CN101454452A - 用于亲和纯化的工程蛋白酶及融合蛋白的加工 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鉴定能够以高亲和力结合相应蛋白酶的蛋白酶前结构域。本发明的前结构域融合到另一蛋白以形成蛋白酶前结构域融合蛋白。融合蛋白中存在蛋白酶前结构域蛋白使得可以通过用相应的蛋白酶温育而容易地和选择性地纯化第二蛋白。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及纯化方法，和更具体地涉及包含靶蛋白和蛋白酶前结构域蛋白的融合蛋白，其中前结构域蛋白与相应的蛋白酶或其变体具有高度亲和力从而以提供随后用于回收靶蛋白的蛋白酶结合复合物。
背景技术
重组DNA技术已经促进了用于医药和生物技术多种应用的蛋白的表达。然而，重组蛋白的纯化通常是复杂和难以解决的。大规模，经济的纯化蛋白通常包括由细胞培养物，比如通过插入含有所述蛋白基因的重组质粒基因工程化产生目的蛋白的细菌细胞系而产生蛋白。从供应给细胞的化合物的混合物及从细胞自身的副产物中分离需要的蛋白到足以用作人药物的纯度构成艰巨的挑战。
用于从细胞碎片纯化蛋白的方法最初取决于蛋白表达的位置。一些蛋白可以直接从细胞分泌到周围生长介质；其它的蛋白则在细胞内制备。对于后一种蛋白，纯化过程的第一步包括裂解细胞，可以通过各种方法完成，包括机械剪切，渗透压冲击或酶处理。这样的破裂将细胞的全部内容物释放进入组织匀浆，此外产生由于其较小而难以除去的亚细胞碎片。这些通常通过差速离心或过滤除去。由于在蛋白生产过程中细胞的自然死亡和细胞内宿主细胞蛋白的释放而出现与直接分泌的蛋白相关的相同问题，尽管程度上较小。
一旦获得含有目的蛋白的澄清溶液，通常尝试使用不同的技术组合将其与细胞产生的其它蛋白分离开来。作为蛋白的总体回收方法的一部分，蛋白可以暴露于结合到蛋白的固定化试剂。
后基因组时代蛋白质组的启动大大地增加了对于快速，有效和标准的蛋白纯化和分析方法的需求。例如，重组蛋白经常与其它的蛋白或肽融合以促进纯化。融合的结构域用作亲和纯化的临时钩子(hook)并最终必须通过位点特异性蛋白水解而被切割掉。许多使用不同的载体蛋白的融合蛋白系统目前市场上可以买到，特别是用于大肠杆菌(E.coli)的表达。例子包括麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽S转移酶，生物素羧基载体蛋白，硫氧还蛋白和纤维素结合结构域。
融合蛋白表达使用固定化的，特异于载体蛋白的中等亲和力的配体通过亲和层析简化从细胞提取物分离重组蛋白。然而固定化通常要求配体共价附于基质，在很多情况下导致活性的损失。广泛使用的产品的典型例子是蛋白A Sepharose。这个非常昂贵的产品用来通过亲和层析纯化IgG，以及用于许多诊断方案。
因而，目前非常需要更经济且技术上简单的不包括大规模亲和步骤的纯化可溶蛋白的方法。
蛋白酶功能的范围从广泛特异性的降解性酶到调节胚胎发育到细胞死亡的生理过程的高度序列特异性的酶。一些高度特异性蛋白酶已经从自然中获得作为蛋白纯化和分析的工具，在某种意义上的方式类似于使用限制性核酸内切酶以操作DNA。现有具体的加工酶来自于哺乳动物来源，比如凝血酶，因子Xa和肠激酶。然而，尽管广泛地用于蛋白工作，这些天然酶非常昂贵而且低稳定性限制了其用于许多应用的用途。
相当多的努力已经被致力于工程化改造耐用的，细菌性蛋白酶比如枯草芽孢杆菌蛋白酶以切割所限定的序列。枯草芽孢杆菌蛋白酶是革兰氏阳性细菌或真菌产生的丝氨酸蛋白酶。枯草芽孢杆菌蛋白酶是重要的工业酶还是了解受酶影响的大量速率增加的模型。许多枯草芽孢杆菌蛋白酶的氨基酸顺序是已知的，包括来自杆菌菌株的枯草芽孢杆菌蛋白酶，例如枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN′，枯草芽孢杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草芽孢杆菌蛋白酶DY，枯草芽孢杆菌蛋白酶amylosacchariticus，和mesenticopeptidase。出于这些以及及时克隆基因，方便表达和获得纯化和原子分辨率的结构的原因，枯草芽孢杆菌蛋白酶成为1980年代蛋白工程研究的模型系统。十五年后，已经在科学文献中已经报道了远远超过枯草芽孢杆菌蛋白酶275个氨基酸的50％的突变。大多数的枯草芽孢杆菌蛋白酶工程改造涉及催化的氨基酸，底物结合区域和稳定性突变。诱变得最显著的枯草芽孢杆菌蛋白酶[1，2]是来自杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(BPN′)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(枯草芽孢杆菌蛋白酶E)和缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)(Savinase)分泌的枯草芽孢杆菌蛋白酶。
尽管枯草芽孢杆菌蛋白酶的蛋白工程中的强活性，先前还不能将该蛋白从具有广泛底物偏爱的蛋白酶转化为适于处理特异性底物的酶从而使其可用于蛋白回收。因而，能使用低特异性蛋白酶比如枯草芽孢杆菌蛋白酶用于纯化过程对于研究和蛋白纯化是非常有用的。
发明概述
本发明涉及当使用对枯草芽孢杆菌蛋白酶具有高亲和力的底物序列时，枯草芽孢杆菌蛋白酶和其变体可用于纯化蛋白的发现，其中底物序列优选为枯草芽孢杆菌蛋白酶的前结构域。此外，本发明公开了生产包含枯草芽孢杆菌蛋白酶的前结构域和目的第二蛋白的融合蛋白的表达系统的构建。
分泌的蛋白酶，比如枯草芽孢杆菌蛋白酶作为无活性的酶原前体合成，以便紧密调节蛋白酶活化的时机[159]。酶原前体常常由附着于成熟蛋白酶序列的N-末端氨基酸组成。许多这些N-末端延伸(前结构域)足够大到能独立地折叠并已经显示紧密结合到成熟蛋白酶的活性位点[149，160-166]。
枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN是来自解淀粉芽孢杆菌的细胞外丝氨酸蛋白酶，具有作为前原蛋白的初级翻译产物[9，10]。30氨基酸前序列(SEQ ID NO.2)用作蛋白跨膜分泌的信号肽并通过信号肽酶被水解[167]。成熟过程的细胞外部分包括枯草芽孢杆菌蛋白酶前体的折叠，77氨基酸序列(SEQ ID NO.1)的自我加工，以产生加工的复合物并最后降解前结构域产生275个氨基酸(SEQ ID NO.3)的成熟SBT序列。77氨基酸前结构域被自身催化除去，已经暗示了前结构域延迟了枯草芽孢杆菌蛋白酶的活化直至从芽孢杆菌分泌之后[168]，因为前结构域是具活性的枯草芽孢杆菌蛋白酶(Ki 5.4×10-7M)的竞争性抑制剂，其显示出对枯草芽孢杆菌蛋白酶活性的强烈抑制。
枯草芽孢杆菌蛋白酶的广泛偏好来自于其结合到蛋白底物的方式。大多数的枯草芽孢杆菌蛋白酶接触的是位于底物结构中的易切断键的酰基侧的最初的四个氨基酸。这些残基命名为P1至P4，从易切断键向底物的N末端编号[157]。底物侧链组分的结合主要来自于P1和P4氨基酸[193][46，47]。枯草芽孢杆菌蛋白酶在这些位置优选疏水性氨基酸。枯草芽孢杆菌蛋白酶和前结构域之间的复合物的高分辨率结构显示了前结构域的C-末端作为底物结合进入枯草芽孢杆菌蛋白酶的活性位点，前结构域的球状部分对枯草芽孢杆菌蛋白酶具有广泛的互补表面。C-末端残基从前结构域的中心部分伸出并以底物样方式沿着SBT的活性位点的裂缝结合。因而，前结构域的残基Y77，A76，H75和A74分别作为P1到P4底物氨基酸。这些残基符合枯草芽孢杆菌蛋白酶的天然序列偏好。折叠的前结构域对天然枯草芽孢杆菌蛋白酶具有通过C-末端尾部的底物相互作用和β-折叠提供的疏水性界面介导的的形状互补性和高亲和力[133]。
