CN101492504A - 抗HnRNP B1抗原的单克隆抗体的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与人类早期肺癌组织及癌前病变组织中HnRNP B1抗原决定簇特异性结合的单克隆抗体的制备方法，它是经用人工合成18肽与血蓝蛋白偶联作为抗原免疫Balb/c小鼠，再用其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，再筛选与功能测定筛选出所需杂交瘤细胞株，此杂交瘤细胞可用体内或体外的方法大量制备抗HnRNP B1单克隆抗体，经饱和硫酸铵沉淀法、Protein G－Sepharose亲和层析将HnRNP B1单抗纯化。本发明还提供了该抗体在人类早期肺癌检测的试剂盒中的应用。

Description

抗HnRNP B1抗原的单克隆抗体的制备及其应用

技术领域

本发明涉及免疫技术领域，具体涉及一种单克隆抗体的制备，利用该方法制备的单克隆抗体对早期肺癌组织及癌前病变组织细胞中特异性表达的蛋白-不均一核糖核蛋白B1(HnRNP B1)抗原有特异反应活性。

背景技术

目前在全球，肺癌的发病率和死亡率均居癌症之首。平均每30秒就有一人死于肺癌，在10个确诊为肺癌的患者中，仅有一人能够生存超过5年。世界卫生组织(WHO)2000年报告：1997年全世界死于恶性肿瘤的共706.5万人，占死亡人数的12.6％，其中肺癌占恶性肿瘤死亡的19％，居恶性肿瘤死因的第一位。目前在多数发达国家中，肺癌居男性恶性肿瘤首位，在女性占第二位。据美国癌症协会(ACS)估计，在2002年美国肺癌死亡占癌症死亡总数的27％～28％。在我国肺癌已成为发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，发病率和死亡率一直呈明显上升趋势。20世纪90年代与70年代相比，我国肺癌的死亡率上升了111.85％。到本世纪初，肺癌的死亡率已由20世纪70年代位居癌症死因的第4位攀升为第1位。由于已暴露的人群数目甚大，上升趋势至少要延续20～30年。英国著名肿瘤学家R.Peto预言：如果我国不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺癌将超过100万，成为世界第一肺癌大国。肺癌是人类致死的重要因素，其发病率有逐年增多的趋势。因此，应在防治方面谋对策。然而在过去30年中，肺癌患者的生存率无明显改善，其根本原因之一是肺癌的早期诊断率低。

目前肺癌尚无特效的治疗方法，早期发现、早期诊断早期治疗是提高生存率的关键。肺癌痰脱落细胞学检查是目前临床对肺癌诊断常用的方法之一。但随着肺癌患者的增加，经研究发现，痰脱落细胞学检查未能够降低死亡率，人类生命受到了严重的威胁。Tockman等(Tockman M S，Gupta P K，Myers J D，et al.Sensitive and specific monoclonal antibodyrecognition of human lung cancer antigen on preserved sputum cells：a new approach to early lungcancer detection.J Clin Oncol，1988，6(11)：1685-1693)报告了一种敏感的早期肺癌检测的方法，即采用抗不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HnRNP A2/B1)单克隆抗体免疫染色痰脱落细胞。在临床前2年肺癌患者痰中即可检测到HnRNP A2/B1，其敏感性与特异性分别为91％及88％，明显优于痰脱落细胞学检查。Sueoka等(Sueoka E，GotoY，Sueoka N，et al，heterogeneous nuclear ribonucleoprein B1 as new marker of early detection forhuman lung cancers.Cencer Res，1999，59：1404-1407)分别制备了抗HnRNP A2的抗体和抗HnRNP B1的抗体，证明了在肺癌细胞HnRNP B1显著增加，而HnRNP A2没有增加，HnRNPA2/B1的增加主要是HnRNP B1增加所致，所以HnRNP B1比HnRNP A2/B1更特异。说明HnRNP B1作为肺癌诊断的分子标志物具有重要意义。

