CN101479247A - 5-脲取代的萘二甲酰亚胺衍生物、制备方法和用于治疗癌症的药物组合物 - Google Patents

Abstract

新的脲基取代的萘二甲酰亚胺衍生物、其药学上可接受的盐和其溶剂化物用于制备治疗细胞增殖性疾病如癌症的药物组合物。本发明还提供通过水解已知化合物制备这些衍生物的方法。

Description

5—脲取代的萘二甲酰亚胺衍生物、制备方法和用于治疗癌症的药物组合物

技术领域

本发明涉及新的取代的萘二甲酰亚胺衍生物、它们的制备方法和它们用作抗肿瘤药剂的制药用途，特别是以含有它们作为活性成分的药物组合物的形式用于预防/或治疗各种形式的癌症。

发明背景

各种取代的萘二甲酰亚胺，包括氨萘非特，在技术上已知具有抗肿瘤效力或其他有用的生物活性。特别在WO 2005/105753中公开了具有特定取代型式的萘二甲酰亚胺衍生物在治疗细胞增殖性病症如癌症中的活性。

虽然氨萘非特的活性水平已经并且继续令人高度重视，但是该物质有显著的缺陷，说明对具有改善的性质的药物有持续的需要。首先，已发现氨萘非特对有些患者毒性太大：特别是它产生了明显的骨髓毒性，导致接受该药物五个日剂量的一些患者死亡。此外，已表明氨萘非特在小鼠的白血病模型中仅有中等活性。并且，已表明氨萘非特对患结肠癌、肺癌和乳腺癌的小鼠中的人肿瘤异种移植物没有活性。因此，虽然氨萘非特显示出显著的生物活性，但它不具有在鼠科肿瘤模型中的相当广谱的活性。Ajani等在Invest New Drugs(1988)6：79-83中表明，在体外原发性人实体肿瘤的测试中，氨萘非特活性很差。

虽然抗增生剂如氨萘非特能显示出对抗某些形式的癌症的临床活性，但是仍然要寻求在肿瘤反应率、反应持续时间、降低骨髓毒性和最终患者生存率的改善。在技术上也还需要通过提供新药和常规抗肿瘤药的适当组合来提高对人的抗增生治疗的效力。

鉴于氨萘非特等的上述缺点，在技术上需要表现出更有希望的活性/副作用平衡的萘二甲酰亚胺衍生物。

发明概述

本发明所依据的第一个意想不到的发现是：在萘二甲酰亚氨基部分的5位被脲基基团取代的萘二甲酰亚胺衍生物在治疗细胞增殖性病症中是有用的，且所述衍生物可以高效的方法通过有限数量的反应步骤制备，并且未表现出以前已知的类似衍生物的某些缺点。本发明还依据的意想不到的发现是：通过水解其他已知的取代的萘二甲酰亚胺衍生物，容易高收率地获得该脲基取代的萘酰亚胺衍生物。本发明还依据的意想不到的发现是：该脲基取代萘二甲酰亚胺衍生物表现出令人满意的化学稳定性，并且能容易地配制成药物，例如，以毫微粒形式的混悬剂或以盐形式的溶液剂。

定义

在本文中用作取代基团，除非另有说明，术语“烷基”意指具有1-4个碳原子的直链和支链的饱和无环烃单价基团，例如：甲基、乙基、丙基、正丁基、1-甲基乙基(异丙基)、2-甲基丙基(异丁基)和1，1-二甲基乙基(叔丁基)。

在本文中用作取代基团的部分，除非另有说明，术语“亚烷基”意指对应于上述定义的烷基的二价的烃基，例如但不限于，亚甲基、二(亚甲基)、三(亚甲基)、四亚甲基等等。

在本文中用作取代基团，除非另有说明，术语“烷氧基”和“烷硫基”指这样的取代基，其中烷基基团例如上文所定义的，通过单键连接到氧原子或二价硫原子，例如但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丙氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、硫甲基、硫乙基、硫丙基、硫丁基等等。

在本文中用作取代原子，除非另有说明，术语“卤素”意指选自氟、氯、溴和碘的任一原子。

在本文中用作取代基团，除非另有说明，术语“卤代烷基”指这样的烷基基团(如上文定义)，其中的一个或多个氢原子独立地被一个或多个卤素(优选氟、氯或溴)置换，例如但不限于，二氟甲基、三氟甲基、三氟乙基、二氯甲基等。

在本文中使用，除非另有说明，术语“溶剂合物”包括任一这样的组合，其可由本发明的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物与适当的无机溶剂形成(例如与水形成的水合物)，或与适当的有机溶剂(例如但不限于醇、酮、酯等)形成。

在本文中使用，除非另有说明，术语“抗迁移”指药物成份停止细胞自肿瘤组织迁移并因此减少由这些细胞造成的新组织的移生的能力。

本文所用的术语“细胞增殖性病症”是指，但不限于任一类型的癌症或其他包括细胞增殖的病理性病症，如白血病、肺癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌症、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质瘤、膀胱癌、骨癌、肉瘤，头颈癌、肝癌、睾丸癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、骨髓癌、十二指肠癌、眼癌(视网膜母细胞瘤)和淋巴瘤。

附图的简要说明

图1显示了本发明化合物对血小板的化合物诱导的血液毒性，并与氨萘非特比较。

图2显示了通过分光光度法测量的本发明化合物的P-gp ATP酶活性，并与氨萘非特比较。

图3显示了本发明的化合物在不同浓度下：

(A)通过对酸性囊状细胞器定量(显示为红色荧光染色)来评估药物诱导的预自噬作用(pro-autophagic effects)，和

(B)用吖啶橙染色和绿色荧光染色定量后评估药物导致的溶酶体膜透化作用(LMP)。

图4显示了在本发明化合物诱导的DU-145人前列腺癌细胞中与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性，并与阿霉素比较。

发明详述

在第一方面，本发明提供一组结构式(I)所示的取代的萘二甲酰亚胺衍生物

其中：

-R₁为单或二C_1-4烷基氨基-C_1-4烷基；

-取代基R₃和R₄各自独立地选自氢、卤素、C_1-4烷基、C_1-7烷氧基、C_1-4烷硫基、硝基、氰基、氨基、被保护的氨基和卤代C_1-4烷基；

-m为取代基R₃的数目，且范围为0-3；

-n为取代基R₄的数目，且范围为0-2；并且

-R₂为CONH₂；

和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物。

结构式(I)所示的衍生物的代谢产物包括但不限于以下：

-其单N-氧化物和二N-氧化物；

-其中R₂为CONHOH的衍生物；和

-其中R₃和/或R₄为羟基的衍生物。

或者，本发明萘二甲酰亚胺衍生物的单和二N-氧化物，可通过用氧化剂(例如但不限于过氧化氢(例如在乙酸存在下)，或过酸例如氯过苯甲酸酸)处理结构式(I)表示的衍生物而直接合成。

上述定义的新化合物共同具有的结构特点是：氨基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)例如但不限于氨萘非特的氨基被脲基基团或其代谢形式(即脲基N-氧化物基团)取代。

在第一方面的优选的实施方案中，本发明涉及一亚组化合物，其中：

-n＝0(当R₄不为氢时)，和/或

-m＝0(当R₃不为氢时)，和/或

-m＝2，两个R₃取代基相邻，并与与它们所连接的碳原子一起形成苯基，和/或

-R₁为亚烷基，其具有1-3个碳原子且连接到二甲基氨基或二乙基氨基，和/或

-R₂为CONH₂；

和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物。

在第一方面的另一个优选的实施方案中，本发明涉及一亚组化合物，其中：

-n＝m＝0(当R₃和R₄不为氢时)，和/或

-R₁为亚烷基，其具有1-2个碳原子且连接到二甲基氨基或二乙基氨基，和/或

-R₂为CONH₂；

和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物。

在第一方面的再一个优选的实施方案中，本发明涉及一亚组化合物、其盐、溶剂合物或代谢产物，其中当m等于1时，R₃不为硝基。在第一方面的再一个优选的实施案中，本发明涉及一亚组化合物、其盐、溶剂合物或代谢产物，其中R₃和/或R₄选自氢、卤素、C_1-4烷基、C_1-7烷氧基、C_1-4烷硫基、氰基、氨基、酰氨基和卤代C_1-4烷基。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及N-{2-[2-(二甲基氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并[de]异喹啉-5-基}脲、其盐或代谢产物。

