CN101434976A - 一种糖化处理木质纤维素的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种糖化处理木质纤维素的新方法,包括稀酸预处理、球磨粉碎、纤维素酶复配和酶解糖化过程,具体方法为:将粉碎后的木质纤维素原料用H+浓度0.01mol/L~0.1mol/L的稀酸预处理、球磨粉碎后得到酸解糖液,将至少两种纤维素酶与木聚糖酶混合得到复配纤维素酶,并对酸解球磨后剩余的固体进行一步酶解糖化处理后得到酶解糖液。利用稀酸球磨和复配酶一步酶解结合的工艺,木质纤维素原料的水解糖得率可以高达90%以上。本方法具有反应条件温和、操作简单、酶解效率高,处理后得到的糖液对后续发酵无抑制、可以综合利用、无环境污染等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖化处理木质纤维素的新方法,具体涉及通过稀酸球磨、结合纤维素酶复配来提高纤维素酶催化木质纤维素糖化的方法,属于生物化工技术领域。
背景技术
乙醇是一种很有希望替代有限石油的燃料。日前燃料乙醇主要原料是粮食,然而粮食生产乙醇产量有限。真正可大量转化乙醇的应是纤维质材料。纤维质材料转化乙醇的挑战性问题是产量偏低、成本偏高。纤维质材料的预处理是转化乙醇过程中的关键步骤,该步骤的优化可明显提高纤维素的水解率,进而降低乙醇的生产成本。
对利用木质纤维素类物质生产乙醇工艺中,通常都要对木质纤维素进行预处理,此步骤的主要目的是改变木质纤维素的表面结构,破坏木质素和半纤维素构成的网络结构,脱去木质素,降低纤维素的结晶度。而目前已经实施产业化的木质纤维素预处理工艺主要有两类:酸水解和酶水解。单一酸或碱处理需要10%~77%左右的浓度,由于其污染重、腐蚀大、酸碱回收困难、后处理难度大等问题依然还在突破中。与酸水解相比,酶解法是近年来刚起步的新方法,由于其条件温和、效率高以及不存在污染等优势,成为全球公认的最有发展前景的方法之一。然而,纤维素酶的使用成本较高,而目前酶解转化的效率又低,这些都成为制约秸秆酶解发酵制备乙醇的关键因素。
纤维质材料必须经过预处理后,才能在纤维素的酶水解过程中获得较高的转化率,并且对前期工序和后期工序的成本都会产生重要影响。因为木质素、半纤维素对纤维素的保护作用以及纤维素本身的结晶结构,天然的纤维质原料直接进行水解时,其水解程度是很低的,即纤维素水解成糖的百分比很低。因此必需对木质纤维素原料进行一定的预处理,将木质素和半纤维素去除,减小纤维素的结晶度和增加多孔性,增大纤维素的可接触面积,进而提高水解效率。较好的预处理方法还可以减少酶的用量。因此提高酶催化效率以及降低酶用量从而降低成本都是目前木质纤维素糖化工艺存在的主要问题。
中国专利CN1806945公开了一种利用秸秆预处理和酶解工艺使秸秆纤维素完全酶解的方法,将秸秆首先经汽爆处理,然后用热水洗涤,除去半纤维素多糖,干燥后与离子液体混合,微波加热或直接加热,然后将处理后的秸秆用水反复冲洗,洗涤液中的溶剂可以通过蒸馏等方法回收,冲洗干净的处理秸秆在50℃下,pH4.8的缓冲液中用纤维素酶酶解48~72小时,纤维素的酶解率可达到100%,但是汽爆处理的上述缺陷仍然存在,且汽爆后仍需要加热,能耗极大,生产成本过高,且工艺繁琐;美国专利US5562777公开了一种强酸水解纤维素和半纤维素的方法,将浓度为70%~77%的浓硫酸与纤维素和半纤维素的混合物按1.25:1混合均匀后形成凝胶状,然后加水使凝胶物中的硫酸浓度稀释至20%~30%,然后加热至80℃~100℃,处理40min~480min,该工艺有效破坏了纤维素的结晶结构,有利于提高后续处理时纤维素的降解率,但该工艺同样存在处理温度高、强酸用量大、生产