQ ID NO:8)与GCT-CAC-CAG-TAT-CG(SEQ ID NO:9)的核酸碱基序列,及它们的互补物。
本发明预期这些经识别的探索核酸碱基序列的变形物应该也提供适用于该微生物分析的探针。落于本文所描述的参数内的探索核酸碱基序列的变形物将视为本发明的实施例。
共同变形物包含缺失、插入与移码。另外,可通过截断上述已识别的序列来产生较短的探索核酸碱基序列。
本发明的探针通常将具有完全与目标物序列互补的探索核酸碱基序列。取代地,也可使用大致上互补的探索核酸碱基序列,这是因为已证实当使用探针时,探针与目标物序列间存在一个或是一个以上点突变(碱基不匹配)可得到较大序列差别度(参见Guo et al.,NatureBiotechnology 15:331-335(1997))。因此,探索核酸碱基序列可能只有90%一致于上述已识别探索核酸碱基序列。落于上述参数中的大致上互补的探索核酸碱基序列将视为本发明的实施例。
探索核酸碱基序列的互补物将视为本发明的实施例。这是因为当待侦测的目标物序列已扩增或是拷贝并由此产生已识别目标序列的互补物时,探索核酸碱基序列的互补物能够因此变成适当探针。侦测、识别和/或是计数:
侦测意指对任选地出现在样本中的生物的存在与否的分析。识别意指以基因名或是种名建立该生物的身分。计量意指对样本中的该生物计数。某些试验形式提供同时侦测、识别与计数,例如参见Stender,H.et al.,J.Microbiol.Methods.45:31-39(2001),其他则是提供侦测与识别,例如参见Stender,H.et al.,Int.J.Tuberc.LungDis.3:830-837(1999),还有其他试验形式只提供识别,例如参见Oliveira,K et al.J.CHn.Microbiol.40:247-251(2002))。
抗生素抗性
对抗生素抗性的决定意指基于与针对抗微生物剂的抗性或敏感性相关的特定基因或是突变对一个生物对抗生素的敏感性的分析。
II.本发明的优选实施例:
a.PNA探针:
于一个实施例中,本发明的PNA探针适于侦测、识别和/或是剂量微生物。适合用于分析的PNA探针的一般性特征(例如长度、标记、核酸碱基序列、连接子等等)已事先于此说明。本发明PNA探针的优选探索核酸碱基序列将列于表1。
表1
序列号码 | 核酸碱基序列 |
SEQ ID NO:1 | ACA-CAC-ACT-GAT-TCA |
SEQ ID NO:2 | CAC-CTA-CAC-ACC-AGC |
SEQ ID NO:3 | CAC-TTA-CCA-TCA-GCG |
SEQ ID NO:4 | ACA-CCA-AAC-CTC-AGC |
SEQ ID NO:5 | ACA-CCA-AAC-ATC-AGC |
SEQ ID NO:6 | CCC-TAG-TCG-GCA-TAG |
SEQ ID NO:7 | CCA-AGA-GAT-CCG-TTG |
SEQ ID NO:8 | CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C |
SEQ ID NO:9 | GCT-CAC-CAG-TAT-CG |
本发明的PNA探针可只包括探索核酸碱基序列(如先前所述者)或是可包括额外部分。额外部分的非限制性例子包含可侦测部分(标记)、连接子、间隔子、自然或非自然氨基酸或其他PNA、DNA或RNA的次单元。额外部分可能在试验中是功能性的或是非功能性的。然而,于使用PNA探针的试验设计中通常选择功能性的额外部分。本发明的优选PNA探针为已标记一种或是一种以上可侦测部分,该可侦测部分选自萤光团、酶与半抗原。
于优选的实施例中,本发明的探针用于原位杂交(ISH)与萤光原位杂交(FISH)试验。典型必须移除原位杂交(ISH)与萤光原位杂交(FISH)试验中所用的过量探针以使得与探针特异结合的可侦测部分可高于由仍然存在但没有杂交的探针所导致的背景信号而被侦测。一般来说,于样本与探针一起反应一段时间后,需洗掉过量的探针。然而本发明的优选实施例为应用自我指示探针,这是因为它只产生少量或是无法侦测的背景信号,而不需要将过量的我指示探针完全由样本中移除(洗掉)。除了ISH或FISH试验之外,包括这里所描述的探索核酸碱基序列的自我指示探针可特别应用于各式均相试验中,例如用于实时PCR或是与自我指示装置(例如横向流动试验)或是自我指示数组一起应用。
b.PNA探针组
