CN101460830A

CN101460830A - 改进的表面增强共振拉曼散射基底

Info

Publication number: CN101460830A
Application number: CNA2007800146105A
Authority: CN
Inventors: R·吉尔伯特
Original assignee: e2v Biosensors Ltd
Current assignee: e2v Biosensors Ltd
Priority date: 2006-03-27
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2009-06-17
Also published as: WO2007110614A3; EP2002242A2; JP2009531696A; AU2007231216A1; GB0705921D0; GB2436719A; GB0606088D0; WO2007110614A2; US20100240144A1; GB2436719B

Abstract

通过在由固体支承材料制成的多孔的3D支承基质之上或之内沉积拉曼增强表面来提供一种用于改进的分析物检测器的改进的SERRS基底。所述支承材料设置成具有分布在体积内的拉曼染料，且由于染料分布在体积内并接近于也分布在该体积内的拉曼增强表面，染料对照射的响应提高。

Description

改进的表面增强共振拉曼散射基底

技术领域

本发明涉及拉曼光谱学、表面增强拉曼光谱学和表面增强共振拉曼光谱学。

背景技术

已知有许多检测分析物分子的作用或存在的技术。这些技术的其中之一利用了拉曼散射(Raman scattering，RS)效应。当光线从分子散射时，大部分的光子被弹性散射。绝大多数被散射的光子具有与入射光子相同的能量(并且因此具有相同的频率和波长)。然而，该光线的小部分(约10⁷个光子中的一个)的散射频率与入射光子的频率不同。当被散射的光子损失能量给分子时，该光子具有比入射光子更长的波长(被称为斯托克斯散射(Stokesscatter))。相反地，当被散射的光子获得能量后，该光子具有较短的波长(被称为反斯托克斯散射(anti-Stokes scatter))。通常地，斯托克斯散射为较强的效应。

产生这种非弹性散射的过程被称为拉曼效应，是以在1928年第一位描述这种非弹性散射的C.V.拉曼先生命名的。非弹性散射与分子的振动、旋转或电子能的变化有关，并伴随通常作为热被散逸的能量从光子传递到分子。入射光子和拉曼散射光子间的能量差等于散射分子的振动态或电子跃迁的能量，使被散射光子与入射激光的量子化能量不同。被散射的光的强度与能量或者波长差的曲线被称为拉曼光谱，并且该技术被知悉为拉曼光谱学(RS)。

表面增强拉曼光谱(SERS)是RS分析技术的一种变体。如果分子在位置上接近于特定金属表面，由于分子和金属的表面电子(等离子激元(plasmons))之间的附加能量传递，拉曼信号的强度能够被极大地增加。为了进行SERS，所述分析物分子被吸附在含有原子级的粗糙金属表面的基底上，并检测到增强的拉曼散射。还能够使用溶液中的银胶(silver colloids)进行SERS。

数埃金属表面内的分子或离子中的拉曼散射能高于在溶液中的拉曼散射的10³-10⁶倍。在可见波长附近，SERS在银上最强，但在金和铜上易于观察。目前的研究已表示许多其它的过渡金属也可以引起有效的SERS增强。所谓的自由电子金属(free electron metals)是具有高数量自由表面电子的金属，通常提供SERS增强。此外，所谓的金属聚合物也能使用；这些是具有电子结构的有机聚合物，因而它们能够与金属以相似的方式表现。可以理解的是术语金属不限于金属元素或者金属混合物或合金，并能够用于本领域技术人员理解为金属的任何物质。提供这种SERS增强的物质此后将称作拉曼增强表面或金属。

所述SERS效应本质上是在分子和金属表面附近的电磁场之传递间的共振能。激发激光的电矢量在金属表面感应出偶极子，并且回复力造成该激发态下的共振频率的振荡电磁场。所述共振的强度和频率主要由金属(等离子激元(plasmons))表面的决定所谓等离子激元波长的自由电子，以及金属的介电常数和环境所决定。吸附或者紧邻在表面上的分子处于特大的电磁场内，该电磁场中曲面法线上的耦合的振动模式被最大地增强。这是表面等离子体共振(SPR)效应，该效应使贯穿空间(through-space)的能量在所述等离子激元和所述表面附近的分子之间传递。由于能量传递的效率依赖于激光波长和金属的等离子体波长之间良好的配合，所述表面等离子体共振效应的强度由包括入射光的波长和金属表面的形态等诸多因素决定。

场的强度和局域密度(local density)取决于一系列的参数。反射光的波长决定了它的能量，并且金属的组成和形态决定表面等离子激元耦合至光子能量的强度和效率。诸如金属和分析物溶液的相对介电性等其它因素也对该效应有较大的贡献。此外，场和与金属表面临近的任何分子之间的能量传递效率也由分子本身的共振能态决定，包括例如红外光谱区的特定振动模式和紫外光谱区的电子跃迁能。这是SERRS性能优于常规SERS的机理。能够通过使用生色团部分以提供导致能量传递的额外的分子共振来产生SERRS。

共振拉曼峰的强度与分子的散射横截面的平方成比例。反过来，散射横截面与跃迁偶极矩(transition dipole moment)的平方有关，并因此通常遵循吸收光谱。如果入射光子具有的能量接近于它们的吸收光谱的吸收峰，则当散射事件发生时，该分子更倾向于处于激发态，因此提高反斯托克斯信号的相对强度。表面和共振增强效应的结合意味着SERRS能够提供巨大的信号增强，通常为传统拉曼光谱的10⁹-10¹⁴倍。

除了拉曼散射的共振增强外，目前还存在共振削弱描述，其中所述拉曼信号的强度通过共振能量传递(resonance energy transfer)机理而被降低。在具体条件下，具有接近所需的能量的激发能态能够引起拉曼散射的下降。在这种情况下，拉曼强度与总的截面的平方成比例，并且如果这些截面异号则能发生相消干扰，使得能够观察到共振削弱。这提供了另一种拉曼基检测器系统中使用的度量(metric)：通过使用促进这种削弱效应的激光频率可以将来自特定拉曼活性的生色团的信号选择性地从拉曼光谱中去除。

表面增强拉曼光谱学(SERS)及其扩展、表面增强共振拉曼光谱学(SERRS)作为定量生物分析工具而得到普及。这两种技术都在很大程度上依赖于在金属(等离子激元)表面的移动传导电子的‘等离子体’和接近该表面的分子种类之间的相互作用。这种相互作用导致特定振动能量下的拉曼散射大幅度增强，在拉曼散射光下产生出强烈的光谱信号。

迄今为止，围绕对这种增强的机理的理解还存在有争议。两种主要观点对大于10⁶的增强因素在化学增强机理和电磁增强机理之间的划分存在分歧。现在被认为促进了10²的增强因素的化学增强机理，声称在金属和被吸附分子之间产生了电荷迁移态。这种机理依赖于位点特异性和分析物。所述分子必须被直接吸附在表面上以进行化学增强。所述电磁增强机理促进了高于正常拉曼散射10⁴倍的增强。为了理解电磁增强，必须考虑到表面纳米级粗糙特征的大小、形状及其材料。如果波长合适的光冲击金属的粗糙特征，传导电子的等离子体将共同振荡。因为这种共同振荡被局限在电子等离子体的表面上，已作为局域表面等离子体共振(LSPR)而被知晓。所述LSPR使得共振波长被吸收和分散，在粗糙特征周围产生大型电磁场。若分子被置于该电磁场内，可以测量到增强的拉曼信号。