HnRNP(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)是存在于细胞核中的一种RNA结合蛋白，它包括近30种与核酸结合的蛋白质，且它们之间相互作用形成复合体，分子量在34～120KD之间。HnRNP的A2、B1是其核心蛋白中两种主要的蛋白质。HnRNP B1基因的cDNA序列在第二个外显子上比HnRNPA2多一个长36bp的片段，其表达的氨基酸序列也比后者多一个12个氨基酸的片段。HnRNP B1mRNA仅占HnRNP A2/B1mRNA组成的2％～5％(Kozu T，Henrich B，Schafer K P.Structure and expression of the gene(HNRPA2B1)encoding the Human hnRNP protein A2/B1[J].Genomics，1995，25(2)：365-371)。

HnRNP A2/B1被发现在正常肺生长的关键阶段过度表达，在肺癌发生早期或癌前阶段，HnRNP A2/B1广泛表达于恶性病变和增殖细胞中。有研究表明(Montuenga LM，Zhou J，Avis I，et al.Expression of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 changes withcritical stages of mammalian lung development.Am J Respir Cell Mol Biol，1998，19：554-562)，HnRNP A2/B1 mRNA和蛋白的表达程度与小鼠肺的发育成熟程度一致。胚肺中的HnRNPA2/B1蛋白随胚肺发育开始表达，最早可在肺发育早期的假腺期被检测到，在假腺期末期和小管期的起始期达到高峰，在囊(小泡)期仍维持高水平的表达。随着肺组织的发育，远端初级肺的柱状上皮细胞显示较高HnRNP A2/B1的表达，然而在近端的气道及成熟肺组织未发现HnRNP A2/B1表达。而在肺组织发育成熟后，HnRNP A2/B1在肺组织中表达受限。HnRNPA2/B1在癌中表达形式类似于在胚肺中的调控表达，这种形式在蛋白质水平和信号分子水平是一致的，提示HnRNP A2/B1可能是一种癌生长蛋白。

HnRNP A2/B1与细胞核内RNA拼接、mRNA的转运及转录后调节，特别是与RNA转录、外显子剪切位点的选择，Pre-mRNA的成熟和降解等密切相关。HnRNP A2/B1在胞核与胞浆之间的穿梭可被RNA聚合酶II抑制剂激活，并参与了将mRNA从胞核向胞浆中转移和对转录过程的调控，是细胞增生过程中不可缺少的重要因素(常珍，沈佐君，操乐杰.异质性胞核核糖核蛋白A2/B1与肺癌的早期诊断.临床检验杂志，2004，22(6)：476-478)。

HnRNP具有明显的RNA结合特异性，主要由其分子中的RNA结合结构域所决定。HnRNP可以“底物呈递”的方式参与RNA的加工过程，并且HnRNP与RNA形成的复合体呈动态变化。HnRNP结合到Pre-mRNA的特定部位引起其二级结构的改变，从而有利于一些加工因子结合到Pre-mRNA上。另外HnRNP决定mRNA的不同拼接方式，从而基因的表达产物也就不同。HnRNP A2/B1在Pre-mRNA的加工过程中表达异常可能导致一些在细胞增殖或分化过程中的重要调节蛋白质翻译错误，从而导致细胞癌变。此外HnRNP还可参与多蛋白的聚集作用，并在核-质转移中也起一定的作用，HnRNP A2/B1作为一种转运蛋白，其表达增高，可能会破坏核内外物质的平衡，促进与之相结合的特定原癌基因的转录和翻译，进一步促进癌症的发生与发展。

晚近的研究证实(李为民，陈文彬.hnRNP A2/B1早期诊断肺癌的研究进展.中华内科杂志，2003，42(7)：520-521)，HnRNP A2/B1蛋白还可与端粒重复序列单链特异性结合，可能与端粒RNP定位及端粒双链的形成有关。HnRNP A2/B1以随机方式结合至端粒单链，保护其免受核酸酶的分解并激活端粒酶。现已明确，端粒酶的活性与细胞增殖有关，在肺癌的发生发展中起重要作用。结合HnRNP A2/B1调节正常细胞的转录翻译过程，它的异常表达可使DNA的转录翻译过程失去正常控制，导致肺癌的发生。

