CN101450110B

CN101450110B - 治疗心脑血管疾病的木波罗提取物及其制备方法

Info

Publication number: CN101450110B
Application number: CN200810164191A
Authority: CN
Inventors: 郑筱祥; 严伟民; 邓同乐; 孙永红; 潘远江; 何山; 乌玛尔·安卡拉·杰尼; 来昂那多·布偌托·苏根·卡多罗; 陈嘉瓦蒂·莫扎芙
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-12-29
Filing date: 2008-12-29
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2028-12-29
Also published as: CN101450110A

Abstract

本发明公开了一种治疗心脑血管疾病的木波罗提取物及其制备方法。该木波罗提取物为从木波罗叶子中提取出来的β-谷甾醇和黄酮，乙醇提取木波罗叶子，得木波罗乙醇总提取物，粗分离木波罗乙醇总提物，得石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位，然后纯化分离石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位，得到治疗心脑血管疾病的木波罗提取物：β-谷甾醇和黄酮。所得到的提取物具有抗血栓、抑制血小板聚集、降低血粘度和保护心肌细胞的作用。

Description

治疗心脑血管疾病的木波罗提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，特别地，涉及一种治疗心脑血管疾病的木波罗提取物及其制备方法。

背景技术

木波罗属桑科Moraceae，俗称菠萝蜜，生长在热带地区，包括印尼、泰国、越南和柬埔寨，常用做碳水化合物食用资源。木波罗含有必需氨基酸，如组胺酸、异亮氨酸、甜菜碱、蛋氨酸、色氨酸和缬氨酸，对健康具有特殊效用。

虽未经过科学证明，但是，印尼已有利用木波罗叶治疗疾病的传统，如用于肝炎、心脏病、肾炎、牙齿病和发痒的治疗。据报道，台湾也利用木波罗的根和茎治疗肝脏病、肝硬化和高血压。有关木波罗研究的大多数结果显示这种植物对健康很有利。Kan等(1978年)发现木波罗的茎具有抗炎和去毒作用。Chen等(1993年)发现木波罗茎含有Prenylflavon等三种新化合物，分别是isocyclomorusin、isocyclomulberrin和cycloaltilisin。Patil等(2002年)成功分离cycloatilisin和cycloaltilisin两种新化合物，能够防止骨质疏松。Lin等(1993年)从几种桑科植物的根皮中分离得到prenylflavonoid化合物，兔子试验表明其有抗血小板作用。与此同时，Liou等(1993年)证明木波罗含有的gamma-pyrones、artomunoxanthotrioneepoxide、cyclocommunol、cyclomulberrin和cyclocommunin能够防止人PLC/PRF/5细胞和人KB细胞的生长。Wei等(2005年)研究发现木波罗含有的类黄酮具有抗炎作用，如dihydroisocycloartomunin与P-methoxy-N-methylphenethylamine刺激之后能够防止大鼠腹腔肥大细胞产生葡萄糖甘酸酶及组胺。在Artocarpone与formyl-Met-Leu-Phe刺激之后，能够有效地防止溶菌酶和超氧化离子的出现。此外，这种化合物与脂多糖(LPS)进行刺激也能够防止在巨噬细胞内NO的产生，在RAW 2647细胞导致iNOS蛋白质的出现。

实际上，桑科植物含有许多具有特殊生物活性的新化合物，特别是异戊酰化黄酮(isoprenylated flavones)的类黄酮。从尖蜜拉分离的类黄酮(cyclochampedol)对卤虫无节幼体具有毒性作用(Achmad，1996年)。从Artocarpus rotunda的Artoindonesianin L(Suhartatia，2001年)及坚硬面包果的Artoindonesianin P(Hakim，2002年)对P388型鼠科白血病细胞显示毒性作用。与此同时，Artoindoneisanin X及Y化合物对卤虫无节幼体具有毒性作用(Soekamto等，2003年)。从尖蜜拉树杆分离的Artoindonesianin U及V对P-388细胞显示很强的毒性(Syah等，2004年)。

根据研究显示，桑科植物含有的类黄酮成分对健康具有特殊的效用。已经有利用木波罗和同种类植物化合物的专利，从木波罗提取的2-genaryl-3，4，2’，4’-tetrahydroxychalcone，作为治疗癌症的药物，能做为口服或注射用药物(1987年第JP62270544号权利)；二氢查耳酮针对抗过敏症(第JP19860167288号权利)。木波罗的有效成分也用做头发催长剂(于1989年第JP1313414号权利)和抗菌药(于2000年第JP2000136141号权利)。但是，根据现有的文献资料，尚未发现有关木波罗生物活性化合物治疗心血管病的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种治疗心脑血管疾病的木波罗提取物及其制备方法