我们已经意识到拉曼散射效应中的问题：与常规散射(事实上是对噪声比率的弱信号(poor signal))相比，即使采用表面增强拉曼散射(SERS)，拉曼散射也提供小量的拉曼散射辐射。我们更进一步地意识到，由于拉曼信号弱于噪音，需要引入帮助区分拉曼信号和噪音的机理。

我们还意识到，缩短分析物分子的扩散程长度可以对生物传感器实验的速度产生巨大的影响。因此，广义地说，本发明提供使用光谱学技术缩短待检测样品的扩散程长度的装置(arrangement)。

发明内容

本发明在权利要求书中被定义，所述权利要求书被直接引用于此。

本发明的一种实施方式提供了位于通过在由固体支承材料制成的多孔3D支承基质之上或之内沉积拉曼增强表面而形成的反应区内的具有拉曼增强体积(Raman enhancing volume)的改进的分析物检测器。所述支承材料设置成具有分布在该体积内的染料，并且由于染料分布在该体积内并接近也分布在该体积内的拉曼增强表面，染料对照射的响应被提高。

用于分析物检测器的反应载体可以根据本发明制得，测试样品引入到所述反应载体内，所述反应载体具有设置以限定体积的固体支承材料和分布并固定在该体积内的金属/拉曼增强表面。所述金属负载在支承材料上，所述支承材料对使得分析物被检测的染料为多孔的。所述金属被设置成提高染料对照射的光学响应。

尽管本发明所述的实施方式提到对拉曼信号提供的改进及其在拉曼光谱学(特别是SERS和SERRS)中的应用，但应该理解的是，本发明可以用于各种形式的其中可以通过使用例如用以提高染料对照射的响应的金属表面而获得信号强度改进的光谱学中。例如，这可以包括表面吸收荧光(surfaceabsorption fluorescence)或对任何涉及共振能传递给金属表面的对照射的响应。

术语生色团已为本领域技术人员所公知，并在此用于覆盖具有特定光学特性的基团。术语“染料”涉及能发射拉曼射线并且还具有某种官能度如结合基团或亲表面基团(surface-seeking group)的生色团。这种官能度可以由例如加入亲金属表面基团(metal surface seeking group)或能够连接至分析物的基团而产生。所述生色团应该有力地吸附具有适于表面增强的波长的激发激光(最普遍的拉曼激光为514纳米、532纳米和785纳米)。这在绿-红可见范围内，因此传统的色彩明亮的生色团作为特别良好的拉曼活性染料的成分而被发现。

分析物为任何需要检测或量化的化学物质。合适的分析物的例子包括：生物分子(例如蛋白质、抗体、核酸、碳水化合物、蛋白多糖、脂质或荷尔蒙)、药物制剂或其它治疗剂以及它们的代谢产物、滥用药品(drugs of abuse)(例如苯丙胺、阿片、苯二氮类、巴比妥、大麻素、可卡因、麦角酰二乙胺以及它们的代谢产物)、炸药(例如硝化甘油和硝基甲苯，包括三硝基甲苯(TNT)、三次甲基三硝基胺(RDX)、季戊四醇四硝酸酯(PETN)和环四甲撑四硝胺(HMX))、以及环境污染物(例如除草剂、杀虫剂)。

分析物样品为任何需要测定存在或含量的分析物的样品。有许多需要测定分析物存在、不存在或含量的情况。例子包括临床应用(例如检测例如血样或者尿样等生物样品中抗原或抗体的存在)、检测滥用药品的存在(例如在违禁样品中，或在例如体液样品或呼吸样品等生物样品中)、检测炸药、或检测环境污染物(例如在液体、空气、土壤或植物样品中)。

除了直接检测分析物本身以外，还可以通过使用报告分子(reportmolecules)间接地检测分析物，所述报告分子在目标分析物存在下能够产生可测拉曼信号变化。该方法的一个例子将是染料标记的肽从分析物-特定抗体的抗原结合位点上的置换，因此释放出能随后与SERRS活性金属表面发生相互作用的自由报告分子。对于本发明的目的，这种报告分子也可以视为“分析物”。

典型的报告分子将包括报告染料、筛选剂结合基团(selective agentbinding group)以及金属表面结合基团。报告分子与筛选剂相结合(通过筛选剂结合基团的方式)，并且在分析物样品被引入载体之前，报告染料因此被保持远离金属表面。分析物与筛选剂的结合置换报告分子，所述报告分子随后与金属表面结合(通过金属表面结合基团的方式)，因此导致报告染料向金属表面附近的区域移动。如上所述的术语“染料”与报告分子等价使用。

所述筛选剂为在分析物样品的其它组分存在下，并且在检测方法进行的条件下，选择性地结合至分析物，从而能够检测到所述样品中分析物的存在(或含量)的任何试剂。所述筛选剂的性质将当然地依赖于分析物的特性。在多数情况下，所述筛选剂为抗体。然而，可以使用其它合适的分析物结合对。例如，如果所述分析物为抗体，所述筛选剂可以为被抗体选择性地结合的抗原或抗原衍生物。若所述分析物为核酸，则所述筛选剂可以为与该分析物核酸杂交的核酸或核酸类似物。

在引入分析物时，染料不需要与筛选剂分离。相反，在结合分析物时，筛选剂可以改变构型，从而染料移入与金属更接近的新位点，由此导致拉曼信号的增强。也可能染料最初被保持在与金属表面足够接近的位置，以产生SERRS信号，但该染料在待检测分析物的存在下被置换，例如，通过结合筛选剂和从接近金属表面的位置置换染料。在这种情况下，正是寻找拉曼辐射的减弱而不是寻找所发射的拉曼辐射增强，使得不存在、存在或含量被检测到。

分析物本身可以为本征拉曼活性的(intrinsically Raman-active)。在这些实施方式中，染料可能与分析物化学相同，这样可以根据其拉曼信号而直接确定分析物的存在、不存在或含量。因此，术语“染料”也可以包括分析物。

术语“抗体”被应用于此以包括抗体、或片段(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、F(ab’)2片段、单链Fv分子或CDR区)、或能选择性地结合分析物以检测到该分析物的抗体或片段的衍生物。

通常地，希望染料的组分能通过分离的连接子被连接在一起。对本领域技术人员显然的是，有许多可以使用的合适的连接子。所述连接子的特性将依赖于所述染料组分的特性。若所述连接子与传统的肽链化学相容，则当所述筛选剂结合基团含有肽时是有利的。例如，所述连接子可以优选含有单个羧酸基团以与肽的N末端反应。