本发明的探针组包括二种或是更多种PNA探针。于一个实施例中,该组中的某些PNA探针可以是阻断探针。探针组可包含任何一群本发明的探针的二种或是二种以上的探针,不论是标记或是未标记,且也可包含没有特别于本文描述的探针,但其中包含至少一种本发明的探针。对于侦测克雷伯氏菌种,优选的探针组包含CAC-CTA-CAC-ACC-AGC(SEQ ID NO:2)与CAC-TTA-CCA-TCA-GCG(SEQ IDNO:3);对于侦测无乳链球菌变异株,优选的探针组包含ACA-CCA-AAC-CTC-AGC(SEQ ID NO:4)与ACA-CCA-AAC-ATC-AGC(SEQ IDNO:5);对于侦测真菌,优选的探针组包含CCC-TAG-TCG-GCA-TAG(SEQID NO:6)与CCA-AGA-GAT-CCG-TTG(SEQ ID NO:7);而对于侦测不动菌属的种,优选的探针组包含CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C(SEQ ID NO:8)与GCT-CAC-CAG-TAT-CG(SEQ ID NO:9)。
c.方法:
于本发明另一实施例中针对适于分析任选地出现于样本中的微生物的方法。适于微生物分析的PNA探针的一般与特异特征已于先前描述于本文中。优选的探索核酸碱基序列已列于表1中。
分析样本中微生物的方法包括将样本与一种或是一种以上适于与特定目标物序列杂交的PNA探针接触。
根据该方法,于是侦测、识别和/或是计量样本中的微生物,或是决定其对抗生素的抗性。这是通过关连化一个PNA探针的探索核酸碱基序列于适当杂交条件下对样本中预计侦测其存在与否或是数目的微生物的目标物序列的杂交而达成。典型地,该关联是通过直接或是间接侦测该探针/目标物序列的杂交物达成。
萤光原位杂交与实时PCR:
本发明的PNA探针、方法、试剂盒与组合物对于快速以基于探针为基础的微生物分析是特别有用的。于优选的实施例中,用于微生物分析的试验形式为原位杂交或PCR。最佳地,试验形式为萤光原位杂交(PNA FISH)或是实时PCR(Reviewed by Stender et al.J.Microbiol.Methods 48:1-17(2002))。优选的,用於PNA FISH分析的抹片于杂交前不经过交联剂或是酶处理。
示范性试验形式:
实施PNA FISH的示范性方法可在以下找到:Oliveira et.,J.Clin.Microbiol 40:247-251(2002)、Rigby et al.,J.Clin.Microbiol.40:2182-2186(2002)、Stender et al.,J.Clin.Microbiol.37:2760-2765(1999)、Perry-O’Keefe et al.,J.Microbiol.Methods47:281-292(2001)。根据一种方法,于显微镜的载玻片上制备一个样本,例如但不限于阳性血液培养,的涂抹物,然后以溶于杂交缓冲液中的萤光标记PNA探针液滴将其覆盖。将盖玻片放在抹片上以确保平均覆盖,接着将载玻片放到载玻片加温器或是反应器中于55℃反应90分钟。于杂交后,通过将载玻片埋浸到一个预先加温过的强力清洗溶液中将盖玻片移除,并清洗载玻片30分钟。最后以一滴封片液覆盖一个盖玻片封片该抹片,然后以萤光显微镜检验。
可通過多种仪器來决定能以本发明试剂盒所含PNA探针分析的任选地出现在样本中的微生物,例如但不限于下列例子:显微镜(例如参见Oliveira et al.,J.Clin.Microbiol 40:247-251(2002))、菲林(例如参见Perry-O’Keefe et al.,J.Appl.Microbiol.90:180-189)(2001)、像机与即影菲林(例如参见Stender et al.,J.Microbiol.Methods 42:245-253(2000))、光度计(例如参见Stenderet al.,J.Microbiol.Methods.46:69-75(2001)、激光扫描装置(例如参见Stender et al.,J.Microbiol.Methods.45:31-39(2001)或是流式细胞仪(例如参见Wordon et al.,Appl.Environ.Microbiol.66:284-289(2000))。全自动玻片扫瞄仪与流式细胞仪对于快速计量出现于兴趣样本中的微生物特别有用。