同样，碱性磷酸酶(ALP)基因测序显示ALP也以酶原形式合成。在ALP中，前结构域(166个氨基酸)几乎与成熟蛋白酶(198氨基酸)一样大。此外，据显示ALP前结构域是体内产生活性的ALP所需的，而且166氨基酸前结构域是ALP强烈的竞争性抑制剂[170]。有趣的是，ALP与其前结构域的结构分析显示前结构域与ALP活性位点的亲和结合[187]。
前结构域介导的折叠的其它的例子已经在蛋白酶的所有四个机械概念上的家族中发现：丝氨酸蛋白酶[172-177]；天冬氨酸蛋白酶[178-180]；金属蛋白酶[181-185]和半胱氨酸蛋白酶[186]。
因而，在一个方面，本发明涉及使用连接到靶蛋白的前结构域蛋白的蛋白纯化方法，其中前结构域蛋白具有对通常相关的蛋白酶的高亲和力从而可以很容易地由前结构域分离靶蛋白。优选地，本发明涉及分泌的蛋白酶比如枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体的前结构域，其中前结构域具有对于枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体的高亲和力。
在另一个方面，本发明涉及包含融合到靶蛋白的蛋白酶前结构域的融合蛋白，其中切割特异性地指向连接前结构域和靶蛋白的肽键，并且其中前结构域对相应的蛋白酶具有高亲和性。优选，蛋白酶是枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体，其中变体被修饰成特异性水解蛋白酶前结构域和靶蛋白之间的肽键和/或其水解活性可以通过特定的离子触发。另外，前结构域蛋白可以通过包含蛋白酶的同源序列而被优化。
在另一方面，本发明包含融合到目的蛋白的氨基酸序列SEQ IDNO.1的前结构域蛋白。前结构域序列此外可以包含如下在至少P1-P4氨基酸残基位置的取代：
| 前结构域 | P4 | P3 | P2 | P1 |
| 野生型 | A | H | A | Y |
| 取代 | F或Y | 任意 | A或S | M，Y，F，H或L |
包括FKAM，FKAY或FKAF的多个同源序列已经被认为是高度有效的。意外的是添加序列FKAM，FKAY或FKAF也将前结构域对枯草芽孢杆菌蛋白酶的亲和力提高到>109M-1。
另外枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域可以此外包括稳定性突变以进一步提高其对于枯草芽孢杆菌蛋白酶的亲和力。此外，可以将突变引入到枯草芽孢杆菌蛋白酶的四个催化氨基酸的一个或者多个中，以急剧降低其对非特定氨基酸序列的蛋白水解。优选的突变包括在鉴定为SEQ ID NO.3的枯草芽孢杆菌蛋白酶序列的氨基酸位置32，64，55和221并显示于图2中。
因此，在另一个方面，本发明提供了对于前结构域中的同源序列的Km<1nm的加工的蛋白酶。加工的蛋白酶kcat在10-1sec-1到10-5sec-1的范围内。因此加工蛋白酶及其关联前结构域底物的转换数(kcat/Km)在104M-1s-1到108M-1s-1的范围内，而转换数vs.非特定的序列为<1M-1s-1。
一种优选的加工酶优选其关联前结构域比非特异性序列>106倍。本发明最优选的实施方案是具有kcat值在0.001到0.0001S-1范围内的加工枯草芽孢杆菌蛋白酶。在这一时间范围内切割枯草芽孢杆菌蛋白酶可以足够缓慢地加工底物，以允许任何含有作为N-末端融合结构域的关联前结构域的蛋白被亲和纯化。
在另一方面，本发明提供了包含连接到结构域的靶蛋白的融合蛋白，其中结构域蛋白包括在C-末端包含(EEDKL(F/Y)QS(M/L/Y)变体的氨基酸残基，其中结构域的C-末端部分产生对于枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体的亲和力。
在另一方面，本发明提供了生成枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域融合产物的方法。示例性的方法包含以下步骤：
提供编码枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域融合蛋白的核酸，其中融合蛋白包括枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体的前结构域和目的第二蛋白，前结构域能够以高亲和力结合枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体；
用核酸转染宿主细胞或使用等同的方法将核酸引入宿主细胞；和
在适于表达融合蛋白的条件下培养转化的宿主细胞。
目标融合蛋白通常通过重组方法产生，尤其并优选通过表达枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域/第二蛋白DNA，其中DNA在微生物宿主细胞中表达，尤其是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中表达，因为这种细菌天然产生枯草芽孢杆菌蛋白酶，是有效率的蛋白分泌器，并能产生活性构象的前结构域蛋白。然而，本发明不局限于在芽孢杆菌(Bacillus)中表达融合蛋白，而是包括在任何提供融合蛋白表达的宿主细胞中表达。用于表达的合适宿主细胞是本领域公知的，包括例如细菌宿主细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)；芽孢杆菌(Bacillus)，沙门氏菌(Salmonella)，假单胞菌(Pseudomonas)；酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，毕赤氏酵母(Pichia pastoris)，克鲁弗氏酵母(Kluveromyces)，假丝酵母(Candida)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)；和哺乳动物宿主细胞诸如CHO细胞。然而细菌宿主细胞是优选用于表达的宿主细胞。
编码枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域/第二蛋白融合蛋白的DNA的表达可以使用可以获得的载体和调控序列。实际的选择很大部分依赖于用于表达的特定宿主细胞。例如，如果融合蛋白在芽孢杆菌中表达，通常利用芽孢杆菌启动子以及芽孢杆菌来源的载体。在微生物宿主细胞中表达融合蛋白通常是优选的，因为这允许微生物宿主细胞以合适的构象产生枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域。
另一方面，本发明涉及从融合蛋白纯化目的蛋白并从其中分离的方法，所述方法包含：
将包含连接到目的蛋白的前结构域蛋白的融合蛋白与有效量的枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体在适于形成枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体和融合蛋白的前结构域蛋白之间的复合物的条件下接触；
温育结合复合物足够的时间以使枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体从结合复合物切割目的蛋白；以及
回收目的蛋白。
优选地，蛋白酶已经被修饰为特异性结合到蛋白酶前结构域融合蛋白，蛋白酶前结构域蛋白已经修饰为包括蛋白酶的同源序列用于自身催化从结合复合物除去第二蛋白。更优选地，蛋白酶是枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体并且前结构域具有对于这样的蛋白酶的高结合亲和力。
另一方面，本发明提供了编码融合蛋白的核酸，该融合蛋白包含蛋白酶前结构域蛋白和包含位于其间的切割位点的第二靶蛋白。优选地，所述切割位点在融合产物第二蛋白N-末端氨基酸的上游。更优选地，切割位点在P4-P1氨基酸残基的下游。