在某些情况下，依赖于所使用的特定组分，例如通过染料的不同组分的化学基团之间的反应，可以不使用分离的连接子就可能可以将两种或更多的染料组分连接在一起。

所述染料组分可以以任何顺序被连接在一起，如果当所述染料通过金属表面结合基团被连接到表面上时，则该染料在靠近所述金属表面的区域内。

染料中的金属表面结合基团应该为优先结合(典型地通过吸附)至金属表面上的基团。在某些情况下，希望金属表面结合基团足够有力地结合至金属表面以将所述染料固定在金属表面。所述金属表面结合基团的化学性质将依赖于所使用的金属表面。合适的银结合官能团包括具有氮杂环的基团，例如噁唑、噻唑、二唑、三唑、噁二唑、噻二唑、噁三唑(oxathiazoles)、噻三唑、苯并三唑、四唑、苯并咪唑、吲唑、异吲唑、苯并二唑或苯并异二唑。其它合适的官能团包括胺、酰胺、巯基、硫酸盐(或酯)、硫代硫酸盐(或酯)、磷酸盐(或酯)、硫代磷酸酯(或酯)、羟基、羰基、羧酸盐(或酯)、和硫代氨基甲酸酯(或酯)。氨基酸例如半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或精氨酸也能进行银结合。

术语反应载体用于定义待检测分析物被引入和支撑材料所位于的容器。

附图说明

本发明的实施方式将仅通过实施例的方式，并结合附图进行说明，其中：

图1示出了常规的微观流体SER(R)S传感器；

图2示出了各种蛋白质的斯托克斯半径对分子量的曲线；

图3示出了各种蛋白质的计算扩散系数对分子量的曲线；

图4示出了已知生物传感器模型的图示；

图5示出了用于计算在图4所示的生物传感器模型的各个深度的分析物浓度的曲线；

图6示出了腔高度与分析物结合99％的结合对发生的时间的曲线；

图7示出了对于不同的腔高度，对典型的100kDa蛋白质1小时期间内的计算结合量；

图8示出了体现本发明的微观流体SER(R)S传感器；

图9示出了能够用于图8所示的本发明的实施方式的聚焦到镜子(左边)上和体积(右边)内的激光的聚焦特性；

图10示出了滤光玻璃料(filter frit)形式的有细密纹理的三维支承基质；

图11示出了能够以例如图8所示的本发明的实施方式使用的涂敷有金属银颗粒的滤光玻璃料的二氧化硅细粒；

图12以图示的方式示出了涂敷有金属银颗粒的图11的滤光玻璃料的二氧化硅细粒；

图13示出了通过根据本发明的一方面的第一沉积方法形成的包括丝条状的沉积银的形态；

图14示出了沉积银的第二形态；

图15示出了通过根据本发明的另一方面的第二沉积方法获得的每单位面积增加的银沉积数量；

图16示出了通过两种沉积方法叠加在一起获得的银颗粒大小的曲线；

图17示出了使用两种不同方法在例如图11中所示的二氧化硅滤光器上制备的粒子的示例SERRS谱；

图18示出了大小为约80-120微米的可控孔度玻璃(controlled pore glass，CPG)粒子；

图19示出了单控孔度玻璃粒子的表面的关闭状态；

图20示出了在比图19更高的放大倍数下的单控孔度玻璃粒子的表面的关闭状态，显示的孔隙尺寸为约200-500纳米；

图21示出了金属粒子可以被沉积在图20所示的孔隙内；

图22示出了由指定大小和形状的粒子覆盖的表面的紫外/可见吸光度轮廓；

图23示出了λ_max的计算值对测量值的曲线；以及

图24示出了各种宽度和高度下的银颗粒的λ_max预测值；

图25示出了对于指定辐射波长的根据本发明的实施方式的支承材料的吸光度与理论值的比较；

图26示出了图25的用于理论计算的另一种方式的曲线。

具体实施方式

下面描述的实施方式特征为用于光谱法的改进的基底。本发明使用分布在有细密纹理的三维支承材料内的金属来制备具有用于SERS和SERRS的光学特征的基底。使金属在位置上更靠近溶液中的分析物分子，这缩短了扩散程长度并实现减少分析时间和增加可达到指定体积溶液中的分析物分子的可得金属表面积。此外，拉曼照射激光取样3D空间，而不是2D表面，这不仅对信号强度有利，而且对处理工程问题例如聚焦有利。此外，由于这是支承材料的性质而不是反应载体的尺寸，因此对支承生物传感器芯片的工程技术限制也能得到一些放松，这对传感器性能有最大的影响。

本发明的实施方式通过将部分金属化学沉积到支承材料内而得以实现。由此可以实现多方面的好处，包括提高灵敏性、延长对光不安的生色团的稳定性以及大量缩短实验时间。作为优选的特征，沉积在支承材料内以形成拉曼增强表面的金属部分为银。支承材料为固体，例如二氧化硅滤光器(silicafilter)形式，但这不是必须的，支承材料可以为例如粉末或玻璃珠形式。对支承材料的主要要求是它使拉曼增强表面保持固定在反应载体内。

现在描述使用银沉积化学制备改进的基底的方法，并且该方法基于由德国化学家伯恩翰德托伦斯(Bemhand Tollens)(1841-1918)开发并且至今以他命名的碳水化合物分析测试。本领域技术人员能够理解的是，这不是将金属沉积到表面的唯一的方法，其它方法也在本发明的范围内。本领域技术人员将进一步理解的是，虽然银在光谱学中表现出许多用作拉曼增强表面所需的特征，但其它物质例如金和铜也能使用。可以推断这些金属的组合也能有利地灵活用于本发明并在下面进行讨论。

托伦斯反应(Tollen’s reaction)为多步法，包括由醛到羧酸的氧化反应，由水性银离子到金属的还原反应。首先，通过与氢氧化钠的反应由硝酸银制备氢氧化银：

氢氧化物形成棕黑色沉淀，该棕黑色沉淀通常也含有氧化银。加入氢氧化铵制备银二胺络合物(silver diamine complex)作为无色溶液：

该二胺络合物在水溶液中稳定，可以储存至需要使用时。通过加入醛引发银沉积过程。醛与羟基离子(hydroxylion)在碱性溶液中反应，使得醛被氧化成羧酸，并释放出两个电子：

醛可以来源于许多来源。在传统的托伦斯反应中，使用葡萄糖溶液。像大多数糖一样，葡萄糖能够以闭环或开环形式存在。在水溶液中，这两种形式保持平衡：

通过醛的氧化反应释放的电子随后能各自将银二胺络合物还原成金属银和游离氨：

该氧化-还原反应可以被概括成：

被还原的银原子在水溶液中不稳定，并快速结合形成金属银。如果可以获得合适的固体表面，则金属将形成于该表面和溶液之间的界面。在传统的糖的托伦斯测试中，使用干净的玻璃表面，并且几分钟内银形成汇合的像镜面一样的膜。

取决于具体的反应条件和可获得的支承材料的性质，拉曼增强表面(优选银)可以形成微米至纳米级粒子的悬浮液、粒子束，并且粒子沉积在支承材料上和支承材料中存在的任何孔隙内。所述反应条件取决于待检测分析物。

上述方法仅仅是根据本发明的制备支承材料的一种方法。其它方法包括例如将银胶固定在支承结构之上或之内的方法也能使用。

优选所述支承材料选择为具有玻璃光学性质的、有细密纹理的多孔三维支承基体。例如，所述支承材料可以为填充了部分反应载体的玻璃珠形式。尤其是，所述支承材料不应当是荧光的(这将对拉曼光谱产生不可接受的背景干扰)，是理想的生物相容性非常好的材料，并且本身不应当产生实质的拉曼信号或者至少在染料的拉曼响应频率范围内本身不应当产生实质的拉曼信号，以免使染料的拉曼信号变得不清晰。对于上述目的，二氧化硅是理想的，但是应当理解的是，具有类似性质的其它材料也能使用，并且也不背离本发明的范围。可以用于形成支承材料的其它材料的例子包括陶瓷、塑料或气凝胶。