本发明的目的是通过以下技术方案实现：一种治疗心脑血管疾病的木波罗提取物，它是从木波罗叶子中提取出来的β-谷甾醇和黄酮。

一种上述木波罗提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)乙醇提取木波罗叶子，得木波罗乙醇总提取物：取木波罗叶子，阴干；然后用体积百分比为75％的乙醇溶液加热回流提取3～5次，每次乙醇溶液的用量为10～15升/公斤叶子；合并提取液，减压蒸干，得到木波罗乙醇总提取物。

(2)粗分离木波罗乙醇总提物，得石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位：取木波罗乙醇总提取物置于水中混悬，每100克提取物用水10～12升，然后依次用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3～5次，每次溶剂用量与水的体积相同；各萃取液减压蒸干，分别得到石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位。

(3)纯化分离石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位，得到治疗心脑血管疾病的木波罗提取物：β-谷甾醇和黄酮：把石油醚提取部位拌入硅胶，用200～300目硅胶柱进行分离精制，然后用体积比为15∶1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液洗脱，混合溶液体积为柱体积的4～5倍，得到有效部位：β-谷甾醇；把乙酸乙酯提取部位拌入硅胶，用200～300目硅胶柱进行分离精制，用体积比为3∶1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液洗脱，混合溶液体积为柱体积的4～5倍，得到有效部位：黄酮。

本发明的有益效果是：本发明采用硅胶柱层析精制方法制备木波罗提取物，提取物中有效成分含量显著提高，总黄酮含量不低于50％，谷甾醇提取物中β-谷甾醇含量不低于70％。该提取物具有抗血栓、抑制血小板聚集、降低血粘度和保护心肌细胞的作用。这种药物的药效和具有抗血栓作用的阿司匹林以及在中国已销售的地奥及银杏心血管病中药相当。

附图说明

图1为木波罗总提物的粗分离过程示意图；

图2为木波罗提取物血栓形成时间图。

具体实施方式

下面详细说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。

本发明的制备方法包括以下步骤：

一、乙醇提取木波罗叶子，得木波罗乙醇总提取物。

取木波罗叶子，阴干；然后用体积百分比为75％的乙醇溶液(其余25％是水)加热回流提取3～5次，每次乙醇溶液的用量为10～15升/公斤叶子；合并提取液，减压蒸干，得到木波罗乙醇总提取物，得率为10～15％。该提取物为黄褐色粉末，成分复杂。

二、粗分离木波罗乙醇总提物，得石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位。

如图2所示，取木波罗乙醇总提取物置于水中混悬(每100克提取物用水10-12升)，然后依次用石油醚和乙酸乙酯分别进行萃取3～5次，每次的溶剂用量与水的体积相同。各萃取液减压蒸干，分别得到石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位。

三、纯化分离石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位，得到治疗心脑血管疾病的木波罗提取物：β-谷甾醇和黄酮。

把石油醚提取部位拌入硅胶(石油醚提取部位与硅胶比例约为1∶1)，用200～300目硅胶柱进行分离精制(拌样硅胶与装柱硅胶的比例约为1∶20)，然后用石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)混合溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的4-5倍。依次用体积比为15∶1、12∶1、10∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1比例的溶液洗脱，可分别得到样品A1、A2、A3、A4、A12、A5、A6和A7。其中用石油醚∶乙酸乙酯＝15∶1洗脱得到得样品A1为甾醇，其有效部位是β-谷甾醇，β-谷甾醇的含量为石油醚提取部位质量的70％-80％。

把乙酸乙酯提取部位拌入硅胶(乙酸乙酯提取部位与硅胶比例约为1∶1)，用200-300目硅胶柱进行分离精制(拌样硅胶与装柱硅胶得比例约为1∶20)，用石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)混合溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的4-5倍。依次用体积比为5∶1、3∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶8、1∶10比例的溶液洗脱，可分别得到样品A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14和A15。其中用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1洗脱得到得样品A9为总黄酮，其有效部位是黄酮，黄酮含量为乙酸乙酯提取部位质量的15％-20％。

