CN101473029A - 抗凋亡基因在用于灌注培养的哺乳动物细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过在表达重组因子VIII的细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽来阻止或延迟程序性细胞死亡，从而使得细胞中的程序性细胞死亡被阻止或延迟。本发明还涉及通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽来增加重组因子VIII的生产，从而使得经由细胞的重组因子VIII生产得到增加。用于生产因子VIII的重组细胞。
Description
本申请要求于2006年4月21日提交的美国临时申请系列号60/793,905的利益，所述临时申请的内容整体引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及作为用于改善细胞存活、细胞生理学和蛋白质生产的手段的抗凋亡基因。具体而言，本发明涉及通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽抑制分泌重组因子VIII(FVIII)的细胞系中的程序性细胞死亡。
发明背景
哺乳动物细胞培养是选择用于许多重组蛋白质生产过程的系统，这是由于其产生具有正确的翻译后修饰的蛋白质的能力。随着制造需要增加，存在改善过程效率以增加产物得率和质量的强烈兴趣。凋亡细胞死亡途径的修饰是可用于达到这个目标的一种途径。凋亡已被识别为细胞培养中的死亡的主要原因，培养损伤的结果，例如营养物和生长因子剥夺、氧耗尽、毒素积聚和切应力(Cotter和Al-Rubeai，Trends Biotechnol.13(4)：150-5，1995；Mastrangelo，等人，Biotechnol.Bioeng.67(5)：544-54，2000a；Mastrangelo，等人，Biotechnol.Bioeng.67(5)：544-54，2000b；Mercille和Massie，Cytotechnology 15(1-3)：117-28，1994；Sanfeliu和Stephanopoulos，Biotechnol.Bioeng.64(1)：46-53，1999；Lengwehasatit和Dickson，Biotechnol.Bioeng.80(7)：719-30，2002；Zanghi，等人，Biotechnol.Bioeng.64(1)：108-19，1999；Wong，等人，Biotechnol.Bioeng.94(2)：373-82，2006)。凋亡限制最大活细胞密度，促进毒性代谢物从死细胞中释放，且可能减少异源蛋白质得率(Chiang和Sisk，Biotechnol.Bioeng.91(7)：779-92，2005；Figueroa，等人，Biotechnol.Bioeng.73(3)：211-22，2001；Figueroa，等人，Metab.Eng.5(4)：230-45，2003；Figueroa，等人，Biotechnol.Bioeng.85(6)：589-600，2004；Mastrangelo，等人，2000a，b；Mercille和Massie，1999)。
为了解决这些问题，已存在研究抗凋亡基因在小规模、分批和灌注细胞培养过程中的表达的众多报道(Chiang和Sisk，2005；Mercille和Massie，1999；Kim和Lee，Biotechnol.Bioeng.71(3)：184-93，2000；Mastrangelo，等人，2000a，b；Meents，等人，Biotechnol.Bioeng.80(6)：706-16，2002；Tey，等人，J.Biotechnol.79(2)：147-59，2000a；Tey，等人，Biotechnol.Bioeng.68(1)：31-43，2000b；Vives，等人，Biotechnol.Prog.19(1)：84-9，2003)。在这些研究中的许多中，目的抗凋亡基因的表达增加暴露于毒性损伤、营养物剥夺或毒素积聚的培养物的生存力。这些研究中的几项已探究来自Bcl-2家族的抗凋亡基因的使用(Singh，等人，Biotech.Bioeng.52(1)：166-75，1996；Goswami，等人，Biotechnol.Bioeng.62(6)：632-40，1999；Tey，等人，2000a，b；Figueroa，等人，2001；Meents，等人，2002；Arden和Betenbaugh，TrendsBiotechnol.22(4)：174-80，2004；Sung，等人，Biotechnol.Prog.21(1)：50-7，2005；Sauerwald，等人，Biotechnol.Bioeng.94(2)：362-72，2006)。其他研究已探究了Bcl-2的功能病毒同源物的使用，例如腺病毒E1B-19K蛋白质(Mercille，等人，Biotechnol.Bioeng.63(5)：516-28，1999)、卡波西肉瘤相关病毒KSBcl-2蛋白质和EB病毒BHRF-1蛋白质(Vives，等人，2003)。尽管Bcl-2和E1B-19K的序列同源性限制于某些保守结构域(Chiou，等人，J.Virol.68(10)：6553-66，1994；Subramanian，等人，Oncogene 11(11)：2403-9，1995a)，但它们的功能在抑制起因于腺病毒感染和腺病毒E1A蛋白质表达的凋亡中可互换(Rao，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(16)：7742-6，1992；Chiou，等人，1994；Subramanian，等人，Cell Growth Differ.6(2)：131-7，1995b)。E1B-19K通过与促凋亡(pro-apoptotic)蛋白质Bax、Bak和Bik，以及p53肿瘤抑制蛋白结合来抑制凋亡(Boyd，等人，Oncogenell(9)：1921-8，1995；Farrow，等人，Nature 374(6524)：731-3，1995；Han，等人，Mol.Cell Biol.16(10)：5857-64，1996a；Han，等人，Genes Dev10(4)：461-77，1996b；Lomonosova，等人，Oncogene24(45)：6796-808，2005)。在p53诱导的凋亡期间，E1B-19K结合Bak且抑制Bax-Bak相互作用，从而阻止来自线粒体的促凋亡因子，细胞色素c和Smac/DIABLO的释放(Henry，等人，Oncogene 21(5)：748-60，2002)。
