CN101495130A - 肽酰二酰基甘油酯 - Google Patents
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Abstract
本文公开可以被共价键连到脂上的一个肽和多个肽以及利用这些肽和脂肽来预防或治疗疾病的方法。
Description
B.相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2005年7月25日递交的题为“一类新型脂肽及其生物活性”的美国临时申请No.60/702,111、2006年2月28日递交的题为“新型免疫调节肽和脂肽及其生物活性”的美国临时申请No.60/777,319以及2006年3月29日递交的题为“新型免疫调节肽及脂肽”的美国临时申请No.60/787,385的优先权,其公开内容通过引用被整体包括在本文中。
C.关于联邦资助研究项目的声明——不适用
D.联合研究协定——不适用
E.引用在光盘上递交的材料的并入——无
F.发明背景
[0002]在本范例中,脊椎动物中的免疫功能的特征在于由两种主要的应答类型所组成:适应性免疫应答和先天性免疫应答。所述的适应性免疫应答只存在于脊椎动物中并提供对于曾经有过早先暴露的病原体的选择性长期保护以防再感染。先天性免疫应答提供对于感染和损伤的立即响应并增进效应细胞的噬菌、细胞溶解和细胞毒性作用。
[0003]先天性免疫应答是动物中进化上最古老(>2.5亿年)的免疫系统并且事实上存在于所有脊椎动物和无脊椎动物中。脊椎动物免疫应答的先天性分支(innate arm)是抵御入侵的病原体的第一防线并且是由在组织部位(尤其是在细菌和病毒病原体的主要入口的组织,例如皮肤和呼吸及消化道)中大量存在的免疫细胞构成。由一组种系编码的受体介导,免疫应答的先天性分支的免疫细胞与介导免疫应答的适应性分支作用的免疫细胞在表型上和基因型上是截然不同的。
[0004]先天性免疫应答和炎症是密切相关的。对局部感染或创伤的炎性应答通常被看作是有益的,导致通过组织驻留效应细胞的细胞毒性和噬菌作用的病原体防范和清除。尽管局部炎症是有益的,但全身炎症却是有害的并常常是创伤性损伤或败血症的致命后果。因此,限制对创伤或败血症的炎性应答是当前医学研究的主题,并且在创伤性损伤或败血症期间制约先天性免疫应答可能是限制炎症的有效途径。
[0005]组织因子或外源性凝血瀑布反应(extrinsic clotting cascade)最近已被鉴定为全身炎症或败血症期间凝血的激活剂。传统上凝固曾被认为是独立于炎症的过程,其具体发展为防止由循环系统物理缺口(physical breach)而导致的血量和血液组分的流失。在这种传统观点中,凝血酶介导所述瀑布反应,而所述瀑布反应是血液凝固的唯一机制。然而,近期的证据已经确定,促炎性细胞因子,尤其是IL-6,也通过增加目前被认为是全身炎症或败血症期间的首要激活剂的组织因子(TF)的表达而促进凝固。
[0006]相反地,凝血酶具有要包括白细胞粘附、促炎性细胞因子产生(尤其是IL-6和IL-8)、从血小板释放可溶性CD40L以及从肥大细胞释放组胺的各种促炎性作用。血小板先前也未被认识到是具有联系炎症和先天性免疫应答的分子信号能力的炎性介体。因此,目前清楚的是凝固、炎症以及先天性免疫应答是相互联系的过程。对炎症在宿主免疫应答中的角色人们知之甚少,但是它是免疫应答的先天性分支的调节、控制以及相互联系的重要方面。在统一观点中,哺乳动物先天性免疫应答是四个阶段的统一体,其由炎症开始,先天性免疫效应细胞的上调,先天性免疫应答的细胞毒性以及细胞溶解作用的下调,以及回到稳态。对炎性瀑布反应的较好理解对于作为许多重要的人类疾病的基础的免疫病理学的理解以及合理设计安全有效的治疗策略是首要的。
[0007]T细胞是哺乳类的免疫应答的首要参与者并已通过T细胞受体(TCR)的不同表达被分为αβ或γδ异二聚体。人类大部分循环T细胞具有αβ亚群的性质(αβT细胞)。历史上,研究集中在αβT细胞上,并且αβT细胞在适应性免疫应答中的角色已由借助于存在抗原的细胞以及与主要的组织相容性复合物(MHC)结合的TCR的识别抗原被清楚地确定。
[0008]T细胞的γδ亚群是占组织驻留T细胞总体直至50%的组织驻留细胞的未较好研究的细胞系。然而在循环中,γδT细胞比其αβ同类要更不普遍得多并且只占循环T细胞总体的大约1-5%。γδT细胞细胞因子释放对于巨噬细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)激活作用的影响最近在鼠科动物模型中有报道。简要地,缺乏γδT细胞的小鼠已经呈现为较不能抵抗细菌感染并且其特征为巨噬细胞稳态破坏,降低的来自NK细胞的INF-γ产量以及增加的细菌生长。γδT细胞的抗原识别不取决于MHC并且这些细胞具有多样的TCR所有组成成分。因此,γδT细胞可以在各种感染期间被激活。一旦激活,这些细胞能够采用似乎与适应性类型的体外免疫应答类似的克隆扩增的机理而经历克隆扩增从而占总的T细胞总体的高达97%。
[0009]已经表征了在首次用于实验的小鼠和感染了假结核耶尔森菌(Yeserniapseudotuberculosis)的小鼠中γδT细胞的转录特性,表明鼠类γδT细胞基本表达粒酶A、B以及RANTES和其他例如淋巴毒素b、Fas配体、NKR-PLA、NKR-PLC、LAG-3以及2B4的细胞毒介体的高转录水平以及相应的抑制受体。然而,据我们所知,对于灵长类γδT细胞尚未开展相似的研究。
[0010]病原体的先天性免疫识别通常被认为是通过一系列组织驻留单核细胞上的被称为模式识别受体(PRRs)的种系编码的受体所介导的。研究最多的PRR是Toll样受体(TLR)。Toll受体是首先在果蝇(Drosophila)中鉴定的跨膜受体,但随后在人类中鉴定了同源TLR族。TLR的细胞内区域在结构上与IL-1受体紧密相关并且被称作Toll/白介素-1(TIR)区域。果蝇Toll和人类TLR共有由四个主要部分组成的同源细胞内信号组分:(1)衔接蛋白MyD88,(2)TOLLIP(Toll相互作用蛋白),(3)蛋白激酶IRAK(IL-1R相关激酶)以及(4)TRAF6(TNF-受体相关因子6)。
[0011]TLR识别病原体衍生分子的保守区,通常被称为病原体相关分子模式或PAMPs,例如细菌细胞壁脂多糖(LPS)、葡萄球菌肠毒素B(SEB)、破伤风毒素抗原(TTA)、双螺旋病毒RNA片段、细菌DNA以及鞭毛蛋白。TLR激活作用最终导致NFκB的激活作用以及在巨噬细胞和树突状细胞中产生下游趋化因子,所述趋化因子包括,IL-8,IP-10,MIP-1α和β,和RANTES,以及在感染位置NK细胞和T细胞的流入。除纤连蛋白片段之外,人类TLRs还未被显示为以类似于果蝇处理的方式响应病原体感染而识别内源性配体。
[0012]热休克蛋白(HSPs)是一族由哺乳动物细胞和类似的微生物病原体产生的高度保守的应激蛋白,在风湿关节炎和动脉粥样硬化症免疫疗法中涉及HSPs。HSPs的免疫原性似乎是由HSPs所相伴的抗原肽而衍生的。HSP-肽复合物将相伴肽的抗原性较之例如白蛋白的非HSP肽结合抗体提高了几个数量级。HSP-肽复合物的共同受体已被鉴定为CD91,其是一种单核细胞上的α2巨球蛋白受体。因此,HSPs是响应病原体感染的先天性免疫应答中重要的炎性调节蛋白。
[0013]防御素和cathelicidins都是最近被发现具有免疫调节特性的小的阳离子抗菌肽。人类防御素和cathelicidins源白于包括嗜中性白细胞、单核细胞,某些淋巴细胞群、角质形成细胞和支气管上皮细胞的细胞。防御素是具有类似于趋化因子结构的复杂三级结构的3.5-4k Da的富含半胱氨酸的阳离子肽。cathelicidins是线性肽,以LL-37为例,由人类CAP-18的C端序列衍生。