切割点
↓
前结构域P4 P3 P2 P1 靶蛋白
本发明的另一方面提供了包含编码本发明的蛋白酶前结构域融合蛋白的核酸的宿主细胞。
本发明的附加方面涉及用于检测目的物质的诊断试剂盒，包括：
(a)蛋白酶前结构域融合蛋白，包括：
(i)能够以高亲和力结合到枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体的蛋白酶前结构域；和
(ii)能够结合目的物质的第二蛋白；
(b)可检测的标记物；和
(c)用于结合到蛋白酶前结构域融合蛋白的枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体。
优选地，前结构域是枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域并且第二蛋白可以包括但不局限于酶，激素，抗原或抗体。
在另一个方面，本发明涉及使用上述诊断试剂盒检测测试样品中目的物质的存在的分析方法，包括：
(a)用足够量的蛋白酶前结构域融合蛋白与可以包含目的物质的测试样品一起温育，其中蛋白酶前结构域融合蛋白包括：
(i)能够以高亲和力结合到枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体的蛋白酶前结构域；和
(ii)能够结合目的物质的第二蛋白，
其中所述培养条件允许目的物质与第二蛋白的结合；
(b)将用于步骤(a)的蛋白酶前结构域融合蛋白与枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体接触，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体在溶液中以有效量结合融合蛋白并形成结合复合物，或固定在固相上以形成枯草芽孢杆菌蛋白酶/前结构域融合蛋白结合复合物；
(c)将枯草芽孢杆菌蛋白酶/前结构域融合蛋白结合复合物温育足够的时间以自身催化第二蛋白从结合复合物上的切割；
(d)回收结合到目的物质的第二蛋白。
该实施方案还提供了引入可检测的标记物的方法，其中标记物能够结合到目的物质；以及确定标记物存在与否，以提供测试样品中目的物质存在与否的指示。可检测的标记物可以在从结合复合物分离第二蛋白之前或回收第二蛋白之后被引入。
测试样品可以是体液，包括但不限于，血液，尿，精液，唾液，粘液，眼泪，阴道分泌物等等。
在本发明具体的实施方案中，该方法设计成检测测试样品中的特定蛋白或肽，因而前结构域枯草芽孢杆菌蛋白酶融合蛋白的第二蛋白可以是针对测试样品中特定蛋白或肽的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明的枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域可以直接地或通过接头部分结合于抗体。
目的物质还可以包含结合到蛋白，肽，激素，核酸或其它可靶向到探针的分子的生物素化探针。所述标记物可以包括酶，在添加足够量用于该酶的底物后，底物通过酶被转化为可检测的化合物。
最后，本发明的另一方面提供了药物递送系统，包括连接到药物化合物或目的药物以形成融合产物的枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白，其中融合产物还复合到枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体中以形成药物递送复合物。在这样的药物递送系统中，目的药物可以直接地或通过接头部分结合到枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域。存在许多结合方法，并且是本领域已知的。例如，存在酰基活化试剂，例如可用于形成酰胺或者酯键的环己基碳二亚胺。
在一个实施方案中，这样的药物递送系统可以是缓慢的或缓释的药物递送系统，其中目的药物被缓慢地从结合到枯草芽孢杆菌蛋白酶的枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域中释放。构思这样的药物递送系统可以引入到可以非肠道，口服，局部或通过吸入给药的组合物中。此外，组合物可以是固体，凝胶，液体或气溶胶的形式。
本发明的其它特征和优点从以下详细说明，附图和权利要求而显而易见。
附图说明
图1示例了显示与其前结构域复合的枯草芽孢杆菌蛋白酶的α碳主链的带状图。
图2显示了野生型枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
图3显示了引入到枯草芽孢杆菌蛋白酶’BPN的表1所述的突变。
图4显示了与离子浓度成比例的蛋白酶加工速度。
图5显示了加工枯草芽孢杆菌蛋白酶(S189)对前结构域的结合速度是快速的。
图6显示了S189切割大约四个小时的半衰期。迟滞期是明显的。滞后对于蛋白纯化是有用的，允许污染物在发生显著切割前被洗涤掉。
图7显示包括具有固定化的底物枯草芽孢杆菌蛋白酶S189或190的pR8FKAM-蛋白G融合蛋白纯化的结果，其中印迹泳道的分配如下：
泳道1：分子量标准参照物-2μg条带
泳道2：细胞裂解物-10ml取自250ml671pr8FKAM-蛋白G培养物中的10μl
泳道3：以1ml/min(10μl级分2)上样的S189AL的流出液
泳道4：以1ml/min(10μl级分2)上样的S190AL的流出液
泳道5：15小时后从S189AL的洗脱液(10μl，8μg蛋白G)
泳道6：15小时后从S190AL的洗脱液(10μl级分，4.8μg蛋白G)
泳道7：从189AL解离(10μl级分7，3μg pR8FKAM)
泳道8：从S190AL解离(10μl级分7，9μg pR8FKAM)
泳道9：约10分钟后从S189AL解离(10μL级分6，6.4μg 671FKAM)
泳道10：GB标准品
图8显示了牛转导素α-亚单位的纯化结果，其中印迹泳道的分配如下：
泳道1：细胞裂解物-10ml取自250ml的671pr8FKAM-ChiT培养物中的10μL
泳道2-3：洗涤柱
泳道4-9：15小时后从S189AL的洗脱液
泳道10：合并的级分
图9显示了甲烷杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicum)CDC6的纯化结果，其中印迹泳道的分配如下：
泳道1：分子量标准参照物-2μg条带
泳道2：细胞裂解物-50ml取自750ml的pr8FKAM-CDC6的培养物中的10μl
泳道3：以10ml/min上样的来自S189AL_10柱的流出液
泳道4-8：15小时后从S189AL的洗脱液(10μl级分2-6)
图10A和B显示了(a)蛋白G311和(b)蛋白A219的具有残基特异性主链分配的15N HSQC谱。两种蛋白序列上59％相同，但NMR显示不同的蛋白折叠。
图11显示在S189HiTrap NHS柱上56个氨基酸GB从671融合蛋白(pR58FKAM-GB)分离方法的结果，其中融合蛋白以常规的方法结合和洗涤。
图12显示通过添加氟离子触发靶蛋白的释放时的结果，所述氟离子减少了纯化靶蛋白所需要的时间。
图13显示了以正常方法当用0.1M H3PO4使前结构域(pR58)从柱上脱离时的结果。
图14显示当通过添加KF触发链球菌蛋白GB的纯化结果，其中印迹泳道的分配如下：
泳道1：分子量标准参照物-2μg条带
泳道2：BL21 DE3细胞裂解物-50ml取自1L 671(pR58FKAM-GB)培养物中的10μl
在S189HT1柱上注射的1ml的裂解物；
泳道3：以1ml/min上样的流出液(2ml级分2的10μl)
泳道4：以1ml/min上样的流出液(2ml级分3的10μ)
泳道5：通过0.1M KF切割/洗脱(1ml级分1的10μl；总共大约7μg)