在第二方面，本发明提供了制备结构式(I)所示的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物的方法，其通过水解5-取代的氨萘非特或氨萘非特衍生物进行，其中其5-取代基以这种方式选择，即，通过水解，它可以转换成脲基基团。用于水解的适当的5-取代的氨萘非特衍生物包括但不限于结构式(II)的化合物

其中：

-m、n、R₁、R₃和R₄各自如结构式(I)所定义，并且

-R′为C_1-4烷氧基酰胺基羰基或C₁卤代烷基酰胺基羰基。

有些上述结构式(II)的化合物已经从例如WO 2005/105753中得知，但是仅以非常中等的收率获得，例如，作为氨萘非特与C_1-4烷氧基羰基异氰酸酯如乙氧羰基异氰酸酯或C₁卤代烷基羰基异氰酸酯如三氯乙酰基异氰酸酯或三氟乙酰基异氰酸酯反应的产物获得。因此，本发明的另一个方面是设计允许以更高的收率得到这些中间体的反应条件。在为此目的的方法中，所述氨萘非特与C_1-4烷氧基羰基异氰酸酯或C₁卤代烷基羰基异氰酸酯的反应进行的条件包括：

-溶剂的存在，所述溶剂选自醚(例如二乙醚)、酮(例如2-丁酮或甲乙酮)和卤代烃(更优选具有至多2个碳原子和/或至少一个氯原子的卤代烃，例如二氯甲烷)，和/或

-低于0℃的温度，例如约-30℃至约-5℃的温度，和/或

-摩尔过量的所述C_1-4烷氧基羰基异氰酸酯或C₁卤代烷基羰基异氰酸酯，和/或

-在所述反应完成后，通过向反应混合物加水终止反应，因此避免(当使用摩尔过量的C_1-4烷氧基羰基异氰酸酯或C₁卤代烷基羰基异氰酸酯时)不希望的环化副产物的形成。

当使用一种或多种上述反应条件时，在同样或更短的反应时间内，与现有技术相比，上述结构式(II)的化合物可以以明显更高的收率获得。根据参数，例如R′、R₁、R₃和R₄的确切性质，普通技术人员能够容易地确定上述方法特征的哪种组合能在最短的可能的反应时间内提供最佳收率。

水解5-取代的氨萘非特或氨萘非特衍生物(其中其5-取代基可转换成脲基基团，例如但不限于结构式(II)的化合物)可以在酸性条件下或在碱性条件下进行。普通技术人员根据参数，例如但不限于pH、温度、所用酸或碱的种类和反应混合物的溶剂的种类，容易理解这种水解容易产生作为副产物的氨萘非特，然后必须将其与所要得到的结构式(I)的化合物分离。确定使氨萘非特的生成最小化的最佳条件是在本领域普通技术人员的常识范围内的。本发明的优势为；已证明很容易保持残留的氨萘非特在最终产物中的比例低于3wt％。

在第三方面，本发明提供了药物组合物，其包含：

-治疗有效量的结构式(I)所示的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物；和

-一种或多种药学上可接受的载体。

在另一方面，本发明提供了联合制剂，其包含：至少一种结构式(I)所示的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或者其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物，和一种或多种抗肿瘤药，优选以如下详述的协同联合的形式。

在另一方面，发明涉及意想不到的发现：通式(I)所示的取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物比氨萘非特具有显著地更高的生物活性，特别是对肿瘤细胞，同时避免氨萘非特的许多上述缺点。特别地，根据本发明的脲基取代的萘二甲酰亚胺衍生物具有显著的抗迁移效力。迁移是指细胞从肿瘤组织迁移并移生新组织的生物过程，其利用血管或淋巴管作为主要的迁移途径，该生物过程也称为转移过程。基于这个发现，本发明提供用于治疗和/或预防人肿瘤的方法。更具体地，本发明涉及治疗细胞增殖性疾病宿主的方法，其包括给予所述宿主有效量的结构式(I)所示的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物。

在另一个实施方案中，发明提供了结构式(I)所示的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物作为抗肿瘤药剂的用途。

在另一特定实施方案中，本发明涉及上述结构式(I)和以药学上可接受的盐的形式的一组脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物，以及含有它们作为活性成分的药物组合物。后者包含任意的有治疗活性的无毒的盐，结构式(I)的化合物能与成盐剂形成所述无毒的盐。这些加成盐可常规地通过用适当的成盐酸或碱处理本发明的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物而获得。例如，可以按照常规方法，通过用适当量的适当酸处理游离碱形式的具有碱的性质的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物，将其转换成对应的有治疗活性的无毒酸的盐的形式。所述适当的成盐酸的实例包括：例如，无机酸，其导致成盐，例如但不限于氢卤化物(即盐酸盐和氢溴酸盐)、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐等等；以及有机一元羧酸或二羧酸，其导致成盐，例如乙酸盐、丙酸盐、羟基乙酸盐、2-羟基丙酸盐、2-氧代丙酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯甲酸盐、2-羟基苯甲酸盐、4-氨基-2-羟基苯甲酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、对氨基水杨酸盐、双羟萘酸盐、酒石酸氢盐、樟脑磺酸盐、依地酸盐、1，2-乙二磺酸盐、延胡索酸酸、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、己基间苯二酚盐、羟基萘甲酸盐(hydroxynaphtoate)、羟基乙磺酸盐、扁桃酸盐、甲基硫酸盐、泛酸盐、硬脂酸盐，以及衍生自自乙二酸、丙二酸、丁二酸、(Z)2-丁烯二酸、(E)2-丁烯二酸、2-羟基丁二酸、2，3-二羟基丁二酸、2-羟基-1，2，3-丙三羧酸、环己烷氨基磺酸等的盐。

具有酸的性质的结构式(I)的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)的衍生物可以类似的方式转换成对应的具有治疗活性的无毒碱的盐形式。适当的成盐碱的实例包括，例如，无机碱例如金属氢氧化物，例如但不限于碱金属和碱土金属如钙、锂、镁、钾和钠，或锌的氢氧化物，生成对应的金属盐；含氮的有机碱，例如但不限于铵、烷基胺、苄星青霉素、海巴胺(hydrabamine)、精氨酸、赖氨酸、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因等。

用适当的成盐酸或碱处理本发明脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物(I)的反应条件分别与涉及同样酸或碱但涉及具有碱性或酸性性质的不同有机化合物的标准条件相似。优选地，鉴于它在药物组合物或制备治疗细胞增殖性疾病药物中的用途，会设计成药学上可接受的盐，即，会选择成盐酸或碱，以便给予本发明的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物更大的水溶性、更低的毒性、更高的稳定性和更缓慢的溶出速率。

本发明还提供结构式(I)所示的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物或其药学上可接受的盐或其溶剂合物和/或其代谢产物的用途，其作为生物活性成份，即有效成分，特别是作为药物或诊断用药或用于制备药物或诊断试剂盒。特别地，所述药物可以用于预防或治疗选自细胞增殖性病症的病理性病症。

本发明的化合物对几种类型的癌症有高活性。因此，由于本发明的化合物良好的药理性质，它们特别适合用作药物或用于制备药物和联合制剂，以用于治疗罹患与细胞增殖相关的疾病的患者，特别是治疗癌症。