[0014]各种来自细菌细胞膜的脂蛋白已显示出激活巨噬细胞、成纤维细胞和淋巴细胞而诱导炎性应答,并广泛被视为本质上是促炎性的。例如来自大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)的脂蛋白被表征并显示是单核细胞的激活剂。最近,一族脂肽已从支原体(Mycoplasma)有机体中表征出来。母体2kDa的脂肽已被表征为巨噬细胞的强力激活剂,并且被称为巨噬细胞激活脂肽即MALP-2。这些单核细胞激活脂肽具有某些关键的共同结构特点。该支原体脂肽含有不同长度和序列的肽,但都有一个N-端半胱氨酸。脂质部分被酯化为N端半胱氨酸的2,3-二酰基(diacoyl)氧丙基硫醚。因此,N端氮是游离的。此外S-对映体是生物活性的,而R-对映体不是。另一方面来自大肠埃希氏菌的活性脂肽是一种三脂变体,其中第三脂是作为N-末端酰胺连接的。
[0015]文献中已有二酰甘油生物作用的详尽描述。举例来说,众所周知二酰甘油参与如三甘油酯的脂类的运输并且与可溶性蛋白质(如载脂蛋白)缔合,是胆固醇的转运者。还已知二酰甘油具有胞内信号功能。细胞内的膜结合磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸酯是由磷脂酶C酶的作用被裂解而释放两个胞内信使分子,肌醇三磷酸和膜结合二酰甘油(具体为1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油)。二酰甘油激活蛋白激酶C,所述蛋白激酶C激活转录因子NFκB以上调各种细胞因子和趋化因子的基因表达。
G.发明简述
[0016]本文所述发明的实施方案包括可以激发免疫应答的化合物,所述化合物包括共价键连(link)到脂上的从大约5到大约25个氨基酸的免疫反应性肽。在一些实施方案中,所述的脂可以是具有通式(I)的甘油酯:
其中X1,X2和X3选自氢、C2到C25脂肪酸和肽,并且X1,X2和X3中至少一个是肽。实施方案中的脂肪酸可以是饱和的,不饱和的或多不饱和脂肪酸,并且所述的肽可以通过所述肽C端处的酯键共价键连到所述的脂上。
[0017]在某些实施方案中,所述免疫反应性肽具有氨基酸序列XSHNLCX或其翻转(inversion),在一些实施方案中,可以是RSHNLCX或YTSHNLCX或其翻转。在又一些其他的实施方案中,所述氨基酸序列可以是YTSHNLCXCLNHSR或其翻转,而在某些其他的实施方案中,所述氨基酸序列可以是FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE。
[0018]本发明实施方案的化合物还可以进一步包含药学上可接受的赋形剂并可以以与所述化合物有效量一致的单位剂量形式来被提供,并且这些实施方案可以被认为是药物组合物。
[0019]本发明进一步的实施方案包括一些方法,所述方法可以包括向需要所述方法的对象施用有效量的由共价键连到脂上的具有大约5到大约25个氨基酸的肽制成的药剂,并且激发免疫应答。本发明实施方案的所述肽,可以包括氨基酸序列RSHNLCX或YTSHNLCX或其翻转、并且在一些实施方案中包括YTSHNLCXCLNHSR或其翻转的肽或肽片段。
[0020]本发明实施方案的药剂可以包括以下通式(I)的甘油酯
其中X1,X2和X3选自氢、C2到C25脂肪酸和肽,并且X1,X2和X3中至少一个是肽。一些实施方案中的脂肪酸可以是饱和的,不饱和的或多不饱和脂肪酸。所述肽可以通过所述肽C端处的酯键共价键连到所述的脂。所述药剂可以被施用以激发先天性免疫应答,并且包括但不限于γδT细胞、单核细胞、NK细胞、嗜中性白细胞、C5+B细胞及其组合的组织驻留免疫细胞可以被激发。在一些实施方案中,所述组织驻留免疫细胞在被所述肽接触时被激发。
[0021]在本发明的一些实施方案中,所激发的免疫应答可以包括在施用所述药剂后至少3天激发免疫应答,并且在某些其他的实施方案中,所述的免疫应答可以被激发一周或更长。
[0022]在又一些实施方案中,所述药剂可以被存储(deposit)在所述对象的脂肪组织中,并且所述的药剂可以以任何方法施用,所述方法包括经肠的、不经肠的和局部递送、乳房输注及其组合。不经肠的施用可以包括,但不限于,关节内、滑膜内、鞘内(interaathecal)、动脉内、静脉内、肌肉内、皮下的及其组合。经肠施用可以包括,但不限于,口服的、经口的、直肠的及其组合,而局部施用可以包括,但不限于鼻内的、呼吸内的(intrarespiratory)、上表皮的、经皮递送及其组合。
[0023]在本发明的一些实施方案中,所述药剂可以在暴露于疾病形成剂(diseaseforming agent)之前被施用,并且在这些实施方案中实质性地预防疾病。在其他实施方案中,所述药剂可以在疾病之前被施用。所述药剂还可以在暴露于疾病形成剂之后被递送,并且在这些实施方案中可以实质性地预防疾病。在再进一步的实施方案中,所述药剂可以在疾病后递送至所述对象。
[0024]本发明实施方案的另外的方法包括治疗感染的方法、激发免疫应答的方法、预防疾病的方法、预防感染的方法及其组合,例如用以上所描述的本发明的药剂和组合物治疗疾病和预防二次感染的方法。
[0025]本发明的实施方案还包括针对本发明化合物的抗体,以及通过施用本发明实施方案的抗体治疗炎症的方法,所述的炎症例如但不限于的全身炎症、慢性炎性疾病以及归因于败血症、非脓毒性损伤、创伤、手术或其组合。本发明实施方案的抗体可以以任何本领域已知的方法施用,所述方法包括,但不限于经肠的、不经肠的以及局部递送。
[0026]本发明实施方案的抗体还可以被键连至可选择的标记物,所述的标记物例如,但不限于,例如蛋白质的荧光标记物或量子点以形成探针,以及利用这样的探针来检测和鉴别例如生物的、细胞的或组织样本的样本中的肽以及与这些肽相互作用的细胞或蛋白质的方法。
H.附图描述
[0027]图1显示纯化的1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯的有代表性的HPLC色谱图。
[0028]图2显示与假定的1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯的预测NMR(图2B)对比的PDAG的1H核磁共振谱(图2A)。插入的图为1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油的实际NMR谱。
[0029]图3显示非灵长类1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯的MALDI-TOF谱。
[0030]图4显示包含1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯的人类血清级分在用脂蛋白脂肪酶处理之前(图4A)和之后(图4B)的HPLC色谱图。
[0031]图5显示纯化的包含1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯的猴血清(图5A)和来自猴血浆的相应级分(图5B)的HPLC色谱图。
I.发明详述
[0032]还必须注意如在本文中和所附权利要求中所使用的,单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该/所述(the)”包括复数涵义,除非上下文清晰表明并非如此。因此,举例来说,论及“细胞(cell)”是论及一个或更多个细胞或本领域技术人员已知的其等价物等等。除非另外定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员中的一员所公知的相同的含义。尽管在本发明实施方案的实际操作和测试中可以使用与本文所描述类似或等价的方法和材料,现在描述的是优选的方法、装置和材料。本文提及的所有出版物都通过引用并入本文。本文中任何都不要解读为承认本发明由于这些在先发明而没有优先于这些公开内容的权利。
[0033]“佐剂”指增强抗原的免疫激发性质或药品的药理学效果的任何物质。
[0034]如本文所使用的,术语“大约”意为正被使用的数据的数值的正或负10%。因此,大约50%意为在45%-55%的范围。
[0035]术语“模拟物”,“肽模拟物”或“拟肽(peptidomimetic)”在本文中被互换使用,并泛指模拟选定的天然肽或蛋白质功能域(例如结合基序和活性位点)三级结合结构或活性的肽、部分肽或非肽分子。如在下面进一步描述的,这些肽模拟物包括重组或化学修饰的肽,以及例如小分子药物模拟物的非肽剂。