HnRNP B1是肺癌细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质，可在细胞、组织提取物或体液中(如血液、痰液等)检测到，在血液中进行循环(http://www.daangene.com(肿瘤标志物在诊断与治疗的应用进展))。由于肺癌本身的复杂性，关于HnRNP B1代谢途径还不十分明了，尚在进一步研究之中，就已研究的内容可从以下方面进行说明：HnRNPB1发现在肺癌组织中。在肺癌发生过程中，由肺癌细胞生物合成并释放产生HnRNP B1，可以在血清、血浆、其他体液检测。HnRNP B1存在于细胞浆和细胞核中，与细胞表面膜相连，在血液中循环并进行代谢(http://www.clinet.cn(肿瘤标志物检测的影响因素和应用原则))。有研究表明(常珍，沈佐君，操乐杰.外周血中hnRNP A2/B1含量及其在肺癌诊断中的意义.安徽医科大学学报，2005，40(5)：458-460)，在对外周血中HnRNP B1蛋白表达及临床意义的研究中，采用VQ-RT-PCR技术对肺癌患者外周血中hnRNP A2/B1 mRNA水平进行检测试验结果证实了HnRNP B1在外周血中的表达。不仅如此，其表达阳性率接近90％，而非肺癌组HnRNP B1表达阳性率不到10％。

HnRNP B1的含量变化与肺癌发生、发展、消退、转移具有良好的相关性。从现有的临床研究中提示两者间存在着定性的关系。HnRNP B1的含量变化与肺癌发生、发展的关系主要体现在：HnRNP B1在肺癌组织中被检测到。随着病情的恶化，HnRNP B1的表达明显，含量增加，能预示肺癌的发展状况。HnRNP B1的含量变化与肺癌消退、转移的关系主要体现在：对肺癌患者手术后，检测到HnRNP B1的含量降低；对肺癌患者进行化疗或放疗后，检测到HnRNP B1的含量降低；若肺癌患者病情再次复发，检测到HnRNP B1的含量再次升高。这表明HnRNP B1的含量变化与肺癌发生、发展、消退、转移存在着相关性。另外，在肺癌的不同病理分型中，HnRNP B1所表达的含量也不一样。以鳞癌最高，腺癌其次，小细胞癌更低。

综上所述，HnRNP B1与肺癌密切相关，若它调节的正常细胞的转录翻译过程失去正常的控制，会导致癌的发生。由于HnRNP B1是HnRNP与端粒重复序列结合的主要成分，因此检测HnRNP B1在肺癌组织中的表达，研究它与端粒的相互作用，探讨HnRNP B1表达的意义及其能否作为肺癌早期诊断的标志物，具有十分重要的意义。

因此，本领域中迫切需要提供一种针对HnRNP B1的抗体并将其用于肺癌早期诊断检测。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种与人早期肺癌组织及癌前病变组织中HnRNP B1特异性结合的小鼠单克隆抗体的制备，其单克隆抗体为一种新的肺癌早期诊断试剂，从而提高肺癌的早期诊断水平，为肺癌的早期治疗创造条件。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种与人早期肺癌组织及癌前病变组织中HnRNPB1抗原决定簇特异性结合的单克隆抗体的制备。

本发明另一方面提供了一株杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCC NO：C200727。

本发明还涉及制备的单克隆抗体在用于早期肺癌检测的试剂盒中的应用。

本发明具有如下优点：通过本发明制备的不均一核糖核蛋白B1肺癌检测试剂盒检测HnRNP B1较之痰脱落细胞学检查、胸部X线检查、纤维支气管镜刷检等常规检测方法的阳性检出率高，能将肺癌检测的敏感性提高8倍多，且在临床前2年肺癌患者痰中检测即呈阳性。此检测试剂盒是利用最新的单克隆抗体技术及免疫组织化学技术以痰液标本或纤维支气管镜刷检标本中的脱落细胞为检测对象。该方法取材方便，患者无任何痛苦；检测过程在体外进行，对受检人的安全有很好的保证，因此，是一种值得推广的肺癌检测方法。