上述用途中的任一项也可限于非医学的用途(例如在化妆品组合物中)、非治疗用途、非诊断用途、非人类用途(例如在兽药组合物中)，或仅为体外用途或用于离开动物的细胞的用途。

本发明还涉及药物组合物，其包含：

(a)一种或多种结构式(I)所示的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物，和

(b)一种或多种药学上可接受的载体。

在另一实施方案中，本发明提供一种或多种结构式(I)所示的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物与优选选自抗肿瘤药的一种或多种生物活性药物的联合制剂，优选协同组合物。作为常规技术，联合用药的协同作用的评估可以通过使用Chou等在Adv.Enzyme Reg.(1984)22：27中描述的中效原理分析各个药物之间的相互作用的定量而做出。简而言之，该原理阐明，二种药物之间的相互作用(协同作用、加和性、拮抗作用)可以使用由下面的方程所定义的合用指数(combination index)(下文用CI指代)来定量：

${\mathrm{CI}}_x=\frac{{\mathrm{ED}}_x^{1c}}{{\mathrm{ED}}_x^{1a}}+\frac{{\mathrm{ED}}_x^{2c}}{{\mathrm{ED}}_x^{2a}}$

其中ED_x是第一种或第二种药物分别单独使用时的剂量(1a，2a)，或与第二种药物或第一种药物联合时的剂量(1c，2c)，所述剂量是产生特定的效果所需要的。所述的第一和第二种药物具有协同作用或加和性或拮抗作用分别根据CI<1，CI＝1或CI>1。下文将更详细地解释，该原理可被应用于许多期望的效果，例如但不限于抗细胞增殖的活性。

本发明还涉及抗细胞增殖的具有协同作用的组合物或联合制剂，其包含：

(a)一种或多种抗肿瘤药，和

(b)至少一种结构式(I)所示的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物，和

(c)任选的一种或多种药用赋形剂或药学上可接受的载体，用于在治疗或预防细胞增殖性病症中同时、单独或顺序使用。

包含在本发明的协同抗增殖药物组合物或联合制剂中的适当的抗肿瘤药优选选自生物碱、烷化剂(包括但不限于烷基磺酸盐、氮丙啶、氮杂环丙烷、甲基三聚氰胺、氮芥和亚硝基脲)、抗生素、抗代谢药(包括但不限于叶酸类似物、嘌呤类似物和嘧啶类似物)、酶、干扰素和铂络合物。更具体的实例包括阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波毒素；阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；蒽霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿替哌；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；比生群；双奈法德；比折来新；博来霉素；布喹那；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；地吖醌；多西他赛；阿霉素；屈洛昔芬；屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；二氟甲基鸟氨酸(Eflomithine)；依沙芦星；恩洛铂；苯环丙炔酯；依匹哌啶；表柔比星；厄布洛唑；依索比星；雌氮芥磷酸钠(estramustine)；依他硝唑；乙碘油I131；依托泊苷；氯苯乙嘧胺；法倔唑(fadrozole)；法扎拉滨；芬维A胺；氮尿苷；氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星；吉西他滨；金198；羟基脲；伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-1a；干扰素γ-1b；异丙铂；伊立替康；兰瑞肽；来曲唑；亮丙瑞林；利阿唑；洛美曲索；洛莫司汀；洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；氮芥；甲地孕酮；美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托克星(mitocarcin)；丝裂红素；丝林霉素；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟菲尔钠(porfimer)；泊非霉素；泼尼莫司汀；丙卡巴肼；嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠(sparfosate)；稀疏霉素；螺锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲菌素；氯化锶89；磺氯苯脲；他利霉素；紫杉烷；紫杉醇类(taxoid)；替可加兰(tecogalan)；替加氟；替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑羧胺核苷(tiazofurin)；替拉扎明；拓扑替康(topotecan)；托瑞米芬；曲托龙；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；长春碱；长春新碱；长春地辛；长春匹定；长春甘酯；长春罗新；长春瑞滨；长春罗定；长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；佐柔比星；以及它们的药学上可接受的盐。

包含在本发明的协同抗增殖药物组合物或联合制剂中的其他适当的抗肿瘤化合物包括20-表-1，25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基酮戊酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯(antarelix)；抗背部化形态发生蛋白-1(nti-dorsalizing morphogenetic protein-1)；抗雄激素类，例如但不限于贝诺睾酮、塞奥罗奈、环丙孕酮、地马孕酮、奥生多龙、托普雄酮、扎诺特隆；抗雌激素类，例如但不限于氯甲孕酮；地马孕酮；萘福昔定；硝米芬；雷洛昔芬；他莫昔芬；托瑞米芬；曲沃昔芬和它们的药学上可接受的盐；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非科林酯(aphidicolin glycinate)；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin；阿扎司琼；阿扎毒素(azatoxin)；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟吩；苯甲酰星状孢子素(benzoylstaurosporine)；β-内酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycin B；白桦脂酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；bisaziridinylspermine；双萘法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；丁硫氨酸硫酸亚胺(buthionine sulfoximine)；钙泊三醇；calphostin C；喜树碱衍生物；canarypox IL-2；卡培他滨；氨甲酰氨基三唑(carboxamide aminotriazole)；羧胺三唑(carboxyamidotriazole)；CaRest M3；CARN 700；来自软骨的抑制剂(cartilage derived inhibitor)；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂；栗精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；二氢卟吩；氯喹喔啉磺胺；西卡前列素；顺式-卟啉；氯米芬及其类似物；克霉唑；collismycin A和B；考布他汀及其类似物；conagenin；crambescidin 816；cryptophycin及其衍生物；curacin A；环戊蒽醌；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗；dehydro didemnin B；地洛瑞林；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生；右维拉帕米；代代宁B；didox；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮胞苷；二氢紫杉醇；dioxamycin；二苯基螺莫司汀；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡米星SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；榄香烯；乙嘧替氟；爱普列特；雌激素激动剂和拮抗剂；依西美坦；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度(flavopiridol)；氟卓斯汀；fluasterone；fluorodaunorunicin；福酚美克；福美坦；福莫司汀；莫特沙芬钆(gadoliniumtexaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；heregulin；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；艾多昔芬；伊决孟酮；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯苦醇；伊立替康；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrinB；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；片螺素-N(lamellarin-N)；leinamycin；来格司亭；香菇多糖；leptolstatin；白血病抑制因子；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；lissoclinamide；洛铂；蚯蚓磷脂；氯尼达明；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；得克萨菲啉镥(lutetium texaphyrin)；lysofylline；mannostatin A；马立马司他；马索罗酚；maspin；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂(matrix metalloproteinase inhibitors)；美巴龙(merbarone)；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴卫矛醇；米托萘胺；细胞毒性成纤维细胞生长因子-皂素(mitotoxin fibroblast growth factor-saporin)；莫法罗汀；莫拉司亭；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体；莫哌达醇；mycaperoxB；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮；喷他佐辛；napavin；萘萜二醇(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性肽链内切酶；尼鲁米特；nisamycin；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧剂(nitroxide antioxidant)；nitrullyn；奥曲肽；okicenone；奥那司酮；恩丹西酮(ondanestron)；昂丹司琼；oracin；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；palauamine；棕榈酰基根毒素(palmitoylrhizoxin)；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；副菌铁素(parabactin)；帕折普汀；培得星(peldesine)；戊聚糖；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；紫苏子醇；苯连氮霉素(phenazinomycin)；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶链菌制剂(picibanil)；毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A和B；纤溶酶原激活物抑制剂；丙基二吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；雷替曲塞；雷莫司琼；ras蛋白法尼基转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；瑞替普汀；依替膦酸铼186；根霉素；维A胺(retinamide)；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；saintopin；sarcophytol A；沙格司亭；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；磷乙天冬氨酸；穗霉素D(spicamycin D)；脾脏五肽(splenopentin)；海绵抑制素1(spongistatin 1)；角鲨胺；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；溶基质蛋白酶抑制剂；sulfinosine；suradista；苏拉明；苦马豆素；他莫司汀；他莫昔芬；牛磺莫司汀；他扎罗汀；tecogalan；tellurapyrylium；端粒末端转移酶抑制剂；替莫唑胺；十氧化四氯；tetrazomine；thaliblastine；噻可拉林；血小板生成素；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；锡乙基初紫红素；二茂钛；topsentin；维A酸；三乙酰基尿苷；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostins)；乌苯美司；泌尿生殖窦源生长抑制因子(urogenital sinus-derived growth inhibitory factor)；尿激酶受体拮抗剂；variolin B；维拉雷琐；藜芦胺；verdins；维替泊芬；vinxaltine；vitaxin；扎诺特隆；亚苄维C(zilascorb)；以及它们的药学上可接受的盐。