所述支承材料限定了银颗粒可以分布的体积。在一种实施方式中，所述银颗粒沉积在含有支承材料的各基底粒子的外面。这种实施方式的例子可以参见图11和12，在图11和12中，限定体积的二氧化硅基底粒子上沉积有银颗粒。这意味着银颗粒出现在含有支承材料的粒子之间的孔隙(111，121)内。进一步的例子是由玻璃珠堆组成的其上沉积有银的支承材料。相邻玻璃珠之间或基底粒子之间的缝隙或孔隙导致支承材料为多孔的，并在整个支承材料上固定有银颗粒。

下面将描述另一种实施方式，其中含有支承材料的基底粒子本身对染料为多孔的，且它们的内部结构中沉积有银颗粒。

3D多孔材料例如二氧化硅提供与扁平表面相比具有大得多的内表面积的体积，因此对分子吸附有大得多的可得表面。入射激光也不是照射平面点，而是照射材料内的体积，由此进一步增加了拉曼激光探测到(interrogate)的表面积。这两个因素都导致照射光束内SERRS活性分子数量的大量增加，结果导致信号强度的提高。

图8示出了体现本发明的微观流体SER(R)S检测器装置。所述检测器装置包括含有染料的反应载体、激光形式的照射源以及检测器。其内沉积有金属粒子的3D多孔材料如二氧化硅设置在反应载体内。由于激光探测的是体积而不是平面，因此精确聚焦到样品上变得更不重要。事实上，如图9所示，因为激光的光束聚焦成锥形、穿过焦点并且随后扩展成超过该点的锥形，因此焦点前后的分子立即处于相对强的电磁场中。在理想的情况下，当焦点在基质内时，位于强场的分子的数量是焦点位于平面时的两倍，因此，拉曼信号得以成倍增强。

平的金属表面可以起镜子的作用，在这种情况下，焦点前面的分子将处于增强的EM场(来自入射光束及其反射光束)中。在光束干扰积极(constructively)处，分子将处于强度加倍的场内。由于拉曼强度与场强度的平方成比例，双倍增强的场内的分子将发射四倍的拉曼信号。然而，一半的分子将位于场被消极性干扰的区域，因此对拉曼信号没有任何贡献。总的来说，拉曼散射强度将因此为没有反射表面时的两倍。然而，该信号来源于双倍增强的场内的分子，因此分子将最终以更高的速率光降解(photodegrade)。当由于光子引发激发和随后的共价修饰(covalentmodification)而导致生色团永久性破坏时，光降解发生。当从激发单重态向激发三重态跃迁时，生色团更可能与另一个分子发生相互作用，以产生不可逆共价修饰。三重态相对于单重态寿命更长，因此允许激发分子有长得多的时间帧，以进行与环境中其它组分的化学反应。对于指定的表面积，基质内聚焦装置因此能够产生与反射表面相同的拉曼信号强度，但却赋予了生色团光降解速率降低的优点。如果表面不反射，基质装置将提供增强的信号。

有细密纹理的三维支承基质可以为二氧化硅滤光玻璃料(如图10中的横截面所示)的形式，该二氧化硅滤光玻璃料具有多孔结构，在圆形二氧化硅细粒之间具有几十微米的孔隙。当用作用于化学沉积银的支承表面时，二氧化硅细粒涂敷有金属银颗粒，如图11和图12的图解所示。

典型地，基质孔隙111/121可以为约50-80微米跨度，导致扩散程为25-40微米。对于典型的100kDa蛋白质分析物，这将导致约30秒内99％结合。由于不严格的激光聚焦的需要，3D基质赋予了微观流体体系的反应速度优点，但同时能够使得检测体积为毫米级或更大。

沉积的金属部分有两种形态。第一种形式包括图13所示的丝条状，它们是直径为约250纳米的约球形粒子的熔融直链(fused linear chain)。这些丝线被第二种形式的更小的独立的粒子包围，这些粒子的大小为几十至几百纳米，如图14所示。应当理解的是，由不同方法形成的其它的形态也能起作用。

图14示出了直径为约12纳米至约220纳米的510个约球形银颗粒。制备这些沉积物所需的方法包括将滤光玻璃料完全浸没在托伦斯反应混合物中。

如果允许玻璃料漂浮在反应混合物的表面上，则银颗粒以图15所示的大得多的单位面积密度沉积。虽然图15示出了更高的粒子表面密度(图15为976，而图14为510)，但它们具有与通过完全淹没滤光玻璃料制得的银颗粒非常相似的大小分布，这通过将粒子大小分布重叠在一起绘制可以发现(图16)。滤光玻璃料的部分淹没产生几乎两倍于方法1的单位表面积的粒子，并因此提供更强的拉曼信号。

在二氧化硅滤光器上使用两种方法和在扁平表面上制得的粒子的示例SERRS谱如图17所示。在各种情况下，以10^-5M的浓度使用相同的SERRS活性化合物，积分时间为1秒。滤光法1指玻璃料被完全浸没在反应混合物中的情况；方法2指允许玻璃料漂浮在表面的情况。

虽然通过使用漂浮玻璃料制得的表面上的银颗粒的数量为方法1的约2倍，但SERRS信号比方法1的强约3倍。这是因为信号强度不是线性依赖于表面的粒子数量。由于粒子遵循相同的大小分布，因此不成比例增强的SERRS信号不能简单地归因于可得银表面的增加，而必然具有由粒子之间的相互作用所引起的额外贡献，更高的堆集密度导致额外的SERRS增强。一般被接受的是，通过由它们之间的传导电子的同步运动(synchronisedmotion)产生的电磁场，粒子相互作用，并且这种相互作用依赖于粒子之间的距离。

在本发明的另一种实施方式中，即使进一步通过在含有支承材料本身的基底粒子的结构内沉积银颗粒，也可能缩短分析物分子的平均扩散程长度。如果支承材料为多孔的则可以实现缩短分析物分子的平均扩散程长度。在这种情况下，术语多孔的指含有孔的材料，所述孔的大小使得形成该材料的粒子对用于检测分析物的染料为多孔的。在该实施方式中，支承材料本身的基底粒子具有孔隙或孔，导致完全可进入的内部结构。

由微孔粒子制得的支承材料的好的例子是可控孔度玻璃(CPG)，并可以由二氧化硅形成。微孔指孔的尺寸为几微米级或几十微米级的事实。制备CPG的一种方法是通过酸蚀玻璃混合物，所述玻璃混合物中的一种玻璃易被酸腐蚀，而另一种则不易被被酸腐蚀。结果是特征为完全可进入内部结构的玻璃/二氧化硅材料，单个的二氧化硅颗粒具有纳米级用于增加吸附银颗粒的可得内部表面积的孔隙。这种材料的例子如图18-21所示。

图18示出了其中单个粒子可见的CPG的放大图。图19示出了单个细粒的表面，揭示了表面由许多互相连接的孔隙做为标记，提供了完全可进入的内部结构。图20示出了能辨认出孔隙的尺寸(在这种情况下为几百纳米)的更大倍数的CPG粒子表面的放大图，图21示出了金属粒子可以沉积在这些孔隙内。适合用于例如CPG的材料的金属粒子的典型大小为约50-150纳米。