使用自我报告PNA探针来实施实时PCR的示范性方法可于以下找到:Fiandaca et al.,Abstract,nucleic Acid-Based technologies、DNA/RNA/PNA Diagnostics,Washington,DC,May 14-16,2001,以及Perry-O’Keefe et al.,Abstract,International Conference onEmerging Infectious Diseases,Atlanta,2002。
d.试剂盒:
于本发明又一实施例中针对适于实施一种试验的试剂盒,其分析任选地出现于样本中的微生物。适于微生物分析的PNA探针的优选与一般特征先前已描述于本文中。优选的探索核酸碱基序列为列于表1中。再者,适合应用该PNA探针以分析样本中微生物的方法先前已描述于本文中。
本发明的试剂盒包括一种或是一种以上的PNA探针与其他试剂或是组合物,该其他试剂或是组合物是选用来实施一种试验或是用来简化用以分析样本中微生物的试验的表现。
举例来说,该试剂盒可应用在原位试验中或是与核酸扩增技术一起应用。核酸扩增技术的非限制性例子包含但不限于聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链替代扩增法(SDA)、转录介导的扩增法(TMA)、Q beta复制酶扩增法(Q-beta)以及滚环式扩增(RCA)。因此,于某些实施例中,该其他试剂可包括实施以原位或核酸扩增试验为基础的缓冲液、酶和/或是主要混合物。
e.使用本发明的示范性应用:
本发明的PNA探针、方法与试剂盒对于临床样本的微生物分析特别有用,例如尿液、血液、创伤、唾液、喉拭物(laryngeal swabs)、胃灌洗液、支气管冲洗物、切片、吸出物(aspirates)、痰以及在食物、饮料、水、医药产品、个人护理产品、日用品以及环境样本中者及它们的培养物。
另外的侦测策略
虽然已描述以萤光素与tamra标记的探针,产生一种可察觉的第三萤光的萤光标记的任何组合是落于本发明的概念中。同样地,应用二种或是二种以上标记已产生多个可察觉颜色也是可想象的到的。潜在萤光标记也都包含于本说明书中。已证实二种或是二种以上萤光部分的符合萤光对于产生颜色光谱有用(Kool et al JACS 2003)。组合颜色是通过二种或是二种以上萤光团「混合物」以及调整它们的比例取得。举例来说,二部分的红色与一部分的绿色的组合产生不同于一部分的红色与二部分的绿色所组合的颜色。虽然以肉眼正确分辨这些变化浓淡有一定的限度,建构出一个装置来正确察觉这类维细变化并不困难。
可侦测与独立可侦测部分/多重(multiplex)分析:可根据本发明实施多重杂交试验。于多重试验中,可同时试验大量感兴趣的条件。多重分析依赖其能够在试验中或是完成试验后将样本组份或是与它们相关的资料分类。于本发明优选的实施例中,可使用一种或是一种以上可区分的独立可侦测部分來标记二种或是二种以上应用于试验中的不同的探针。能够于各独立可侦测部分间区分和/或是将其计量的能力使得该方法能够多重分析杂交试验。各该可区分(独立)標記探針對特定核酸序列的杂交的关联性对于样本中各待侦测生物出现与否与量具有指示性。
因此,本发明的多重试验可在相同试验中用来同时侦测二种或是二种以上于样本中的不同生物(例如克雷伯氏菌的不同种)的出现与否与量。例如,多重试验可利用二种或是二种以上各自以一种或是一组独立可侦测萤光团标记的PNA探针。
因此,本发明提供治疗患者的方法其于实例中包含至少一个或是优选包含所有下列步骤:
a)从患者取得生物性样本
b决定微生物出现、量和/或是其身分;以及
c)投药至少一种具有朝排除感染的活性的抗生素。
本发明更提供PNA探针组,其包含至少一种本文所提供的PNA探针,优选的为二种或是二种以上探针,其中该探针通过符合萤光产生第三颜色。
根据本发明所描述的优选实施例,对熟习本领域技述者显然可以应用其他结合本文所描述概念的实施例。有感于此,实施例不应该只限制于所描述的那些实施例而是应该只限制于下列权利要求书的精神与范围。
实施例
本发明现在以下列实施例说明,但并不意味以任何形式受限制。
实施例1
PNA探针序列
Kpn23S01-Flu FIU-OO-CACCTACACACCAGC-NH2(SEQ ID NO:2)
Kox23S01-Tam Tam-OO-CACTTACCATCAGCG-NH2(SEQ ID NO:3)
