CN101475924A - 一种降解3-硝基甲苯的红球菌菌株及制备方法和应用 - Google Patents

一种降解3-硝基甲苯的红球菌菌株及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红球菌菌株ZWL3NT CCTCC NO：M 208206。该菌株的制备方法是：包括配制无机盐培养基、菌种富集、分离和降解菌的鉴定步骤：无机盐培养基含有Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O等成分；菌种的富集是将取样土样与无机盐培养基配制成悬浮液，将悬浮液以一定体积接种量接种到含3－硝基甲苯的新鲜无机盐培养基中，恒温，摇床培养，直到获得有显著降解性能的富集培养物；分离是利用平板培养技术，将培养物在LB培养基中分离和纯化。本发明提供的菌株可用于3－硝基甲苯的降解，降解率达99％，并且制备方法简单，操作方便。

Description

一种降解3-硝基甲苯的红球菌菌株及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种降解3-硝基甲苯的红球菌菌株及制备方法和应用。红球菌菌株ZWL3NT(Rhodococcus sp.ZWL3NT)由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期是2008年11月10日，保藏号是CCTCC NO：M208206。
背景技术
硝基甲苯类化合物包括三种异构体，即：3-硝基甲苯(3-nitrotoluene，3NT)，2-硝基甲苯(2-nitrotoluene，2NT)，4-硝基甲苯(4-nitrotoluene，4NT)。作为原材料和中间体被广泛用于生产和制造各种染料、农药、医用药品。它们在生产过程中具有多种途径进入环境成为污染物。硝基甲苯类化合物对人体的危害类似于硝基苯。能经吸入、食入和皮肤迅速吸收。对眼睛、呼吸道和皮肤有刺激作用。吸收进入体内可引起高铁血红蛋白血症，出现紫绀。严重中毒者可致死。在三种异构体中，不同的单硝基甲苯产生血液毒性的能力依下列順序递增：4-硝基甲苯，2-硝基甲苯，3-硝基甲苯。硝基芳烃中的硝基的吸电子特性和苯环结构的稳定性增加了硝基芳烃环裂解的难度，因而使这类化合物在环境中表现出生物难降解性，由此导致这类化合物在环境中长期滞留，对环境和人类健康造成威胁。因比，研究硝基甲苯类化合物的生物降解对于环境保护及人类的健康具有重要意义。
微生物对2-硝基甲苯和4-硝基甲苯化合物的降解已有报道，如2-硝基甲苯降解菌Acidovorax JS42能已2-硝基甲苯作为唯一碳源和氮源生长，完全降解2-硝基甲苯，其通过双加氧途径降解2-硝基甲苯。4-硝基甲苯降解菌Pweudomonas sp.4NT和Pseudomonasputida TW3能以4-硝基甲苯作为唯一碳源和氮源生长，完全降解4-硝基甲苯，该菌通过部分还原代谢途径降解4-硝基甲苯。目前国内外还未见纯培养微生物能完全降解3-硝基甲苯化合物的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种降解3-硝基甲苯的ZWL3NT菌株的制备方法，该方法操作简便易行。本发明的另外一个目的在于提供一种ZWL3NT菌株的应用，该菌能降解3-硝基甲苯，从而为生物治理硝基甲苯类化合物的污染提供了菌种资源。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：
本发明提供一种红球菌菌株ZWL3NT CCTCC NO：M 208206。
本发明提供了红球菌菌株ZWL3NT CCTCC NO：M 208206的用途，即：将所述菌株作为3-硝基甲苯的降解菌。
若将红球菌菌株ZWL3NT按5％接种量接种到含1mM 3-硝基甲苯的无机盐培养基中，经测定，得知：1mM 3-硝基甲苯在2天内被降解，降解率达99％，并且菌体密度O.D.600吸收值由0.1升至0.3，并伴随有亚硝酸根离子的产生。这表明ZWL3NT菌株能以3-硝基甲苯作为唯一碳源生长，并彻底降解3-硝基甲苯。
本发明提供了红球菌菌株ZWL3NT CCTCC NO：M 208206的制备方法，具体是采用包括以下步骤的方法：
a.配制无机盐培养基：
所述培养基成分为：Na2HPO4·12H2O 14.3g，KH2PO4 3.0g，MnSO4·H2O 0.28mg，FeSO4·7H2O 0.3mg，MgSO4 0.06mg，CaCL2 1mg，CuSO4 0.05mg和ZnSO4 0.05mg。
将上述成分以双蒸水定容至1000ml，调pH7.0，121℃，15磅高压灭菌30分钟。
b.菌种的富集：
从化工厂土壤中取样，将5-20克土壤加到100毫升无机盐培养基中配制成悬浮液，然后取5-10毫升土壤悬浮液接种到100毫升含1mM 3-硝基甲苯的无机盐培养基中，恒温30℃，摇床培养5-7天。取该培养物1-5毫升接种到100毫升1mM 3-硝基甲苯的无机盐培养基中，继续摇床培养，如此反复多次，直到获得有显著降解性能的富集培养物。