本发明的药物组合物或联合制剂的抗细胞增殖的协同活性可以容易地通过一种或多种测试来测定，例如但不限于，肿瘤细胞系培养物中引入³H-胸苷导致的放射性的测定。例如，为了评估供试化合物的抗肿瘤作用，可以选择不同的肿瘤细胞系，例如，但不限于：

-RPM11788：人外周血液白细胞(PBL)Caucasian肿瘤系，

-Jurkat：人急性T细胞白血病，

-EL4：C57BI/6小鼠淋巴瘤，或

-THP-1：人单核细胞肿瘤系。

根据所选的肿瘤细胞系，可以使用不同的培养基，例如：

-对于RPMI1788和THP-1：RPMI-1640+10％ FCS+1％ NEAA+1％丙酮酸钠+5x10^-5巯基乙醇+抗生素(G-418 0.45μg/ml)；

-对于Jurkat和EL4：RPMI-1640+10％ FCS+抗生素(G-418 0.45μg/ml)。

在协同作用测定试验的具体实施方案中，收集肿瘤细胞系，并制备0.27x10⁶细胞/ml完全培养基的悬浮液。将悬浮液(150μl)一式三份地加到微孔滴定板上。将完全培养基(对照)或实验浓度的供试化合物(50μl)加到微孔滴定板的细胞悬浮液中。细胞在5％CO₂下在37℃孵化约16个小时。加入³H-胸苷，并将细胞再孵化8个小时。收集细胞，并用β-计数器以每分钟计数次数(CPM)来测定放射活性。³H-胸苷细胞的含量，以及这样测定的放射活性，是与细胞系的增殖成比例的。通过上文公开的中效分析方法评估协同作用。

本发明的具有抗细胞增殖协同活性的药物组合物或联合制剂可以含结构式(I)的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物，其根据明确的预期用途和制剂的期望效果有宽的含量范围。通常，联合制剂中的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物的含量为约0.1-约99.9重量％，优选1-99重量％，更优选5-95重量％。

根据本发明的药物组合物和联合制剂可以口服或以其他适当的方式给药。优选口服给药，并且制剂的形式可以是片剂、水分散体、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆剂、酏剂或凝胶剂。所述剂型可以通过使用本领域任何已知的制备这些药物组合物方法制备，并且可以包含添加剂：甜味剂、调味剂、着色剂、防腐剂等。下文详细描述载体材料和赋形剂，除了别的以外，其可以包括碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂、粘合剂等。本发明的药物组合物或联合制剂可以包含在明胶胶囊中并与任意的惰性固体稀释剂或载体材料混合，或具有软明胶胶囊的形式，其中的成分与水或油介质混合。水分散体可以包含所述生物活性组合物或联合制剂，并与助悬剂、分散剂或润湿剂结合。油分散体可以包含助悬剂例如植物油。直肠给药也是适用的，例如以栓剂或凝胶剂的形式。根据治疗的病症和患者的情况，注射(例如静脉内、肌内或腹膜内)也是可用的给药方式，例如，以可注射的溶液或分散体的形式。

除非另有说明，本文所用的涉及药物组合物和联合制剂的术语“药学上可接受的载体或赋形剂”意指任何材料或物质，其可与活性成分，即本发明的脲基取代的萘二甲酰亚胺和任选的抗肿瘤药配制，以帮助活性成分的施用或散布到治疗部位，例如通过溶解、分散、扩散所述组合物，和/或使其易于贮存、运输或处理，而不损害其药效。药学上可接受的载体可以是固体或液体或被压缩形成液体的气体，即，本发明的组合物可适当地用作浓缩剂、乳剂、溶液剂、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、气雾剂、丸剂或散剂。

用于本发明的所述药物组合物的合适的药用载体及配制它们的有效方式是药学领域的普通技术人员熟知的。在本发明范围内，对它们的选择没有特殊限制，但是，由于本发明的蝶啶衍生物的水溶性通常较低或很低，会特别注意选择能帮助它们针对期望的时间释放曲线来恰当地配制的适当的载体组合。适当的药用载体包括添加剂例如润湿剂、分散剂、粘着剂、粘合剂、乳化剂或表面活性剂、增稠剂、络合剂、胶凝剂、溶剂、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂(例如苯酚、山梨酸、氯代丁醇)、等渗剂(例如糖或氯化钠)等，条件是它们与制药实践一致，即，对哺乳动物不会造成永久性损伤的载体和添加剂。本发明的药物组合物可以以任何已知的方式制备，例如在一步或多步的方法中，与所选的载体材料以及(适当时)其他添加剂例如表面活性剂一起，通过混合、溶解、喷雾干燥、包衣和/或研磨活性成份来制备。本发明的药物组合物也可以通过微粉化制备，例如为了获得它们的通常有约1-10μm直径的微球的形式，即为了制备生物活性成分的控释或缓释的微胶囊。

用于本发明的药物组合物的适当的表面活性剂优选具有良好的乳化性、分散性和/或润湿性非离子型、阳离子型和/或阴离子型材料。这样的适当的阴离子表面活性剂包括水溶性皂和水溶性合成表面活性剂。适当的皂是高级脂肪酸(C₁₀-C₂₂)的碱金属或碱土金属的盐、未取代或取代的铵盐，例如，油酸或硬脂酸、或可得自椰子油或牛油的天然脂肪酸混合物的钠盐或钾盐。合成表面活性剂包括聚丙烯酸的钠盐或钙盐；脂肪磺酸盐和硫酸盐；磺化苯并咪唑衍生物和烷基芳基磺酸盐。脂肪磺酸盐或硫酸盐通常为碱金属或碱土金属的盐、未取代的铵盐或被具有8-22个碳原子的烷基或酰基取代的铵盐，例如，木质素磺酸或十二烷基磺酸的钠盐或钙盐或从天然脂肪酸得到的脂肪醇硫酸盐混合物，硫酸酯或磺酸酯和脂肪醇/环氧乙烷加合物的磺酸的碱金属或碱土金属的盐(例如十二烷基硫酸钠)。适当的磺化苯并咪唑衍生物优选包含8-22个碳原子。烷基芳基磺酸盐的实例为十二烷基苯磺酸或二丁基萘磺酸或萘磺酸/甲醛缩合产物的钠、钙或醇胺盐。适用于实现本发明的还有对应的磷酸盐，例如磷酸酯、和邻壬基酚与环氧乙烷和/或环氧丙烷的加合物、或磷脂的盐。为此目的的适当的磷脂包括，但不限于脑磷脂或卵磷脂型的天然的(来自动物或植物细胞)或合成的磷脂，例如，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、溶血卵磷脂、心磷脂、二辛酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和它们的混合物。