通过硝酸铝比色法，测试波长500nm，测定所获得的提取物中总黄酮含量达到50％-65％。

用HPLC测定总黄酮里活性化合物含量，使用Diamonsil C18色谱柱(200x4.6mm，5μm)。流动相乙腈-磷酸溶液(pH 2.0)，梯度洗脱时间0-90分钟，乙腈浓度从15％提高到85％，流速1.0毫升/分钟，检测波长为210nm。在总黄酮提取物里活性化合物含量是：

(2-geranyl-2、3、4、4’-tetrahydroxychalcone)含量15-20％

(8-geranyl-4、5、7-tirhydroxyflavone)含量10-15％

((1-(2，4-Dihydroxyphenyl)-3-(8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl)-1-propanone)含量5-8％。

使用硅胶树脂的柱层析分离石油醚提取部位，用15∶1的石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到β-谷甾醇提取部位。利用HPLC方法测定该部位β-谷甾醇的含量，使用Diamonsil C18色谱柱(200x 4.6，5μm)，流动相甲醇，流速1.0毫升/分钟，检测波长为210nm。β-谷甾醇标准品浓度为1.0mg/ml，测试样品的浓度为1.37mg/ml，HPLC外标测定。结果：该部位中β-谷甾醇的含量范围70-80％。

实施例

取木波罗干叶子3公斤，用75％乙醇水溶液加热回流提取3次，每次溶剂用量为30升。合并提取液，蒸干得到乙醇总提取物335克。

把乙醇提取物加入33升水混悬，然后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚提取部位62g、乙酸乙酯提取部位131g和正丁醇提取部位38g。

总黄酮的提取过程是把木波罗的乙酸乙酯提取部位(131克)用200-300目硅胶柱进行层析。使用石油醚和乙酸乙酯混合溶液进行洗脱，用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1洗脱，样品约20克，为总黄酮有效部位。

通过硝酸铝比色法，测试波长500nm，测定所获得的总黄酮有效部位中总黄酮含量达到62.4％。

用HPLC测定总黄酮里活性化合物含量为：(2-geranyl-2、3、4、4’-tetrahydroxychalcone)16.5％，(8-geranyl-4、5、7-tirhydroxyflavone)13.1％.((1-(2，4-Dihydroxyphenyl)-3-(8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl)-1-propanone)5.5％。

利用HPLC方法测定使用硅胶树脂柱层析分离石油醚提取部位得到的β-谷甾醇提取部位中的β-谷甾醇含量为76.55％。

本发明公布了作为心血管病药品的木波罗有效部位总黄酮与β-谷甾醇的制备方法和药效试验。木波罗提取物用做心血管病药物，人使用的剂量是每天40至80mg总黄酮/体量及β-谷甾醇剂量达每天8-16mg/体量。

木波罗提取物药效实验

应用了3种细胞模型，即内皮细胞、U937细胞-衍生泡沫细胞(derived foamcells)和心肌细胞模型，对所获得的各提取组分进行体内生物活性研究，以了解木波罗提取物抗心脑血管病的作用。

1、抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)所致人脐静脉内皮细胞损伤实验

从人脐带静脉获取内皮细胞，然后在含有20％胎牛血清、100U/ml青毒素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中，放在37℃、5v％CO₂培养箱里培养4至5天，直至融合。用0.25％胰酶作用5分钟，将细胞消化下来。加以上培养基(5x5体积)中断胰蛋白酶的消化反应，离心(1200rpm，5分钟)，去掉含有胰酶的培养基。底部的内皮细胞中加入新的培养基，并把细胞吹匀，然后将细胞悬浮液分配到96孔培养板中，每孔细胞密度约为2x10⁵ cell/ml，分为4组，即：

a)正常组：只有培养基；b)模型组-氧化修饰低密度脂蛋白组(Ox-LDL)：含有100μg/ml ox-LDL；c)阳性药物组：含有100μg/ml ox-LDL和Simvastatin10μM；d)样品组：含有100μg/ml ox-LDL、木波罗有效部位＞10μg/ml，100μg/ml为好。

在5v％CO₂培养箱里24小时后，每孔加10μl(0.1％)WST-1试剂，然后在同样条件再培养2小时。使用酶标仪测量光密度值OD 440nm(λref：700nm)。