Aven是在酵母双杂交筛选中鉴定的抗凋亡蛋白质(Chau，等人，Mol.Cell 6(1)：31-40，2000)，其抑制胱天蛋白酶激活。外部或内部凋亡刺激后，细胞色素c从线粒体膜间间隙中释放，在其中它起始Apaf-1寡聚化，且这种结合召募且激活胱天蛋白酶-9(Saleh，等人，J.Biol.Chem.274(25)：17941-5，1999；Adams和Cory，Curr.Opin.Cell Biol.14(6)：715-20，2002)。激活的胱天蛋白酶-9进一步激活下游胱天蛋白酶，从而导致细胞降解(Wolf和Green，J.Biol.Chem.274(29)：20049-52，1999)。Aven抑制Apaf-1自缔合且因此抑制胱天蛋白酶9激活(Chau，等人，2000)。Aven与Bcl-xL结合，从而在胱天蛋白酶-1诱导的凋亡后增强Bcl-xL的抗凋亡性质(Chau，等人，2000)。此外，Aven表达增强Bcl-xL在暴露于各种凋亡损伤的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的保护作用，所述凋亡损伤包括在失效培养基中培养和血清撤除(Figueroa，等人，2004)。近来，观察到表达Aven和E1B-19K的CHO细胞生长至更高的细胞密度，存活更久，且在小规模旋转瓶(spinnerflask)中和大规模补料分批培养中产生更高水平的单克隆抗体。容量生产力中的增加主要是由于由Aven和E1B-19K表达提供的增强的细胞生存力(Figueroa，等人，Biotechnol.Bioeng.，Epub，2006)。
用于动物细胞的分批和补料分批处理的可替代培养方式是灌注培养。在灌注培养过程中，分泌重组蛋白质的细胞保留在生物反应器中，而新鲜营养培养基持续供应，且条件培养基连同目的蛋白质和代谢副产物连续取出。与其中代谢副产物的积聚和营养物的耗尽可以限制细胞培养性能的分批培养不同，灌注培养确立了允许细胞以高密度培养长时间段的稳态环境(Tolbert，等人，In Vitro 17(10)：885-90，1981；Butler，等人，J.Cell Sci.61：351-63，1983；Prior，等人，J.Parenter Sci.Technol.43(1)：15-23，1989；Ozturk，等人，Biotechnol.Bioeng.48(3)：201-206，1995；Michaels，等人，European Society for Animal CellTechnology(ESACT)Conference，1999)。然而，细胞生存力中的减少仍在灌注培养中观察到，其中凋亡被鉴定为死亡的主因，特别是在高细胞密度和低灌注率条件下(Al-Rubeai，等人，Cytotechnology 9(1-3)：85-97，1992；Mercille，等人，1994；Banik和Heath，Appl.Biochem.Biotechnol.61(3)：211-29，1996；Bierau，等人，J.Biotechnol.62(3)：195-207，1998；Thrift，等人，European Society for Animal CellTechnology(ESACT)Conference，2003)。存在通过在分泌重组蛋白质的细胞中表达抗凋亡蛋白质例如Bcl-2(Bierau，等人，1998；Fassnacht，等人，Cytotechnology30：95-105，1998；Tey，等人，Apoptosis 9(6)：843-52，2004)和E1B-19K(Mercille和Massie，Biotechnol.Bioeng.63(5)：529-43，1999)来调查灌注培养中的凋亡抑制的研究。这些报道证实与亲代细胞培养相比较，表达抗凋亡基因的细胞培养的细胞生存力中的改善和活细胞密度中的增加。然而，对比生产力的作用已是相矛盾的。Bierau等人报道在旋转滤器(spinfilter)和超声滤器灌注生物反应器中培养的Bcl-2表达杂交瘤细胞系中比单克隆抗体生产力中的减少。用在固定床反应器中培养的Bcl-2表达杂交瘤细胞系的另一项研究显示比单克隆抗体生产力中的增加(Fassnacht，等人，1999)。表达E1B-19K的NSO骨髓瘤细胞系显示更高的嵌合抗体比生产力(Mercille和Massie，1999)，但表达Bcl-2的另一种NSO细胞系呈现较低的比抗体生产力(Tey，等人，2004)。然而，这些先前研究在有限数目的稀释率上且伴随与灌注率一致改变细胞密度检查细胞生存力和生产力。在一项研究中的补料策略这样设计，从而使得细胞随着时间推移积聚，并且灌注率(培养基体积/细胞培养体积/天)相应于增高细胞密度而增加(Tey，等人，2004)。在另一项研究中，培养以恒定VVD(新鲜培养基体积/有效细胞悬浮体积/天)进行，而细胞密度在随后阶段时增至平台(Mercille和Massie，1999)。
上文描述的增加蛋白质生产力的各种方法已在不同程度上成功。然而，仍需要开发增加细胞相关产物例如重组蛋白质特别是在大规模商业生产中的生产的方法。此外，需要开发用于阻止或延迟程序性细胞死亡的方法。
发明概述
本发明的目的是提供通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽用于阻止或延迟分泌重组FVIII的细胞系中的程序性细胞死亡的方法。该方法包括在细胞中表达或诱导一种或多种抗凋亡多肽例如Aven或E1B-19K的表达，从而使得细胞中的程序性细胞死亡被阻止或延迟。
本发明的另一个目的是提供增加经由重组细胞的细胞相关产物生产的方法，所述重组细胞例如分泌重组FVIII的细胞。该方法包括在细胞中表达或诱导一种或多种抗凋亡多肽例如Aven或E1B-19K的表达，从而使得经由细胞的细胞相关产物生产得到增加。
本发明的另一目的是提供增加重组细胞例如分泌重组FVIII的细胞的生产的方法。所述方法包括在细胞中表达或诱导一种或多种抗凋亡多肽例如Aven或E1B-19K的表达，从而使得重组细胞的生产得到增加。
本发明的另一个目的是提供增加小规模、分批或灌注细胞培养过程中的重组细胞例如表达重组FVIII的细胞生产的方法。此外，本发明的目的是提供大规模生物反应器或商业生产的培养设备中的重组细胞例如例如表达重组FVIII的细胞生产的方法。本发明的另一个目的是提供增加大规模灌注细胞培养生物反应器或商业生产的灌注细胞培养设备中的重组细胞例如例如表达重组FVIII的细胞生产的方法。
本发明的另一个目的是提供用于生产细胞相关产物的重组细胞，例如分泌重组FVIII的细胞系。重组细胞表达或可以被诱导以表达至少2种抗凋亡多肽。
附图说明
图1A描述了5种E1B-19K细胞系的免疫印迹结果以证实E1B-19K表达，和6种Aven-E1B-19K细胞系以证实Aven和E1B-19K表达。