适当的非离子表面活性剂包括烷基酚、脂肪醇、脂肪酸、在分子中含有至少12个碳原子的脂肪族胺或酰胺、烷基芳烃磺酸酯和二烷基磺基琥珀酸酯的聚乙氧基化和聚丙氧基化衍生物，例如脂肪族和脂环族醇、饱和与不饱和的脂肪酸和烷基酚的聚乙二醇醚衍生物，所述衍生物优选含有3-10个乙二醇醚基团，且在(脂肪族)烃部分含8-20个碳原子，且在烷基酚的烷基部分含6-18个碳原子。其他适合的非离子表面活性剂为在烷基链中含有1-10个碳原子的聚氧化乙烯与聚丙二醇、乙二胺基聚丙二醇的水溶性加合物，所述加合物包含20-250个乙二醇醚基团和/或10-100个丙二醇醚基团。这样的化合物通常每个丙二醇单位含有1-5个乙二醇单位。非离子型表面活性剂的代表性实例为壬基酚-聚乙氧基乙醇、蓖麻油聚乙二醇醚、聚氧化丙烯/聚氧化乙烯加合物、三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。聚乙烯山梨糖醇酐、甘油、山梨聚糖、蔗糖和季戊四醇的脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯)也是适当的非离子表面活性剂。

用于实现本发明的适合的阳离子型表面活性剂包括，但不限于，具有四个任选地被卤素、苯基、取代的苯基或羟基取代的烃基的季铵盐(优选卤化物)；例如这样的季铵盐，其含有作为N-取代基的至少一个C₈-C₂₂烷基(例如，鲸蜡基、月桂基、棕榈基、肉豆蔻基、油基等)和作为其他取代基的未取代或卤化的低级烷基、苄基和/或羟基-低级烷基。

适用于该目的的表面活性剂的更详细的说明可见于例如“McCutcheon′sDetergents and Emulsifiers Annual”，(MC Publishing Crop.，Ridgewood，NewJersey，1981)，“Tensid-Taschenbuch”，2^nd ed.(Hanser Verlag，Vienna，1981)和“Encyclopedia of Surfactants”(Chemical Publishing Co.，New York，1981)。

结构形成剂、增稠剂或成胶剂也可以包含在本发明的药物组合物和联合制剂中。适当的这些药剂特别包括，但不限于，高度分散的硅酸，例如市售的商品名为Aerosil的产品；膨润土；蒙脱石的四烷基铵盐(例如市售的商品名为Bentone的产品)，其中所述烷基基团各自可包含1-20个碳原子；十六醇十八醇混合物和改性蓖麻油产品(例如市售的商品名为Antisettle的产品)。

可以包含在本发明的药物组合物和联合制剂中的胶凝剂包括，但不限于，纤维素衍生物例如羧甲基纤维素、乙酸纤维素等；天然胶例如阿拉伯胶、黄原胶、黄芪胶、瓜尔胶等；明胶；二氧化硅；合成聚合物例如卡波姆，以及它们的任意适当比例的混合物。明胶和改性纤维素代表优选的胶凝剂类别。

还可以存在于本发明的药物组合物和联合制剂中的其他任选的赋形剂包括，但不限于，添加剂例如氧化镁；偶氮染料；有机和无机颜料例如二氧化钛；UV吸收剂；稳定剂；掩味剂；增黏剂；抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠等以及它们的混合物；防腐剂，例如山梨酸钾，苯甲酸钠、山梨酸、没食子酸丙酯、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等；多价螯合剂例如乙二胺四乙酸；调味剂例如天然的香草醛；缓冲剂例如柠檬酸和乙酸；增量剂或填充剂例如硅酸盐、硅藻土、氧化镁或氧化铝；增稠剂例如镁盐；以及它们的混合物。

为了控制本发明的组合物和联合制剂中的生物活性成份的作用的持续时间，可以包含其他成份。控释组合物可以通过选择适当的聚合物载体而实现，所述聚合物载体例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白等。药物释放的速度和作用的持续时间还可以通过将有效成份引入到聚合物例如水凝胶、聚乳酸、羟甲基纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯和其他上述聚合物的颗粒(例如微胶囊)中来控制。这种方法包括胶态药物递送系统，例如脂质体、微球、微乳液、毫微粒、纳米囊等。根据给药途径，本发明的药物组合物或联合制剂还可以需要保护性包衣。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和它们用于临时配制的无菌粉末。因此，为此目的的典型载体包括生物相容的缓冲水溶液、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、络合剂例如环糊精等，及其混合物。

在包含结构式(I)的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物和抗肿瘤药的联合制剂的情况下，因为两种成份不一定直接在被治疗的患者中同时产生它们的协同治疗作用，所以，所述联合制剂可以为药剂盒或包装的形式，其包含以独立但相邻的形式的所述二种成份。在后一情况下，各个成份因此可以以适于不同于另一成分的给药途径的方式配制，例如，它们中的一个可以为口服或肠胃外制剂的形式，而另一个为用于静脉注射的安瓿或气雾剂的形式。

本发明还涉及用于预防或治疗患者的细胞增殖性病症的方法，所述患者优选为哺乳动物，更优选为人。本发明的方法由以下组成：向有此需要的患者给药有效量的结构式(I)的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物，并任选地一起给药有效量的抗肿瘤药，或给药包含它们(例如上文详尽公开的)的药物组合物。对于人，有效量的脲基取代的萘二甲酰亚胺(异喹啉二酮)衍生物通常为0.01mg-20mg/天/kg体重，优选为0.1mg-5mg/天/kg体重。根据要治疗的病理性病症和患者的情况，所述有效量可以每天分成几个亚单位或者可以以超过一天的间隔给药。所要治疗的患者可以是罹患所述病理性病症的任何温血动物，优选是人。

以下实施例是为了例证本发明的几种实施方案，包括脲基取代的萘二甲酰亚胺的制备、药物制剂和生物学评估，而不以任何方式限制它的范围。

实施例1 制备({2-[2-(二甲氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并[de] 异喹啉-5-基}氨基)羰基氨基甲酸乙酯

在氮氛下在-20℃，将1.086g氨萘非特溶于80ml 2-丁酮。然后将溶于2ml 2-丁酮的880mg乙氧羰基异氰酸酯(2摩尔当量)用滴液漏斗在5分钟内小心加入。搅拌下，将反应温度维持在-20℃ 25分钟。然后在40分钟内，将反应混合物温热到45℃，然后加入250μL水。在该反应终止后，所形成的沉淀物在40℃被过滤在纸上。干燥后，得到1.162g预期的产物(结构式如下)(收率：76％)。高效液相色谱法(下文称为HPLC)显示纯度超过95.6％。仍存在微量的氨萘非特(约2％)。

期望的产品的特征为：

-质子核磁共振(300MHz，CDCl₃)显示出与WO 2005/105753的实施例4同样的峰，和

-电喷雾电离质谱：显示的峰在M+H⁺＝399；并且出现了加合物，在2M+H⁺＝797。

实施例2 制备N-{2-[2-(二甲氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并 [de]异喹啉-5-基}脲

将100mg实施例1的化合物溶于100mL 0.1M的NaOH。将反应混合物温热并回流，维持在该温度1小时。通过HPLC分析混合物，显示存在期望的脲(结构式如下)，为主产物(产率76％)。

该产品通过下述技术表征：

-质子核磁共振(RMN ¹H，300MHz，DMSO)显示峰在：9.40(NH-17，bs)；8.53(H-2，d，J＝1.8)；8.48(H-4，d，J＝1.8)；8.26-8.32(H-6和H-7，m)；6.18(NH2-19，bs)；4.14(H-14，t，J＝6.6)；2.51(H-13，m)；和2.21(H-15和H-16，s)ppm；

-¹³C NMR(75.4MHz、DMSO，TMS作为内标)显示峰在37.5(CH2，C-13)；49.9(2X CH3，C-15和C-16)；57.0(CH，C14)；119.0(CH，C-arom)；122.2(C，C-arom)；122.9(C，C-arom)；123.5(C，C-arom)；123.9(CH，C-arom)；127.8(CH，C-arom)；128.6(CH，C-arom)；132.7(C，Carom)；133.8(CH，C-arom)；140.3(C，C-arom)；156.5(C，C-18)；和163.8(C，C-12)；164.0(C，C-11)ppm；和