CPG被广泛用作化学合成的支承基质。可以获得粒子大小(CPG通常处理为粒子粉末)、孔隙大小(一般从约100纳米至约1微米)和表面衍生(许多官能团，以有利于与表面的化学连接)不同的多个级别的CPG。由于具有大的内表面积(高达100平方米/克或更高)、化学惰性(除非衍生化以提高其金属结合力或粒子结粒性质(particle seeding properties))且不产生实质的拉曼峰导致光谱干扰，CPG特别适合作为生物传感器支承基质。

孔隙应该足够大，以供染料进入和容纳金属部分/粒子。典型的染料的大小为约1-5纳米，分析物的大小为5-100纳米。当使用大小为约50纳米的金属粒子时，这意味着孔隙大小也应当在约150纳米或更大。

作为例子，制备银基基底的一种方法是在CPG存在下进行托伦斯反应。用醛、醇或羧酸酯(或盐)基团的CPG的表面衍生化特别适合于这种方法。

在本发明的所有实施方式中，支承材料可以为对待检测分析物为多孔的，检测化学(例如报告分子或染料被分析物置换)发生在支承结构本身内。然而，本发明并不是必须如此。取决于待检测的分析物，支承材料可以仅仅对染料为多孔的，而对样品中的分析物或其它物质不是多孔的。其它物质可以包括样品内的不希望检测的任何物质，或者希望保持远离照射部分的物质。例子可以包括血细胞或可以使拉曼信号失真的化学物质。分析物可以在支承材料的外表面置换染料，并且该染料随后扩散到支承材料内以与拉曼增强金属粒子发生相互作用。对于支承材料的最低要求是对染料为多孔的。此外，基底粒子可以为对染料为多孔的但对分析物样品中的其它物质不是多孔的。分析物可以在支承材料的外表面或支承材料内但在基底粒子外部置换染料，并且随后染料扩散到基底粒子内以与拉曼增强金属粒子发生相互作用。

在支承结构或基底粒子仅对染料为多孔的时，分析物可以在支承材料或基底粒子外表面置换来自筛选剂的染料。该染料随后将扩散到支承材料或基底粒子内，以与分布在其中的银颗粒发生相互作用。当然，在其中分析物也是染料本身的情况下，不需要单独的染料，且支承材料或基底粒子将对分析物本身是多孔的。当引入到反应载体中时，分析物将扩散到支承材料或基底粒子内，并与银颗粒发生相互作用。

支承材料或基底粒子的孔/孔隙的大小控制拉曼增强粒子在整个支承材料内的分布以及染料必须经过以与拉曼增强表面发生相互作用的距离。结果，整个支承结构的孔隙/孔的大小应该与所用染料的平均自由程具有相同的数量级。所需的大小可以从图3所示由扩散系数确定。

作为优选特征，拉曼增强粒子在孔隙内的分布应当为使相邻金属粒子之间的距离与拉曼响应待检测的染料的平均自由程为相同的数量级。

当使用例如CPG的材料时，由于具有大的内表面，分子必须扩散以与金属粒子发生相互作用的距离可能大，因为粒子内的孔可以从100纳米至10000纳米。当使用诸如结晶或沉积的方法将金属沉积在这种结构内时，金属粒子的分布遵循径向分布函数。在该结构的更内部存在更少的与染料发生相互作用的金属粒子。然而，染料也以相同的方式扩散，并且因此大部分染料分子将在高浓度金属粒子的区域发现。

根据本发明的3D多孔支承材料在被激光照射时经历两级共振。首先是由各个金属粒子经历的表面等离子激元共振。此外，还有来自于基本上为置于介电介质(样品和支承材料)内的金属的更大规模的共振。该第二共振水平与光子学晶体结构内的共振相同，然而，支承结构内的金属粒子的总的分散是不均匀的，因此很难直接相比。

具有金属分布和固定在其中的支承结构如负载有银的CPG在合理的近似值(仅为计算目的)上可以视为等于物理固定的胶态分散。孔隙内的CPG和样品溶液接近介电介质，使沿CPG内孔隙的壁排列的金属纳米粒子等价于悬浮液中的胶粒。孔隙的尺寸和孔隙壁上的纳米粒子的空间分散决定胶体类似物的“浓度”。

胶粒的光学性质已经被广泛研究。胶体的吸收光谱可以根据全米氏理论(Mie theory)计算。对于小的球形粒子，每单位体积N个粒子的分散的吸光度A仅取决于Mie求和中的偶极项，并可计算为

A = \frac{CNl}{2.303}

其中，C和I分别为吸收横截面积和光路长度。如果粒子尺寸小于传导电子的平均自由程，则这些电子将与粒子壁发生“碰撞”，导致比块体材料内更低的有效平均自由程。

在极限2πR<λ(其中R为粒子半径，λ为周围介质中的光的波长)中，横截面积可以表达为

C = \frac{18 π {Vϵ}_{2} (ω) ϵ_{m}^{3 / 2}}{λ [{(ϵ_{1} (ω) + 2 ϵ_{m})}^{2} + ϵ_{2} {(ω)}^{2}]}

其中V为球形粒子的体积，λ为入射波长(相应于频率ω)且ε_m为介质的介电常数。块体金属(bulk metal)的相对复介电常数由

ε(ω)＝ε₁(ω)+iε₂(ω)

给出。

对于自由电子金属如银，ε₁(ω)和ε₂(ω)经常为已知，在一定波长范围内的已通过实验确定了。从上述方程式可以看出，当ε₁(ω)＝-2ε_m时，出现最大吸光度。当ε₁(ω)＝-2ε_m时，ε₂(ω)的值以及ε₁(ω)随波长的变化率是确定所得吸收谱带的高度和宽度的因子。

对于具有可以与传导电子(L)的平均自由程相比的大小的金属粒子，自由电子和粒子壁之间的碰撞速率变得可测量了。电子部分被有效抑制，导致金属介电性质发生变化。为了说明这种表面效应，介电函数的虚数部分的计算需要加入第二项：

ϵ_{2'} (ω) = ϵ_{2} (ω) + \frac{L}{R}

其中ε_2’(ω)是用于修正小粒子的介电参数。

如前所述，可以分布在本发明所提供的支承材料之上和之内的典型银颗粒的直径为几十纳米。在银中，电子的平均自由程L通常可接受的值为约57nm。用于银、玻璃和水(非常接近样品的近似值)的复介电函数的波长相关值(wavelength-dependent values)在本领域是公知的。使用这些数据，可以预知负载银的CPG的紫外/可见吸收光谱。

在图25中可以看到理论结果和实验结果之间的比较，但是在短波长的实验吸光度比预测的低。这个差别可以通过减去下面公式的高斯函数很容易地被修正。

f (x) = a e^{\frac{- {(λ - b)}^{2}}{c^{2}}}

如下所示，发现与实验数据的最佳匹配a＝7×10^-6，b＝3.34×10^-7和c＝3.5×10^-8。

参数a只是比例因子。参数b和c各自确定高斯峰的位置和宽度。减去这个高斯具有将‘凹口’滤光器应用到光学光谱的效果。如果负载银的CPG与排除了约334nm处的带隙的光子学晶体表现相似行为，这个效果可以被有理化。使用标称波长532nm(真空中)的激光收集该实验数据。标称波长与视波长(apparent wavelength)之比(532/334)给出了负载银的CPG‘光子学晶体’1.593的有效折射率。玻璃、水和银在该标称波长的折射系数分别为约1.520、1.336和0.002。因此，负载银的CPG表现为具有不同于其组成材料的性能的超材料(metamaterial)。