成本高等缺点;中国专利CN1970781公开了一种超声波协同改性纤维素酶催化木质纤维素糖化的方法,通过粉碎(20目)和碱处理(常温,3%~8%)分离原料中的木质素,用活化后的单甲氧基聚乙二醇与纤维素酶在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中反应得到改性纤维素酶,将改性纤维素酶与β-葡萄糖苷酶、淀粉酶和果胶酶混合得到复配酶液,将复配酶按照相应的比例加入预处理后的原料中,配合超声波(80W~300W)进行酶催化反应,最后经过滤、减压蒸发,得到浓缩糖液(25%~35%),该方法采用酶改性结合复配的方法,提高了综纤维素的转化率,但该方法的碱液浓度过大,对生产设备的维护保养和生产成本造成了巨大压力,由于前期碱处理效果不良,造成了后期酶解工艺的复杂化,超声处理和减压等操作进一步增加了能耗及生产成本;中国专利CN101255479公开了一种将木质纤维素高效糖化的预处理方法,具体涉及一种常温低浓度碱液预处理木质纤维素的方法,其优点在于整个操作不需要加热,且利用浓度为0.1%~3%的超低浓度碱液湿磨的预处理方式,而且碱液可以回收使用,大大节约了操作成本,但是该方法对酶的使用未作优化,使得其酶解效率相对低下;中国专利CN101092639公开了一种生物酶降解糖化作物秸秆的方法,将经粉碎后的秸秆采用微生物和稀酸联合预处理后,再用中性木聚糖酶和酸性纤维素酶进行降解糖化,且其纤维质的酶水解分两步进行,该方法转化率较高,污染轻,但是在预处理阶段采用微生物发酵和稀酸联合处理,一定程度上延长了操作时间,而且酶水解分两步进行,并不算是实质上的复配操作,其繁琐的工艺和冗长的时间,并不适用于工业化大生产。
现有技术存在的问题可归结为:(1)大多工艺需要使用高温高压处理方法,能耗高、糖收率低;(2)化学处理与蒸汽爆破、超声波、微生物发酵等特殊操作结合提高了处理效果,但是生产成本也相应增加;(3)预处理阶段普遍使用酸处理或碱处理方法,但酸/碱浓度均高于3%,对设备的耐腐蚀性能要求较高,因而增加了维护和保养费用,以及酸/碱的大量使用,以及未反应的酸/碱无法回收等问题,均增加了生产成本;(4)有的方法虽然提到了酶复配,但是没有一个可以定量说明和分析酶复配的方法,而且酶解效率提高不明显,仍需要在超声波等辅助条件下操作,无形中进一步增加了操作成本;(5)或者有的工艺使用了复配酶,但是酶解效率不高,仍需要再进行二次单酶酶解,并不能达到省时省力、节约经济的目的。因此,改进预处理方法是目前木质纤维素预处理的关键问题以及发展方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种糖化处理木质纤维素的新方法,通过该方法具有反应条件温和、操作简单、酶解效率高,处理后得到的糖液对后续发酵无抑制、可以综合利用、无环境污染等特点。
为达到以上目的,本发明是通过以下技术方案实现的:
一种糖化处理木质纤维素的新方法,其特征在于包括稀酸预处理、球磨粉碎、纤维素酶复配和酶解糖化过程:将粉碎后的木质纤维素原料用稀酸在常温下浸泡预处理、球磨粉碎后得到酸解糖液,将至少两种纤维素酶与木聚糖酶混合得到复配纤维素酶,并对酸解球磨后剩余的固体进行一步酶解糖化处理后得到酶解糖液。
本发明技术方案的具体步骤包括:
(1)稀酸预处理
将木质纤维素原料进行粗粉碎,取粉碎后的原料按照1:5~1:15(kg:L)的比例与H+浓度为0.01mol/L~0.1mol/L的稀酸在常温下浸泡4h~12h;
(2)球磨粉碎
将稀酸浸泡后的原料加入球磨罐,装料量为球磨罐容积的50%~80%,其中研磨介质填充率为10%~50%,装入球磨机进行球磨,球磨15min~30min后,用一价金属碱液溶液或者Ca(OH)2中和、过滤、水洗,得到酸解糖液;