附图说明

图1显示了Western blotting免疫印迹分析抗HnRNP B1单克隆抗体结果图。

图2和图3显示了抗HnRNP B1单克隆抗体免疫组织化学鉴定试验结果图，其中图2为免疫组织化学染色法染色肺癌细胞株阳性图，图3为阴性对照图。

具体实施方式

本发明首次获得了对人类早期肺癌组织及癌前病变组织内HnRNP B1抗原特异的单克隆抗体(以下简称HnRNP B1单克隆抗体)。

HnRNP B1单克隆抗体可用于检测人类肺癌组织及癌前病变组织。在这项应用中，利用患者痰液或纤支镜刷检常规涂片通过免疫组织化学方法进行体外诊断性检测，当HnRNP B1单克隆抗体与其抗原决定簇结合时便呈现阳性反应。另外的体外应用包括对患者血清、血浆进行酶联免疫分析测定。

为了获得大量的抗HnRNP B1单克隆抗体，需要进行扩大培养，这里采用的是小鼠腹水制备的方法。杂交瘤细胞在小鼠腹腔中定植，并产生大量腹水，腹水中除了含有所需的抗HnRNP B1抗体外，还含有较多的杂蛋白、非特异性IgG和许多的蛋白酶，易使抗体失活，因此腹水收集后应尽快纯化，防止降解。

本试验采用Western blotting法对抗HnRNP B1单克隆抗体进行免疫学鉴定。由肺癌细胞系提取HnRNPB1蛋白，进行SDS-PAGE，按常规电转移至硝酸纤维素(NC)膜上，经过封闭-加HnRNP B1单抗-显色等一系列步骤后，结果表明抗HnRNP B1单克隆抗体对转移至NC膜上的肺癌组织中HnRNP B1提取物在相对分子质量为37KD处呈现特异性的反应带。

本试验采用的是用于检测抗体的间接酶联免疫技术(ELISA)法对抗HnRNP B1单克隆抗体进行筛选。用HnRNP B1多肽抗原包被ELISA板，1％BSA封闭，PBS洗涤，然后加入含有HnRNP B1抗体的上清夜；经过一定时间反应后，洗去未结合的抗体；再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG；用辣根过氧化物酶底物(TMB)为酶底物显色。因上清液中的杂交瘤分泌出的抗HnRNP B1抗体与HnRNP B1抗原结合，而抗HnRNP B1抗体又与酶标二抗结合，这样酶催化底物而显蓝色，通过酶标仪检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：获得HnRNP B1单克隆抗体

1)特异性HnRNP B1抗原免疫小鼠流程

可溶性抗原免疫原性弱，在免疫过程中用福氏完全佐剂。将HnRNP B1抗原和福氏完全佐剂等体积混合在一起，充分震荡混匀乳化，研磨成油包水的乳糜状(放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态)，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。具体操作如下：

a.初次免疫：HnRNP B1抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射小鼠，(一般0.5～1ml，0.1ml/点)；

b.第二次免疫：1周后剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下多点注射小鼠；

c.第三次免疫：1周后剂量同上，不加佐剂，皮下多点注射小鼠。(5～7天后采血测其效价，检测免疫结果)；

d.加强免疫：1～2周后，剂量50～500μg为宜，皮下多点注射小鼠；

e.加强免疫3天后，无菌取脾细胞，制备脾细胞悬液。

2)免疫脾细胞的制备

加强免疫3天后，无菌取脾细胞，制备脾细胞悬液，具体操作如下：

a.脱臼法处死小鼠；

b.将小鼠放于75％酒精中浸泡消毒后，以无菌剪刀剪开其腹部取出脾脏，置于无菌的含少量培养液(1640培养液)的平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数；

c.冰浴上收集脾细胞悬液，离心去上清；

d.将沉淀用新鲜RPMI-1640培养液再次离心洗涤；

e.加入新鲜RPMI-1640培养液，计数脾细胞。

3)骨髓瘤细胞的制备

目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：NS1、SP2/0-Ag14(简称SP2/0)、X63Ag8.653等。在本试验中，采用的是SP2/0。