CPG内银颗粒的几何分散不是规则的晶格，因此不必适用常规的描述光子学晶体的理论。然而，存在一定程度的粒子分散的局部规则性，主要由CPG结构内的孔隙大小和内孔隙间距决定。由于粒子不是被均匀的介电介质分开、而是被填充了样品(具有未确定介电性质的至少含有待检测染料和可能的分析物的稀水溶液以及其它不被检测的其它化学物质)以及在这种情况下含有玻璃的内孔隙材料的孔隙的组合分开的事实，情况变得更复杂了。诸如此类的材料的准确的介电性质在很大程度上将取决于CPG孔隙的精确几何和体积构型，并且一般的分析描述很难推出。然而，负载银的CPG基质的行为可以使用数学技术例如有限元分析或无网格法进行预测。

感应材料的光学行为因此由两种基本机理决定。首先，表面等离子激元共振主要受金属粒子本身的大小、组成和几何形状影响。第二较大规模共振受支承基质的组成和空间分布影响，这反过来影响空间分布和金属粒子分布的介电环境。金属粒子本身的光学性质可以通过使用上述数学技术来预测(并因此被理性地设计)。负载金属的基质材料的光学性质可以由如适于结构的复杂性的分析或数字方法来确定。支承材料和样品的不同的折射系数和介电性质决定了确保入射辐射最大吸光度所需的金属粒子之间的光学间距。理想情况下，金属粒子的平均间距应该为入射辐射波长的一半，然而波长取决于辐射穿过的材料。孔隙直径与支承材料的壁厚之间的比例应当优选等于填充孔隙的溶液的折射系数和支承材料的折射系数之间的比例，在这种情况下，两种材料的激发光子的实际波长将相等。结果，CPG超材料中的孔隙/壁结构的尺寸应当优选选择为加权平均值，以说明包括孔隙的支承材料的体积和包括固体支承材料的体积之间的差别。金属粒子之间的间距是入射辐射的半波长的几倍，这也将给出额外的谐波共振。

用于拉曼光谱的激光典型地具有大约100微米的聚焦面积，尽管这可能延伸到500微米大。图18示出了CPG粒子的大小可能属于100微米跨度级。因此，应该意识到根据本发明的支承材料可能包括具有其中固定和分布有金属的多孔结构的单基底粒子。由于大量的粒子有效地稀释样品浓度，因此理想情况下，尽可能少地使用粒子。更大量的粒子可以方便地使用以简化结合本发明的检测器的工程/构造。

虽然激光通常用于拉曼光谱学，唯一的要求是照射源为单色且具有特定波长。对将要进行相干的照射源没有要求。

如果孔隙大小与所用光的波长大致相等，孔隙的大小可以影响照射光。通过使用孔隙大小比光的波长小足够多的孔隙可以减少这些问题。

粒子大小和形状对金属粒子通过与传导电子的等离子体在它们的表面的共振(等离子激元)与入射激光耦合的能力有很大的影响。关于此的实验证据在图22中示出了(取自Haes等.，MRS Bulletin(30)，May 2005)。

图22示出了覆盖有指定大小和形状的粒子的表面的紫外/可见吸光度轮廓。目前可得的最完整的整套数据包括了紫外/可见和红外区，是关于三角形粒子的，在下表中示出：

通过将非线性衰退模型应用于三角形粒子数据，可以得出关于λ_max与粒子宽度和高度的经验公式：

λ_max＝(3.703319918×宽度)+(0.000026746×宽度³)-(0.00218472×高度³)-(0.000464139×宽度²*高度)+(0.001779672×高度²*宽度)+242.638583311

这非常合理地吻合图23所示的实验数据，该图23示出了λ_max的计算值对测量值的曲线。

该关系仅严格地适用于三角形粒子，并基于相对少量的实验数据点，因此如果能获得更多的观察点，则其精确性将提高很多。特别是，对于宽度和高度的组合位于经验观察范围外的情况，其精确性将明显降低。尽管假设存在这些警告，然而，预测各种宽度和高度的银颗粒的λmax近似值是可能的。图24的曲线中的黑暗轮廓表明与通常使用的532纳米激光的更好的耦合。

图24关于宽度和高度不对称，因为观察的粒子体系涉及粒子的2D平面阵列。粒子场在表面的平面中发生强烈的作用，但不是在面外方向，因此“宽度”与粒子的面内尺寸有关，“高度”与它们的垂直于平面的尺寸有关。

存在粒子宽度(约100纳米)，大于该宽度，λ_max变得大于532纳米而不可接受。宽度相对较小(<约50纳米)的粒子具有不可接受的低λ_max预测值。对于大于约100纳米的粒子宽度，用532纳米激光共振的最佳高度(高度≈25+0.42×宽度)。宽度为约75纳米的粒子具有的最佳高度低于50纳米，宽度低于75纳米的粒子具有的次最佳λ_max值小于532纳米。因此具有窄的尺寸范围，在该范围内，附着到表面的具体大小的粒子将显示对特定激光波长良好的消光性。

通过使用托伦斯反应沉积形成的粒子将具有不同大小的范围，这些大小由于不规则分散而分布。这种大小范围的一个好处是确保具有合适大小的粒子的比例，以提供染料对辐射照射的响应的提高。使用拉曼光谱学，这个通过使等离子激元波长与入射辐射的波长相匹配而起作用。然而，只有当所需大小的粒子均匀分布在基底表面上，这将进一步提高表面增强拉曼效应。这可以通过将银胶体固定在支承材料内来实现，因为这种胶体的大小可以比通过沉积技术制得的银颗粒得到更大的程度的控制。

假设通过托伦斯反应沉积的粒子接近于其中a＝b＝观察直径的粒子，我们可以估计，来自图24所示的大小分布的全体的表面增强拉曼信号几乎来源于仅0.6％的这些粒子。这个数字与实验观察的所谓的“热粒子”入射非常一致，其一般认为低于1％。然而，需要注意的是，大小接近于上述最优值的全部粒子将具有高得多的热粒子比例，并且因此显示对指定量的银明显提高的拉曼信号。

理论基础讨论

图1示出了已知的微观流体SER(R)S传感器。照射激光聚焦于微观流体芯片上的腔内的平面银表面上，因此取样于限定的曲面片(surface patch)。吸收到该区域的表面的分子根据拉曼机理散射光子，并且一定比例的散射光返回到记录光谱的分光计。对于表面增强共振拉曼光谱学(SERRS)，入射激光被选择成与拉曼散射分子的吸收峰相符，因此提高产生拉曼信号的效率。因为便宜且易得，一般使用波长为532纳米的激光。