-电喷雾电离质谱：显示峰在M+H⁺＝327，和加合物在2M+H⁺＝653。

实施例3 对全部细胞成长的效力

为了快速地(例如在5天内)测量实施例2化合物对全部细胞生长的效力，进行了试验。试验测定了能通过线粒体还原将黄色产物3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(本文中称为MTT)转化成蓝色产物甲染料的新陈代谢活跃的活细胞的数量。实验最终获得的甲的量，通过分光光度计测量，其与活细胞的数目成正比。因此，光密度测定能与对照条件(未经处理的细胞)和/或其他参比物相比较，定量测定所测化合物的效力。

表1中所述6种人癌细胞系用于以下的MTT测试。这些细胞系包括6种组织学癌症类型，分别为前列腺癌、胶质瘤、胰腺癌、大肠癌、肺癌和乳腺癌。细胞在96孔平底微孔中生长，每孔细胞悬浮液的量为100μl，根据所用细胞的类型，有1000-4000细胞/孔。各个细胞系接种在公知的MEM10％血清培养基中。

表1

 

细胞系	ATCC编号	组织	参考文献
				PC3	CRL-1435	前列腺癌	Invest.UroL 17：16-23，1979；Cancer Res.40：524-534.1980
U-373MG	HTB-17	胶质瘤	Acta Pathol.Mircrobial.Scand.74：465-486，1968
				BxPC3	CRL-1687	胰腺癌	Cancer Invest.4：15-23，1986；Clin.Lap.Med.2：567-578，1982
LoVo	CCL-229	大肠癌	Exp.Cell Res Cancer 101：414-416，1976；J.Natl.Cancer Inst 61：75-83，1978；Cancer Res.39：2630-2636，1979
				A549	CCL-185	肺癌	J.Natl.Cancer lnst.51：1417-1423，1973；Int.J.Cancer 17：62-70，1976
Mcf-7	HTB-22	乳腺癌	J.Natl.Cancer Inst.51：1409-1418，1973

详细的实验方法如下：在37℃孵育24小时后，用其中事先溶解供试化合物的100μl新鲜培养基替换培养基，所述供试化合物的摩尔浓度如下：10^-9M、5.10^-9M、10^-8M、5.10^-8M、10^-7M、5.10^-7M、10^-6M、5.10^-6M和10^-5M。每个实验重复6次。

在37℃孵育72小时后，含有(试验条件)或不含有(对照条件)供试化合物的培养基，被100μlMTT浓度为1mg/ml的RPMI(无酚红的1640)溶液替换。随后在37℃孵育微孔3小时，在400g离心10分钟。除去MTT，将形成的甲结晶溶于100μl DMSO。振摇微孔5分钟，然后在分光光度计上，在570nm波长(甲的最大吸收值)和630nm波长(背景噪音)读数。

计算各试验条件下的光密度均值，以及与对照相比的剩余活细胞的百分比。

下面的表2显示了实施例2的化合物的IC₅₀值。IC₅₀代表供试化合物抑制全部肿瘤细胞生长达50％时的摩尔浓度范围。

表2

 

细胞系	IC50(M)
		PC3	10-5-5.10-6
U-373MG	10-5-5.10-6
		BxPC3	10-5-5.10-6

实施例4 对细胞迁移的作用

将不同癌系的细胞，即U-373 MG(胶质瘤癌)和A549(肺癌)在迁移实验的48小时前接种于培养瓶。在测试当天，控制温度在(37.0±0.1℃)，在含缓冲培养基的封闭的Falcon盘中，将细胞用实施例2的化合物处理或不用实施例2的化合物处理，持续12或22小时，如表3右栏所记录。实施例2的化合物用了三种非细胞毒性的浓度(10^-6M，10^-7M，10^-8M)。通过反向显微镜上的CCD-照相机观察细胞迁移。用非参数的Mann-Whitney检验对25％和50％的最活动细胞和整个细胞群的迁移进行统计分析。下面的表3显示供试化合物的抗迁移效力。

表3

 

细胞系	最大效力	条件
			U-373MG	-29％p<0.001	25％的最活动细胞，22小时，10-7M
U-373MG	-24％p<0.001	50％的最活动细胞，22小时，10-7M
			U-373MG	-20％	100％的细胞，22小时，10-7M

表3的数据表明，在这项研究中，实施例2的化合物以非细胞毒性的浓度导致了U-373 MG癌细胞的迁移水平的降低。特别是，该化合物显示出对细胞迁移的统计学上显著性抑制。

实施例5-毫微粒悬浮液制剂

毫微粒悬浮液被用于实施例2的化合物的制剂。为了该方法，所用的所选的赋形剂(特别是张力活性剂)包括聚山梨酯80(吐温80)、TexaponK12(SDS)、PVA(聚乙烯醇)、Lutrol F68(Poloxamer188)、LutrolF127(Poloxamer 407)、羟丙基-β-环糊精、牛磺胆酸钠和其他磷脂(Lipoid SPC-3和Phopholipon 90H)。

选择赋形剂及其用量后，通过简单地将其计划的量加入到期望体积的水中制备含有实施例2的化合物的悬浮液。然后将悬浮液放入匀浆器(turax)，在低温下在24000rpm进行初步的粒度粉碎。然后将悬浮液放入高压乳化匀浆机。可以采用在不同压力下匀浆化三周以获得预期大小的粒子，例如，第一周在7000磅/平方英寸下进行7分钟，第二周在12000磅/平方英寸下进行8分钟，并且最后一周在约21000-24000磅/平方英寸下进行30分钟。然后通过激光衍射测定粒度分布，测量5次，各次测量间隔20秒。这5次测量的平均值代表悬浮液的粒度分布。

实施例6 制备2，2，2-三氯-N-[({2-[2-(二甲氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二 氢-1H--苯并[de]异喹啉-5-基}氨基)羰基]乙酰胺

在氮氛下，将氨萘非特(90g)和3，6L甲乙酮(MEK)装入装备了机械搅拌器、回流冷凝器和温度控制器的3颈12L的圆底烧瓶。将所得的悬浮液冷却到-10℃，维持温度低于-5℃的同时，在35分钟内滴加三氯乙酰基异氰酸酯(120g，0.64摩尔)的MEK(600mL)溶液。在-10℃至-5℃搅拌反应混合物3小时，然后慢慢加入2.8mL水。可以在室温下温热混合物，过滤分离所得固体，用100mL MEK在过滤器上洗涤，并风干两天，得到147克期望的化合物(收率：97％；纯度：98.1％)。该化合物的特征光谱与WO2005/105753的实施例2所述的相同。

实施例7 备选制备N-{2-[2-(二甲氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H- 苯并[de]异喹啉-5-基}脲

将实施例6的化合物(250g)和7.5L 5％的K₂CO₃水溶液装入装备了机械搅拌器、回流冷凝器、温度控制器的3颈22L的圆底烧瓶。(用冰浴)将混合物冷却到10℃，然后一次加入7.5L甲醇(MeOH)。温度上升到20℃。将烧瓶从冰浴中取出，并在环境温度下继续搅拌，直到大部分原料溶解(约30-45分钟)。迅速过滤(澄清)混合物，去除少量未反应的原料和其他机械杂质。在室温下搅拌混合物2小时，并一次加入4L MeOH。在54-56℃加热混合物3小时。通过HPLC监测反应的进度以保证完成。(冰浴)冷却反应混合物，并维持在8-10℃2小时。过滤分离所得固体，在过滤器中洗涤(2x100mL水)，然后在空气中干燥两天，得到156g期望的化合物(收率：90％)(HPLC纯度：99.47％)。该化合物的特征光谱与本文上述实施例2所述的相同。