图1B描述了在摇瓶悬浮培养中以5 x 106细胞/mL接种后，与空白载体和亲代细胞系相比较，E1B-19K细胞系的生存力。每个数据点表示具有5％或更小的标准差的16细胞计数。
图1C描述了在摇瓶培养中以5 x 106细胞/mL接种后，与空白载体和亲代细胞系相比较，Aven-E1B-19K细胞系的生存力。每个数据点表示具有5％或更小的标准差的16细胞计数。
图1D描述了在摇瓶培养中以5 x 106细胞/mL接种后，E1B-19K和Aven-E1B-19K细胞系的平均生存力的比较。Aven-E1B-19K细胞系显示平均生存力中的最大改善，随后为E1B-19K细胞系，使用空白载体和亲代细胞系作为对照。
图2A描述了在摇瓶培养中以5 x 106细胞/mL接种后，在第2天时胱天蛋白酶-3激活的细胞的百分比。
图2B描述了在摇瓶培养中以5 x 106细胞/mL接种后，在第2天时膜联蛋白-V阳性细胞(膜联蛋白-V阳性7-AAD阴性)的百分比。活、凋亡和死细胞使用膜联蛋白-V和7-AAD染色进行区分。
图3A描述了在摇瓶培养中以5 x 106细胞/mL接种后，在第6天时Aven-E1B-19K细胞系的Aven表达水平和百分比生存力之间的关联。Aven表达水平由图1A中的免疫印迹进行定量。
图3B描述了在摇瓶培养中以5 x 106细胞/mL接种后，在第6天时Aven-E1B-19K和E1B-19K细胞系的E1B-19K表达水平和百分比生存力之间的关联。Aven和E1B-19K表达水平由图1A中的免疫印迹进行定量。
图3C描述了E1B-19K表达水平和百分比生存力之间的关联，类似于图2B但包括高E1B-19K表达克隆(#6，#11)。
图4A描述了未处理的、由用于递送毒胡萝卜素的相同体积的DMSO处理、或由2μM毒胡萝卜素处理的亲代、空白载体、E1B-19K#6和Aven-E1B-19K#22细胞系。评估了48小时处理后的生存力。每个值是使用相同处理的三(3)个细胞培养瓶的平均生存力。
图4B描述了未处理的、由用于递送毒胡萝卜素的相同体积的DMSO处理、或由2μM毒胡萝卜素处理的亲代、空白载体、E1B-19K#6和Aven-E1B-19K#22细胞系。评估了24小时处理后的胱天蛋白酶-3激活的细胞的百分比。
图5A描述了当在最佳条件下通过每2天传代培养且就生长率和生产力监控时的细胞系性能。细胞系的标准化生长率使用亲代细胞系的值作为100％进行计算。生长率由传代时的活细胞密度进行计算(每2天)。
图5B描述了当在最佳条件下通过每2天传代培养且就生长率和生产力监控时的细胞系性能。细胞系的标准化比生产力使用亲代细胞系的值作为100％进行计算。比生产力使用如由生色测定测量的培养物中分泌的FVIII量进行测定。
图6A描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的细胞培养时间概况。亲代培养物的活细胞密度(空心正方形)和百分比生存力(实心三角形)。
图6B描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的细胞培养时间概况。亲代培养物的胱天蛋白酶-3激活的细胞的百分比。
图6C描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的细胞培养时间概况。Aven-E1B-19K培养物的活细胞密度(空心正方形)和百分比生存力(实心三角形)。
图6D描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的细胞培养时间概况。Aven-E1B-19K培养物的胱天蛋白酶-3激活的细胞的百分比。
图7A描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。比生产力相对于0.5灌注率的亲代培养的值。
图7B描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。比生产力作为关于每种培养物的起始水平的百分比绘图。
图7C描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。生长率相对于0.5灌注率的亲代值。
图7D描述了在以灌注率中的逐步下降操作的12-L生物反应器中的亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。生长率作为起始生长率的百分比。值是由在各自的灌注率时操作的培养物的每日测量计算的平均值。
图8A描述了在灌注率：比葡萄糖消耗率中的逐步下降期间亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。
图8B描述了在灌注率：比谷氨酰胺消耗率中的逐步下降期间亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。
图8C描述了在灌注率：比乳酸生产率中的逐步下降期间亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。
图8D描述了在灌注率：比摄氧率作为起始水平的百分比中的逐步下降期间亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。
图8E描述了在生物反应器中的灌注率：葡萄糖水平中的逐步下降期间亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。
图8F描述了在生物反应器中的灌注率：谷氨酰胺水平中的逐步下降期间亲代和Aven-E1B-19K培养物之间的比较。
图9描述了以减少的灌注率运行的亲代和Aven-E1B-19K培养物的平均细胞直径。
发明详述
本发明涉及阻止或延迟重组细胞中的程序性细胞死亡。本发明提供了通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽阻止或延迟重组细胞中的程序性细胞死亡的方法。本发明还提供了通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽增加重组细胞中的细胞相关产物生产的方法。此外，本发明提供了用于生产细胞相关产物或细胞疗法的重组细胞。
本发明涉及阻止或延迟分泌重组FVIII的重组细胞中的程序性细胞死亡。本发明提供了通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽例如Aven或E1B-19K阻止或延迟分泌重组FVIII的重组细胞中的程序性细胞死亡的方法。本发明还提供了通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽例如Aven或E1B-19K增加分泌重组FVIII的重组细胞的生产的方法。此外，本发明提供了用于生产细胞相关产物或细胞疗法的重组细胞。