(注意:于此使用一般命名法说明PNA探针的端点;O=8-氨基-3,6-二氧杂辛酸;flu=5(6)-羧基-荧光素;tam=5(6)-羧基四甲基若丹明)
细菌菌株
制备代表各式革兰氏阴性杆菌参考菌珠的隔夜培养(AmericanType Cultuere Collection,Manassas,VA),该革兰氏阴性杆菌包含克雷伯氏肺炎菌以及克雷伯氏菌菌种。
制备抹片
通过混合一滴培养物与一滴含有1%(v/v)Triton X-100磷酸盐缓冲盐水,为各菌株制备涂附在直径为8mm培养井的涂有铁氟龙的载玻片(AdvanDx,Woburn,MA)上的抹片。接着将该载玻片放在55℃的载玻片加温器中20分钟,于该时间点,抹片呈干燥。接着,通过浸没于96%(v/v)乙醇中5-10分钟,消毒该抹片,然后风干。
萤光原位杂交(FISH)
于抹片上覆盖一滴含有10%(w/v)硫酸葡聚醣、10mM NaCl、30%(v/v)甲酰胺、0.1%(w/v)焦磷酸钠、0.2%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、0.2%(w/v)菲可、5mM Na2EDTA、1%(v/v)Triton X-100、pH 7.5的50mM Tris/HCl,以及500nM Kpn23S01-Flu以及500nM Kox23S01-Tam探针的杂交溶液(Flu为萤光染料,其产生特有的绿色萤光,Tam为萤光染料其产生特有的红色萤光)。将盖玻面覆盖在抹片上以确保平均覆盖杂交溶液,然后将载玻片放到载玻片加温器(Slidemoat,Boekel,Germany)于55℃反应90分钟。于杂交后,通过将载玻片埋浸到每个载玻片约20ml预先加温过的25mM Tris,pH 10、137mMNaCl与3mMKCl(于55℃水浴中)中将盖玻片移除,并于清洗载玻片30分钟。最后各以一滴封片媒介(AdvanDx,Woburn,MA)覆盖盖玻片封片该抹片,然后以配置FITC/Texas Red双频滤光组的萤光显微镜检验。克雷伯氏肺炎菌经识别为绿色萤光杆菌,而克雷伯氏菌经识别为红色萤光杆菌,结果纪录于表2。
表2
生物 | 结果 |
大肠杆菌 | 阴性 |
克雷伯氏肺炎菌 | 阳性/绿色 |
克雷伯氏菌 | 阳性/红色 |
绿脓杆菌(Pseudomonasa eruginosa) | 阴性 |
毁花假单胞(Pseudomonas florescens) | 阴性 |
门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina) | 阴性 |
类鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mucidolens) | 阴性 |
类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcigenes) | 阴性 |
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) | 阴性 |
紫丁香假单胞菌(Pseudomonas syringe) | 阴性 |
参考表2,所测试10个革兰氏阴性杆菌菌种中只有2个有阳性结果,克雷伯氏肺炎菌样本中含有绿色萤光杆菌,而克雷伯氏菌样本中含有红色萤光杆菌。阳性结果证明所测试的该探针混合物分别对克雷伯氏肺炎菌与克雷伯氏菌产生绿色与红色的菌种特异信号。
实施例2
PNA探针序列
Saga16S03-Flu Flu-OO-ACACCAAACCTCAGC(Seq.Id.No.4)
Saga16S04-Flu Flu-OO-ACACCAAACATCAGC(Seq.Id.No.5)
(注意:于此使用一般命名法说明PNA探针的端点;O=8-氨基-3,6-二氧杂辛酸;flu=5(6)-羧基-荧光素)
细菌菌株
制备代表各式革兰氏阳性球菌参考菌珠的隔夜培养(AmericanType Cultuere Collection,Manassas,VA),革兰氏阳性球菌包含无乳链球菌。
制备抹片
如同实施例1所述制备抹片。
萤光原位杂交(FISH)
如同实施例1所述实施杂交,除了本例所使用的探针为500nM的Saga16S03-Flu、500nM的Saga16S04-Flu或是Saga16S03-Flu与Saga16S04-Flu的组合,两者都是500nM(双探针)。以配置FITC/TexasRed双频滤光组的萤光显微镜检验。无乳链球菌经识别为绿色萤光球菌,结果纪录于表3。