2、抗氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)所致人U937细胞泡沫化损伤实验

在含有20％胎牛血清、100U/ml青毒素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺和12mM碳酸钠的RPMI 1640培养基中U937细胞，放在37℃、5v％CO₂培养箱里培养。融合后，细胞先在96孔培养板里生长，每孔板密度2x10⁵cell/ml，分成4组，a)对照组：只含有培养基；模型组：含有100μg/ml ox-LDL；c)阳性：含有100μg/ml ox-LDL和阳性药物Simvastatin＞10μM；d)样品组：含有100μg/ml ox-LDL和木波罗有效部位100μg/ml。

在37℃、5v％CO₂培养箱里24小时后，每孔加10μl(0.1％)WST-1试剂，再放在CO₂培养箱中培养2小时，应用酶标仪测量波长440nm的吸收率在(λref：700nm)。

3、抗大鼠心肌肥厚细胞实验

从1天新生鼠心脏分离得到的心肌细胞，在96孔板中培养，然后在37℃、5v％CO₂培养箱里，孵化48个小时，分成4个组：a)对照组：只含有培养基；b)模型组：含有血管紧张素II 1μM；c)阳性对照：含有Angiotensin II 1μM和阳性药物Saralasin 1μM；d)药物组：含有Angiotensin II 1μM和木波罗提取物1001μg/ml。

在37℃、5v％CO₂培养箱里24小时后，取胰蛋白酶消化每孔细胞，用0.1％SDS裂解细胞，采用Bradford法测定蛋白含量实验，波长595nm(λref：700nm)，由此确定蛋白质含量。

16种提取物的细胞实验结果见表1：木波罗中A1、A9、A20三种提取物在三种细胞模型中均有效，继续分离提取物中得出总黄酮和β-谷甾醇对以上三种模型均有效。

表1木波罗提取物体内生物活性研究结果

A1

A2

A3

A4

A5

A6

A7

Endothelial cell

√

·

U937

√

·

√

·

Cardiac myocytes

√

·

A11

A12

A13

A14

A15

A16

A17

Endothelial cell

√

·

√

·

U937

·

·√

·

Cardiac myocytes

√

√：有活性，·：没有活性

将具有生物活性的有效部位进行柱层析分离，然后使用NMR、MS、IR和UVSpectra进行结构鉴定。结果显示生物活性化合物属甾醇类(β-谷甾醇)和黄酮类。属于黄酮类的活性化合物至少有：

*1-(2，4-Dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1benzopyran-5-yl]-1-propanone

*8-geranyl-4’，5，7-tirhydroxyflavone

*2-geranyl-2’，3，4，4’-tetrahydroxychalcone

为开发木波罗有效部位作为心血管病药品，进一步做药理实验和临床前研究，包括急性中毒试验、血小板聚集试验、血粘性试验、和血栓形成试验，结果表明该提取物具有抑制血小板聚集、抗血栓形成和保护心肌细胞的作用。使用4种配比的黄酮化合物与β-谷甾醇提取物，包括高剂量的类黄酮、低剂量类黄酮与中剂量β-谷甾醇、中剂量类黄酮与高剂量β-谷甾醇和高剂量类黄酮与低剂量β-谷甾醇。

1、木波罗提取物对血栓形成的影响实验

成年雄鼠，体重250g-300g，分成5组(每组n＝9)，每天一次，灌胃NaCl/阿司匹林/DMSO/木波罗有效部位溶液，共灌胃4天，动物分组情况是：a)正常NaCl组：0.9％NaCl 2mL/只；b)阿司匹林组(68mg/公斤体重)；c)DMSO小组(木波罗所用溶剂)：2ml DMSO 20％/只；d)β-谷甾醇组：20mg/公斤体重；e)总黄酮组：200mg/公斤体重。

在实验的第五天，取大鼠称重，1％戊巴比妥钠4ml/kg麻醉，分离一侧颈外静脉，插管备用；腹部正中切开后将大鼠放入标本盒，轻轻拉出肠系膜浸入装有温热生理盐水的标本槽内。打开荧光显微镜、监视器、记时器、采集软件(videocatch3.1)，并将动物肠系膜标本置于荧光显微镜下，找出约20-40μm粗的静脉作为目标血管进行观察。同时通过颈外静脉注入2.5％荧光素钠溶液，流到肠系膜的微静脉，将波长490nm的激发光集中到目标微静脉，激发荧光素钠溶液变成为荧光性氧自由基。已形成的氧自由基将破坏内皮组织，血小板粘附在受伤的内皮上，导致血栓形成。记录每组大鼠形成血栓的过程和时间，进行数据处理。