[0036]如在本文中所使用的,术语“药学上可接受的盐、酯、酰胺和前药”指本发明化合物的那些羧酸盐、氨基酸加和盐、酯、酰胺及前药,以及,如果可能的话,本发明化合物的两性离子形式,所述前药在可靠医学判断的范围内适于与患者的组织接触使用,而没有不当的毒性、刺激、变态反应等等,具有合理的益处/风险比例,并且对于其预期的用途是有效的。
[0037]如在本文中所使用的,术语“生理学上可耐受”及其语法变体,由于其指组合物、载体、稀释剂和试剂,被互换使用并且代表所述材料能够使用在哺乳动物上而不产生或产生最小限度的不期望的生理效应,例如恶心、眩晕、皮疹或嘈杂(gastric upset)。在优选的实施方案中,所述治疗组合物在施用于人类患者或其他用于治疗目的的动物时不是抗原的。
[0038]在与治疗方法结合使用时,“提供”意为将治疗物直接施用到靶组织中或靶组织上或将治疗物施用至患者,由此,所述的治疗物确实地影响其所靶向的组织。
[0039]如本文所使用的,“对象”或“患者”指一种动物或哺乳动物,包括,但不限于,人类、狗、猫、马、母牛、猪、绵羊、山羊、鸡、猴、兔、大鼠、小鼠等等。
[0040]针对本发明目的的“疾病”可以是任何感染剂(infectious agent)例如,举例来说,病毒颗粒、细菌病原体等等。关于“患病的对象”中使用的“患病者”可以指任何受感染剂感染的人类和动物对象。所述的“患病的对象”可以呈现或可以不呈现感染的病征,例如,已知的症状。
[0041]如本文所使用的,“样本”包括可以通过本发明的方法测试的生物样本并且包括,但不限于,体液例如血清、血浆、全血、脑脊髓液、淋巴液,各种外分泌物(尿、呼吸道,肠道或泌尿生殖道分泌物、眼泪等)等。
[0042]如本文所使用的,术语“治疗物”意为用于治疗、抗击、缓解、预防或改善患者的有害的病症或疾病的药剂。本发明的实施方案是针对激发先天性免疫应答或炎性应答的调节。本文针对应用的方法预期为预防疾病的应用以及在已有病症的疗法中的治愈的应用。
[0043]如本文所使用的术语“治疗有效的”或“有效的”可以互换地使用并且指本发明的治疗组合物实施方案(例如一种或更多种所述肽酰二酰基甘油酯或其模拟物)的量。举例来说,包括1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯或其模拟物的组合物的治疗有效量是计算为实现期望效果的预先决定的量,即,用以有效地激发被施用了所述组合物的动物中的先天性免疫应答的预先决定的量。
[0044]针对本发明的治疗组合物被使用时的术语“单位剂量”是指,针对所述对象适宜作为单次使用量的物理上分立的单位,每个单位包含与所需稀释剂(即赋形剂、载体或运载体)结合的计算为产生期望的治疗效果的活性材料的预定量。
[0045]本发明的一个实施方案针对1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯或PDAG。本发明其他的实施方案可以包括包含PDAG类的组合物,包含PDAG类的部分的组合物,包含PDAG肽的类似物的组合物以及包含PDAG类肽模拟物的组合物。
[0046]在本发明的一些实施方案中,可以向一对象提供PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物并且可以激发例如,但不限于包括诱导免疫应答的治疗效果,并且在某些实施方案中,所述免疫应答可以是被这样提供的对象中的先天性免疫应答。在本发明其他的实施方案中,PDAG类、PDAG类的部分、PDAG的类似物和PDAG的模拟物可以被施用于正在经受疾病治疗的对象、健康的对象或健康的且可能暴露于疾病、疾病形成颗粒或患疾病的人和/或动物的对象。在其中向健康的对象提供PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物以及包含PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物的治疗物的本发明的实施方案中,所述PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物可以促进所述对象免疫系统的预防疾病的激活作用,并且在某些实施方案中促进先天性免疫性的预防疾病的激活作用。
[0047]不希望受缚于理论,在本发明的实施方案中,当向对象提供PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物时,所述的PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物可以激活所述对象中的组织驻留免疫细胞。在一些实施方案中,所述PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物可以启动免疫应答,而在其他的实施方案中,所述的免疫应答可以是先天性免疫应答。
[0048]本发明的实施方案还可以包括施用PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物以及包含PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物的治疗物的方法,例如,但不限于,不经肠的、经肠的或局部施用的方法。
[0049]本发明其他的实施方案包括具有对所述PDAG类特异性的抗体以及这些抗体在消除对象中PDAG类的全身或局部浓度中的应用的方法。在某些实施方案中,所述被提供具有对所述PDAG特异性的抗体的对象可以呈现免疫疾病的症状,这些免疫疾病例如,但不限于,全身炎症、慢性炎性疾病、动脉粥样硬化疾病、类风湿疾病、自体免疫疾病等等。
[0050]本发明还有其他的实施方案包括荧光标记的PDAG类、PDAG类的类似物以及具有对PDAG类特异性的荧光标记的抗体或抗体片段以及产生这些荧光标记的PDAG类、PDAG类的类似物和抗体的方法。在本发明的实施方案中,荧光标记的PDAG类、PDAG类的类似物和抗体可以作为体外和体内评估免疫系统和免疫病理学方面的诊断工具来被使用,并且在一些实施方案中,对象可以包括,但不限于,呈现与慢性炎性疾病、自体免疫疾病、动脉粥样硬化疾病、糖尿病等等一致的症状的对象。
[0051]在本发明各种实施方案中描述的PDAG类可以包括具有至少一个被共价连接到脂组成成分(moiety)的肽组成成分的肽酰二酰基甘油酯,并且具有通式1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯(1-peptidyl-2,3-diacylglyceride)。在某些实施方案中,所述的脂组成成分是1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油。
[0052]在本发明一些实施方案中描述的PDAG类可以具有通式(I),
其中X1、X2和X3可以是氢、肽、肽模拟物或肽类似物或具有从大约1到大约20个碳原子的饱和、不饱和、或多不饱和脂肪酸。在本发明的一些实施方案中,X1、X2和X3中的至少一个可以是肽、肽模拟物或肽类似物,而在其他一些实施方案中,X1、X2和X3中的多于一个可以是肽、肽模拟物或肽类似物。
[0053]本发明实施方案的所述肽组成成分可以由从在大约5到大约25个之间的氨基酸所构成,并且可以包括一种或更多种天然存在的、非天然存在的以及化学修饰的氨基酸。这些肽组成成分可以重大约1000到大约3000amu。本发明所包含的肽或其模拟物可以包括任何给予激活免疫性的期望效果的氨基酸序列。肽组成成分可以在被连接到所述的脂组成成分之前被制造和/或分离并且可以是合成的或由天然来源分离,所述的天然来源举例来说,人类、动物、细菌来源等等,或可以通过本领域已知的任何方法合成。这样合成和分离的肽、肽模拟物和肽类似物可以通过任何本领域普通技术人员所知的方法纯化和浓缩,所述的方法例如,举例来说,通过过滤、色谱等等。所述的肽组成成分可以通过在所述肽的羧基端羧酸上的酯化而被共价地缀合(conjugate)到所述的脂组成成分上,并且在一些实施方案中,所述的肽组成成分可以经由所述肽羧基端羧酸的磷酸酯被缀合到所述脂组成成分上。
[0054]被共价地缀合到脂组成成分以构成PDAG类的肽、肽模拟物或肽类似物可以被认为是、并且此后被称为“PDAG脂肽”。