表3
生物 | Saga16S03 | Saga16S04 | 双探针 |
无乳链球菌 | 阳性/绿色 | 阴性 | 阳性/绿色 |
类马链球菌(Strep tococcus equisimilis) | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes) | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
耐久肠球菌(Enterococcus durans) | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
粪肠球菌(Enterococcus faecalis) | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
屎肠球菌(Enterococcus facium) | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
海氏肠球菌(Enterococcus hirae) | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
参考表3,不论是以Saga16S03探针或是双探针组侦测无乳链球菌都产生阳性结果,其他结果都是阴性,这显示该探针/探针组具特异性。
实施例3
PNA探针序列
PF-Adx1 Flu-OO-CCCTAGTCGGCATAG(Seq.Id.No.6)
PF-Adx2 Flu-OO-CCAAGAGATCCGTTG(Seq.Id.No.7)
(注意:于此使用一般命名法说明PNA探针的端点;O=8-氨基-3,6-二氧杂辛酸;flu=5(6)-羧基-荧光素)
细菌菌株
制备代表各式革兰氏阳性球菌参考菌珠的隔夜培养(AmericanType Cultuere Collection,Manassas,VA),革兰氏阳性球菌包含无乳链球菌。
制备抹片
如同实施例1所述制备抹片。
萤光原位杂交(FISH)
如同实施例1所述实施杂交,除了本例所使用的探针为500nM的PF-Adx1或是500nM的PF-Adx2。以配置FITC/Texas Red双频滤光组的萤光显微镜检验。真菌经识别为绿色萤光芽或是菌丝,结果纪录于表4。
表4
生物 | PF-Adx1 | PF-Adx2 |
白假丝酵母(Candida albicans) | 阳性/绿色 | 阳性/绿色 |
链状假丝酵母(Candida catenulata) | 阳性/绿色 | 阳性/绿色 |
光滑假丝酵母(Candida glabrata) | 阳性/绿色 | 阴性 |
金黄色葡萄球菌(S.aureus) | 阴性 | 阴性 |
大肠杆菌 | 阴性 | 阴性 |
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) | 阳性/绿色 | 阳性/绿色 |
参考表4,所有以PF-Adx1探针侦测的真菌生物,包括白假丝酵母、链状假丝酵母、光滑假丝酵母及酿酒酵母都呈阳性。而所测试的二个细菌菌种(金黄色葡萄球菌与大肠杆菌)都呈阴性。除了光滑假丝酵母的测试呈阴性之外PF-Adx2探针产生与PF-Adx1的结果类似的模式,。与已公开光滑假丝酵母的5.8S rRNA基因序列比对证实基因中存在一个不匹的配碱基,这可能是导致阴性结果的原因。
实施例4
PNA探针序列
Eco23S277-Flu Flu-OO-ACA-CAC-ACT-GAT-TCA(Seq.Id.No.1)
Abau23S-03b-Flu Flu-OO-CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C(Seq.Id.No.8)
Abau16S-04c-Flu Flu-OO-GCT-CAC-CAG-TAT-CG(Seq.Id.No.9)
(注意:于此使用一般命名法说明PNA探针的端点;O=8-氨基-3,6-二氧杂辛酸;flu=5(6)-羧基-荧光素)
细菌菌株
制备代表各式细菌菌种的参考菌珠的隔夜培养(American TypeCultuere Collection,Manassas,VA),所有的细菌菌种为革兰氏阴性杆菌(杆菌(bacilli))。
制备抹片
如同实施例1所述制备抹片。