泳道6：通过0.1M KF切割/洗脱(1ml级分2的10μl；总共大约3μg)
泳道7：通过0.1M H3PO4脱离(1ml级分1的10μl；两种条带组合总共大约10μg)
注：
1)GB的考马斯染色比pR58融合结构域的染色弱得多。通过A280测定蛋白浓度。
2)使用该切割/洗脱方案切割反应完成大约90％。
发明详述
本发明涉及包含优化的同源序列的前结构域，用于结合到高度特异的加工枯草芽孢杆菌蛋白酶，其中该配对对于蛋白纯化特别有用。
分离的枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域是解折叠的但是具有与枯草芽孢杆菌蛋白酶复合的四个条状反向平行的β-折叠和两个三转角α螺旋的致密结构[130，131](图1)。C-末端残基从前结构域的中心部分伸出并以底物样方式沿着SBT的活性位点裂缝结合。因而，前结构域的残基Y77，A76，H75和A74分别变成P1到P4底物氨基酸。这些残基符合枯草芽孢杆菌蛋白酶的天然序列偏好。折叠的前结构域具有通过C-末端尾部的底物相互作用和β-折叠提供的疏水性界面介导的对天然的枯草芽孢杆菌蛋白酶的形状互补性和高亲和力[133]。前结构域的天然三级结构是对枯草芽孢杆菌蛋白酶的最大结合所需的。如果突变被引入到不直接接触枯草芽孢杆菌蛋白酶的前结构域区域，则突变对于结合枯草芽孢杆菌蛋白酶的影响与它们是否稳定天然构象有关。因此，稳定前结构域独立折叠的突变提高前了结构域的结合亲和力[137]。
此处使用的术语“突变“是指基因序列的改变和/或通过那些基因序列产生的氨基酸序列的改变。突变包括野生型蛋白序列的氨基酸残基的缺失，置换，和添加。
此处使用的术语“野生型”是指由未突变的生物产生的蛋白，此处具体是指蛋白酶或前结构域。野生型枯草芽孢杆菌蛋白酶样蛋白酶由例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)，解淀粉芽孢杆菌，Bacillusamylosaccharicus，地衣芽孢杆菌，缓慢芽孢杆菌，和枯草芽孢杆菌的微生物产生。
此处使用的术语“变体”定义为天然存在的分子的氨基酸序列或其它特征已经被修饰并包含突变体。一些本发明范围内的变体具有氨基酸置换缺失和/或插入，条件是最终的结构在蛋白酶前结构域和相应的蛋白酶之间具有需要的结合亲和力。蛋白酶前结构域蛋白或相应的蛋白酶的氨基酸置换可以基于关联残基的极性，电荷，溶解性，疏水性，亲水性和/或两亲性的性质的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有类似的亲水性值的无电荷的极性头基团或非极性的头基团的氨基酸包括：亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸；甘氨酸，丙氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。还包括在变体定义内的是那些在C-末端，N-末端的一个或多个位点具有附加氨基酸的蛋白，只要变体保持结合亲和力。
本发明的变体可以包含枯草芽孢杆菌蛋白酶样蛋白酶。此处使用的术语“枯草芽孢杆菌蛋白酶样蛋白酶”表示与枯草芽孢杆菌蛋白酶的序列具有至少25％，和优选80％，和更优选90％氨基酸序列同一性并保持与野生型蛋白酶至少相同功能活性的蛋白酶。
本发明涉及能够以高亲和力结合相应的蛋白酶的蛋白酶前结构域的鉴定。本发明的蛋白酶前结构域融合到第二蛋白以形成蛋白酶前结构域融合蛋白。融合蛋白中存在蛋白酶前结构域蛋白使得通过与相应的蛋白酶一起温育而容易地和选择性地纯化第二蛋白。
第二蛋白的例子包括但是不限于蛋白A，包括葡萄球菌蛋白AB结构域和蛋白AB的突变体A219；蛋白G包括链球菌蛋白GB结构域，链球菌蛋白Ga结构域和蛋白GB突变体G311；大肠杆菌假定的Yab；牛转导素a亚单位；甲烷杆菌CDC 6；链霉亲和素；亲和素；Taq聚合酶及其他聚合酶；碱性磷酸酶；RNase；DNase；各种限制性内切酶；过氧化物酶；葡聚糖酶例如内-1，4-β葡聚糖酶，内-1，3-β-葡聚糖酶；几丁质酶，等；β和α葡萄糖苷酶；β和α葡苷酸酶(glucoronidase)；淀粉酶；转移酶例如葡萄糖基转移酶，磷酸转移酶，氯霉素乙酰基转移酶；β-内酰胺酶及其他抗生素修饰和降解酶；荧光素酶；酯酶；脂肪酶；蛋白酶；细菌素；抗生素；酶抑制剂；不同的生长因子；激素；受体；膜蛋白；核蛋白；转录和翻译因子和核酸修饰酶。
术语“蛋白酶前结构域蛋白”是指前结构域氨基酸序列或其功能等同物，其中蛋白酶前结构域蛋白具有以高亲和力结合到相应的蛋白酶的能力。优选，前结构域基本没有与其天然联系的其它蛋白，例如蛋白酶蛋白的配重。此外，前结构域中的一个或者多个预定的氨基酸残基可以例如被置换，插入或缺失以产生具有改进的生物学性质的前结构域蛋白，或改变结合和表达水平。通过使用重组DNA技术，具有残基缺失，置换和/或插入的本发明的前结构域蛋白可以通过改变基础(underlying)核酸而进行制备。
在一个实施方案中，蛋白酶前结构域蛋白可以融合到作为第二蛋白的抗体或抗原决定簇形成用于诊断试剂盒和免疫分析的蛋白酶前结构域融合蛋白。因而，例如可以通过利用蛋白酶前结构域和作为融合到蛋白酶前结构域蛋白的第二蛋白的抗原性表位来检验体液中特定抗体的存在。相反的，可以使用蛋白酶前结构域和抗体融合蛋白检测抗原或其抗原性部分。
此处使用的术语“融合蛋白”是指至少两个蛋白，前结构域蛋白优选蛋白酶前结构域和第二蛋白连接在一起。另外，本发明的融合产物包括位于蛋白酶前结构域和第二蛋白之间的酶切割位点。所述切割位点优选与第二蛋白N末端邻接从而提供从融合产物回收第二蛋白的方法。
在本发明的另一个实施方案中，融合蛋白是重组融合产物。“重组融合产物”是已经在用编码融合产物的核酸转化或转染的宿主细胞中产生的融合产物，或作为同源重组的结果产生融合蛋白。“转化”和“转染”可互换使用，是指将核酸引入到细胞的方法。继转化或转染之后，核酸可以整合到宿主细胞基因组，或可以作为染色体外因子存在。所述“宿主细胞”包括体外细胞培养的细胞以及宿主生物体内的细胞。
“核酸”是指包括一系列5′到3′磷酸二酯键的核酸的核苷酸序列，其可以是RNA或DNA序列。如果所述核酸是DNA，所述核苷酸序列是单链或双链的。编码前结构域蛋白酶蛋白的核酸是编码能够以高亲和力结合相应蛋白酶的蛋白的RNA或DNA，与编码这样的蛋白的核酸序列互补，或杂交到编码这样的蛋白的核酸序列并在下严格条件下保持稳定结合到该核酸序列。
在构造融合蛋白表达载体时，编码前结构域的核酸被连接或结合到编码第二蛋白的核酸，使得蛋白酶前结构域蛋白和第二蛋白的开放阅读框是完整的，允许融合蛋白产物翻译的发生。
编码本发明前结构域蛋白的核酸可以从细胞来源或通过基因组克隆而分离和纯化的DNA获得。可以使用本领域已知的技术制备cDNA或基因组文库克隆，并可以用基本上互补到基因的任何部分的核苷酸探针筛选具体的蛋白酶或蛋白酶前结构域的编码核酸。或者，cDNA或基因组DNA可以用合适的寡聚核苷酸引物被用作PCR克隆的模板。全长克隆，即含有需要的蛋白酶前结构域蛋白的全部编码区域的那些克隆可以被选择用于构建表达载体，或者重叠cDNAs可以被连接到一起形成完整的编码序列。或者，优选的蛋白酶前结构域编码DNA可以使用本领域的标准技术通过化学合成全部或部分合成。
用于重组生产多肽的方法是本领域技术人员公知的。简而言之，例如，宿主细胞用编码连接到选择的第二蛋白的蛋白酶前结构域蛋白的多核苷酸转染。用外源多核苷酸例如DNA分子转化或转染细胞的方法是本领域公知的，包括例如磷酸钙或DEAE葡聚糖介导的转染，原生质体融合，电穿孔法，脂质体介导的转染，直接显微注射和腺病毒感染。