[0055]举例来说,PDAG类可以按如下合成。PDAG肽或PDAG肽模拟物可以用固相合成方法制备,所述的固相合成方法例如具有延长的HBTU/HOBt偶合循环和预填充的Wang树脂的FMOC合成方案。在合成之后,所述的肽侧链保护基可以被切除并且所述的肽可以用试剂K(Reagent-K)从所述树脂释放。然后所述肽可以从合成缓冲液中用例如二乙醚萃取和冻干而提取。反相C-18纯化可以被用于进一步纯化所得的粗品肽并且可以接着MALDI-TOF表征以确认所述的氨基酸序列。
[0056]肽模拟物的所述PDAG肽可以采用两步过程被共价连接到所述的PDAG的脂部分,在所述的两步过程中,首先,所述的PDAG肽按如上所述被合成但没有所述的脱保护步骤。然后,可以用,举例来说,可以用例如二环己基碳酰亚胺活化C-末端羧酸,并且可以使所述肽在二酰甘油或二酰甘油磷酸酯的存在下温育几个小时。其酯化可以在使肽酰二酰基甘油酯形成的温育步骤期间发生。所述肽侧链保护基可以接着被试剂K切除,并且所述的肽酰二酰基甘油酯产品可以被分离并用色谱纯化。然后可以用MALDI-TOF表征来确认所述被纯化产品的结构。
[0057]本发明实施方案的PDAG类的肽部分可以被修饰,例如,举例来说,通过用非天然存在侧链替代一个或更多个所述的20个基因编码的氨基酸(或D氨基酸)的天然存在侧链来被修饰,非天然存在侧链的实施例包括,但不限于,烷基、较低级烷基、4-,5-,6-至7元烷芳基、酰胺、酰胺较低级烷基、酰胺二(较低级烷基)、较低级烷氧基、羟基、羧基和其较低级酯衍生物,以及具有4-,5-,6-至7元的杂环以产生肽模拟物。举例来说,脯氨酸类似物可以用其中脯氨酸残基的环大小从5元改变到4,6或7元的来制备。环状基团可以是饱和的或不饱和的,并且如果是不饱和的,可以是芳香的或非芳香的。杂环基团可以包括一个或更多个杂原子例如,举例来说,氮、氧、和/或硫等等,并且可以形成一些基团,这些基团包括但不限于呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基(例如:吗啉代)、噁唑基、哌嗪基(如1-哌嗪基)、哌啶基(如1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(如1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代吗啉基(如硫代吗啉代)以及三唑基的基团。这些杂环基团可以是饱和或不饱和的。取代的杂环基团可以包括取代基,所述的取代基例如但不限于烷基、烷氧基、卤素、氧或取代的或未取代苯基。PDAG肽的拟肽还可以具有被化学修饰过(例如通过磷酸化、磺化、生物素化等等)的氨基酸残基。
[0058]有各种技术可用于构建具有与相应的天然肽相同或相似的所期望的生物活性但具有较好溶解性、稳定性和/或易水解性到易蛋白酶解性的肽模拟物。因此,由于其具有增加的细胞渗透性、较大的亲和性和/或对细胞受体的亲合力以及延长的生物半衰期,这些拟肽化合物的特征激励了其在治疗性应用中的使用。某些拟肽化合物是基于本发明的肽的氨基酸序列。拟肽化合物常常是具有基于选定肽三维结构的三维结构(即肽基序)的合成化合物。所述肽基序提供给所述的拟肽化合物期望的生物活性,即,增强或激发免疫应答,其中所述的模拟化合物的结合活性不被实质性地降低,并且常常是与所述模拟物所模拟的天然肽的活性相同或比所述模拟物所模拟的天然肽的活性高。
[0059]拟肽设计策略在本领域是容易获得的。拟肽中的一类除了模拟原子之间的肽骨架外,还包含部分或全部为非肽的骨架,并且包括同样模拟所述天然氨基酸残基侧基官能性的侧基。在耐受蛋白酶的拟肽的构建中,本领域已知几种化学键,例如酯、硫酯、硫代酰胺、逆酰胺、还原的羰基、二亚甲基以及酮亚甲基(ketomethylene)键通常是肽键的有用的替代者。另一类拟肽是一种结合至另一种肽或蛋白的小的非肽分子,但是所述小的非肽分子并非必须是天然肽的结构模拟物。拟肽中的另一类来自于组合化学以及大量化学物文库。这些通常在结构上与天然肽不相关的新模板,却拥有位于非肽构架上的必要官能基从而起到原始肽“形貌”模拟物的作用。
[0060]不希望局限于理论,当脂蛋白脂肪酶切断所述PDGA的脂骨架,将肽酰部分从所述的二乙酰甘油中释放时,PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物或PDAG类的模拟物可以在靶组织中被激活。然后所述的肽酰组成成分可以结合至组织驻留免疫细胞例如,但不限于,γδT细胞,启动细胞因子的释放,所述细胞因子例如但不限于INF-γ、TNF-α、粒酶以及RANTES激活组织驻留巨噬细胞、噬菌NK细胞或嗜中性白细胞,并且激发其他刺激性(stimulatory)细胞因子和肽的释放。细胞因子的释放还可以激发CD5+B-细胞(还称作组织驻留B1细胞)产生免疫球蛋白(IgM,有效力的调理作用的免疫球蛋白)以及其他B-细胞衍生的细胞因子和趋化因子。因此,本发明的实施方案包括PDAG肽、PDAG肽的部分、PDAG肽的类似物和PDAG肽的肽模拟物,当向对象施用所述的PDAG肽、PDAG肽的部分、PDAG肽的类似物和PDAG肽的肽模拟物时,可以以非活性形式(即共价连接到所述的脂组成成分)在靶组织中出现,并且通过脂蛋白脂肪酶随时间的作用而被激活,由此顾及在所述对象的靶组织中增加的PDAG肽浓度以及免疫激活作用随时间的维持。所述的活性PDAG肽的持续释放可以顾及持续的先天性免疫系统激活作用,由此给予预防疾病治疗的对象随着时间的过去当在免疫上受威胁时具有增强的抵抗疾病的能力,或者给予治疗学治疗的对象以PDAG的长效配方。
[0061]在本发明其他的实施方案中,多于一种PDAG肽可以被共价缀合到所述的脂组成成分。不希望局限于理论,PDAG肽或肽模拟物的有效释放持续期,可以与缀合到所述脂组成成分的PDAG肽或肽模拟物的数量直接有关。因此,较之类似地施用的只有一个PDAG组成成分缀合至脂组成成分的PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物或PDAG类的模拟物,具有三个缀合到单个的脂组成成分的PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物或PDAG类的模拟物的施用可以在较长的时间阶段上释放PDAG肽。
[0062]在一些实施方案中,PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物或PDAG类的模拟物可以直接被递送至对象,而在其他的实施方案中,PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物或PDAG类的模拟物,可以与药学上可接受的载体组合以制备可以被递送或提供给对象的药物组合物。
[0063]在本发明的实施方案中,各种施用途径都是可用的。所选的具体方式将取决于所选的具体的化学治疗性药物、所治疗病症的严重性以及治疗效果所需的剂量。本发明的方法一般来说可以用任何医学上可接受的施用方式,意为任何产生有效水平的活性化合物而不导致临床上不可接受的有害影响的方式。这样的施用方式包括但不限于口腔的、直肠的、局部的、鼻腔的、皮内的、吸入的、腹膜内的或不经肠的途径。术语“不经肠的”包括皮下的、静脉内的、肌肉内的或输注。静脉内的,皮下的或肌肉内的途径尤其适于本发明的目的。
[0064]本发明实施方案的药物组合物可以包括缓冲剂例如,举例来说,在盐中的醋酸、在盐中的柠檬酸、在盐中的硼酸、在盐中的磷酸等等以及可选地,防腐剂例如苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯类(parabens)、水杨乙汞等等。
[0065]药物组合物可以方便地以单位剂量形式存在并且可以通过任何制药领域已知的方法制备。所有的方法可以包括使活性剂与组成一种或更多种附属成分的载体结合的步骤。一般来说,所述的组合物可以单一地或有意地使活性化合物与液体载体、细分固体载体或其两者结合,然后,如果必要的话,将所述产品成型。