c.分离：在获得有显著降解性能的富集培养物后，利用平板培养技术，将培养物在LB培养基中分离和纯化，然后将分离纯化的菌种逐个接种到含3-硝基甲苯的无机盐培养基中，恒温30℃，摇床培养，通过检测培养基中3-硝基甲苯的降低以及亚硝酸根离子的产生，筛选3-硝基甲苯降解菌。
d.降解菌的鉴定：经细菌16S rDNA测序，并用NCBI的BLAST程序对该菌的16S rDNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸相似性比较，发现与之序列相似性达到98～99％的菌种是Rhodococcus sp.strain。
本发明与现有技术相比具有以下主要的优点：
其一.首次分离到能完全降解3-硝基甲苯的ZWL3NT菌株。若按5％接种量的培养物可在2天内降解1mM 3-硝基甲苯，降解率达99％。
其二.ZWL3NT菌株的分离为生物治理硝基甲苯类化合物污染提供了菌种资源。
其三.ZWL3NT菌株的分离和获得，为今后研究微生物对3-硝基甲苯的代谢途径，以及从分子生物学水平揭示3-硝基甲苯的降解途径和机理，提供了材料。
其四.ZWL3NT菌株的制备方法简单，操作方便。
附图说明
图1是1mM 3-硝基甲苯的培养液和ZWL3NT菌株混合1分钟时上清液的HPLC图。
图2是1mM 3-硝基甲苯的培养液和ZWL3NT菌株培养2天时上清液的HPLC图。
具体实施方式
本发明提供了一种红球菌ZWL3NT菌株的制法和应用，下面结合实施例及附图对其作进一步说明。
一.红球菌菌株ZWL3NT的制备方法
1.配制无机盐培养基：
成分为Na2HPO4·12H2O 14.3g，KH2PO4 3.0g，MnSO4·H2O 0.28mg，FeSO4·7H2O0.3mg，MgSO4 0.06mg，CaCL2 1mg，CuSO4 0.05mg，ZnSO4 0.05mg和H3BO3 0.05mg，将其以双蒸水定容至1000ml，调pH7.0，121℃，15磅高压灭菌30分钟。
2.降解菌的富集：
从山东华阳农药公司土壤中取样，将5-20克土壤加到100毫升无机盐培养基中配制成悬浮液，然后取5-10毫升土壤悬浮液接种到100毫升含1mM 3-硝基甲苯的无机盐培养基中，恒温30℃，摇床培养5-7天。取该培养物1-5毫升接种到100毫升1mM 3-硝基甲苯的无机盐培养基中，继续摇床培养，如此反复多次，直到获得有显著降解性能的富集培养物。
3.降解菌的分离和纯化：
在获得有显著降解性能的富集培养物后，利用平板培养技术，将培养物在LB固体培养基中分离和纯化，然后将分离纯化的菌种逐个接种到含3-硝基甲苯(1mM)的无机盐培养基中，恒温30℃，摇床培养，通过检测培养基中3-硝基甲苯的降低以及亚硝酸根离子的产生，筛选到一株3-硝基甲苯降解菌。用高效液相色谱(HPLC)检测3-硝基甲苯，用试剂1％的氨基苯磺酸和0.02％N-(1-萘)乙二胺，检测亚硝酸根离子。
4.降解菌的鉴定：
1)形态特征：菌落呈淡黄色，光滑，边缘整齐。菌体呈多形态状，革兰氏染色阳性。
2)16S rDNA测序，比对：16S rDNA为原核生物核糖体亚基16S RNA的DNA序列，在原核生物中具有较高的保守性，能够提供科、属、种等多层次的信息。
a.制备方法：
用E.Z.N.A.Bacterial DNA kit(Omega Bio-tek)制备降解细菌基因组DNA。以细菌16SrDNA通用引物1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)为扩增引物，降解细菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增降解菌的16S rDNA片段，得到1431bp序列。
b.序列比较：
用NCBI的BLAST程序对该菌的16S rDNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸相似性比较，发现与之序列相似性达到98～99％的菌种是Rhodococcus sp.strain。并且该菌好气、革兰氏阳性、多形态菌。所以鉴定该菌为红球菌属菌株(Rhodococcus sp.strain)，并命名为红球菌菌株ZWL3NT(Rhodococcus sp.ZWL3NT)。
二.红球菌菌株ZWL3NT的应用：用于降解3-硝基甲苯。
将红球菌ZWL3NT菌株按5％接种量接种到含1mM 3-硝基甲苯的无机盐培养基中，培养2天菌体密度O.D.600吸收值由0.1升至0.3，并伴随有亚硝酸根离子的产生，1mM3-硝基甲苯也被降解，降解率达99％(见图1，图2)。从图2中可看出保留时间为35.4min的3-硝基甲苯吸收峰已消失。HPLC检测条件为：色谱仪为GLSON 119 UV/VIS，色谱柱为C18反相柱(25cm×4.6mm，5μm)(Supelco)，流动相为甲醇和水，梯度洗脱，流速为1ml/min，检测波长274nm。用亚硝酸根试剂1％的氨基苯磺酸和0.02％N-(1-萘)乙二胺检测亚硝酸根，用分光光度计检测菌体浓度(O.D.600)。