骨髓瘤细胞保存于-196℃液氮罐中，试验时将其复苏、增殖、传代即可。在融合前，应先用含15μg/ml 8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，取约1×10⁷～6×10⁷/ml对数生长期(即培养15h～20h)的骨髓瘤细胞，在室温离心(400r/min)10min，沉淀用2.5％胎牛血清(FCS)-1640培养液再悬浮离心，最后计数。

4)饲养细胞的制备

在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。具体操作如下：

a.脱臼处死小鼠，75％酒精浸泡消毒10min；

b.用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔；

c.用注射器将4～5ml无血清RPMI-1640培养液注入腹腔，用手指轻揉按摩腹部，仍用该注射器回抽腹腔液体，移入离心管；

d.1000r/min离心10min，去上清；

e.用含20％小牛血清(NCS)的RPMI-1640培养液混悬，调整细胞数4×10⁵/ml；

f.用1ml吸管将细胞加入96孔培养板，每孔0.05ml(含2万个细胞)，放入37℃、5％CO₂培养箱培养，所得饲养细胞即可供细胞融合和克隆化之用。

5)细胞融合流程

细胞融合的基本步骤是将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合后，在PEG的作用下使两种细胞彼此融合，将融合后的细胞适当稀释，分置含饲养细胞的培养板中培养。具体操作如下：

a.将经预先处理好的骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶5的比例混合，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm/min，8min；

b.弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动；

c.将37℃水浴中保温的50％PEG(分子量4000)0.5ml，缓慢滴入离心管，1min内加完，边滴边摇；

d.加预热的不完全培养液，每隔2min分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml，终止PEG作用。

e.离心，800rpm/min，6min。

f.弃上清，先用约6ml含20％小牛血清的RPMI1640培养基(Gibco，美国)轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开；

g.用无菌吸管将融合后细胞悬液加入含有预先接种了饲养细胞的96孔板，100μl/孔，放入37℃、5％CO₂培养箱培养。

6)HAT筛选杂交瘤

一般在融合24h后，加次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT，Sigma，美国)选择培养液。用时将1ml加入50ml含20％小牛血清的完全培养液中。由于脾细胞在体外培养条件下只能存活几天，不影响杂交瘤细胞生长；而骨髓瘤细胞由于在叶酸抑制剂氨基喋呤存在时无法合成嘌呤环和胸腺嘧啶甲基而不能合成DNA，同时又因为它是HGPRT^-和TK^-的缺陷型，无法利用培养液中的HGPRT和TK来合成DNA，因此骨髓瘤细胞在这种培养液中无法存活。这样最后能在HAT培养液中存活的就只有杂交瘤细胞，因为它具有两种亲代细胞的染色体，可以产生原来脾细胞所具有的HGPRT，又从骨髓瘤细胞中获得了在细胞培养基中长期生存繁殖的能力。

当HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养一周，改用一般培养液。

通过选择性培养而获得的杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗HnRNP B1抗体，筛选出所需要的高分泌的杂交瘤细胞系。

7)杂交瘤细胞的克隆化

融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后应有36％的孔为1个细胞/孔。依据ELISA检测筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗HnRNP B1抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆。具体操作如下：

a.制备饲养细胞悬液(同融合前准备同)；

b.阳性孔细胞的计数，并调节细胞数在1～5×10³/ml；

c.取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液(即20个细胞/ml)，以100μl/孔加A、B、C三排，即为每孔2个细胞；余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，以100μl/孔加D、E、F三排，既为每孔1个细胞；余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，以100μl/孔，加G、H两排，即为每孔0.5个细胞；

d.培养4～5天后，补加完全培养液200μl/孔；

e.第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗HnRNP B1抗体检测。

8)抗HnRNP B1单克隆抗体的腹水制备

筛选出的阳性抗HnRNP B1杂交瘤细胞株应及早进行抗HnRNP B1单克隆抗体的大量制备。本实验采用的是小鼠腹腔接种法，在小鼠体内接种抗HnRNP B1杂交瘤细胞，制备腹水。具体操作如下：