[0066]各种其他的载体材料可以有利地以适当的量存在于鼻喷雾剂中。所述的溶液可以通过将小量的氯化钠溶解在水性介质中而被制备为轻度的盐水。盐浓度可以在大约0.1-2.0%的范围内并且优选地在大约0.65%的量级上。其他的材料,例如表面活性剂、维生素和维生素衍生物、抗组胺剂、润湿剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、添味剂等等也可以以常规浓度存在。可以在与水相介质中的有效浓度的描述在一起的文献中找到许多合适材料的公开。那些本领域技术人员将不困难地确定合适的材料和用于其已知功能的浓度。将所述喷雾剂递送到鼻腔中可以是用任何常规的喷雾技术或装置。
[0067]本发明的实施方案还提供适于不经肠施用的组合物,其中无菌的PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物的水性制剂被优选地等渗于接受者的血液。这种水性制剂可以采用合适的分散或润湿剂以及悬浮剂按照已知的方法配制。所述的无菌可注射制剂还可以是在无毒不经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液,例如作为1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受运载体和溶剂中有水、林格氏溶液,以及等渗氯化钠溶液。此外,无菌的、固定油(fixed oils)常规地被用作溶剂或悬浮介质。为此目的,任何可以被使用的温和的固定油包括合成的甘油单酸酯和甘油二酯。此外,例如油酸的脂肪酸也可以被用于可注射物的制备。适于口服、皮下、静脉内、肌肉内等等施用的载体配方可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack PublishingCo.,Easton,PA)中找到,其通过引用被整体并入本文。
[0068]本发明的实施方案的递送系统可以被设计为包括缓释的(time-released)、延迟释放或持续释放递送系统。PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物以及PDAG类的模拟物也可以与其他的免疫激发剂或免疫增强剂联合使用。使用这样的系统,避免PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物以及PDAG类的模拟物的重复施用,对于所述对象增加了方便,并且可以尤其适于本发明的某些组合物。
[0069]PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物,PDAG类的模拟物以及包括PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物的药物组合物可以以增强或激发免疫应答的有效量被施用,而在某些实施方案中,以激发先天性免疫应答的有效量被施用。
[0070]通常,临床试验中的常规试验可以被用于确定每种试剂或药物组合物以及施用方案的最优效果的具体范围。向具体对象施用PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物、PDAG类的模拟物以及包括PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物、PDAG类的模拟物的药物组合物可以被调整到有效且安全的范围内,取决于所述对象的病症和对于初次施用的响应性。然而,考虑到例如年龄、病症和所述对象的大小,PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物,PDAG类的模拟物,以及包括PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物和PDAG类的模拟物的药物组合物的效力、治疗的持续期以及所治疗的疾病的严重性,最终的施用方案可以根据主治临床医生的判断加以调整。
[0071]在本发明的实施方案中,PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物,PDAG类的模拟物以及包括PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物,PDAG类的模拟物的药物组合物的给药方案可以通过鼻喷雾剂或吸入器施用。对于鼻喷雾剂或吸入器配方,为了所述PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物,PDAG类的模拟物以及包括PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物,PDAG类的模拟物的药物组合物的有效溶解或悬浮的研磨颗粒大小可以在大约0.1到大约20微米的量级,大约0.2到大约10微米的量级,并且在某些实施方案中在大约0.2到大约5微米的量级。将PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物或PDAG类的模拟物并入水性载体可以由首先将所述PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物、或PDAG类的模拟物悬浮在溶液中得以辅助,例如在内酯溶液中4%浓度。一旦完全混合,分散的和/或溶解的PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物或PDAG类的模拟物可以以从大约0.001%到大约2.0%,大约0.01%到大约0.35%,以及在一些实施方案中,大约0.10%的浓度存在(本文中所有百分数都是基于重量,除非另外标明)。
[0072]在其他的实施方案中,PDAG类、PDAG类的部分、PDAG类的类似物或PDAG类的模拟物可以口服施用以在从二到四分剂量(divided dose)中达到从约25μg到大约2000μg/天,大约25到500μg/天,或在某些实施方案中,从大约50到大约250μg/天的总血液水平。在一些实施方案中,可以采用间歇治疗(例如,每三周中的一周或四周中的三周)。
[0073]在当初始剂量施用时对象的应答不够的情形下,较高的剂量(或通过不同的、更局域化的递送途径的有效的较高剂量)可以被使用到所述患者耐受所允许的程度。可以每天使用多个剂量来实现化合物的适当的全身水平。通常,可以使用最大剂量。最大剂量可以被认为是根据可靠的医学判断最高的安全剂量。然而,本领域普通技术人员将会理解的是,由于医学原因、心理学原因或者由于几乎是任何其他原因,对象可能坚持主张较低的剂量或可耐受的剂量。
[0074]在本文其他的实施方案中,至少一种PDAG、PDAG的部分、PDAG的类似物、PDAG的模拟物或PDAG肽可以在抗原肽或疫苗施用至对象之前被共价连接到抗原肽上或简单地与所述抗原肽或疫苗混合。不希望局限于理论,PDAG或PDAG肽的添加可以在所述抗原肽或疫苗施用时通过激发先天性免疫系统增强抗原肽或疫苗的免疫原性。可以向对象施用具有共价连接一个或更多个PDAG或PDAG肽或PDAG或PDAG肽抗原或疫苗的混合物的合成抗原以在所述对象中诱导长期的适应性、更具体的TH 1型“细胞的”、免疫应答。
[0075]在本发明的其他实施方案中,可以培养(raise)针对天然存在的PDAG类和PDAG肽的抗体,而在又一些实施方案中,可以向对象施用这样培养的抗体来消耗PDAG的浓度,而所述抗体是针对PDAG被培养的。不希望受缚于理论,施用消耗PDAG和/或PDAG肽的抗体对于呈现失控的全身炎症例如,举例来说脓毒症、动脉粥样硬化症、类风湿疾病、自体免疫疾病、炎性肠疾病、II型糖尿病等等可能是有益的治疗策略。在类似的实施方案中,消耗PDAG和PDAG肽的抗体可以被用于治疗非脓毒性损伤例如,举例来说,创伤、由于扩大手术过程导致的炎症等等。
[0076]本发明实施方案的PDAG和PDAG肽的抗体,可以用本领域技术人员公知的方法在兔、小鼠、山羊、马或其他物种中培养。举例来说,针对PDAG和PDAG肽的单克隆抗体可以利用杂交瘤融合技术培养,并且所选择的杂交瘤可以被维持在细胞培养物或生物反应器中来连续生产单克隆抗体。在一些实施方案中,单克隆抗体的PDAG肽特异结合区可以选择性地通过特异性化学切割整个抗体或本领域已知的重组方法来生产。在其他的实施方案中,所述特异性的PDAG结合区可以被缀合到人类抗体的Fc区来产生人源化嵌合体以将消耗PDAG的抗体施用到人类对象上。嵌合抗体在本领域是公知的并且可以采用合成的、半合成的或重组方法生成。由于在人类对象中基本不可以导致二级抗体反应,人源化的PDAG嵌合体抗体对于人类对象中的使用可能是有利的。