(3)纤维素酶复配
确定各种纤维素酶的滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶酶活,以及木聚糖酶的酶活后,将至少两种纤维素酶与木聚糖酶按照
滤纸酶活:CMC酶活:β-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:(1~3):(100~130):(0~55)的比例混合,得到各酶系比例一定的复配纤维素酶;
(4)酶解糖化
向球磨后过滤得到的固体中以料液比1:5~1:15加入标准柠檬酸缓冲液,调节pH值为4.5~5.0,反应温度50℃,按照5.0~30.0FPIU(滤纸酶活)/g纤维素的量加入第(3)步的复配纤维素酶,搅拌酶解36h~50h后过滤得到酶解糖液。
本发明所述的木质纤维素原料包括秸秆类、草类、木材类、玉米芯、甘蔗渣、或者其它各种粮食和水果加工残渣;
本发明所述的稀酸预处理步骤中使用的稀酸溶质包括HCl或H2SO4;
本发明所述的一价金属碱液溶液包括NaOH溶液、KOH溶液。
本发明所得的酸解糖液含有半纤维素分解得到木糖和葡萄糖,酶解糖液含有纤维素分解得到的葡萄糖,将两种糖液合并后,可以将其减压蒸发浓缩,直接用于燃料乙醇的发酵生产。
本发明的有益效果在于:
(1)整个糖化处理工艺在常温下进行,而且不需要任何的诸如超声波、蒸汽爆破、超声波、微生物发酵等辅助操作,既避免了高温高压,又缩短了整个工艺的操作时间,且采用的超低浓度的稀酸处理方法,避免了浓酸浓碱的处理过程,设备损耗和成本低,污染小;
(2)采用对超低浓度稀酸预处理后的木质纤维素原料进行湿磨的方法,不仅可以将包裹在纤维外表面起保护作用的木质素破坏掉,使木质纤维原料微观结构更加松散破坏其晶体结构增加纤维素酶的接触比表面积,而且可以将木质素半纤维素少量水解,更有利于后续纤维素水解酶的作用;
(3)纤维素酶是多组分的复合酶系,主要包括三种组分:内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶,每一组分又有若干亚组分组成。纤维素水解生成葡萄糖的过程必须依靠这三组分的协同作用才能完成,单独的都不能有效降解天然纤维素。目前人们比较认同的纤维素酶协同作用观点认为:内切葡聚糖酶优先水解底物的较小部分,然后作用于纤维素分子的非结晶区,剪切纤维素产生很多非还原性末端,但它不易于作用于结晶区;外切葡聚糖酶可从纤维素的非还原端以纤维二糖为单位,将纤维素分子进一步水解,可释放葡萄糖或纤维二糖,纤维三糖单元,纤维二糖对外切酶和内切酶有强烈抑制作用;β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解为葡萄糖,从反应混合物中除去抑制剂。
由于产纤维素酶的微生物不同,因此每种微生物所产的纤维素酶浓度和酶系比例都有差异,即市售和发酵得到的各种纤维素酶的三种酶系的含量都是有差异的。利用将不同种纤维素酶复配的方法得到的内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的比例一定的复配纤维素酶,并结合木聚糖酶对半纤维素的酶解,克服了现有技术中粗放地对酶的使用,不仅精确计算了用酶总量的问题,避免了对酶的浪费,而且可消除使用单一的纤维素酶的个体差异性,显著提高了复合酶对木质纤维素的水解效率,保证了工厂各批次生产的稳定性;
(4)由于稀酸处理后的原料经过湿磨处理后,已经破坏了原半纤维素和纤维素的结构,因此,为复配酶的有效酶解提供了便利,采取湿磨法与复配酶的酶解双重处理方法,可以使复配酶一次性彻底酶解酸解后剩余的纤维素和半纤维素,无需现有技术中使用的两步酶解操作,因此大大提高了酶解效率缩短酶解时间,进一步节省了操作成本和时间。利用稀酸球磨和复配酶一步酶解结合的工艺,木质纤维素原料的水解糖得率可以高达90%以上;