萤光原位杂交(FISH)
如同实施例1所述实施杂交,除了本例所使用的探针为500nM的Eco23S277-Flu、200nM的Abau23S-03b-Flu或是200nM的Abau16S-04c-Flu。以配置FITC/Texas Red双频滤光组的萤光显微镜检验。绿色萤光杆菌(杆菌(bacilli))识别为阳性,结果纪录于表4。
表4
生物 | Eco23S277 | Abau16S-04c | Abau23S-03b |
大肠杆菌(35218) | 阳性/绿色 | 阴性 | 阴性 |
大肠杆菌(0157:H7)(43888) | 阳性/绿色 | 未试验 | 未试验 |
乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)(14987) | 阴性 | 阳性/绿色 | 阳性/绿色 |
鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(19606) | 未试验 | 阳性/绿色 | 阳性/绿色 |
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(10145) | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
克雷伯氏肺炎菌(10031) | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
克雷伯氏菌(43086) | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
参考表4,以Eco23S277-Flu探针侦测大肠杆菌的菌株号都呈阳性、以Abau23S-03b-Flu与Abau23S-03b-Flu探针侦测不动杆菌菌种,这二者都呈阳性。,其他结果都是阴性,这显示该探针/探针组具特异性。
均等物
当本发明已经以参考最优选实施例的方式特地显示或是描述后,应理解对熟习本领域技术人员来说,其可于其中作出形式或是细部的各式变化,而不会偏离本发明如同随附的权利要求书所定义的精神与范围。那些熟习本领域技术人员将能够不超过常规实验而确认本发明于此描述的特定实施例的许多均等物。预期这样的均等物应包含在权利要求书的范围内。
所有于本文所提及的参考文件都并入本文参考。
序列表
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<120>用于微生物分析的肽核酸探针
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<140>PCT/US06/021614
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<160>9
<170>专利第3.3版
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对于人工序列的描述:合成探针
<400>1
acacacactg attca
<210>2
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>对于人工序列的描述:合成探针
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cacctacaca ccagc
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对于人工序列的描述:合成探针
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acaccaaaca tcagc
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<212>DNA
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<220>
<223>对于人工序列的描述:合成探针
<400>9
gctcaccagt atcg
Claims (36)
1.一种包括适于微生物分析的核酸碱基序列的PNA探针,该PNA探针选自下列所组成的群组:SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8或9及其互补物。