基因操作技术可以包括标准重组DNA技术，其中目的靶基因被整合到哺乳动物基因组或染色体外因子内，以允许整合的基因作为异源蛋白表达。本申请中描述的技术对于其凋亡在细胞培养过程中发生的哺乳动物和其他真核细胞系可以是合适的。这些细胞系可以得自诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)的来源。此种技术对于经历程序性细胞死亡且可以进行基因操作以产生目的异源蛋白的任何真核细胞可以是合适的，例如上文列出的那些。
一种或多种抗凋亡多肽在细胞中的表达可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来实现。例如，人们可以引入编码一种或多种抗凋亡多肽的一种或多种多核苷酸构建体。此种构建体可以是表达构建体，且可以包括与编码一种或多种抗凋亡多肽的多核苷酸可操作地连接的至少一种诱导型启动子。
根据本发明，可以表达一种或多种抗凋亡多肽。抗凋亡多肽包括在细胞中具有抑制或减少凋亡的活性的任何多肽。例如，抗凋亡多肽可以由异源多核苷酸编码，例如真核细胞或病毒中的基因。在一个实施方案中，抗凋亡多肽是Aven或E1B-19K。
在重组细胞中，抗凋亡多肽可以单独或与其他组合表达。例如，Aven可以单独表达或与E1B-19K共表达。一种或多种表达构建体可以用于表达2种或更多抗凋亡多肽。
本发明的重组细胞包括本领域技术人员已知且可用的任何合适的细胞。在一个实施方案中，重组细胞是幼仓鼠肾(BHK)或CHO细胞。此外，本发明的方法可以应用于大规模生物反应器或商业生产的培养设备中的重组细胞。
本发明还提供了用于生产细胞相关产物的重组细胞。这些细胞表达或可以被诱导表达一种或多种抗凋亡多肽。在一个实施方案中，这些细胞表达至少2种抗凋亡多肽。
为了使本发明更好理解，阐述下述实施例。这些实施例仅用于举例说明的目的，且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。本文提及的所有出版物整体引入本文作为参考。
实施例
检查了在被工程改造以表达单独及与Aven基因组合的E1B-19K基因的BHK生产细胞系中的FVIII表达。细胞系最初在小规模摇瓶培养中就生存力和产物得率进行分析。随后，表达Aven和E1B-19K的细胞系的行为在以一系列比灌注率(培养基体积/活细胞/天)运行的灌注培养中与亲代细胞系进行比较。活细胞密度维持在恒定水平上而比灌注率逐步减少，从允许营养物快速周转的高速率到其中营养培养基慢得多地补料和失效培养基一致地更慢地取出的低速率。评估改变灌注率对生存力、胱天蛋白酶-3激活水平、营养物消耗、代谢物生产和蛋白质生产力的作用，且将其在亲代细胞系和表达Aven和E1B-19K的细胞系之间进行比较。
灌注系统可以由用于细胞培养的生物反应器和用于细胞保留的沉积槽组成。使用倾斜沉积槽，使活细胞与条件培养基分开且返回生物反应器(Batt，等人，Biotechnol.Prog.6(6)：458-64，1990；Searles，等人，Biotechnol.Prog.10(2)：198-206，1994)。将新鲜培养基持续供应给生物反应器以维持培养体积。细胞培养物以调整的清除率取出以维持生物反应器中的细胞密度。此种生物反应器设置使得能够检查比灌注率和培养物中的凋亡之间的关联，且允许阐述在灌注策略上用抗凋亡基因的细胞工程改造的任何可能利益。
实施例1.质粒构建
载体pBUDCE4.1(pBUD)(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于Aven(SEQ ID NO：1-2)和E1B-19K(SEQ ID NO：3-6)的组成型表达。该载体设计用于2种基因的同时组成型表达，其中使用pCMV启动子和pEF-1α启动子。使用BamHI位点将Aven基因亚克隆到pBUDCE4.1载体内且通过CMV启动子进行表达。使用NotI和XhoI位点将E1B-19K基因亚克隆到相同的pBUDCE4.1载体内且通过EF-1α启动子进行表达。Aven-E1B-19K载体包含由相应启动子表达的每种基因。E1B-19K载体仅包含由EF-1α启动子表达的E1B-19K基因。空白载体指原始pBUDCE4.1载体。
实施例2.稳定细胞系的产生
表达重组FVIII的BHK-21细胞系(BHK-FVIII)用空白载体、E1B-19K载体、或Aven-E1B-19K载体进行超转染(supertransfect)，其中使用Lipofectamine Plus(Invitrogen，Carlsbad，CA)，根据制造商的说明书。稳定细胞系在补加有5％ FBS的贴壁培养中在1mg/mL Zeocin(Invitrogen)的选择下产生。分离每种构建体的约100个克隆且就FVIII表达水平(SEQ ID NO：7)进行分析。选择约25个克隆分离物，且通过免疫印迹检测Aven的表达和E1B-19K表达。基于Aven和/或E1B-19K的表达水平和FVIII生产力，使每种构建体的3-6个克隆适应在不存在Zeocin的情况下的无血清悬浮培养。来自不含抗生素培养的细胞的Aven和E1B-19K表达通过另一轮免疫印迹证实是稳定的(图1A)。
实施例3.免疫印迹分析
细胞用包含1％ NP-40、120mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.2mMPMSF和1mM EDTA的裂解缓冲液进行收集。蛋白质浓度使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)进行测定。每个泳道装载等量蛋白质。蛋白质通过凝胶电泳进行分离，转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)，并且用兔抗Aven抗体以1:1000的稀度(Chau，等人，2000)，和小鼠抗E1B-19K抗体以1:40的稀度(Calbiochem，San Diego，CA)进行免疫印迹。
实施例4.摇瓶培养分析和凋亡检测
将细胞以5 x 106细胞/mL的密度接种在摇瓶中且在维持于37℃和5％ CO2的培养箱中进行培养。培养物每24小时就生存力、胱天蛋白酶-3激活、膜联蛋白-V结合测定和营养物测量进行检查。细胞计数通过锥虫蓝排除测定使用Cedex细胞计数设备(Innovatis，Bielefeld，德国)来进行。胱天蛋白酶-3激活使用Guava PCA系统(Guava Technologies，Hayward，CA)进行检测。细胞用冷PBS进行洗涤，用Cytofix/Cytoperm溶液(BD Pharmingen，San Diego，CA)进行固定，且随后在用Guava系统分析前用PE缀合的单克隆活性胱天蛋白酶-3抗体(BD Pharmingen)进行染色。对于膜联蛋白-V结合测定，收集细胞，并且使用Guava Nexin试剂盒进行温育，且根据制造商的说明书(Guava Technologies)在GuavaPCA系统上进行分析。谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖和乳酸的水平通过YSI分析仪(YSI Life Sciences，Yellow Springs，OH)进行测量。