(5)酸解和酶解的糖液合并后最终得到的糖化液可以直接用于发酵生产乙醇,且不含对发酵酵母有害的毒性成分,为乙醇发酵工业进一步减低了操作成本。
具体实施方式
本发明实施例中使用到的相关计算公式和测定方法如下:
1、水解液中糖浓度测定:
DNS(3,5-二硝基水杨酸)法。
2、滤纸酶活力的测定——纤维素酶的总体酶活力测定:
采用国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法测定[Ghose,T.K.,et al.Pure& Appl.Chem.,1987,59,257~268],一个滤纸酶活力的国际单位(FPIU)等于在标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖量的酶量。测定方法如下:
取6支试管在其中1#~5#支小试管中加入50mg卷成筒状的滤纸条,适当稀释酶液,取6支试管按表1操作:
表1 滤纸酶活力的测定操作标准
注:5#有底物无酶,6#为有酶无底物空白对照
将上述试管置于恒温水浴器中,保持在振幅100和温度50℃下保温60min后立即取出加入3mL DNS试剂,在沸水中反应5min,冷却后加水至25mL摇匀,于550nm波长下测定吸光度A值。反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得;
以0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标,酶量的对数为纵坐标作图,从图中找出生成2mg葡萄糖的酶量,按下式计算样品的滤纸酶活力(FPIU):
其中,一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量,单位:IU/mL。
3、羧甲基纤维素(CMC)酶活力测定——内切葡聚糖酶活力测定:
(1)在试管中加入0.5mL适当稀释的酶液和1.0mL用0.05mol/L柠檬酸缓冲液配制的1%(w/v)羧甲基纤维素悬浮液;
(2)将试管置于恒温水浴器中,保持在振幅100和温度50℃下保温30min后立即取出加入3mL DNS试剂,在100℃沸水中煮沸5min,冷却到室温后,加水定容至25mL,充分摇匀后于550nm波长下测定吸光度A值;
(3)反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。按下式计算CMC酶活力:
一个CMC酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量,单位:IU/mL。
4、β-葡萄糖苷酶酶活测定:
采用pNPG(对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷)试剂测定。
一个β-葡萄糖苷酶酶活力单位定义为:每分钟水解生成1μmol对硝基苯酚所需要的酶量。计算公式如下:
5、木聚糖酶活力的测定
用0.05mol/L柠檬酸缓冲液配制的1%(w/v)桦木木聚糖(Sigma公司制造)溶液。适当稀释酶液,取6支25mL刻度试管按表2操作(5#有底物无酶、6#为有酶无底物空白对照):
表2 木聚糖酶活力的测定操作标准
注:5#有底物无酶、6#为有酶无底物空白对照
将上述试管置于恒温水浴器中,保持在振幅100和温度50℃下保温30min后立即取出加入3mL DNS试剂,在沸水中反应5min,冷却到室温后,加水到25mL,摇匀后于550nm波长下测定吸光度A值。计算反应所产生的木糖量;