最广泛使用的方法是通过磷酸钙或DEAE葡聚糖介导的转染。尽管机制还不清楚，据信转染的DNA通过胞吞进入细胞的细胞质并转运到细胞核。取决于细胞类型，在任意一次转染中可以转染高达90％的培养细胞群体。因为其高效率，通过磷酸钙或DEAE葡聚糖介导的转染是在大量细胞中要求瞬时表达外源DNA的实验中选择的方法。磷酸钙介导的转染还用于建立整合外源DNA拷贝的细胞系，该DNA通常首尾串联排列进入宿主细胞基因组。
对各种哺乳动物和植物细胞施用短暂的高电压电脉冲导致在质膜中形成纳米大小的孔。DNA通过这些孔或作为伴随孔闭合的膜组分重新分配的结果而直接地吸收进入细胞质。电穿孔法可以是非常有效率的，并可以用于克隆的基因的瞬时表达和用于建立携带整合的目的基因拷贝的细胞系。与磷酸钙介导的转染和原生质体融合相反，电穿孔法经常产生携带一个或至多一些外源DNA整合的拷贝的细胞系。
继转染之后，细胞被培养在培养条件下持续一段足以表达本发明融合蛋白的时间。培养条件是本领域公知的，包括离子组成和浓度，温度，pH等等。典型地，转染的细胞在培养条件下被培养在培养基中。用于各种细胞类型的合适的培养基是本领域公知的。在优选实施方案中，温度从大约20℃到大约50℃。pH优选从大约6.0到大约8.0。转染和表达编码的蛋白所需的其它的生物学条件是本领域公知的。
转染的细胞培养一段足以表达融合蛋白的时间，典型地，培养时间从大约2到大约14天。使用重组技术时，融合蛋白可以在细胞内，周质间隙内产生，或直接分泌进入培养基。如果多肽在细胞内产生，作为第一步通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解细胞(例如来自于匀浆)的颗粒碎片。
为将本发明的蛋白酶前结构域融合蛋白导向宿主细胞的分泌途径，通常需要分泌信号序列(又名引导序列或前序列)。在本发明中，蛋白酶的前结构域序列是融合蛋白的一部分，因而通过包括信号序列例如SEQ ID NO.2所定义的序列而容易地实现融合蛋白的分泌。
因而，从转染的细胞或培养细胞的培养基中回收或收集重组融合蛋白。然后融合蛋白进行一个和多个纯化步骤。在本发明的一个实施方案中，回收步骤包括将包含融合蛋白的组合物暴露于固相，该固相上固定有以高亲和力结合前结构域蛋白的枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体从而形成蛋白酶/蛋白酶前结构域结合复合物。固相可以被填充在柱中，固定的相应蛋白酶捕获融合蛋白并化学和/或物理修饰融合蛋白以释放第二蛋白。
“固相”表示包含可以吸附融合产物的蛋白酶的基质。固相可以是纯化柱，非连续相的离散颗粒，膜或滤器。用于形成固相的材料的例子包括多糖(例如琼脂糖和纤维素)；及其他机械稳定的基质例如二氧化硅(例如可控孔度的玻璃)，聚(苯乙烯二乙烯基)苯，聚丙烯酰胺，陶瓷颗粒和上述任何物质的衍生物。在优选的实施方案中，固相包括维持在柱中的可控孔度玻璃珠，其涂布有用于以高亲和力结合融合蛋白产物的前结构域蛋白的蛋白酶。
此处使用的短语“以高亲和力结合”指蛋白酶前结构域以Kd从nM到pM，范围从大约10nM到大约10pM，优选<100pM，结合到同源蛋白酶的能力。
本发明还涉及使用本发明的融合蛋白诊断检测测试样品中目的蛋白，特别是在生物样品例如组织提取液或生物液体，例如血清或尿中的目的蛋白。生物样品优选是哺乳动物来源的并最优选人来源。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白可以包含使用各种本领域公知的免疫分析形式用来检测生物样品中抗原存在的抗体。或者，融合蛋白的第二蛋白包括可用于检测识别抗原决定簇的抗体的抗原性表位。
此处使用的“抗体”包括多克隆抗体，单克隆抗体(MAbs)，人源化或嵌合抗体，单链抗体，抗独特型(抗-Id)抗体，和上述任何抗体的表位结合片段。
此处使用的术语“可检测的标记物”是指直接或间接提供可检测的信号的任何标记物，并包括例如酶，放射性标记的分子，荧光剂，颗粒，化学发光剂，酶底物或辅因子，酶抑制剂，磁性颗粒。用作本发明的可检测的标记物的例子包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。多种方法可以用于将可检测的标记物连接到目的蛋白，包括例如使用双功能试剂例如4，4′-二氟-3，3′-二硝基-苯基砜以将酶例如辣根过氧化物酶连接到目的蛋白上。附加的可检测的标记物然后与底物反应得到可检测的反应产物。
同时在本发明范围内的是蛋白酶前结构域融合产物的治疗或诊断应用，其中第二蛋白是对抗原性表位具有亲和力的单克隆抗体。例如，包括如下产物的蛋白酶前结构域融合产物可被用于将药物/蛋白酶复合物或显影剂/蛋白酶复合物靶向产生抗原的癌细胞的方法：(i)能够以高亲和力结合到同源蛋白酶的蛋白酶前结构域，和(ii)能够结合抗原的单克隆抗体。在此实施方案中，连接到第二蛋白(单克隆抗体)的蛋白酶前结构域被给药到哺乳动物。与融合产物给药同时或给药之后，给药药物/蛋白酶或显影剂/蛋白酶复合物。药物/蛋白酶或显影剂/蛋白酶复合物与定位在抗原位点的蛋白酶前结构域融合产物结合将药物或显影剂导向和靶向到有关的位点用于目的治疗或诊断活性。
本发明将在下面的实施例中进一步举例说明，实施例不是以任何方式限制本发明的范围。
方法和材料
突变的选择，克隆和表达
本申请中列举的具体的点突变鉴定了枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN′氨基酸序列的具体的氨基酸，如根据本发明突变的SEQUENCE ID NO：3(图2)所示。例如，S149突变体包括75-83氨基酸的缺失，还包括以下置换突变：Q2K，S3C，P5S，S9A，I31L，K43N，MS0F，A73L，E156S，G166S，G169A，S188P，Q206C，N212G，K217L，N218S，T254A和Q271E。表1中所述的另外的突变体如图3所示。
来自解淀粉芽孢杆菌的枯草芽孢杆菌蛋白酶(枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN′)基因已经在枯草芽孢杆菌中被克隆，测序和从其天然启动子序列高水平表达[9，10]。所有的突变体基因被再克隆进基于pUB110-的表达质粒中并用于转化枯草芽孢杆菌。用作宿主的枯草芽孢杆菌菌株包含其枯草芽孢杆菌蛋白酶基因的染色体缺失并因此产生无背景的野生型(wt)活性(Fahnestock等，Appl.Environ.Microbial.53：379-384(1987))。如前所述进行寡聚核苷酸诱变[17]。
野生型枯草芽孢杆菌蛋白酶和变体酶主要如Bryan等[17，94和95]所述被纯化和验证均一性。在一些情况下，C221突变体枯草芽孢杆菌蛋白酶在巯基特异性的汞亲和柱(Affi-gel 501，Biorad)上再纯化。
枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域的克隆和表达
枯草芽孢杆菌蛋白酶BPN′前结构域区域基因如Strausberg等所述使用聚合酶链式反应亚克隆[138]。根据寡聚核苷酸导向的体外诱变系统，版本2(Amersham International plc)进行克隆的前结构域基因的诱变。
实施例1
为表明前结构域导向的加工的可行性，构建基因以指导pR8前结构域向链球菌蛋白G的56氨基酸B结构域(GB)上的融合。在氨基酸残基16-21(QTMSTM)具有突变的前结构域pR8独立稳定并以比野生型前结构域高约100倍的亲和力结合到枯草芽孢杆菌蛋白酶，所述的氨基酸残基16-21(QTMSTM)被SGIK置换产生pR8两个氨基酸的缺失，其中S替换Q16，G替换T17，M18I替换S19和T20以及“K”替换M；连同另外的置换A23C，K27Q，V37L，Q40C，H72K和H75K。此外，pR8因而变成指定枯草芽孢杆菌蛋白酶切割位点的同源序列。
融合蛋白(1μM)与1μM野生型枯草芽孢杆菌蛋白酶混合。融合蛋白被快速和特异性地切割以从pR8释放GB。从结果观察到一些的相应的结论，包括：1)该加工是pR8在循环的结尾的具有强烈的产物抑制的单个转换反应；2)单个切割周期的速度受底物结合速度(1e6M-1s-1)的限制；和3)加工是高度特异性的，因为GB相当耐受枯草芽孢杆菌蛋白酶的活性。