试验所用木波罗总黄酮和β-谷甾醇混合物的4个组合公式如下：

1)HT组F：高剂量总黄酮(200mg/kg)，

2)LTF+MBS组：低剂量总黄酮(50mg/kg)和中剂量β-谷甾醇(10mg/kg)

3)MTF+HBS组：中剂量总黄酮(100mg/kg)和高剂量β-谷甾醇(20mg/kg)

4)HTF+LBS组：高剂量总黄酮(200mg/kg)和中剂量β-谷甾醇(5mg/kg)

阿司匹林、地奥，和银杏作为对照。体内生物活性研究结果显示，β-谷甾醇和特定剂量黄酮具有延长血栓形成的作用。结果见图1。

通过以上的实验可知，低剂量总黄酮与中剂量β-谷甾醇组和低剂量总黄酮与中剂量β-谷甾醇组对实验动物血栓形成有一定的延缓作用，说明该提取物具有很好的抗血栓作用，能预防血栓的异常形成。

2、木波罗提取物小鼠最大耐受量试验

进行毒性试验的目的是利用雌雄小白鼠了解药物的安全剂量，一天一次灌胃高剂量的木波罗有效部位，连续14天，所用剂量为：类黄酮剂量为4.5g/kg.体重，或者大约达到400x成年人的临床剂量为10mg/kg体重；β-谷甾醇剂量为2.5g/kg.体重，或者大约达到125x成年人的临床剂量为2mg/kg.体重。

在第3、第7，第14天观察小鼠，包括体重、死亡率和行动(走路、吃饭和喝水的能力，以及观察眼睛和毛的明亮)。

实验结果：小鼠在给药后无异常反应，在14天的观察期内未见有小鼠死亡，雌雄小鼠的体重均有增长，表明该提取物无明显毒性。

3、木波罗提取物对ADP诱导的血小板聚集的影响实验

抗血小板聚集试验是用大鼠的富含血小板血浆(Platelet Rich Plasma，简称PRP)和贫血小板血浆(Platelet Poor Plasma，简称PPP)对进行试验，采用腺二磷酸(Adenosin Diphosphat，简称ADP)进行刺激，使用血小板聚集仪进行测试分析。

成年雄鼠(体重250克至300克)分成7组：a)NaCl组(正常剂量)：0.9％NaCl2ml；b)阿司匹林组：剂量312.5mg/kg.体重；c)银杏小组：剂量5.76mg/kg.体重；d)高剂量总黄酮(HTF)组：剂量200mg/kg.体重；e))低剂量总黄酮LTF，剂量50mg/kg.体重和中剂量的β-谷甾醇(MB)，剂量10mg/kg.体重；f)中剂量总黄酮(MTF)，剂量100mg/kg.体重和高剂量的β-谷甾醇(HB)，剂量达到20mg/kg.体重；g)高剂量总黄酮(HTF)组，剂量200mg/kg.bw和低剂量的β-谷甾醇(LB)，剂量达到5mg/kg.体重。

在第7天，从腹主动脉采取血液，立即对血液进行离心(800rpm，10分钟)，以获得富含血小板血浆。对上清液在2000rpm进行10，以获得贫血小板血浆。将10μl腺二磷酸(33.3μM)分别加入300μl的富血小板血浆或贫血小板血浆，立即上血小板聚集仪进行分析。

实验结果见表2：与正常对照组比较，阿司匹林组、银杏组、低剂量总黄酮与中剂量β-谷甾醇组和中剂量总黄酮与高剂量β-谷甾醇组的大鼠ADP诱导的血小板聚集有显著性差异，可见总黄酮与β-谷甾醇具有较好的抗血小板聚集作用，提示有抗血栓作用。

表2：木波罗提取物对ADP诱导的血小板凝集的影响

**：P＜0.01vs.对照组

4、木波罗提取物对血粘度的影响实验

利用血液粘度计进行血粘度试验：成年雄鼠(250g至300g)，分成7组：a)NaCl组：剂量0.9％NaCl 2ml；b)阿司匹林组：剂量312.5mg/kg.体重；c)银杏组：剂量达到5.76mg/kg.体重；d)高剂量总黄酮(HTF)组：剂量达到200mg/kg.体重；e)低剂量总黄酮(LTF)组，剂量50mg/kg.体重和中剂量β-谷甾醇(MB)，剂量达到10mg/kg.体重；f)中剂量总黄酮(MTF)组，剂量100mg/kg.体重和高剂量的β-谷甾醇(HB)，剂量达到20mg/kg.体重；g)高剂量总黄酮(HTF)组，剂量200mg/kg.体重和低剂量的β-谷甾醇(LB)，剂量达到5mg/kg.体重。