[0077]在本发明又一些实施方案中,可以制备荧光标记的PDAG类、PDAG肽或PDAG抗体。在这些实施方案中,例如但不限于藻红素(PE)、红色荧光染料以及异硫氰酸酯荧光素(FITC)、绿色荧光染料的荧光染料可以被活化缀合到PDAG、PDAG肽的肽酰部分的N-末端或PDAG抗体的自由氨基基团。
[0078]制备这些缀合物的方法在本领域是已知的,举例来说,可以通过活化所述的肽将PDAG或PDAG肽通过N-末端缀合到荧光染料上,所述的活化是通过连接琥珀酰亚胺基反-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(LC-SMCC)的硫醇反应性延展链类似物并用尺寸排阻色谱将未反应的LC-SMCC从衍生化的PDAG肽中分离来进行的。R-PE或FITC的吡啶基二硫化物衍生物到游离硫醇可以通过将所述的R-PE或FITC在三-(2-羧乙基)膦(TCEP)中温育10到15分钟被活化。纯化的LC-SMCC-PDAG肽衍生物然后可以与活化的R-PE或PITC合并并在4℃混合过夜。所述反应可以通过添加可以将任何剩余巯基基团封端的N-乙基马来酰亚胺(NEM)而中止。所述的R-PE或FITC-PDAG缀合物可以通过尺寸排阻色谱纯化并冻干以产出终产品。
[0079]在本发明其他的实施方案中,荧光标记的PDAG或PDAG肽可以用于分析组织样本。举例来说,荧光标记的PDAG或PDAG肽可以与来自对象体内样本在体外混合以检测并定量接合(engaging)免疫细胞的荧光标记PDAG类或PDAG肽。在又一些其他的实施方案中,针对PDAG或PDAG肽的荧光标记抗体可以用于用例如荧光显微方法,ELISA等等方法体外检测并定量来自对象体内的样本中的PDAG或PDAG肽的水平。这些分析方法对于实践于本领域的人员是公知的。
实施例1
[0080]本实施例描述来自人类、非人类灵长类动物以及非灵长类物种PDAG类的分离和结构分析。PDAG类可以通过经10KDa分子量截止的透析卡(Slide-A-Lyzer,PierceBiotechnology,Inc.)对蒸馏水透析,并通过减压蒸发浓缩以及冻干透析物而从凝结血液的血清级分以研究规模的量常规地分离。
[0081]粗血清级分通过尺寸排阻色谱或通过尺寸排阻树脂过滤或过滤除去盐和其他低分子量杂质来进一步提纯。最终的纯化是通过反相HPLC来实现的。这种过程在纯化后提供足够进行生物活性研究以及开始所述一种或多种生物活性组分化学表征的材料。LC/MS分析将所述的PDAG组分表征为2-3kDa的脂肽。基于总质量丰度的定量分析,表明所述PDAG的纯度在HPLC之后>98%。MALDI-TOF质谱可以用于确认所述肽的氨基酸序列并鉴定所述PDAG类的脂部分。纯化的非灵长类PDAB的代表性HPLC曲线在图1中描述。分析型HPLC是用Phemomenex C-18柱(250×4.6mm)以及0.1%TFA水溶液(溶剂A)和在0.1%TFA水溶液中的乙腈(溶剂B)流动相进行的。在十分钟上形成从95%A和5%B到70%A和30%B的线性梯度(每分钟2.5%),并且,随后在接下来的30分钟到40%A和60%B(每分钟1%)。在这些条件下,来自人类、猴以及非灵长类血清的PDAG分别在24.2分钟、22.7分钟以及23.6分钟洗脱。
[0082]使大约100mg的HPLC纯化的非灵长类PDAG经酸(6N HCl)或碱(1N NaOH)的水解并通过HPLC-MS分析。所观察到的离子碎片支持硬脂酰-花生四烯酰甘油的存在并且在下表中阐述:
表1:支持二酰基甘油鉴定的关键离子碎片
离子碎片 | 归属 |
PDAG血清级分 | |
875-494 | 花生四烯酰甘油 |
1635-1254 | 花生四烯酰甘油 |
628 | 硬脂酰-花生四烯酰甘油 |
碱水解 | |
360 | 硬脂酰甘油 |
酸水解 | |
1875-1247 | 硬脂酰-花生四烯酰甘油 |
[0083]大约20mg纯化的PDAG被溶解在d6-DMSO中并且由NITY Plus-400核磁共振谱仪获得光谱(1H在399.95MHz)。射频带宽为6000Hz,45度脉冲角,1.0秒的弛豫时间以及2.601秒/扫描的采集时间。总分析时间为11小时43分钟22秒。显示了几个关键结构特征。由谱图的低场区域开始,9.2ppm处观察到酸性质子的吸收。芳香区显示肽酰酰胺的氢的特征的以约8.0ppm为中心的大的多重峰。观察到另一裂分的多重峰在以7.4ppm(J=200Hz)为中心,其可能表明苯丙氨酸和/或酪氨酸的存在。在6.6-7.0ppm区域内观察到乙烯基氢,其可以由不饱和脂肪酸做出解释。在0.8ppm处观察到甲基氢的吸收,并且注意到在1.5ppm附近区域中的相当大的亚甲基氢的吸收。肽和脂肪酸的大量缀合也可以解释芳香区信号的展宽,这有可能是由甲基和亚甲基质子的各向异性屏蔽效应导致的。在4.0-5.0ppm区域的宽的信号与肽键上α-亚甲基氢的吸收一致。图2展示与模型1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯理论预测的NMR谱(图2B)相对照的HPLC纯化的PDAG的NMR谱(图2A)。插图显示1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油的实际NMR谱。预测的相对于三甲基硅烷的假想的1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯的1H化学位移(图2B)是基于得自生成热和立体能的能量最小化的采用半经验MNDO计算迭代(MOPAC和MM2)的理论计算所得的最低能量构型。理论预测模型1-肽酰-2-花生四烯酰-3-硬脂酰的NMR和天然存在PDAG的良好吻合支持此结构表征。
[0084]非灵长类PDAG的MALDI-TOF质谱展示于图3中。表2显示主要离子碎片的关系以及归属并证明PDAG的肽组成成分的氨基酸组成。
表2:MALDI-TOF质谱离子关系
离子1 | 离子2 | 差值 | 归属 |
1734 | 1571 | 163 | 酪氨酸(-H2O) |
1625 | 1469 | 156 | 精氨酸(-H2O) |
1571 | 1469 | 102 | 苏氨酸(-OH) |
1469 | 1382 | 87 | 丝氨酸(-H2O) |
1382 | 1253 | 129 | 赖氨酸(-OH) |
1382 | 1228 | 154 | 组氨酸(-H) |
1228 | 1113 | 115 | 天冬氨酸(-OH) |
1113 | 999 | 114 | 亮氨酸(-OH) |
999 | 895 | 104 | 半胱氨酸(-OH) |
895 | 592 | 303 | 花生四烯酸脂(-H) |
[0085]前述与序列RSHNLCX(1652amu)和YTSHNLCX(1734amu)的肽碎片一致,其中X分别具有879和880amu的离子质量。
[0086]727和895amu两处的MALDI离子包含与1-硬脂酰-2-花生四烯酰-3-磷酸甘油(727amu)一致的二酰基甘油磷酸酯组成成分并且895amu处的离子与1-精氨酸磷脂酰(argininephospotidyl)-2-花生四烯酰-3-硬脂酰甘油一致。因此,来自非灵长类血清的生物活性的PDAG的部分结构与序列YTSHNLCXCLNHSR-OPO3-DAG一致。因此,所述的肽酰组成成分可以被归为CXC类型的细胞因子。
实施例2