a.腹腔注射液体石蜡于Balb/c鼠，0.5ml/只；

b.1～2周后，同法对上述小鼠进行腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞；

c.接种细胞7～10天后可产生腹水，此时小鼠腹部明显隆起，手触有波动感，用16号针头采集腹水；

d.将收集到的腹水1500r/min离心30min，及时纯化。

9)抗HnRNP B1单克隆抗体的纯化

腹水特异性抗HnRNP B1抗体的浓度较抗血清中的高，纯化效果好。本实验采用的是硫酸铵沉淀法，具体操作如下：

a.配制饱和硫酸铵溶液(SAS)：将767g(NH₄)₂SO₄边搅拌边慢慢加到1L蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100％的硫酸铵溶液(4.1mol/L，25℃)；

b.沉淀：将小鼠腹水4℃离心30min，除去细胞碎片，保留其上清液并测量体积，边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1∶1(v/v)，将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6h或搅拌过夜(4℃)，使蛋白质充分沉淀；

c.透析：将经上述处理后的蛋白质溶液离心30min(4℃)，弃上清保留沉淀，将沉淀溶于少量(约10-20ml)含0.2g/L叠氮钠的0.01mol/L、pH7.2PBS中。沉淀溶解后放入透析袋，用含0.2g/L叠氮钠的0.01mol/L、pH7.2PBS透析24～48h(4℃)，每隔3～6h换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸铵(用奈氏试剂检测硫酸铵无残余)；

d.将收集到的透析袋内液体离心，其上清液用PEG(MW 20000)浓缩，装入瓶中，加保护剂，4℃冰箱保存。

实施例2：用Protein G-Sepharose进行亲和层析纯化抗HnRNP B1单克隆抗体

1)凝胶制备

a.用Binding buffer(20mmol/L、PH 7.0PBS)，溶解Protein G-Sepharose干粉，比例3.5ml∶1g，形成凝胶，4℃无菌保存；

b.用时凝胶恢复室温。

2)装柱

a.用Binding buffer冲出圆柱四周以及底部孔隙中的气体，当出口管中有少许液体时关闭出口，并保留1/3凝胶体积buffer在层析柱内；

b.把凝胶沿着玻棒倒入层析柱，尽量避免产生气泡；

c.剩余孔隙用Binding buffer补足，封上进口，并连接蠕动泵，开泵(速度控制在1～2ml/min不宜过快，小于75cm/h)；

d.用Binding buffer充分平衡。

3)上样

a.将经饱和硫酸铵初纯的抗HnRNP B1单克隆抗体约50mg蛋白，小心加到凝胶柱床表面；

b.用10×体积的Binding buffer充分洗涤凝胶柱。

4)洗脱

a.用Elution buffer(0.1mol/L、pH 2.8Tris-甘氨酸缓冲液)进行洗脱；

b.分步收集各蛋白峰；

c.用PEG(MW 20000)浓缩，装入瓶中，加保护剂，4℃冰箱保存。

实施例3：抗HnRNP B1单克隆抗体效价测定——采用ELISA检测方法

用包被液(0.05mol/L、pH 9.6CB buffer)将HnRNP B1抗原稀释至浓度为10μg/ml后加入酶标板上，100μl/孔，后将酶标板置37℃温箱中孵育2h，或置4℃冰箱过夜；从冰箱中取出包被板，倒掉包被液，用吸水纸拍干孔中液体，每孔加入1％BSA，120μl/孔，置37℃温箱中孵育2h；甩去孔中液体，用PBS-T洗涤4次，用吸水纸拍干，4℃保存；加入经4×稀释的不同稀释度抗HnRNPB1单抗，100μl/孔，同时以加PBS为阴性对照；37℃温箱中孵育2h，后用PBS-T洗涤4次，每次3min，吸水纸上拍干；加羊抗鼠-HRP二抗(厂家建议使用浓度)，100μl/孔，37℃温箱中孵育1h，同样洗板；加底物(TMB、H₂O₂等)显色，100μl/孔，室温显色15min；最后加入2mol/L H₂SO₄，100μl/孔，终止反应；在酶标仪上测定450nm波长处各孔吸光度值。