由微观流体系统带来的关键优点之一是由于将反应位置限定在体积内而导致反应时间大大缩短，所述体积的尺寸可以与所涉及的分子的扩散程长度相比。

分子通过液体介质扩散的能力用其扩散系数D来描述，所述扩散系数D使用斯托克斯-爱因斯坦方程来估计：

D = \frac{kT}{6 πηR}

其中k为玻尔兹曼常数，T为绝对温度。该模型假设分子为在连续统一体的溶剂中自由扩散的半径为R球体，分子大小至少为溶剂分子大小的5倍，并且液体具有低粘度(η)。

虽然蛋白质不是完美的球体，但是它们的表观斯托克斯半径可以用实验方法测定。典型的实例如下表所示。

这些数据可用于得出从其分子量预测蛋白质的斯托克斯半径的经验方法。

图2示出了斯托克斯半径对分子量的曲线。实验确定的点取决于遵循关系R＝1.2719ln(摩尔重量)-1.6908的对数曲线。使用该方程，R的预测值可以用于斯托克斯-爱因斯坦方程，以仅基于其分子量来估计任何蛋白质的扩散系数。显示计算的扩散系数对分子量的曲线从图3中可以看出。

用于估计微观流体体系中典型的扩散限时标(t_D)的常规方法是使用方程：

t_{D} = \frac{l^{2}}{2 D}

其中l为体系的特征长度。对于l＝1cm的大规模体系中质量为100kDa的典型蛋白质，t_D为约230小时。对于l＝100μm的微观流体体系中的相同的蛋白质，t_D为约84秒。

假设感应反应在具有可以与分子成分的扩散程相比的尺寸的反应腔进行，“典型时标”计算显示微观流体生物传感器能在实验时间方面提供巨大的优势。然而，该计算不考虑分子成分的损耗，所述分子中成分的损耗伴随分子传感器表面的结合事件。由于浓度梯度，用于生物传感器的更可行的模型可以使用用于粒子通量j的菲克第一扩散定律(Fick’s 1^stlaw)来获得：

j = - D \frac{&PartialD; c}{&PartialD; x}

图4示出了其中假设分析物分子根据斯托克斯-爱因斯坦模型在液体中扩散并假设它们被限制在高度为h的反应腔内、且假设它们的筛选剂(也已知为结合对如抗体或核酸低聚物)附着到一个壁上的生物传感器模型的图。因为许多分子从左边进入并从右边离开限定区域，因此还假设径向扩散不重要(仅严格支持区域非常远离腔侧壁的假设)。为了简化该计算，假设与筛选剂的结合不可逆，且结合对过量，并假设各个结合事件是瞬间的。

分析物在高度x和时间t的浓度定义为c(x，t)。初始态(t＝0)的c(x，t)＝c₀(初始浓度)，其中在x＝h结合壁的损耗为c(h，t)＝0。随着反应继续进行，结合反应使分析物的浓度减少至接近结合壁。这诱导了分析物分子向该壁的扩散通量，由于浓度梯度已经形成，并随着时间推移，腔内的分析物分子耗尽了。

该计算通过图5所示的两个阶段进行。在阶段1中，有一个耗尽区在x＝h处接近壁，从腔的其余部分通过分子扩散不断补充该区。在阶段2中，这个耗尽区扩大到包括整个腔。用于计算的更进一步的一个近似值是假设浓度梯度具有线性轮廓。

第一步是计算阶段1所花费的时间。根据菲克原理，在耗尽区，通过扩散梯度驱使向结合壁的扩散，我们假设所述耗尽区具有线性轮廓：

j = - D \frac{&PartialD; c}{&PartialD; d} \approx - D \frac{c_{0}}{x (t)}

腔中在时间t时自由分析物分子的数量n由下式给出：

n (t) = {hc}_{0} - \frac{1}{2} x (t) c_{0}

那么，改变率(例如：流量)是：

\frac{dn}{dt} = - \frac{1}{2} \frac{dx (t)}{dt} c_{0} = j = - D \frac{c_{0}}{x (t)}

使用边界条件x(0)＝0，导致：

x (t) = \sqrt{4 Dt}

在阶段1结束时，在时间t₁发生，x(t₁)＝h，所以

t_{1} = \frac{h^{2}}{4 D}

阶段2的计算类似。再次，我们考虑到结合壁的扩散，但是这次我们仅需要考虑耗尽区：

j = - D \frac{c (0, t)}{h}

自由分析物分子的数量然后通过以下得出：

n (t) = \frac{1}{2} hc (0, t)

所以流量是：

\frac{dn}{dt} = - \frac{1}{2} h \frac{dc (0, t)}{dt} = j = - D \frac{c (0, t)}{h)}

使用边界条件c(0，0)＝c₀，我们得到：

c (0, t) = c_{0} e^{(- \frac{2 D}{h^{2}} t)}

由于这是一个指数式衰减，所以对于分析物的浓度达到0将花费无限时间。然而，我们可以计算结合的分析物比例p(0<p<1)所花费的时间。我们称之为t₂。

\frac{1}{2} c (0, t_{2}) h = (1 - p) c_{0} h

所以，

c(0，t₂)＝2(1-p)c₀

使用用于阶段2的指数式衰减方程，可以看到：

t_{2} = \frac{- \ln (2 (1 - p)) h^{2}}{2 D}

然后结合分析物分子比例p所花费的时间t_p通过以下给出：

t_{p} {= t}_{1} + t_{2} = \frac{h^{2}}{4 D} - \frac{- \ln (2 (1 - p)) h^{2}}{2 D}

或者：

t_{p} = \frac{h^{2}}{2 D} (\frac{1}{2} - \ln (2 (1 - p)))

将用于微观流体体系的所接受的“典型时间标”方程与这个方程比较：

t_{D} = \frac{l^{2}}{2 D}

很清楚，腔高度h代替了特征长度l，并且另有一个由于分析物损耗而导入体系的描述指数式衰减的项。

对于典型的100kDa蛋白质，可以计算不同高度的微观流体反应腔达到99％最大结合所需的时间，腔高度对99％结合发生的时间的曲线如图6所示。

图6的曲线使用双对数坐标(log-log scale)，这是由于两个轴的数值范围覆盖几个数量级。对于腔高度低于约40微米，结合在几秒钟内完成。对于高度在40至310微米，在几分钟内实现99％结合，并且对于高度超过310微米，结合需要几小时。典型的微孔板具有几毫米的尺度，相应的结合时间超过10小时，虽然假设该板在结合期间不摇动或搅动，摇动或搅动将很大地加速该过程。

对于典型的100kDa蛋白质例子，对于不同的腔高度1小时内的计算结合时间过程如图7所示。减少尺度的好处是显而易见的，对于1厘米高度的“大量”1小时后达到低于5％的结合，而对于100微米腔高度约6分钟后结合基本完成。

Claims

1、一种用于检测样品中分析物存在、不存在或含量的检测器装置中所用的反应载体，在该反应载体内能够引入用于测试的样品，该反应载体包括：

为限定体积而设置的固体支承材料，以及分布并固定在该体积内且由所述支承材料支承的金属，所述支承材料对染料为多孔的；所述金属被设置成提高染料对照射的光学响应。

2、根据权利要求1所述的反应载体，其中，所述金属被设置成通过金属内电子和染料之间的相互作用来提高对照射的响应。

3、根据权利要求1或2所述的反应载体，其中，检测的所述响应为表面增强拉曼散射相互作用。

4、根据权利要求1或2所述的反应载体，其中，检测的所述响应为表面增强共振拉曼散射相互作用。

5、根据前述权利要求中任意一项所述的反应载体，其中，所述支承材料被设置成使染料分布在所述体积内，并且对照射的响应提高是由于所述染料分布在所述体积内且接近于同样分布在该体积内的所述金属而导致的。