以0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL酶量所生成木糖的毫克数为横坐标,酶量的对数为纵坐标作图,从图中找出生成2mg木糖的酶量,按下式计算木聚糖酶活力:
一个木聚糖酶活力单位定义为每分钟生成1μmol木糖所需的酶量,单位:IU/mL。
6、水解糖得率的计算:
其中,综纤维素为纤维素和半纤维素的总称。
下面的实施例对本发明方法作详细说明,但对本发明没有限制。
实施例1
将玉米秸秆粉碎成0.5mm粒径。取3.00g粉碎好的原料,加入45mL H+浓度为0.1mol/L的HCl溶液室温浸泡8h后,用行星式球磨机球磨,60mL玛瑙球磨罐,转速340r/min,玛瑙研磨球装量为填充率为10%,交替运行间隔3min,球磨15min;原料经过球磨后,用10%的NaOH溶液中和后过滤、水洗,收集水洗液得到酸解糖液。
选择进行复配的纤维素酶和木糖酶:
A、纤维素酶Accellerase 1000(购自杰能科国际公司)
酶活测定结果为(/mL纤维素酶):滤纸酶活93FPIU,CMC酶活7.38IU,β-葡萄糖苷酶1632.9IU;
B、纤维素酶ZSL-1300(山东泽生生物科技公司)
酶活测定结果为(/mL纤维素酶):滤纸酶活77FPIU,CMC酶活17.35IU,B-葡萄糖苷酶1356.5IU;
C、木聚糖酶(山东泽生生物科技公司),酶活为964IU/mL。
将上述三种酶按体积配比为A:B:C=3:2:2的配比混合,得到滤纸酶活:CMC酶活:β-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:1:110:44的复配酶。
向球磨原料中加入标准柠檬酸缓冲液,调节pH值为4.8,料液比1:8,按照5.0FPIU(滤纸酶活)/g纤维素加入复配酶,置恒温震荡水浴锅50℃,100r/min,搅拌酶解36h。
酶解液用布氏漏斗过滤分离,该酶解糖液和酸解糖液合并后经减压蒸发浓缩后可以直接用于燃料乙醇的发酵工艺。通过测量水解液中糖浓度,可以算出木质纤维原料水解后糖得率91.1%。
实施例2
将锯末粉碎成0.5mm粒径。取3.00g粉碎好的原料,加入30mL H+浓度为0.01mol/L的H2SO4溶液室温浸泡12h后,用行星式球磨机球磨,60mL玛瑙球磨罐,转速340r/min,玛瑙研磨球填充率为50%,交替运行间隔3min,球磨30min;原料经过球磨后,用10%的Ca(OH)2溶液中和后过滤、水洗,收集水洗液得到酸解糖液。
选择进行复配的纤维素酶和木糖酶:
A、纤维素酶R-10(购自上海楷洋生物技术有限公司)
酶活测定结果为(/g纤维素酶):滤纸酶活9FPIU,CMC酶活24IU,β-葡萄糖苷酶859IU;
B、纤维素酶(购自无锡高润洁生物工程有限公司)
酶活测定结果为(/g纤维素酶):滤纸酶活22FPIU,CMC酶活7.8IU,β-葡萄糖苷酶919.5IU;
C、纤维素酶EN0029(购自上海斯高勒生物科技有限公司)
酶活测定结果为(/g纤维素酶):滤纸酶活52FPIU,CMC酶活105IU,β-葡萄糖苷酶910.5IU;
D、木聚糖酶(购自宁夏和氏璧生物技术有限公司),酶活为1246IU/g。
将上述四种酶按体积配比为A:B:C:D=3:2:4:3的配比混合,得到滤纸酶活:CMC酶活:β-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:2:130:55的复配酶。
向球磨原料中加入标准柠檬酸缓冲液,调节pH值为5.0,料液比1:15,按照30FPIU(滤纸酶活)/g纤维素加入复配酶,置恒温震荡水浴锅50℃,100r/min,搅拌酶解50h。