实施例8 乳酸系溶液制剂

根据实施例2或实施例7制备的化合物的液体溶液可以如下得到。

首先，如下制备2体积％的乳酸溶液：将40mL 0.9％的注射用NaCl溶液和(使用A-TD级移液管)1.18mL的乳酸、85％ ACS试剂加入50mL的容量瓶。然后用0.9％的注射用NaCl溶液将体积调整到50mL，并且通过倒转整体混和。

精确称量实施例2和7的化合物700毫克，加入到25mL的容量瓶。向该特定量加入10mL 0.9％的注射用NaCl溶液和8.89mL上述2％乳酸水溶液。将所得溶液用力搅拌并超声处理10分钟。溶液的pH值在6.4-6.6之间。然后通过小心地加入少量(20μL)的上述2％乳酸水溶液调节pH值至5.75。用0.9％的注射用NaCl溶液将最终体积调节为25mL。在这一点，通过目测观察到本发明化合物完全溶解，并通过使溶液通过预消毒的注射器式过滤器(例如微孔滤器-Durapore(PVDF)，0.22μm)进行消毒，由此得到28mg/mL的溶液。

从该28mg/mL的储备溶液，按照以下的稀释步骤用0.9％的注射用NaCl在10mL容量瓶中得到下表所列的稀溶液。在表4中，所述的剂量对应静脉注射的体积剂量为5Ml/kg的假设。

表4

 

化合物浓度	28mg/kg	24mg/kg	20mg/kg	16mg/kg	12mg/kg
						剂量	140mg/kg	120mg/kg	100mg/kg	80mg/kg	60mg/kg
28mg/kg储备溶液的体积	NA	8.571mL	7.143mL	5.714mL	4.886mL
						用9％注射用NaCl的体积(调整至10mL)	NA	调整至10mL	调整至10mL	调整至10mL	调整至10mL

 

目标浓度	8mg/mL	4mg/mL	2mg/mL	1mg/mL	0.5mg/mL
						剂量	40mg/kg	20mg/kg	10mg/kg	5mg/kg	2.5mg/kg
28mg/kg储备溶液的体积	2.857mL	1.429mL	0.714mL	0.357mL	0.179mL
						用9％注射用NaCl	调整至	调整至	调整至	调整至	调整至

 

的体积(调整至10mL)

10mL

10mL

10mL

10mL

10mL

实施例9 N-{2-[2-(二甲氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并[de]异 喹啉-5-基}脲的血液毒性

我们测定了根据实施例2或实施例7制备的化合物对血小板、红细胞和白细胞的化合物诱导的潜在血液毒性，并与氨萘非特对血小板、红细胞和白细胞的作用相比较。通过以10mg/kg和20mg/kg向小鼠腹膜内给药评价氨萘非特的作用。给药日程为是每周五次，连续三周。通过以20mg/kg向小鼠静脉内给药评价根据实施例2或实施例7制备的化合物的作用。给药日程为每周三次(在星期一、星期三和星期五)，连续五周。在末次注射后的第3天处死动物。每组有10只小鼠。图1说明该对血小板的化合物诱导的血液毒性测定的结果。图1表明：小鼠耐受了以10mg/kg剂量15天长期给药氨萘非特，而以20mg/kg的剂量接受氨萘非特的所有动物在15天长期给药结束前全部死亡。相反，图1表明：小鼠耐受了以20mg/kg剂量15天长期给药根据实施例2或实施例7制备的化合物。因此，不同于氨萘非特，在这些试验条件下，未发现根据实施例2或实施例7制备的化合物在治疗剂量引起血液毒性。

实施例10 N-{2-[2-(二甲氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并[de] 异喹啉-5-基}脲与P-糖蛋白的相互作用

为了测试与P-糖蛋白(下文称为P-gp)的药物相互作用，我们使用基于对得自富含P-gp的膜囊制剂的ATP酶活性调节的研究的测定法(使用下述试剂盒：P-gp药物相互作用测定试剂盒，购自法国SPI BIO)。根据监测所述囊泡悬浮介质中ADP的形成，用分光光度法测定P-gp ATP酶活性。基础ATP酶活性定义为：在没有加入任何药物时所测得的活性。通过加入不同浓度(分别为2、10和50μM)的氨萘非特或根据实施例2或实施例7制备的化合物来调节基础活性。在图2所示的数据表明，当氨萘非特(以50μM测定时)显著地改变ATP酶活性时，本发明化合物还不影响ATP酶活性。

实施例11 N-{2-[2-(二甲氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并[de] 异喹啉-5-基}脲对人癌细胞中自体吞噬相关的细胞死亡的诱导作用

拓扑异构酶II-靶向性药物的标志是诱导细胞凋亡；这是稳定可裂解复合物造成细胞内DNA损伤水平增加或抑制拓扑异构酶II链传代(strand-passage)活性导致不能完成染色体的完全分离的结果。氨萘非特是拓扑异构酶II抑制剂，并导致细胞凋亡，我们在用根据实施例2或实施例7制备的化合物处理的人PC-3(参见表1)和DU-145(ATCC号：HTB-81)前列腺癌细胞中没有观察到这个特征。

我们使用流式细胞仪(根据Mijatovic等，Neoplasia，2006的实验方案)测定对膜联蛋白V和碘化丙啶的PC-3和DU-145阳性细胞的百分比，并且我们观察到，在接受10μM根据实施例2或实施例7制备的化合物处理后，最多仅10％的PC-3和DU-145细胞出现细胞凋亡过程。

我们观察到用该化合物处理的PC-3和DU-145细胞中的预自噬作用。我们在用0(对照，未处理细胞)、1μM、10μM处理PC-3(灰色柱)或DU-145(黑色柱)细胞后，对它们进行吖啶橙染色，然后定量了酸性囊状细胞器(显示为红色荧光染色)(根据Kanzawa等，Cell Death Differ 2004所述的实验方案)，结果显示在图3A中。

众所周知，溶酶体在多个层次上控制细胞死亡。响应内源或外源性应激(包括化疗)，可发生溶酶体膜透化(LMP)，其导致分解代谢水解酶的释放，所述酶能介导胱天蛋白酶依赖性的细胞凋亡、伴随LMP的高水平的胱天蛋白酶依赖性的凋亡样细胞死亡或甚至坏死。因此，我们在用0(对照，未处理细胞)、1μM、10μM的根据实施例2或实施例7制备的化合物处理PC-3(灰色柱)或DU-145(黑色柱)细胞72小时后，对它们进行吖啶橙染色，然后定量了酸性囊状细胞器的“泄露”(显示为绿色荧光染色)(根据Nylandsted，J等，Heat Shock Protein 70 Promotes Cell Survival by InhibitingLysosomal Membrane Permeabilization，J Exp Med.(2004)16；200(4)：425-35和Mijatovic等，Neoplasia 2006中所述的实验方案)，结果显示在图3B中。我们未观察到在处理72小时后PC-3细胞的LMP，而在用10μM本发明化合物处理的DU-145细胞中出现了明显药物诱导的LMP。

实施例12 N-{2-[2-(二甲氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并[de] 异喹啉-5-基}脲对DU-145人前列腺癌细胞衰老的诱导作用

通过对用10μM根据实施例2或实施例7制备的化合物处理的人PC-3和DU-145前列腺癌细胞进行细胞成像6天的方法(细胞接种在Falcon烧瓶(25cm²)中，并用定量电视显微镜分析6天)，进一步在形态学水平上观察了所述化合物诱导非凋亡细胞死亡的这一特征。