实施例4：Western blotting免疫印迹分析抗HnRNP B1单克隆抗体

采用Western blotting法，由肺癌组织提取总蛋白，进行SDS-PAGE，按常规电转移至硝酸纤维素(NC)膜上，1％BSA封闭；反复洗涤NC膜三次，加入抗HnRNP B1单克隆抗体37℃震荡2小时；再次反复洗涤NC膜三次，加入羊抗鼠-HRP，37℃震荡1小时；反复洗涤NC膜三次，再加入DAB显色液显色；自来水冲洗并加入终止液即可。结果表明，抗HnRNPB1单克隆抗体对转移至NC膜上的肺癌组织中的蛋白提取物在相对分子质量为37KD处呈现特异性的反应带，其结果见图1。

实施例5：抗HnRNP B1单克隆抗体免疫组化鉴定试验

取患者痰液或纤支镜刷检常规涂片；4％多聚甲醛固定30min，蒸馏水冲洗2min×2次；3％的过氧化氢37℃孵育30min，蒸馏水冲洗2min×2次；加抗原修复液50μl(1～2滴)，30min，蒸馏水冲洗2min×2次；加封闭用正常山羊血清50μl(1～2滴)，37℃孵育30min，倾去，勿洗；滴加HnRNP B₁单抗50μl(1～2滴)，置湿盒，4℃过夜或37℃1～2h，阴性对照加正常鼠IgG；PBS-T冲洗，3min×3次；滴加生物素化羊抗小鼠IgG 50μl(1～2滴)，37℃湿盒孵育30min；PBS-T冲洗，3min×3次；滴加辣根酶标记链亲合素50μl(1～2滴)，37℃湿盒孵育30min；PBS-T冲洗，3min×3次；DAB显色约5～10min(镜下观察掌握具体时间)；蒸馏水冲洗2min×2次；苏木素复染3～5min，蒸馏水冲洗2min×2次；镜检，10％甘油封片，采图。结果显示在图1及图2中。结果显示试验组(图2)有明显染色，对照组(图3)无免疫染色。

Claims (7)

1、一种抗HnRNP B1抗原的单克隆抗体的制备及其应用，是与人类早期肺癌组织及癌前病变组织中HnRNP B1抗原决定簇特异性结合的单克隆抗体的制备方法及其应用。其特征是：用人工合成18肽与血蓝蛋白偶联作为抗原免疫小鼠，再用其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞。再筛选与功能测定筛选出所需杂交瘤细胞株。此杂交瘤细胞可用体内或体外的方法大量制备抗HnRNP B1单克隆抗体，经饱和硫酸铵沉淀法、Protein G-Sepharose亲和层析将抗HnRNP B1单抗纯化。

2、根据权利要求1所述抗HnRNP B1抗原的单克隆抗体的制备及其应用，其特征是：18肽抗原为人工合成的HnRNP B1抗原。

3、根据权利要求1所述抗HnRNP B1抗原的单克隆抗体的制备及其应用，其特征是：免疫小鼠为Balb/c小鼠，小鼠骨髓瘤细胞为SP2/0-Ag14细胞。

4、根据权利要求1所述抗HnRNP B1抗原的单克隆抗体的制备及其应用，其特征是：一株杂交瘤细胞，其保藏号为CCTCC NO：C200727。

5、根据权利要求1所述抗HnRNP B1抗原的单克隆抗体的制备及其应用，其特征是：制备的单克隆抗体在人类早期肺癌检测的试剂盒中的应用。

6、根据权利要求5所述抗HnRNP B1抗原的单克隆抗体的制备及其应用，其特征是：此检测试剂盒是利用最新的单克隆抗体技术及免疫组织化学技术以痰液标本或纤维支气管镜刷检标本中的脱落细胞为检测对象，当HnRNP B1单克隆抗体与其抗原决定簇结合时便呈现阳性反应。

7、根据权利要求1所述抗HnRNP B1抗原的单克隆抗体的制备及其应用，其体外应用还包括对患者血清、血浆进行酶联免疫分析测定。

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