实施例2
突变以降低枯草芽孢杆菌蛋白酶对非同源序列的活性。
由于枯草芽孢杆菌蛋白酶针对非同源序列的高活性，使用pR8直接地切割之中和自身不产生最佳加工系统。下一步是加工枯草芽孢杆菌蛋白酶使其对非同源序列的活性降低。工程改造加工枯草芽孢杆菌蛋白酶的起点是表示为S149的突变体：(Q2K，S3C，P5S，K43N，A73L，75-83，E156S，G166S，G169A，S188P，Q206C，N212G，K217L，N218S，T254A和Q271E)。S149先前被加工用于高稳定性和独立于前结构域折叠的能力。这些特性尽管不是关键的，但是在加工酶时是高度合乎需要的。
首先，在S149(表示S160)中引入突变G128S和Y104A以扩大S4口袋[48，51]。使用瞬态动力学方法研究针对两个荧光底物sDVRAF-AMC和sDFRAM-AMC的S149和S160的催化性质。S160中扩大的S4口袋在P1位置对M比对F具有现有的结合偏好，产生相对于sDVRAF-AMC(Ks＝83μM)而言对sDFRAM-AMC(Ks＝0.8μM)高100倍的偏好。比较起来S149优选sDFRAM-AMC(Ks＝1μM)超过sDVRAF-AMC(Ks＝5μM)5倍。因而，修饰的枯草芽孢杆菌蛋白酶可以被工程化以提高对于同源序列的偏好。
实施例3
pR8的版本被构造为其最后的四个氨基酸(AHAY)被FRAM置换(表示为pR58)。PR58以大约30pM的Ki抑制S160。pR58与GB结构域的N-末端融合被发现在pM范围，比高度优选的五肽底物sDFRAM-AMC至少高1e5倍的底物亲和力(Ks)结合到S160。前结构域结构主要作为P1和P4序列信号的放大器。通过强烈的产物抑制将水解限于单个转换(turn-over)。由于底物和产物的结构相似性，在使用高底物亲和力以导向特异性切割时难以避免产物抑制。因此我们不试图消除该性质。随后将描述，可以开发单个转换反应将该系统用于蛋白纯化。
还构建了具有S166G的修饰版本的S160(表示为S193)。该突变体分别优选F和Y作为P4和P1氨基酸。
相对于非同源序列S160对pR58-融合物的偏好结合不产生高度特异性的切割。其原因通过考虑以下单个催化性循环的机制可以得出：
k1 k2
E+S → ES → EX+P
←
k-1
产物释放的速度dP/dt＝k2k1[S]/(k1[S]+k-1+k2)。
在sDFRAM-AMC与S160的反应中，与酰化速度(k2)100s-1相比底物的释放速度(k-1)为大约10s-1。在pR58-GB的反应中，酰化速度是类似的，但k-1要小5个数量级(1×10-4s-1)。然而速率方程的分母中的k2在两种情况下都比k-1大≥10倍。因而k-1对观察的产物形成速度影响很小。然而底物亲和力变得越来越重要，如果酰化速度足够缓慢，则酶和底物之间的平衡相类似。通过在催化氨基酸(S190中的D32)，(S194中的S221)和氧负离子孔氨基酸(S188的N155)的突变完成减缓k2(参见图3中的表1)。
亲核的活性位点S221A中的突变
S160中活性位点丝氨酸亲核试剂的突变产生突变体(S194)，其以≤10pM的亲和力结合pR58融合蛋白。结合的速度是快速的(～1 x 106M-1s-1)，但S194切割融合蛋白非常缓慢(<100hr-1)。然而，突变体适用于未切割的融合蛋白的亲和纯化。
氧负离子孔的突变：N155L，N155Q。
除去稳定过渡状态氧负离子的氢键降低酰化反应的速度(k2)约1000倍。pR58-GB融合蛋白被N155(S188和S191)突变体的加工是一种缓慢的，单转换反应。在一轮切割之后pR58保持紧密结合到酶上。如上述的解释，k2的降低产生基于差别底物结合的很大程度上的序列识别力。
Asp-His配对中的突变：产生阴离子开关。
尤其有用的是D32的突变。D32的羧化物氢键键合到催化性的H64并使得其在酰化时首先作为常规碱并然后作为常规酸。胰蛋白酶催化性的Asp的突变产生约中性pH的活性的急剧降低，但是在高于pH10时出现明显的强烈的氢氧化物依赖的替换机制。产生由结合步骤随后是化学触发的切割步骤组成的产生两阶段反应的潜力导致集中在D32的突变。结果在S160和S193中D32被突变为A，S，V，G，和T。对比sFRAM-AMC，D32突变体的序列特异性极高，kcat/Km≤10M-1s-1。高特异性还通过其不能加工pR8-GB及其不能体内自身加工所显示，除非前序列的P4残基被从A突变为F。
融合蛋白pR58-GB切割的动力学显示在表2中：
| 突变 | D32A(S189) | D32V(S196) | D32S(S190) |
| 速度(hr-1) | 0.18 | 0.3 | 1.4 |
反应在0.1M KPi，pH7.2，23℃下进行。
实施例4
尤其有用的是其活性按需要触发的加工蛋白酶。用作触发剂的离子是OH-(pH)，Cl-和F-。表总结了作为具体的阴离子的函数的多种D32突变体的切割速度。
S189和S190的速度及pH比较
| pH | 5.7 | 7.2 | 8.8 | 10.0 |
| S189hr-1 | 0.135 | 0.18 | 0.97 | 4 |
| S190hr-1 | 0.18 | 1 | 5 | ≥25 |
反应在0.1M KPi，23℃中进行
S189的速度与[Cl]
| [Cl] | 0M | 0.5M |
| S189hr-1 | 0.97 | 5 |
反应在0.1M KPi，pH8.8，23℃中进行
S189的速度与[F]
| [F] | 0mM | 1mM | 10mM | 100mM |
| S189min-1 | 0.003 | 0.018 | 0.14 | 0.8 |
反应在0.1M KPi，pH7.2，23℃中进行
如图4所示，激活速度与离子的浓度成正比。因而，如果需要的话S189可以被触发以提高切割速度，而这在需要用于纯化过程时是非常有利的。一旦融合蛋白被结合到枯草芽孢杆菌蛋白酶变体以形成结合复合物，靶蛋白可以通过引入活化性的离子溶液活化枯草芽孢杆菌蛋白酶变体而从前结构域蛋白切割下来。
实施例5
前结构域的平截
枯草芽孢杆菌蛋白酶的前结构域可以用短很多的同源序列置换，后者已经被选择用于优化与加工蛋白酶的结合。包括只有前结构域的C末端部分的突变的氨基酸(EEDKL(F/Y)QS(M/L/Y)可以用作同源序列。例如，已经显示链球菌蛋白G的IgG结合结构域一旦添加C-末端尾部九个氨基酸后则以亚微摩尔的离解常数结合到S194，所述链球菌蛋白G对枯草芽孢杆菌蛋白酶没有天然的亲和力。
实施例6
用于亲和纯化和加工的加工枯草芽孢杆菌蛋白酶的固定。
加工枯草芽孢杆菌蛋白酶的结合和催化性质使得它们既可用作亲和力基质也可用作纯化带有pR58序列标记的蛋白的加工蛋白酶。为证明这一点，S189被固定在层析树脂上。
含有pR58-GB的大肠杆菌细胞裂解物经过含有固定化S189的基质。融合蛋白快速结合到S189基质而杂质如图5所示被从基质上洗掉。如图6所示切割结合的融合蛋白然后通过添加触发阴离子(例如，10mM KF)或通过延长培养(例如pH7.2下18小时)而起实现。切割后，纯化的加工蛋白被从基质洗涤下来，而同源的前结构域保持紧密结合到基质上的枯草芽孢杆菌蛋白酶。可以通过在pH2.1将pR从S189柱上脱离和将柱在中性pH重新平衡而实现多次纯化。高度稳定的和容易折叠的突变体例如那些列在表1(图3)的加工枯草芽孢杆菌蛋白酶是柱循环所需的。
包括pR58和靶蛋白的八个不同融合蛋白通过将融合蛋白与枯草芽孢杆菌蛋白酶S189或S190复合而以良好的收率纯化和回收，包括：
链球菌蛋白GB结构域 56aa
链球菌蛋白Ga结构域 45aa
蛋白GB突变体G311 56aa
金黄色葡萄球菌蛋白AB结构域 56aa