6、根据前述权利要求中任意一项所述的反应载体，其中，所述金属作为多个分布的固体金属部分而分布在所述体积内。

7、根据权利要求6所述的反应载体，其中，所述分布的金属部分为金属粒子。

8、根据权利要求6或7所述的反应载体，其中，所述支承材料含有一种或多种基底粒子，并且所述金属沉积在该一种或多种基底粒子的外表面上。

9、根据权利要求6、7或8所述的反应载体，其中，所述金属沉积在所述一种或多种基底粒子内。

10、根据前述权利要求中任意一项所述的反应载体，其中，所述染料在所述体积内附着在能够结合所述分析物的筛选剂上，以当所述分析物结合所述筛选剂时，所述染料向所述金属附近的区域移动。

11、根据权利要求10所述的检测器装置，其中，所述染料可置换地附着到所述筛选剂上并通过该筛选剂保持远离所述金属。

12、根据权利要求9所述的反应载体，其中，所述基底粒子对染料为多孔的。

13、根据权利要求9所述的反应载体，其中，所述基底粒子对染料为多孔但对分析物样品中的其它物质不是多孔的。

14、根据权利要求7所述的反应载体，其中，所述金属的相邻的粒子之间的距离为所述染料平均自由程的量级。

15、根据前述权利要求中任意一项所述的反应载体，其中，所述支承材料在染料对照射响应的频率范围内不产生对照射的响应。

16、根据权利要求1至9中任意一项所述的反应载体，其中，待检测的分析物起染料的作用。

17、根据前述权利要求中任意一项所述的反应载体，其中，所述支承材料含有二氧化硅。

18、根据前述权利要求中任意一项所述的反应载体，其中，所述支承材料含有可控孔度玻璃。

19、根据前述权利要求中任意一项所述的反应载体，其中，由于拉曼散射，在特定波长位移下对照射的响应是一强度变量。

20、根据前述权利要求中任意一项所述的反应载体，其中，选择金属的类型以提高染料对照射的响应。

21、根据前述权利要求中任意一项所述的反应载体，其中，所述金属为银、金或铜。

22、根据权利要求7所述的反应载体，其中，所述金属粒子具有与该金属内电子的平均自由程相同的量级的尺寸。

23、一种检测器装置，该检测器装置包括前述权利要求中任意一项所述的反应载体、照射源、检测器和染料，该检测器装置被设置成所述照射源以特定的辐射波长照射所述反应载体，以检测对照射响应的染料的不存在、存在或含量，从而显示分析物的不存在、存在或含量。

24、根据权利要求23所述的检测器装置，其中，设置所述照射源以提供覆盖由所述支承材料所限定的体积的至少一部分的照射。

25、根据权利要求24所述的检测器装置，其中，所述照射源聚焦以使该体积部分包括所述照射源的光束。

26、根据权利要求25所述的检测器装置，其中，所述体积部分包括所述照射源的焦点两侧的该照射源的光束。

27、根据权利要求7所述的检测器装置，其中，所述金属粒子的尺寸为10-250纳米的量级。

28、根据权利要求7所述的检测器装置，其中，所述金属粒子的尺寸和照射辐射的波长为使大量的入射辐射被所述金属粒子吸收的波长。

29、根据权利要求7所述的检测器装置，其中，所述金属粒子的空间分散和照射辐射的波长为使大量的入射辐射被所述金属粒子吸收的波长。

30、根据权利要求29所述的检测器装置，其中，所述金属粒子的空间分散约等于所述体积内照射辐射的半波长。

31、根据权利要求29所述的检测器装置，其中，所述金属粒子的空间分散约等于所述体积内照射辐射的半波长的任意倍。

32、一种检测反应载体内的样品中分析物的存在、不存在或含量的方法，该方法包括以下步骤：在反应载体内提供为限定体积而设置的固体支承材料和分布并固定在该体积内且由所述支承材料支承的金属，所述支承材料对染料为多孔的，所述金属被设置成提高染料对照射的响应；提供染料；用特定波长的辐射照射所述反应载体；检测来自染料的对照射的响应，以确定染料的含量，从而显示分析物的存在、不存在或含量。

33、根据权利要求32所述的方法，其中，所述染料附着在能够结合分析物的筛选剂上，从而在引入分析物样品时，所述分析物能够与引起所述染料向所述金属附近的区域移动的筛选剂结合。

34、根据权利要求33所述的方法，其中，所述筛选剂保持染料远离所述金属，直到引入引起所述染料分开并向所述金属附近的区域移动的分析物。

35、根据权利要求32至34中任意一项所述的方法，其中，当引入分析物样品时，所述分析物能够与引起所述染料分开并扩散到所述支承材料内从而向所述金属附近的区域移动的筛选剂结合。

36、根据权利要求35所述的方法，其中，所述支承材料包括一种或多种基底粒子，并且所述金属沉积在该一种或多种基底粒子内，其中当引入分析物样品时，所述分析物能够与引起所述染料分开并扩散到所述一种或多种粒子内从而向所述金属附近的区域移动的筛选剂结合。

37、根据权利要求35或36所述的方法，其中，所述支承材料对所述染料为多孔但对其它物质不是多孔的，从而当分析物置换所述染料时，仅所述染料能够扩散到所述支承材料内。

38、根据权利要求36所述的方法，其中，所述支承材料对分析物样品为多孔的，但所述一种或多种基底粒子对分析物不是多孔的，从而当所述分析物置换所述染料时，仅所述染料能够扩散到所述一种或多种基底粒子内。

39、根据权利要求32至38中任意一项所述的方法，其中，该方法包括向引起染料进入所述体积的反应载体内引入分析物样品。

40、根据权利要求32至38中任意一项所述的方法，其中，该方法包括向所述体积内引入分析物样品。

41、根据权利要求32至40中任意一项所述的方法，其中，该方法包括使用照射源照射由所述支承材料所限定的体积的至少一部分。

42、根据权利要求41所述的方法，其中，所述照射源为激光，并且该方法包括设置所述激光以使该体积部分包括所述激光的光束。

43、根据权利要求42所述的方法，其中，所述体积部分包括激光焦点两侧的激光的光束。

44、根据权利要求32所述的方法，其中，所述染料附着在能够结合分析物的筛选剂上并保持在所述金属附近的区域，从而当引入分析物样品时，所述分析物能够与引起染料向远离所述金属附近的区域移动的筛选剂结合。

45、根据权利要求44所述的方法，其中，所述筛选剂将染料保持在所述金属附近的区域，直到引入引起染料分开并向远离所述金属附近的区域移动的分析物。

46、根据权利要求1所述的反应载体，其中，所述染料在所述体积内附着在能够结合分析物的筛选剂上，并保持在所述金属附近的区域，从而当分析物结合筛选剂时，所述染料向远离所述金属附近的区域移动。

47、根据权利要求46所述的检测器装置，其中，所述染料为可置换地附着在筛选剂上并通过筛选剂保持在所述金属附近的区域内。