[0087]本实施例描述在脂蛋白脂肪酶存在下PDAG类断裂而释放所述分子的肽部分。从伊利诺伊大学芝加哥医学院的灵长类生物医学研究中心的七只食蟹猴(cynomologousmonkey)(短尾猿)上采集两个单独合并的静脉血样(每个30ml)。从Lampire BiologicalLaboratories,Inc.获取合并人类静脉血样(500ml)。脂蛋白脂肪酶(从牛乳纯化,Sigma-Aldrich)被加至其中一个猴血样本并且两者都被凝固,离心,采集血清级分,冰冻,并且在运输到匹兹堡大学分子医学研究所之前储存(-80℃)。分离PDAG并用实施例1中描述的程序分析。正常猴血清的PDAG级分在所述具体条件下名义上地在21分钟洗脱并且MALDI-TOF质谱确认了1-肽酰-2,3-酰基甘油酯和相应的肽以及1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油片段的存在。相反,在存在脂蛋白脂肪酶的存在下制备的血清级分中仅发现PDAG肽。用合并人血清也获得相似的结果。在脂蛋白脂肪酶处理前后人血清的HPLC曲线示于图4。分析型HPLC是用Phemomenex C-18柱(250×4.6mm)以及流动相0.1%TFA水溶液(溶剂A)和0.1%TFA水溶液中的乙腈(溶剂B)来进行的。线性梯度在15分钟上形成从95%A和5%B开始到20%A和80%B(5%/分钟)。在这些条件下,来自人类、猴和非灵长类血清的PDAG在色谱上不可分辨并且在10-11分钟之间洗脱。
实施例3
[0088]本实施例确定PDAG是由血小板在全血凝固期间诱导的。从伊利诺伊大学芝加哥医学院的灵长类生物医学研究中心的七只食蟹猴(短尾猿)采集加和不加肝素钠作为抗凝剂的合并静脉血样(每个30ml)。血浆和血清级分在离心之后采集,冰冻,并且在运输到匹兹堡大学分子医学研究所之前储存(-80℃)。血浆和血清通过实施例1中描述的程序分析。血浆中存在的PDAG仅是血清中存在的2%。MALDI-TOF质谱确认了1-肽酰-2,3-二酰基甘油酯和相应的肽以及1-硬脂酰-2-花生四烯酰甘油片段的存在。从猴血清和血浆中分离的PDAG的HPLC曲线的对比展示在图5中。分析型HPLC是用PhemomenexC-18柱(250×4.6mm)以及0.1%TFA水溶液(溶剂A)和0.1%TFA水溶液中的乙腈(溶剂B)的流动相进行的。在10分钟上形成从95%A和5%B开始到70%A和30%B(2.5%/分钟),然后在接下来的30分钟上到40%A和60%B(1%/分钟)的线性梯度。在这些条件下,来自猴血清的PDAG在22.7分钟洗脱。
实施例4
[0089]本实施例描述所述的PDAG的肽酰部分的固相合成方法以及荧光标记的PDAG或PDAG肽的制备方法。PDAG肽和变体的合成是通过433A肽合成仪(加利福尼亚州,佛斯特市,Applied Biosystems)上的固相采用具有延长的HBTU/HOBt偶合循环和预填充的Wang树脂的FMOC合成方案来实现的。在合成之后,在肽侧链的保护基的切断并用试剂K从所述树脂上释放之后将接着进行二乙醚萃取并冻干。在Waters DeltaPrep 4000色谱系统上反相C-18提纯所得的粗品肽接着在Applied Biosystems Voyager-DE活组织分光度测量术(Biospectometry)工作站上的MALDI-TOF表征以确认所述的氨基酸序列。
[0090]藻红素(PE)是一种红色荧光染料而荧光素异硫氰酸酯(FITC)是一种绿色荧光染料,它们是商业上可获得以被活化的形式与一级胺或巯基(sulfhydryl)缀合。PE(或FITC)是通过间隔基臂和PDAG的肽酰部分的N-末端缀合。为了促进通过N-末端的缀合,PDAG肽可以通过琥珀酰亚胺基反-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(LC-SMCC)的硫醇反应性延展链类似物的连接来被活化。从衍生化的PDAG肽中分离未反应的LC-SMCC可以通过从G-10柱上用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗脱来实现。将R-藻红素(或FITC)的吡啶基二硫化物衍生物到游离的硫醇形式的活化作用发生在用三-(2-羧乙基)膦(TCEP)温育10-15分钟后。立即将纯化过的LC-SMCC PDAG肽衍生物和活化的R-藻红素(或FITC)合并,随后在4℃混合过夜。在温育阶段完成后,通过添加封端任何剩余硫醇基团的N-乙基马来酰亚胺(NEM)来终止反应。在G-10柱上R-藻红素(或FITC)-PDAG缀合物的提纯是通过用PBS洗脱并冻干过夜来实现,这产出终产品。
实施例5
[0091]本实施例用合成肽参考标准物(FNN-21)来确定从灵长类和非灵长类物种所分离的PDAG的生物等价性。FNN-21是假定的普遍T-细胞表位(破伤风毒素aa的947-967)的破伤风毒素中的21个氨基酸的肽。七组、每组三只兔子中的每一组接受如下其中之一:(i)正常生理盐水安慰剂,(ii)弗氏完全佐剂(FCA),(iii)猴PDAG血清因子(95+%HPLC纯度),(iv)山羊PDAG血清因子(95+%HPLC纯度),或四个合成FNN-21剂量其中之一(25μg,50μg或100μg)。分别从每个动物采集动脉血液样本,凝结,血清用ELISA分析IgM滴度。
[0092]来自血清的PDAG(95+%纯度)如实施例1所述制备。合成FNN-21通过标准的采用延长的HBTU/HOBt偶合循环并预填充Wang树脂的FMOC固相肽合成方案制备。所有测试物被在弗氏完全佐剂(FCA)中配制为用于注射。
[0093]合成的FNN-21被溶解在生理盐水中以给出1mg/ml的终浓度。此储备接种物(inoculate)用FCA稀释1∶2.5,1∶5或者1∶10而得分别为400μg/ml,200μg/ml,100μg/ml的接种物。
[0094]提纯的血清衍生的PDAG溶于生理盐水而得1mg/ml的储备接种物。所述的储备接种物用FCA稀释1∶5而得最终的200μg/ml接种物浓度。
[0095]研究第0天所有的兔子通过在侧胸皮下注射接受0.25ml的适当的接种物或生理盐水安慰剂。在第1天(基线)和第3、5、7、10和14天抽取所有动物的动脉血样并使其凝结。通过ELISA方法分析血清的对于结核分支杆菌(M.tuberculosis)特异的免疫球蛋白滴度(IgG和IgM)并且对于每个测试日报告作为对于每个测试组(n=6)的三只兔子中每一个的重复测定的按吸收单位(AU 405nm)计的吸收平均值。该结果展示于下表中。FNN-21测试结果针对最高剂量测试组(100μg)。
表3PDAG类的生物等价性
实施例6
[0096]本实施例证实PDAG不是内源性抗微生物的。通过进行如Hart和Champlin(1988)所述的纸片琼脂扩散测试(disk agar diffusion assay)评定PDAG(200μg/ml)对于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌两者的抗微生物活性。采用先前描述的肉汤稀释法(Darnell等,1987)在Mueller-Hinton肉汤中确定抗菌最小抑制浓度(MICs)。浸透PDAG的无菌滤纸纸片被无菌地施加到种子(seeded)平板表面。所述平板在37℃温育24小时,在此时间期间在4和24h时视觉评定在围绕所述纸片的区内的生长抑制。PDAG未能抑制所有测试的菌种物种的生长。
[0097]PDAG不能抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的生长。对于典型的防御素最小抑制浓度(MIC)通常是在1-8μg/ml的范围内。在200μg/ml,25倍于防御素经过验证的MIC上限以及4倍于观察到的疗效剂量,PDAG经测试不具有对于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长的抑制。
实施例7
[0098]本实施例证实PDAG的预防疾病的益处并确定PDAG至无作用量(NOEL)的清除率。单剂量的治疗水平的PDAG(50μg,皮下)在受到致命细菌攻击之前的各种时间施用至小鼠并且每组的致病率/死亡率被跟踪10天。PDAG在受攻击前第1,2和4天(第1、第2、第4天),或者与受攻击一致地在第0天施用。死亡率的发生在第4天在对照组的受到鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)(施加i.p.~5×103cfu/小鼠)攻击的雌性瑞士韦伯斯特鼠中被观察到。跟着发生的是快速的死亡数上升,其累积死亡数在攻击后7-8天大约为80%并且到第10天时为100%。在攻击前4天用PDAG治疗的小鼠显示与未治疗对照的小鼠在死亡率上无显著差异。然而,如果在第2、第1、第0天给予PDAG,则观察到预防疾病的益处。到第8天时,未治疗对照群达到80%的死亡率,但在第2、第1、第0天的任一天接受PDAG的组分别具有60%、30%、50%的累计死亡率。从攻击后第4天开始(在此对照群体中死亡率在该时间确立)所述对照组和所述PDAG治疗组之间在死亡率发生在统计学上有显著延迟。第1天治疗组在第8天比第0天和第2天治疗群体具有显著低的累计死亡率(分别地,p=0.0189和p=0.0012)。因此,PDAG对于NOEL的清除速率是96小时并且PDAG 50%清除速率是大约48小时。