蛋白AB突变体A219 56aa
E.coli假定的Yab 117aa
牛转导素a亚单位 350aa
甲烷杆菌CDC6 379aa
如图7所示，包括连接到链球菌蛋白GB结构域的pR58(pR8FRAM)的融合蛋白在S189和S190固定化床上复合和分离。泳道3和4显示不同分子量的多组分被洗涤通过该系统。在充分温育之后，输出级分限于蛋白G，由如泳道5，6，7和8相对于泳道10鉴定的蛋白G的分子量而言的分子量级分所证实。
牛转导素β亚单位(350aa)的纯化结果如图8所示。通过泳道4-9的洗脱液证实，在通过枯草芽孢杆菌蛋白酶S189的活性切割前结构域蛋白和靶蛋白之间的键足够的时间后，蛋白从柱上洗脱下来。
CDC6(379aa)的纯化结果如图9所示。包括连接到甲烷杆菌CDC6的pR58(pR8FRAM)融合蛋白在S189固定化的床上被复合和分离。泳道2显示不同分子量的多组分在分离的早期被洗涤通过系统。在充分温育之后，输出级分限于CDC6，通过如泳道4-8的分子量级分所证实。
图10A和B显示在S189AL_10柱上纯化和回收的(a)蛋白G311和(b)蛋白A219的15N HSQC谱。两个蛋白在序列上59％同一，但代表不同的蛋白折叠。
实施例7
还对连接到pR58(pR8FRAM)的56个氨基酸的链球菌蛋白GB结构域进行了进一步的纯化实验，其中671融合蛋白(pR58FKAM-GB)通过连续注入0.1M KF在S189 HiTrap NHS柱上纯化和分离，以证明当突变体枯草芽孢杆菌蛋白酶被氟离子触发时释放靶蛋白的效力。图11显示当融合蛋白以常规方法结合和洗涤时的结果。图12显示添加以0.1ml/min注射的100mM氟化钾引起当氟离子接触到结合的融合蛋白时的快速切割以释放靶蛋白，因此当其在柱上被洗涤下来时被浓缩。图13显示以常规方法用0.1M H3PO4从柱上解离前结构域(pR58)。这些结果显示可以通过利用某些离子作为触发剂(OH-(pH)，Cl-和F-)以启动突变体枯草芽孢杆菌蛋白酶的蛋白酶活性而调整靶蛋白的释放。
图14显示在S189固定化的床上分离包括连接到链球菌蛋白GB结构域的pR58(pR8FRAM)的融合蛋白。泳道1是分子量标准参照物。泳道2和4显示不同分子量的多组分被洗涤通过该系统。在添加0.1M的KF之后，输出级分限于蛋白GB，由泳道5和6的分子量级分所证实。
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序列表
<110>马里兰大学生物技术研究中心
<120>用于亲和纯化的工程蛋白酶及融合蛋白的加工
(Engineered Proteases for Affinity Purification and Processing of Fusion Proteins)
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<140>Not yet assigned
<150>US 60/493,032
<151>2003-08-06
<160>3
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>30
<212>PRT
<213>解淀粉芽孢杆菌
<400>1
<210>2
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<212>PRT
<213>解淀粉芽孢杆菌
<400>2
<210>3
<211>275
<212>PRT
<213>解淀粉芽孢杆菌
<400>3
Claims (44)
1.编码融合蛋白的核酸构建物，其中该构建物包括可操作连接到前结构域蛋白编码序列的目的蛋白的编码序列，其中前结构域蛋白具有与其相应的蛋白酶或其变体增加的亲和力。
2.权利要求1的核酸构建物，其中相应的蛋白酶是枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体。
3.权利要求2的核酸构建物，其中前结构域蛋白还包括对枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体提高结合亲和力的氨基酸序列。
4.权利要求1的核酸构建物，其中前结构域蛋白包括P1-P4氨基酸序列的替换序列，包括用氨基酸残基F或Y置换P4，任一氨基酸残基置换P3，A或S置换P2，以及M、F、Y、H或L置换P1。
5.权利要求2的核酸构建物，其中前结构域蛋白是枯草芽孢杆菌蛋白酶的前结构域。
6.权利要求5的核酸构建物，其中前结构域蛋白包括在C末端用氨基酸残基F或Y置换P4，任一氨基酸残基置换P3，A或S置换P2以及M、F、Y、H或L置换P1。
7.融合蛋白，包括可操作连接到前结构域蛋白的靶蛋白，其中前结构域蛋白被修饰以显示对枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体增加的亲和力。
8.权利要求7的融合蛋白，其中前结构域蛋白是枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白。
9.权利要求8的融合蛋白，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白包括置换P1至P4氨基酸的氨基酸序列FKAM。
10.权利要求7的融合蛋白，其中前结构域蛋白包括用作同源序列的各种氨基酸残基EEDKL(F/Y)QS(M/L/Y)。
11.权利要求7的融合蛋白，其中靶蛋白是金黄色葡萄球菌蛋白AB结构域；蛋白AB突变体A219；链球菌蛋白GB结构域；链球菌蛋白Ga结构域；蛋白GB突变体G311；大肠杆菌假定的Yab；牛转导素的α亚单位；甲烷杆菌(M.thermautotrophicus)CDC6；链霉亲和素；亲和素；Taq聚合酶；碱性磷酸酶；RNase；DNase；限制性内切酶；过氧化物酶；内-1，4-β葡聚糖酶；内-1，3-β-葡聚糖酶；几丁质酶；β和α葡萄糖苷酶；β和α葡苷酸酶；淀粉酶；葡萄糖基转移酶；磷酸转移酶；氯霉素-乙酰转移酶；β-内酰胺酶；荧光素酶；酯酶；脂肪酶；蛋白酶；细菌素；抗生素；酶抑制剂；生长因子；激素；受体；膜蛋白；核蛋白；转录因子；翻译因子或核酸修饰酶。
13.一种生产结合枯草芽孢杆菌蛋白酶的融合蛋白的方法，该方法包括：
提供编码融合蛋白的核酸构建物，其中该融合蛋白包括前结构域蛋白和目的第二蛋白，其中前结构域蛋白被修饰以高亲和力结合枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体；
用核酸构建物转染宿主细胞；以及
在适合表达融合蛋白的条件下培养转化的宿主细胞。
14.权利要求13的方法，其中前结构域蛋白是枯草芽孢杆菌蛋白酶的前结构域。
15.权利要求14的方法，其中前结构域蛋白通过用氨基酸序列FKAM、FKAY或FKAF替换P4至P1的氨基酸而进行修饰。
16.权利要求15的方法，其中所述目的第二蛋白是金黄色葡萄球菌蛋白AB结构域；蛋白AB突变体A219；链球菌蛋白GB结构域；链球菌蛋白Ga结构域；蛋白GB突变体G311；大肠杆菌假定的Yab；牛转导素的α亚单位；甲烷杆菌CDC6；链霉亲和素；亲和素；Taq聚合酶；碱性磷酸酶；RNase；DNase；限制性内切酶；过氧化物酶；内-1，4-β葡聚糖酶；内-1，3-β-葡聚糖酶；几丁质酶；β和α葡萄糖苷酶；β和α葡苷酸酶；淀粉酶；葡萄糖基转移酶；磷酸转移酶；氯霉素-乙酰转移酶；β-内酰胺酶；荧光素酶；酯酶；脂肪酶；蛋白酶；细菌素；抗生素；酶抑制剂；生长因子；激素；受体；膜蛋白；核蛋白；转录因子；翻译因子或核酸修饰酶。
17.权利要求13的方法，其中宿主细胞包括来自大肠杆菌；芽孢杆菌，沙门氏菌，假单孢菌；酿酒酵母，毕赤氏酵母，克鲁弗氏酵母，假丝酵母，裂殖酵母或CHO细胞的细胞。
18.一种从融合蛋白纯化并从其中分离目的蛋白的方法，该方法包括：