在第7天，从眼框收集血液。为避免发生凝血，每3ml血液加入60μl肝素(40u/ml)，然后到粘度计进行测定

实验结果见表3：与正常对照组比较，低剂量黄酮与中剂量β-谷甾醇组、阿司匹林组和银杏组的大鼠全血粘度有非常显著性差异(P＜0.01)，中剂量黄酮与高剂量β-谷甾醇组的大鼠全血粘度有显著性差异(P＜0.05)。

表3木波罗提取物对血粘度的影响(X±SD，n＝10)

*：p＜0.05；**：p＜0.01vs.生理盐水组

根据以上试验结果示，总黄酮和β-谷甾醇提取物有具有阻止血小板聚集，降低血粘性，保护内皮细胞和心肌细胞以及抑制血栓的形成，可用做抗心血管病药物。

大鼠木波罗提取物有效剂量：总黄酮50mg/kg-100mg/kg，β-谷甾醇10mg/kg-20mg/kg。根据动物试验结果，可推算体重70公斤人的用药剂量。

下面的公式是用于总黄酮和β-谷甾醇人较高剂量的计算：

a)总黄酮：100x56＝每天达5600mg(体重达70公斤)。

b)β-谷甾醇：20x56＝每天达1120mg(体重达70公斤)。

下面的公式是用于总黄酮和β-谷甾醇人较低剂量的计算：

a)总黄酮：50x56＝每天达2800mg(体重达70公斤)。

b)β-谷甾醇：10x56＝每天达560mg(体重达70公斤)。

5、木波罗提取物微生物和重金属限量分析

该提取有效部位的分析结果见表4，木波罗叶乙醇提取部位中有机氯和有机磷类型的农药残留量为阴性，未检测出Pb、Hg和As重金属，未检出病原菌微生物。

表4、木波罗叶乙醇提取部位微生物和重金属限量分析

No	化学参数
				1	有机氯农药		阴性
2	有机磷农药		阴性
				3	Pb金属(ppm)		未测出
4	Hg金属(ppb)		未测出
				5	As金属(ppm)		未测出
6	水份		8.12％
				7		Total slab number	7.2x100/ml
8		Total Plate Count forcolony number & mold	0/ml

9		金黄色葡萄球菌	阴性
				10		大肠杆菌	阴性

Claims

1.一种治疗心脑血管疾病的木波罗提取物，其特征在于，它是从木波罗叶子中提取出来的β-谷甾醇提取部位和黄酮提取部位，β-谷甾醇提取部位质量的70％-80％为β-谷甾醇，黄酮提取部位质量的50％-65％为总黄酮，且总黄酮中，主要的活性化合物及含量为：

2-geranyl-2、3、4、4’-tetrahydroxychalcone，含量，15-20％；

8-geranyl-4、5、7-trihydroxyflavone，含量10-15％；

1-(2，4-Dihydroxyphenyl)-3-(8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl)-1-propanone，含量5-8％。

2.一种权利要求1所述木波罗提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)乙醇提取木波罗叶子，得木波罗乙醇总提取物：取木波罗叶子，阴干；然后用体积百分比为75％的乙醇溶液加热回流提取3～5次，每次乙醇溶液的用量为10～15升/公斤叶子；合并提取液，减压蒸干，得到木波罗乙醇总提取物；

(2)粗分离木波罗乙醇总提物，得石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位：取木波罗乙醇总提取物置于水中混悬，每100克提取物用水10～12升，然后依次用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3～5次，每次溶剂用量与水的体积相同；各萃取液减压蒸干，分别得到石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位；

(3)纯化分离石油醚提取部位和乙酸乙酯提取部位，得到治疗心脑血管疾病的木波罗提取物：β-谷甾醇和黄酮：把石油醚提取部位拌入硅胶，用200～300目硅胶柱进行分离精制，然后用体积比为15∶1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液洗脱，混合溶液体积为柱体积的4～5倍，得到有效部位：β-谷甾醇提取部位；把乙酸乙酯提取部位拌入硅胶，用200～300目硅胶柱进行分离精制，依次用体积比为5∶1、3∶1的石油醚/乙酸乙酯混合溶液洗脱，混合溶液体积为柱体积的4～5倍，得到有效部位：黄酮提取部位。