实施例8
[0099]本实施例检验了首次用于实验的Sprague Dawley大鼠中作为PDAG促炎性作用指示剂的急性相蛋白的产量。以治疗剂量(50μg,i.v.)或两倍治疗剂量(100μg,i.v.)在两组5只大鼠中施用PDAG。安慰剂组的5只大鼠接受生理盐水。三天后处死大鼠并在通过心脏抽吸获得的血液中测量循环的急性相蛋白(血清淀粉样A蛋白和结合珠蛋白)。平均急性相蛋白浓度在下面的表4中描述。
表4:第3天急性相蛋白水平
安慰剂 | 50μg剂量 | 100μg剂量 | |
血清淀粉样A蛋白(mg/ml) | 0.006 | 3.230 | 5.617 |
结合珠蛋白(mg/ml) | 0.0410 | 5.312 | 7.841 |
[0100]这些结果清楚地表明以诱导的急性相蛋白产量衡量的PDAG的促炎性作用,并且所述的急性相蛋白的产生看来可能是PDAG剂量依赖的。
实施例9
[0101]本实施例确定了PDAG对于治疗诊断为患临床或亚临床细菌性乳腺炎的泌乳奶牛的功效。在250头的商业化牛奶厂检验PDAG治疗牛乳腺炎的功效。在测试期间畜群的平均储桶体细胞计数(bulk tank somatic cell count,BTSCC)是763,000,有近40%的畜群具有高于正常的体细胞计数。随机选择49只(n=49)有升高体细胞计数而没有经历治疗的动物并用PDAG(600μg,i.m.)治疗,在首次剂量3天之后接着第二次加强注射。除去那些接受治疗的动物,剩余的畜群(n=100)任其不治疗而成为对照组。在进行下一次DHIA体细胞计数测试之后30天后比较治疗组动物以及对照动物的体细胞计数(SCC)。测试和对照组在治疗前被确定为统计上无差异(t=0.1703,P=0.8650)。在整个测试阶段上,治疗后,PDAG治疗组中的百分之五十六(56%)的动物显示降低的SCC,每个动物的平均SCC降低25%,而未治疗对照动物中的平均SCC每只增加了11%。此差异被确定是统计显著性的(P<0.05)。
[0102]19只动物表现出临床乳腺炎的症状,即,异常乳外观。这些动物随机地被指定为测试组或对照组。对照组的动物(n=10)根据牛奶厂的治疗乳腺炎临床病例的正常实践治疗,即,肌肉注射Polyflex牌(Fort Dodge Animal Health)的氨比西林(5mg/lb x 3天)。测试组动物(n=9)用PDAG(600μg,i.m.)治疗,接着在三天以后加强注射。治疗和对照动物的SCC在下一次DHIA体细胞计数测量之后进行比较。治疗前测试的均值和对照组被确定为无统计学差异(P=0.3965,t=0.8698),并且两个组的标准偏差也无统计学差异(F=1.889,P=0.1914)。样本数据得自遵循由Kolmogorov和Smirnov的方法检验的高斯分布的群体,并确定为正态分布(KS~0.2,P>0.01)。测试组的几只动物显示改善并且对于该组的平均SCC下降了19%。测试组的两个动物难以治愈。在测试期间,只有一只对照组的动物显示了改善,并且对照组的平均体细胞计数增加了7%。这些结果在下面的表5中列出。
表5:与常规抗生素治疗对比的PDAG的功效
[0103]畜群中9只动物历史上对于抗生素治疗难以治愈或者在产乳时多次出现临床乳腺炎。这9只动物加上上面2只来自PDAG测试组的难以治愈的动物(动物编号11和116)被一起编组(n=11)用于抗生素(Polyflex)加PDAG治疗,作为联合治疗法。在下一步计划的DHIA SCC测量中,评价治疗功效。11只动物中的8只改善(80%)而该组的平均SCC降低了42%。两只动物(20%)对于该治疗仍然难以治愈。这些结果在下面的表6中列表表示。
表6:作为联合疗法的PDAG的功效
注:在测试期结束之前20号动物进入干乳期(dry off)
[0104]我们在该畜群中鉴定出了5个亚临床乳腺炎病例。来自这5只动物的乳的细菌培养显示非溶血性链球菌和E.coli的混合物是致病生物体。这5只亚临床动物用PDAG治疗,所述的SCC在治疗后下一次DHIA采样间隙测定。所述5只动物中的4只在治疗后正常并且所有的5只动物均显示了改善。此组的平均SCC在治疗前是715,000而在治疗后降为205,000。采用Welch近似以校正不等标准偏差的显著性的双侧t-检验表明在治疗前和治疗后组的均值的差异是非常显著的(P=0.005,t=4.759)。所述结果在下表7中展示。
表7.PDAG用于治疗亚临床乳腺炎的功效
Claims (20)
1.一种在需要激发免疫应答的对象中激发免疫应答的方法,包括:
向所述对象施用有效量的药剂,所述药剂包括共价键连至脂的具有大约5到大约25个氨基酸的肽;以及
激发所述对象中的免疫应答。
3.如权利要求1所述的方法,其中激发免疫应答还包括激发先天性免疫应答。
4.如权利要求1所述的方法,其中激发免疫应答还包括激发组织驻留免疫细胞。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述组织驻留免疫细胞选自γδT细胞、单核细胞、NK细胞、嗜中性白细胞、C5+B-细胞及其组合。
6.如权利要求4所述的方法,其中所述组织驻留免疫细胞在被所述肽接触时被激发。
7.如权利要求1所述的方法,其中激发免疫应答包括在施用后至少大约3天激发免疫应答。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述化合物基本上被存储在所述对象的脂肪组织内。
9.如权利要求1所述的方法,其中施用所述药剂包括通过选自经肠的、不经肠的、局部的或乳房输注及其组合的方法来施用所述药剂。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述药剂在暴露于疾病形成剂之前被施用。
11.如权利要求7所述的方法,其中感染基本上被预防。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述药剂在感染之前被施用。
13.如权利要求1所述的方法,其中所述药剂在暴露于疾病形成剂之后被施用。
14.如权利要求1所述的方法,其中所述药剂在感染之后被施用。
15.一种化合物,包括氨基酸序列YTSHNLCX或其翻转的肽。
16.如权利要求15所述的化合物,其中所述肽被共价连接至脂。
17.一种化合物,包括氨基酸序列RSHNLCX或其翻转的肽。
18.如权利要求17所述的化合物,其中所述肽被共价连接至脂。
19.一种化合物,包括氨基酸序列YTSHNLCXCLNHSR或其翻转的肽。
20.如权利要求19所述的化合物,其中所述肽被共价连接至脂。
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Cited By (1)
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CN110317248A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-10-11 | 遵义医科大学珠海校区 | 一种人工合成抗菌肽及其设计方法与应用 |
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- 2006-07-25 CN CNA2006800342500A patent/CN101495130A/zh active Pending
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