将包括连接到目的蛋白的前结构域蛋白的融合蛋白与有效量的枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体在适合形成枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体与融合蛋白的前结构域蛋白之间的结合复合物的条件下接触；
将结合复合物温育足够的时间，以使枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体从结合复合物切割目的蛋白；和
回收目的蛋白。
19.权利要求18的方法，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶被修饰以特异性结合到蛋白酶前结构域融合蛋白。
20.权利要求19的方法，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶包括突变Q2K，S3C，P5S，K43N，A73L，Δ75-83，E156S，G166S，G169A，S188P，Q206C，N212G，K217L，N218S，T254A，Q271E，Y104A，G128S和氨基酸位置32、155或221的至少一个另外的突变。
21.权利要求19的方法，其中前结构域蛋白是枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域，并通过用氨基酸序列FKAM、FKAY或FKAF替换P4至P1的氨基酸而进行修饰。
22.权利要求21的方法，其中目的蛋白是金黄色葡萄球菌蛋白AB结构域；蛋白AB突变体A219；链球菌蛋白GB结构域；链球菌蛋白Ga结构域；蛋白GB突变体G311；大肠杆菌假定的Yab；牛转导素的α亚单位；甲烷杆菌CDC6；链霉亲和素；亲和素；Taq聚合酶；碱性磷酸酶；RNase；DNase；限制性内切酶；过氧化物酶；内-1，4-β葡聚糖酶；内-1，3-β-葡聚糖酶；几丁质酶；β和α葡萄糖苷酶；β和α葡苷酸酶；淀粉酶；葡萄糖基转移酶；磷酸转移酶；氯霉素-乙酰转移酶；β-内酰胺酶；荧光素酶；酯酶；脂肪酶；蛋白酶；细菌素；抗生素；酶抑制剂；生长因子；激素；受体；膜蛋白；核蛋白；转录因子；翻译因子或核酸修饰酶。
23.权利要求20的方法，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶被固定在固相基质上。
24.权利要求21的方法，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶的前结构域被突变以使枯草芽孢杆菌蛋白酶的结合亲和力提高到大于109M-1。
25.权利要求19的方法，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶包括突变Q2K，S3C，P5S，K43N，A73L，Δ75-83，E156S，G169A，S188P，Q206C，N212G，K217L，N218S，T254A，Q271E，Y104A，G128S和氨基酸位置32或221的至少一个另外的突变。
26.权利要求20的方法，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶是S189，S190，S194，S196，S197或S198。
27.权利要求25的方法，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶是S199，S201或S202。
28.一种检测测试样品中目的物质存在的分析方法，包括：
(a)温育测试样品，其可以含有目的物质和足够量的蛋白酶前结构域融合蛋白，其中蛋白酶前结构域融合蛋白包括：
(i)能够以高亲和力结合到枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体的蛋白酶前结构域，和
(ii)能够在允许目的物质与第二蛋白结合的温育条件下结合目的物质的第二蛋白；
(b)将用于步骤(a)的蛋白酶前结构域融合蛋白与枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体接触，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体以有效量在溶液中结合融合蛋白或固定在固相上以形成枯草芽孢杆菌蛋白酶/前结构域融合蛋白结合复合物；
(c)将枯草芽孢杆菌蛋白酶/前结构域融合蛋白结合复合物温育足够的时间，以使枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体从结合复合物切割第二蛋白
(d)回收结合到目的物质的第二蛋白。
29.权利要求28的方法，还包括引入能够结合到目的物质的可检测的标记物；以及测定标记物存在与否，以提供测试样品中是否存在目的物质的指示。
30.权利要求29的方法，其中可检测的标记物在从结合复合物分离第二蛋白之前或回收第二蛋白之后引入。
31.权利要求28的方法，其中测试样品是血液，尿，精液，唾液，粘液，眼泪或阴道分泌物。
32.权利要求31的方法，其中目的物质是抗体。
33.权利要求32的方法，其中第二蛋白是与抗体具有亲和力的抗原性受体。
34.权利要求31的方法，其中目的物质是抗原。
35.权利要求34的方法，其中第二蛋白是与抗体具有亲和力的抗体。
36.权利要求28的方法，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶被修饰为特异性结合到蛋白酶前结构域融合蛋白。
37.权利要求36的方法，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶包括突变Q2K，S3C，P5S，K43N，A73L，Δ75-83，E156S，G166S，G169A，S188P，Q206C，N212G，K217L，N218S，T254A，Q271E，Y104A，G128S和氨基酸位置32、155或221的至少一个另外的突变。
38.权利要求28的方法，其中蛋白酶前结构域蛋白是枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域并通过用氨基酸序列FKAM、FKAY或FKAF替换P4至P1的氨基酸而进行修饰。
39.药物递送系统，包含枯草芽孢杆菌蛋白酶与目的药物相连形成融合产物，其中融合产物被进一步复合到枯草芽孢杆菌蛋白酶或其变体上以形成药物递送复合物。
40.权利要求39的药物递送系统，其中目的药物被直接或通过接头部分结合到枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白。
41.权利要求39的药物递送系统，其中目的药物从药物递送复合物中缓慢释放。
42.权利要求41的药物递送系统，其中药物递送产物被包含在组合物中，并经肠胃外，口服，局部或吸入给药。
43.权利要求41的药物递送系统，其中的组合物包括固体、凝胶、液体或气溶胶。
44.权利要求41的药物递送系统，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶包括突变Q2K，S3C，P5S，K43N，A73L，Δ75-83，E156S，G166S，G169A，S188P，Q206C，N212G，K217L，N218S，T254A，Q271E，Y104A，G128S和氨基酸位置32、155或221的至少一个另外的突变。
45.权利要求41的药物递送系统，其中枯草芽孢杆菌蛋白酶前结构域蛋白通过用氨基酸序列FKAM、FKAY或FKAF替换P4至P1的氨基酸残基而进行修饰。
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