实施例5.FVIII定量
因子VIII使用生色测定试剂盒(Chromogenix，Milano，意大利)和凝固测定进行定量。在生色测定中，FVIII量通过因子X至因子Xa的激活的因子刺激进行定量。反应用过量提供的因子X和因子IXa来进行。激活的因子Xa切割生色底物，从而导致变色。测量在405nm处的吸光度，且FVIII活性针对标准曲线进行测量。凝固测定根据样品加入FVIII缺乏血浆后血纤蛋白凝块发展的速率来测量FVIII活性。反应通过激活部分促凝血酶原激酶试剂和CaCl2得到促进。
实施例6.生物反应器评估
2个12-L生物反应器用亲代细胞系或Aven-E1B-19K细胞系以1x106细胞/mL的密度进行接种。细胞积聚直至细胞密度达到20 x 106细胞/mL，随后通过调整细胞弃去率使细胞密度维持恒定在20 x 106细胞/mL。溶解氧浓度维持在50％空气饱和。pH控制在设定点6.8，且温度维持于35.5℃。细胞生存力、活细胞密度和细胞直径通过Cedex细胞计数设备(Innovatis，Bielefeld，德国)进行测量。谷氨酰胺、谷氨酸、葡萄糖和乳酸的水平通过YSI分析仪(YSI Life Sciences，Yellow Springs，OH)进行测量。摄氧率计算为假定为100％的在0.5灌注率时的其初始值的百分比。相对摄氧率由硅酮管和反应器中的氧分压中的差异进行测定，同时假定传质率和面积(kLa)值、反应器体积和平均活细胞密度在培养过程中保持恒定。
实施例7.在高细胞密度摇瓶培养中的细胞生存力
将表达E1B-19K的5种细胞系、表达Aven-E1B-19K的6种细胞系、空白载体细胞系和亲代细胞系以高密度(5 x 106细胞/mL)接种到摇瓶内。如图1B和1C中所示，表达E1B-19K和Aven-E1B-19K的细胞系的生存力针对对照亲代和空白载体细胞系进行比较。6天后，最佳表现的E1B-19K克隆(#6)的生存力为48％，最佳表现的Aven-E1B-19K克隆(#22)是65％活的。空白载体细胞系的生存力是12％，且亲代细胞系的那种是10％。观察到每种克隆分离物在不同时间点时的生存力测量中的一些变异性。与2种对照细胞系相比较，表达抗凋亡基因的细胞系一般维持更高的生存力。为了证实E1B-19K和Aven-E1B-19K的构建体对细胞生存力具有作用，测定细胞系的平均细胞生存力和标准差且进行绘图(图1D)。表达E1B-19K的BHK-FVIII细胞维持在第3天时超过对照平均18个百分点和在第6天时超过对照23个百分点的生存力。表达Aven和Aven-E1B-19K的BHK-FVIII细胞系的平均值呈现甚至更高的生存力水平：在第3天时超过对照平均35个百分点，和在第6天时超过对照36个百分点。相对于对照细胞系，E1B-19K的表达改善细胞生存力，以及对于以高密度接种的分批细胞培养，Aven和E1B-19K表达的组合进一步改善细胞存活。
实施例8.摇瓶培养中的凋亡
细胞就胱天蛋白酶-3激活和膜联蛋白-V表面染色进行分析以检查细胞死亡模式。胱天蛋白酶-3的激活是在凋亡级联中导致“不可恢复点”的主要事件，这导致其他胱天蛋白酶的激活(Adams，Genes Dev.17(20)：2481-95，2003；Danial和Korsmeyer，Cell116(2)：205-19，2004)。胱天蛋白酶-3激活和膜联蛋白-V测定在第2天时进行，当生存力从66％变成89％时，并且在大量死细胞变得明显前。如图2A中所示，除一种细胞系外的所有E1B-19K细胞系(#6、#8、#11、#15)和所有Aven-E1B-19K细胞系都显示比亲代或空白载体克隆更低的胱天蛋白酶-3激活细胞百分比。
在凋亡级联中的早期阶段时，磷脂酰丝氨酸从质膜的内部小叶易位至外部小叶。膜联蛋白-V对于磷脂酰丝氨酸具有高结合亲和力，且因此与凋亡细胞结合。死细胞中膜完整性的丧失暴露内部小叶中的磷脂酰丝氨酸，从而也允许膜联蛋白-V结合(Van Engeland，等人，Cytometry 31(1)：1-9，1998)。可透过膜的DNA染色剂例如7-AAD的使用区分凋亡细胞与死细胞。活、凋亡和死细胞使用膜联蛋白-V和7-AAD染色进行区分。如图2B中所示，也是7-AAD阴性的膜联蛋白-V阳性细胞的百分比在E1B-19K细胞系#6、#8、#11和#15以及所有Aven-E1B-19K细胞系中更低。与胱天蛋白酶-3测定一样，在亲代、空白载体和E1B-19K细胞系#20中发现更高百分比的膜联蛋白-V阳性/7-AAD阴性细胞。E1B-19K#20细胞系表达极低水平的E1B-19K(图1A)，但细胞生存力中的一些改善在高细胞密度培养中观察到(图1B)。与大多数E1B-19K克隆相比较，凋亡细胞的百分比在第2天时在大多数Aven-E1B-19K克隆中更低。在图1D中相对于E1B-19K克隆，凋亡细胞中的这种减少与Aven-E1B-19K克隆的生存力中的改善相关联。
实施例9.细胞生存力和表达水平之间的关联
相对表达水平Aven和E1B-19K由使用光密度计测量的免疫印迹条带强度进行评估(图1A)，且针对高细胞密度摇瓶第6天时的细胞生存力进行绘图(在图1B和1C中显示)。6种Aven-E1B-19K细胞系就细胞生存力和Aven表达之间的关联进行检查。如图3A中所示，在百分比生存力和Aven的表达水平之间无明显关联。Aven-E1B-19K细胞系#12和#22包括高生存力和更高的表达水平，但Aven-E1B-19K克隆#10具有更低的生存力，尽管Aven表达水平高。百分比生存力和E1B-19K的表达水平之间的关联显示于图3B和3C中。对于表达中等E1B-19K水平的这些细胞系，在第6天时E1B-19K表达水平与E1B-19K和Aven-E1B-19K细胞系的百分比生存力相对成比例(图3B)。发现呈现高生存力的细胞系表达增加水平的E1B-19K(Aven-E1B#22，Aven-E1B#12，E1B-19K#8)，且具有针对细胞死亡的有限保护的细胞系显示更低的表达水平。相对于具有低多倍的表达水平的克隆，具有极高表达水平的2种E1B-19K细胞系(#6和#11)在高密度细胞培养的第6天时不呈现存活中的任何显著改善(E1B-19K克隆#6，48％活的；E1B-19K克隆#11，33％活的)，且显示比表达Aven和E1B-19K的一些克隆更低的生存力(图3C)。