Claims (4)

1.一种红球菌菌株ZWL3NT CCTCC NO：M 208206。
2.一种红球菌菌株ZWL3NT CCTCC NO：M 208206的应用，其特征是：红球菌菌株ZWL3NT作为3-硝基甲苯的降解菌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是：将红球菌菌株ZWL3NT接种到含1mM 3-硝基甲苯的无机盐培养基中，该菌株的接种量为无机盐培养基溶液的体积百分比5％，经测定，1mM 3-硝基甲苯在2天内被降解，降解率达99％，并且菌体密度O.D.600吸收值由0.1升至0.3，并伴随有亚硝酸根离子的产生。
4.一种红球菌菌株ZWL3NT CCTCC NO：M 208206的制备方法，其特征是采用包括以下步骤的方法：
a.配制无机盐培养基：
所述培养基成分为：Na2HPO4·12H2O 14.3g，KH2PO4 3.0g，MnSO4·H2O 0.28mg，FeSO4·7H2O 0.3mg，MgSO4 0.06mg，CaCL2 1mg，CuSO4 0.05mg和ZnSO4 0.05mg，
将上述成分以双蒸水定容至1000ml，调pH7.0，121℃，15磅高压灭菌30分钟；
b.菌种的富集：
从化工厂土壤中取样，将5-20克土壤加到100毫升无机盐培养基中配制成悬浮液，然后取5-10毫升土壤悬浮液接种到100毫升含1mM 3-硝基甲苯的无机盐培养基中，恒温30℃，摇床培养5-7天；取该培养物1-5毫升接种到100毫升1mM 3-硝基甲苯的无机盐培养基中，继续摇床培养，如此反复多次，直到获得有显著降解性能的富集培养物。
c.分离：
在获得有显著降解性能的富集培养物后，利用平板培养技术，将培养物在LB培养基中分离和纯化，然后将分离纯化的菌种逐个接种到含3-硝基甲苯的无机盐培养基中，恒温30℃，摇床培养，通过检测培养基中3-硝基甲苯的降低以及亚硝酸根离子的产生，筛选3-硝基甲苯降解菌；
d.降解菌的鉴定：
经细菌16S rDNA测序，并用NCBI的BLAST程序对该菌的16S rDNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸相似性比较，发现与之序列相似性达到98～99％的菌种是Rhodococcus sp.strain。
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