2.如权利要求1所述的PNA探针,其中该探针的至少一部分为与选自下列核酸碱基序列所组成的群组具有至少约86%的同一性:SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8或9。
3.如权利要求2所述的PNA探针,其中该探针序列长度为8至18个核酸碱基。
4.一种用以侦测、识别或是计量具有如SEQ ID NO:1所示序列或其互补物的大肠杆菌的PNA探针。
5.一种用以侦测、识别或是计量具有如SEQ ID NO:2所示序列或其互补物的克雷伯氏肺炎菌的PNA探针。
6.一种用以侦测、识别或是计量具有如SEQ ID NO:3所示序列或其互补物的克雷伯氏菌的PNA探针。
7.一种用以侦测、识别或是计量无乳链球菌的PNA探针,该无乳链球菌选自下列所组成的群组:SEQ ID NO:4、5或其互补物。
8.一种用以侦测、识别和/或是计量真菌的PNA探针,该真菌选自下列所组成的群组:SEQ ID NO:6、7或其互补物。
9.一种用以侦测、识别和/或是计量不动菌菌种的PNA探针,该不动菌菌种选自下列所组成的群组:SEQ ID NO:8、9或其互补物。
10.如权利要求1所述的PNA探针,其中该探针经至少一个可侦测部分标记。
11.如权利要求10所述的PNA探针,其中该可侦测部分选自下列所组成的群组:偶合物、支链侦测系统、发色团、萤光团、自旋标记、放射性同位素、酶、半抗原、吖啶酯以及发光化合物。
12.如权利要求10所述的PNA探针,其中该探针为自我报告。
13.如权利要求12所述的PNA探针,其中该探针为PNA线性信标。
14.如权利要求1所述的PNA探针,其中该探针未经标记。
15.如权利要求1所述的PNA探针,其中该探针结合到一个载体
16.如权利要求15所述的PNA探针,其中该探针进一步包括间隔子或连接子。
17.如权利要求1所述的PNA探针,其中使用原位杂交来分析任选地出现在样本中的微生物。
18.如权利要求1所述的PNA探针组,其中该探针为独立的分析而经不同标记。
19.一种用以侦测、识别和/或是计量样本中微生物的方法,该方法包括:
将至少一个如权利要求1所述的PNA探针与该样本接触;
将该PNA探针与该样本中微生物的目标物序列杂交;以及
以侦测该杂交作为该样本中微生物出现、身分和/或是量的指示。
20.如权利要求19所述的方法,其中该分析发生在原位。
21.如权利要求20所述的方法,其中该分析通过萤光原位杂交发生。
22.如权利要求21所述的方法,其中该方法不涉及于杂交前使用交联剂或是酶。
23.如权利要求21所述的方法,其中该方法用以侦测包括目标物序列的核酸,其中该核酸是于反应中被合成或是被扩增的。
24.如权利要求23所述的方法,其中优选的核酸合成或是核酸扩增法选自下列所组成的群组:聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链替代扩增法(SDA)、转录介导的扩增法(TMA)、滚环式扩增法(RCA)以及Q beta复制酶扩增法。
25.如权利要求21所述的方法,其中该方法更包括加入至少一个阻断探针以降低或是排除任何该PNA探针对非目标物序列的杂交。
26.如权利要求25所述的方法,其中目标物序列是固定到表面上。
27.如权利要求21所述的方法,其中该PNA探针是固定到表面上。
28.如权利要求27所述的方法,其中该PNA探针为阵列的一个组分。
29.如权利要求21所述的方法,其中该方法包括应用如权利要求17-19项所述的PNA探针组。
30.如权利要求21所述的方法,其中该样本为生物样本。
31.如权利要求30所述的方法,其中该生物样本为血液、尿液、分泌液、汗水、唾液、粪便、黏液或是其培养物。
32.一种用以侦测、识别和/或是计量一种或是一种以上微生物的试剂盒,包括:一种或是一种以上如权利要求1所述的PNA探针,以及使用说明书.
33.如权利要求32所述的试剂盒,其中该试剂盒用于原位杂交试验。
34.如权利要求32所述的试剂盒,其中该试剂盒用于实时PCR试验。
35.如权利要求32所述的试剂盒,其中该试剂盒用于检验临床样本,该临床样本例如临床标本或其培养物。
36.包括至少一种如权利要求1所述的PNA探针的RNA探针组,其中二种或是二种以上的探针用于通过符合萤光产生第三颜色。
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