实施例10.由毒胡萝卜素诱导的凋亡
哺乳动物细胞中的重组FVIII已显示具有低分泌效率(Kaufman，等人，J.Biol.Chem.263(13)：6352-62，1988)。发现大多数细胞内FVIII在内质网(ER)中与伴侣蛋白复合，所述伴侣蛋白包括BiP(Dorner，等人，J.Cell.Biol.105(6Pt1)：2665-74，1987)、钙联接蛋白和钙网蛋白(Pipe，等人，J.Biol.Chem.273(14)：8537-44，1998)。毒胡萝卜素是通过抑制钙摄取到ER内破坏细胞内钙稳态的化学药品(Lytton，等人，J.Biol.Chem.266(26)：17067-71，1991)。用毒胡萝卜素处理细胞诱导ER应激和胱天蛋白酶-12激活，从而导致凋亡(Nakagawa，等人，Nature 403(6765)：98-103，2000)。
工程改造的细胞系Aven-E1B-19K#22和E1B-19K#6加上空白载体和亲代细胞系在摇瓶培养中用毒胡萝卜素进行处理。用溶于DMSO的2μM毒胡萝卜素溶液处理48小时后，对照(空白载体和亲代)显示比对于E1B-19K#6和Aven-E1B-19K#22观察到的那些低得多的生存力(图4A)。E1B-19K#6和Aven-E1B-19K#22的生存力超过85％，且2种对照生存力低于50％。作为阴性对照，未处理的细胞或用DMSO处理的那些对于任何细胞系不显示生存力中的显著丧失。为了检查凋亡诱导，胱天蛋白酶-3激活在毒胡萝卜素处理后24小时进行评估。约20％的对照细胞系显示胱天蛋白酶-3激活，且小于5％的抗凋亡工程改造细胞系显示胱天蛋白酶-3激活(图4B)。未处理的和DMSO处理的细胞显示较低水平的胱天蛋白酶-3活性，从而指出毒胡萝卜素处理负责胱天蛋白酶-3的刺激(图4B)。在24小时时间点时在生存力中不存在差异，即使胱天蛋白酶-3活性在对照细胞和表达抗凋亡基因的细胞系之间显示显著差异。
实施例11.连续传代培养中的表达
细胞系在最佳条件下进行培养以评估细胞性能。选择维持高生长率且具有可与亲代细胞系比较的比生产力的细胞系。细胞每2天在摇瓶悬浮培养中进行传代且就生长率和FVIII生产力进行监控。评估了在高细胞密度分批培养中已维持更高生存力的细胞系(Aven-E1B-19K#12、Aven-E1B-19K#22、Aven-E1B-19K#24和E1B-19K#6)。这些细胞系的生长率略微减少至亲代的81％-92％(图5A)。发现这些克隆的比生产力在亲代的83％-130％之间变动(图5B)。尽管大多数工程改造的克隆分离物具有比亲代细胞系略微更低的生产力，但在每个细胞的基础上，Aven-E1B-19K#22细胞系产生比亲代细胞系多约30％的FVIII。根据这些小规模研究，由于在对于亲代细胞系高细胞密度培养中的高生存力、略微减少的生长率(81％)和优良的生产力(130％)，选择Aven-E1B-19K细胞系#22作为最终克隆。
实施例12.关于灌注培养中的生存力和凋亡的共表达
亲代BHK-FVIII细胞系和BHK-FVIII Aven-E1B-19K#22细胞系在12-L连续灌注生物反应器中进行评估。生物反应器进行接种且细胞积聚直至达到2 x 107细胞/mL的细胞密度，在这个点上密度通过从系统中清除细胞得到维持。比灌注率最初设定为0.5ηL/细胞/天，随后以下述顺序降低：0.5、0.3、0.2和0.15，随后增回至0.5以观察细胞在以低灌注率操作后是否能够恢复。每天从生物反应器中取出样品以测定细胞生存力、凋亡状态、营养物和代谢物水平、以及FVIII浓度。其他参数包括溶解氧、温度和培养基组成保持恒定。
图6A显示活细胞密度和亲代细胞培养的生存力的时间概况。随着细胞在生物反应器中积聚，细胞密度在前7天内增加。2 x 107细胞/mL的活细胞密度在第7天时达到，在这个时间点上培养模式从细胞积聚转变成假稳态。假稳态通过以调整速率从生物反应器中放出培养物来达到，以使活细胞密度维持在2x107细胞/mL的恒定水平。在以0.5ηL/细胞/天的比灌注率的最初操作期间，生物反应器中的细胞生存力保持相对恒定在97％。在第17天时，使灌注率减少至0.3，并且亲代细胞系的生存力在这个时间段期间维持在94％-97％。当灌注率在第23天时再次降至0.2时，平均生存力在接下来以0.2灌注率的7天操作时间段内减至91％。当灌注率甚至进一步降至0.15时，生存力相对稳定地减至约80％。在第37天时，灌注率返回0.5，且在培养时间段结束时细胞生存力恢复至94％。为了检查是否存在凋亡，每天执行胱天蛋白酶-3激活测定(图6B)。胱天蛋白酶-3激活细胞的百分比在0.5的最初比灌注率期间处于基线，且在0.3的灌注率时仅略微更高。当灌注率为0.2时，百分比增至5％，这对应于平均细胞生存力从94％到91％的减少。在0.15灌注率时，在细胞生存力稳定下降的相同时间段期间，胱天蛋白酶-3激活细胞的百分比快速增加以显示超过15％的激活。执行膜联蛋白-V染色且显示与胱天蛋白酶-3激活模式相似的概况。在低灌注率时细胞生存力中的减少至少部分是由于细胞经历凋亡。
Aven-E1B-19K细胞生长至相似的细胞密度(2 x 107细胞/mL)且实施灌注率中相似的逐步下降(图6C和6D)。尽管操作条件相似，但Aven-E1B-19K培养物的生存力概况与对于亲代细胞观察到的那种相当不同。Aven-E1B-19K细胞生存力在灌注率的完整范围内保持差不多恒定在约94％时(图6C)。当灌注率减至0.15ηL/细胞/天时，未观察到生存力中的减少，与关于亲代培养物的平均80％相比较，保持恒定在约94％。因为在计划的0.15最低比灌注率时，细胞生存力对于Aven/E1B-19K细胞系不减少，所以比灌注率在第27天时从0.15进一步减至0.1，且以这种最小速率运行4天。即使在这种低灌注率下，细胞生存力在整个4天时间段内维持在94％的平均值升高。相比之下，由于来自培养物的活细胞完全丧失的危险，亲代细胞培养物的灌注不可能减少至低于0.15的水平。培养时间段自始至终也对Aven-E1B-19K培养物进行凋亡分析，且显示对于大多数培养时间段细胞维持胱天蛋白酶-3激活的基础水平(图6D)。在胱天蛋白酶-3活性细胞的百分比中存在轻微但持续的升高，对于以0.10灌注率操作的Aven-E1B-19K细胞达到2％的平均值。膜联蛋白-V阳性细胞的百分比在这些灌注率时显示相似的低激活水平。Aven-E1B-19K细胞系维持高生存力，并且即使当以显示负面影响亲代细胞系的极低比灌注率培养时也不经历显著水平的凋亡。
实施例13.关于灌注培养中的FVIII比生产力和生长率的共表达