衰老可被认为是一种“活细胞死亡”，因为虽然衰老细胞保持着它们细胞膜的完整性，但它们处于永久性生长停止并且失去了克隆形成能力。衰老可作为癌症进展的天然屏障。

在人DU-145前列腺癌细胞中，实施例2的化合物已经诱导了衰老的典型特征。已知衰老细胞通常表现出形态学变化，例如细胞质变平和粒度增加。诱导衰老相关的β-半乳糖苷酶的活性是发生在经历衰老的细胞中的特定事件，是我们在本研究中再一次观察到的特征(根据Dimri等，Abiomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin invivo，Proc Natl Acad Sci U S A.(1995)92(20)：9363-7中所述的实验方案)，如图4所示。已知中等剂量(nM范围)的阿霉素(ADR)诱导野生型人癌细胞的衰老。因此，我们在实验中使用阿霉素作阳性对照。如图4中所示，10μM的本发明化合物在DU-145细胞中诱导了与20nM阿霉素近似的衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性染色百分比。

实施例13 N-{2-[2-(二甲氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并[de] 异喹啉-5-基}脲靶向基因的鉴定

在生物化学的水平上，衰老伴随着新陈代谢的变化，其为我们在本研究中，当对用实施例2的化合物体外处理的PC-3细胞进行基因组分析时，也观察到的特征。

在基因水平上，我们也观察到当用该化合物处理PC-3细胞时，它们中的染色质结构和基因表达模式的变化。

我们使用体外生长的人PC-3癌细胞，将其用本发明的化合物(N-{2-[2-(二甲氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并[de]异喹啉-5-基}脲)以1μM或10μM一次性地，或以每次1μM、每周5次(每天1次，连续5天)进行处理，并通过Affymetrix全基因组微阵列进行评估基因靶点的第一个实验(使用Affymetrix Human Genome U133 set Plus 2.0(High Wycombe，United Kingdom)，在VIB MicroArray Facility(UZ Gasthuisberg，CatholicUniversity of Leuven，Belgium)上进行全基因组分析)。我们得到的最明显的数据报告在表5中，并且表明该化合物，当以单个的大剂量体外测定时(急性体外处理)，显著改变了核的组织，并通过显著增加各种组蛋白的表达水平(至少在mRNA水平)改变生物发生。该化合物靶向的第二套基因属于“氨基酸代谢”标记的基因类别(表5)。

在鉴别前列腺癌细胞中衰老相关的基因过程中，现有技术教导在处于DNA损伤诱导的衰老状态中的癌细胞中上皮细胞特异性同源因子(etshomologous factor，EHF)显著抑制，并且已表明EHF通过抑制衰老和细胞周期停滞在PC-3前列腺癌细胞中提供了实质性药物抵抗。有趣地，我们发现EHF也是本发明化合物的靶点。

众所周知，E2F家族的转录因子在细胞周期进程中发挥着重要的作用。E2F-1，在和另一种蛋白DP-1的异二聚体复合物中，通常是未活化的，因为它与低磷酸化的pRb结合。当细胞进程从G1期到S期时，pRb被高磷酸化并释放出结合的E2F-1/DP-1异二聚体，它随后激活DNA中基因(例如TS和DHFR)的转录。功能性pRb的缺失能引起游离E2F-1水平的增加，接着增加TS和DHFR的水平。正如基因组Affymetrix法所揭示的，我们发现，用实施例2的化合物每天1次、每次1μM、连续五天地处理PC-3细胞，使E2F-1的mRNA水平下降了2倍。

在衰老的最初阶段，Rb可控制整个基因组在特定位点异染色质的成核，然后通过组蛋白甲基转移酶的作用和HP1蛋白的募集扩展。我们发现，实施例2的化合物通过在PC-3细胞中至少在mRNA水平上增加组蛋白H1、H2和H3而显著增加PC-3细胞中异染色质的水平(表5)。与此相反，该化合物使H2AFY的mRNA表达水平降低了2.6倍。

Claims (20)

1、结构式(I)所示的取代的萘二甲酰亚胺衍生物

其中：

-R₁为单或二C_1-4烷基氨基-C_1-4烷基；

-R₃和R₄各自独立地选自氢、卤素、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、C_1-4烷硫基、硝基、氰基、氨基、被保护的氨基和卤代C_1-4烷基；

-m为取代基R₃的数目，且范围为0-3；

-n为取代基R₄的数目，且范围为0-2；并且

-R₂为CONH₂；

和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物。

2、权利要求1的结构式(I)所示的取代的萘二甲酰亚胺衍生物，其中：

-n＝0，和/或

-m＝0，和/或

-m＝2，两个R₃取代基相邻，并与与它们所连接的碳原子一起形成苯基，和/或

-R₁为亚烷基，其具有1-3个碳原子且连接到二甲基氨基或二乙基氨基，和/或

-R₂为CONH₂；

和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物。

3、权利要求1的取代的萘二甲酰亚胺衍生物，其中当m等于1时，R₃不为硝基。

4、权利要求1的取代的萘二甲酰亚胺衍生物，其为N-{2-[2-(二甲基氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并[de]异喹啉-5-基}脲和/或其药学上可接受的盐和/或其代谢产物。

5、权利要求1-4任一项的取代的萘二甲酰亚胺衍生物，其中所述代谢产物选自：

-其单N-氧化物和二N-氧化物；

-其中R₂为CONHOH的衍生物；和

-其中R₃和/或R₄为羟基的衍生物。

6、药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的载体和治疗有效量的权利要求1-5中任一项的取代的萘二甲酰亚胺衍生物。

7、权利要求6的药物组合物，其还包含抗肿瘤药。

8、权利要求6或权利要求7的药物组合物，其中所述取代的萘二甲酰亚胺衍生物为N-{2-[2-(二甲基氨基)乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氢-1H-苯并[de]异喹啉-5-基}脲和/或其药学上可接受的盐和/或其代谢产物。

9、用于制备权利要求1的取代的萘二甲酰亚胺衍生物的方法，其包括水解结构式(II)的化合物的步骤

其中：

-m、n、R₁、R₃和R₄各自如权利要求1中所定义，并且

-R′为C_1-4烷氧基酰胺基羰基或C₁卤代烷基酰胺基羰基。

10、权利要求9的方法，其中所述结构式(II)的化合物为氨萘非特与C_1-4烷氧基羰基异氰酸酯或C₁卤代烷基羰基异氰酸酯反应的产物。

11、权利要求10的方法，其中所述氨萘非特与C_1-4烷氧基羰基异氰酸酯或C₁卤代烷基羰基异氰酸酯的反应是在溶剂存在和/或在低于0℃的温度下进行的，所述溶剂选自醚、酮和卤代烃。

12、权利要求10或权利要求11的方法，其中所述氨萘非特与C_1-4烷氧基羰基异氰酸酯或C₁卤代烷基羰基异氰酸酯的反应是在摩尔过量的所述C_1-4烷氧基羰基异氰酸酯或C₁卤代烷基羰基异氰酸酯存在下进行的，并且其中在所述反应完成后，通过向反应混合物加水终止反应。

13、权利要求9-12中任一项的方法，其中水解结构式(II)的化合物是在碱性条件进行的。

14、权利要求1-5中任一项的取代的萘二甲酰亚胺衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物作为药物的用途。

15、权利要求14的用途，其中所述药物用于治疗细胞增殖性病症。

16、权利要求15的用途，其中所述的细胞增殖性病症选自：白血病、肺癌、结直肠癌、中枢神经系统(CNS)癌症、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质瘤、膀胱癌、骨癌、肉瘤、头颈癌、肝癌、睾丸癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、骨髓癌、十二指肠癌、眼癌(视网膜母细胞瘤)和淋巴瘤。

17、治疗人类细胞增殖性病症的方法，其包括向所述人类给药治疗有效量的权利要求1-5中任一项的取代的萘二甲酰亚胺衍生物和/或其药学上可接受的盐和/或其溶剂合物和/或其代谢产物。

18、权利要求17的治疗细胞增殖性病症的方法，其中所述的量为0.01mg-20mg/天/kg体重。

19、权利要求17或权利要求18的治疗细胞增殖性病症的方法，其还包括给药有效量的抗肿瘤药。

20、权利要求17的治疗细胞增殖性病症的方法，其中所述的给药选自静脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、口服给药和直肠给药。

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