为了比较灌注生物反应器环境中的亲代和Aven-E1B-19K#22细胞系的生产力，在不同灌注率时测量FVIII水平。在图7A中显示的是作为在0.5ηL/细胞/天灌注率时亲代对照的FVIII生产力的函数的对于2种细胞系在每个细胞的基础上的比生产力。图7B中显示的是相对于在0.5灌注率时每种培养物的100％值，伴随减少的灌注率关于每种培养物的生产力中的减少。当灌注率渐进地降低时，2种培养物显示生产力中的下降。在所有比灌注率时，Aven-E1B-19K#22细胞系的生产力更高(参见图4B)。当生产力作为起始水平的百分比进行检查时(图7B)，表达Aven和E1B-19K的效应是明显的。在灌注率从0.5减至0.3后，亲代和Aven-E1B-19K培养物的比生产力从100％降至80％。当比灌注率减至0.2和0.15时，生产力中的下降对于亲代细胞系显著更急促。亲代生产力在0.2灌注率时降至其初始值的约23％且在0.1灌注率时降至约10％，并且Aven-E1B-19K#22细胞系在那个相同时间间隔维持其起始生产力水平的56％和32％。在恢复时间段期间(在结束时的0.5灌注率)，亲代生产力仅恢复至其最初值的37％，从而反映由新鲜营养物灌注中的严重减少引起的亲代细胞性能的损伤量。相比之下，Aven-E1B-19K细胞系能够恢复至初始生产力的80％。
减少比灌注率的另一个结果是生长率的减少。图7C显示作为以0.5比灌注率运行的亲代培养物的函数绘图的细胞比生长率。图7D显示对于亲代和Aven-E1B-19K细胞系作为起始生长率的百分比的生长率。Aven-E1B-19K细胞系在0.5的灌注率时的比生长率是对于那种相同的灌注率亲代细胞系的生长率的约一半(图7C)。在灌注率下降时，亲代细胞的生长率也渐进地下降(图7D)。在灌注率中的每次减少后，亲代细胞的生长率从100％降至80％、52％和31％。生长率中的这种减少是预期的，因为较低的灌注率减少营养物可用性。当灌注率在减至0.15后增至0.5时，亲代细胞生长率处于其最高值，开始值的134％(图7D)。相比之下，在灌注率降低时，Aven-E1B-19K细胞系显示非常不同的生长率模式。在0.3、0.2、0.15的较低灌注率时，Aven-E1B-19K培养物的生长率从100％略微变成109％、84％和84％，且在0.1的灌注率时快速降至31％(图7D)。在灌注率0.15时，Aven-E1B-19K细胞系的生长率仍处于其在0.5灌注率时的值的84％，而亲代对照生长率仅为在0.5灌注率时的值的30％。当灌注率返回0.5时，Aven-E1B-19K细胞系的生长率的确再一次增加，但它的水平非常接近于其最初生长率而不是对于亲代对照观察到的那种(图7D)。
实施例14.关于灌注培养中的营养物代谢的共表达
为了检查在不同灌注率时的细胞代谢对营养物和代谢物水平的作用，每天测量生物反应器中的谷氨酰胺、葡萄糖、溶解氧和乳酸水平。比消耗和生产率(消耗或生产的营养物量/细胞/天)显示于图8A-8D中。生物反应器中的葡萄糖和谷氨酰胺水平显示于图8E和8F中。如对于生长率观察到的，伴随减少的灌注率，亲代细胞系的葡萄糖(图8A)和谷氨酰胺(图8B)消耗率趋于下降，并且随后在0.5恢复时间段期间反弹至超过初始值的水平。生物反应器中可用的葡萄糖在任一情况下都不是限制性的(图8E)；对于亲代和Aven-E1B-19K细胞系，可用的谷氨酰胺在较低的灌注率(0.3、0.2、0.15和0.1)时低(图8F)。在所有灌注率中，Aven-E1B-19K细胞系具有比亲代一致更低的比葡萄糖和谷氨酰胺消耗率(图8A和8B)。比营养物消耗率中的这种减少先前在对于表达E1B-19K(Mercille和Massie，1999)和Bcl-2(Bierau，等人，1998)的细胞系的灌注培养中已观察到。此外，与亲代相比较，在渐进地更低的灌注率时谷氨酰胺消耗的减少对于Aven-E1B-19K细胞系较不明显。Aven-E1B-19K细胞系在0.15的灌注率时的谷氨酰胺消耗水平是其在0.5时的值的24％，而亲代细胞系在0.15时的谷氨酰胺消耗是其在0.5时的值的10％。在培养结束时灌注率返回至0.5后，亲代细胞系显示葡萄糖和谷氨酰胺消耗中急速得多的增加。
比乳酸生产率对于Aven-E1B-19K细胞系更低(图8C)，这暗示与在不同灌注率时的亲代细胞系相比较，在每个细胞的基础上这些细胞产生更少的糖酵解代谢物以及消耗更少的营养物。对于亲代和Aven-E1B-19K细胞系，乳酸生产率伴随较低的灌注率减少，但下降不如对于Aven-E1B-19K细胞系的严重。与葡萄糖和谷氨酰胺消耗趋势不同，随着灌注率从0.5降至0.15，亲代细胞系的摄氧率从100％增至122％，且Aven-E1B-19K摄氧率维持相对稳定从92％到103％(图8D)。当在Aven-E1B-19K培养物中灌注率降至0.1时，摄氧率不增加。
实施例15.细胞大小
图9显示在以不同灌注率运行的生物反应器中亲代和Aven-E1B-19K细胞系的平均细胞直径。亲代细胞系的细胞大小从0.5灌注率时的17.9μm分别降至0.3、0.2和0.15灌注率时的17.7、16.6和15.8μm。这种减少与在较低的灌注率时减少的生存力关联(图6A)。细胞体积的丧失或细胞皱缩是凋亡的主要特点之一(Bortner和Cidlowski，Cell Death Differ.9(12)：1307-10，2002)；因此细胞大小中的这种减少可能涉及凋亡诱导。相比之下，Aven-E1B-19K细胞系显示细胞大小从0.5灌注率时的18.5μm分别降到0.3、0.2、0.15和0.1灌注率时的17.8、17.7、17.5和17.1μm的较小减少。当灌注率最初增至0.5时，亲代和Aven-E1B-19K细胞系的细胞直径增至起始水平或更高。
E1B-19K的表达使高细胞密度摇瓶培养中的BHK-FVIII细胞延迟经历凋亡，并且Aven和E1B-19K的共表达相对于亲代和空白载体细胞系甚至进一步增强保护。因此抗凋亡基因的表达允许在低得多的灌注率时更有效的存活和蛋白质生产。这些效应提供可以导致更强壮和生产性的细胞系用于在生物技术中的灌注细胞培养应用的利益。
在上述说明书中提及的所有出版物和专利引入本文作为参考。在不背离本发明的精神和范围的情况下，本发明描述的方法的各种修饰和改变对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管本发明已结合具体实施方案进行描述，但应当理解如要求保护的本发明不应不当地限制于此种具体实施方案。事实上，对于生物化学领域或相关领域技术人员显而易见的、用于执行本发明的上述方式的各种修饰预期在下述权利要求的范围内。本领域技术人员将认识到，或能够使用仅仅常规实验确定关于本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。此种等同方案预期由下述权利要求包含。
<110>Bayer HealthCare LLC
Johns Hopkins University
Betenbaugh，Michael J.
Murphy，John E
Thrift，John
Nivitchanyong，Tarangsri
Konstantinov，Konstantin
<120>抗凋亡基因在用于灌注培养的哺乳动物细胞中的应用
<130>MSB-7314
<150>US 60/793,905
<151>2006-04-21
<160>7
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>1089
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
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<210>2
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
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<212>DNA
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Claims (42)
1.一种用于阻止或延迟表达重组因子VIII的细胞中的程序性细胞死亡的方法，其包括在所述细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽，从而使得所述细胞中的程序性细胞死亡被阻止或延迟。
2.权利要求1的方法，其中所述一种或多种抗凋亡多肽的表达受至少一种诱导型异源启动子控制，所述诱导型异源启动子与编码所述一种或多种抗凋亡多肽的多核苷酸可操作地连接。
3.权利要求1的方法，其中所述抗凋亡多肽由真核细胞或病毒中的基因编码。
4.权利要求1的方法，其中所述抗凋亡多肽选自Aven和E1B-19K。
5.权利要求1的方法，其包括表达1种抗凋亡多肽。
6.权利要求5的方法，其中所述抗凋亡多肽是E1B-19K。
7.权利要求1的方法，其包括表达至少2种抗凋亡多肽。
8.权利要求7的方法，其中所述至少2种抗凋亡多肽包括E1B-19K和Aven。
9.权利要求1的方法，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。
10.权利要求9的方法，其中所述重组细胞选自人细胞、鼠细胞和啮齿类动物细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述重组细胞是CHO细胞。
12.权利要求10的方法，其中所述重组细胞是BHK细胞。
13.权利要求1的方法，其中所述重组细胞在小规模、分批或灌注细胞培养过程中。
14.权利要求1的方法，其中所述重组细胞在大规模生物反应器或商业生产的培养设备中。
15.权利要求14的方法，其中所述重组细胞在大规模灌注细胞培养生物反应器或商业生产的灌注细胞培养设备中。
16.一种增加经由重组细胞的因子VIII生产的方法，其包括在所述细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽，从而使得经由所述细胞的因子VIII生产得到增加。
17.权利要求16的方法，其中所述一种或多种抗凋亡多肽的表达受至少一种诱导型异源启动子控制，所述诱导型异源启动子与编码所述一种或多种抗凋亡多肽的多核苷酸可操作地连接。
18.权利要求16的方法，其中所述抗凋亡多肽由真核细胞或病毒中的基因编码。
19.权利要求16的方法，其中所述抗凋亡多肽选自Aven和E1B-19K。
20.权利要求16的方法，其包括表达1种抗凋亡多肽。
21.权利要求20的方法，其中所述抗凋亡多肽是E1B-19K。
22.权利要求16的方法，其包括表达至少2种抗凋亡多肽。
23.权利要求22的方法，其中所述至少2种抗凋亡多肽包括E1B-19K和Aven。
24.权利要求1的方法，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。
25.权利要求24的方法，其中所述重组细胞选自人细胞、鼠细胞和啮齿类动物细胞。
26.权利要求25的方法，其中所述重组细胞是CHO细胞。
27.权利要求25的方法，其中所述重组细胞是BHK细胞。
28.权利要求16的方法，其中所述重组细胞在小规模、分批或灌注细胞培养过程中。
29.权利要求16的方法，其中所述重组细胞在大规模生物反应器或商业生产的培养设备中。
30.权利要求29的方法，其中所述重组细胞在大规模灌注细胞培养生物反应器或商业生产的灌注细胞培养设备中。
31.一种增加表达重组因子VIII的细胞生产的方法，其包括在所述细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽，从而使得所述重组细胞的生产得到增加。
32.一种用于生产因子VIII的重组细胞，其表达或能够表达至少2种抗凋亡多肽。
33.权利要求32的重组细胞，其中所述抗凋亡多肽由真核细胞或病毒中的基因编码。
34.权利要求33的重组细胞，其中所述抗凋亡多肽选自Aven和E1B-19K。
35.权利要求33的重组细胞，其中所述一种或多种抗凋亡多肽的表达受至少一种诱导型异源启动子控制，所述诱导型异源启动子与编码所述一种或多种抗凋亡多肽的多核苷酸可操作地连接。
36.权利要求32的重组细胞，其中所述重组细胞是哺乳动物细胞。
37.权利要求36的重组细胞，其中所述重组细胞选自人细胞、鼠细胞和啮齿类动物细胞。
38.权利要求37的重组细胞，其中所述重组细胞是CHO细胞。
39.权利要求37的重组细胞，其中所述重组细胞是BHK细胞。
40.权利要求33的重组细胞，其中所述细胞在小规模、分批或灌注细胞培养过程中生产因子VIII。
41.权利要求33的重组细胞，其中所述细胞在大规模生物反应器或商业生产的培养设备中生产因子VIII。
42.权利要求33的重组细胞，其中所述细胞在大规模灌注细胞培养生物反应器或商业生产的灌注细胞培养设备中生产因子VIII。
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Cited By (1)
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