酶解液用布氏漏斗过滤分离,该酶解糖液和酸解糖液合并后经减压蒸发浓缩后可以直接用于燃料乙醇的发酵工艺。通过测量酶解后固体残渣质量,可以算出木质纤维原料水解后糖得率94.1%。
实施例3
将椰壳粉碎成2.5mm粒径。取160.0g粉碎好的原料,加入800mL H+浓度为0.01mol/L的H2SO4室温浸泡4h后,用行星式球磨机球磨,1000mL玛瑙球磨罐,转速390r/min,玛瑙研磨球填充率为50%,交替运行间隔3min,球磨15min;原料经过球磨后,用10%的KOH溶液中和后过滤、水洗,收集水洗液得到酸解糖液。
选择进行复配的纤维素酶和木糖酶:
A、纤维素酶Accellerase 1000(购自杰能科国际公司)
酶活测定结果为(/mL纤维素酶):滤纸酶活93FPIU,CMC酶活7.38IU,β-葡萄糖苷酶1632.9IU;
B、纤维素酶(购自无锡高润洁生物工程有限公司)
酶活测定结果为(/g纤维素酶):滤纸酶活22FPIU,CMC酶活7.8IU,β-葡萄糖苷酶919.5IU;
C、纤维素酶EN0029(购自上海斯高勒生物科技有限公司)
酶活测定结果为(/g纤维素酶):滤纸酶活52FPIU,CMC酶活105IU,β-葡萄糖苷酶910.5IU;
将上述四种酶按体积配比为A:B:C=2:5:3的配比混合,得到滤纸酶活:CMC酶活:β-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:1:100:0的复配酶。
向球磨原料中加入标准柠檬酸缓冲液,调节pH值为4.5,料液比1:5,按照5.0FPIU(滤纸酶活)/g纤维素加入复配酶,置恒温震荡水浴锅50℃,100r/min,搅拌酶解36h。
酶解液用布氏漏斗过滤分离,该酶解糖液和酸解糖液合并后经减压蒸发浓缩后可以直接用于燃料乙醇的发酵工艺。通过测量酶解后固体残渣质量,可以算出木质纤维原料水解后糖得率92.3%。
实施例4
将甘蔗渣粉碎成0.5mm粒径。取80g粉碎好的原料,加入800mL H+浓度为0.08mol/LHCl溶液室温浸泡8h后,用行星式球磨机球磨,1000mL玛瑙球磨罐,转速400r/min,玛瑙研磨球填充率为10%,交替运行间隔3min,球磨15min;原料经过球磨后,用10%的NaOH溶液中和后过滤、水洗,收集水洗液得到酸解糖液。
选择进行复配的纤维素酶和木糖酶:
A、纤维素酶EN0029(购自上海斯高勒生物科技有限公司)
酶活测定结果为(/g纤维素酶):滤纸酶活52FPIU,CMC酶活105IU,β-葡萄糖苷酶910.5IU;
B、纤维素酶ZSL-1300(购自山东泽生生物科技公司)
酶活测定结果为(/mL纤维素酶):滤纸酶活77FPIU,CMC酶活17.35IU,β-葡萄糖苷酶1356.5IU;
C、木聚糖酶(购自山东泽生生物科技公司),酶活为964IU/mL。
将上述三种酶按体积配比为A:B:C=4:2:5配比混合,得到滤纸酶活:CMC酶活:β-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:2:125:45的复配酶。
向球磨原料中加入标准柠檬酸缓冲液,调节pH值为4.8,料液比1:15,按照30FPIU(滤纸酶活)/g纤维素加入复配酶,置恒温震荡水浴锅50℃,100r/min,搅拌酶解50h。
酶解液用布氏漏斗过滤分离,该酶解糖液和酸解糖液合并后经减压蒸发浓缩后可以直接用于燃料乙醇的发酵工艺。通过测量酶解后固体残渣质量,可以算出木质纤维原料水解后糖得率95.1%。
实施例5
将稻草粉碎成3.5mm粒径。取4.00g粉碎好的原料,加入40mL H+浓度为0.04mol/L的HCl溶液室温浸泡8h后,用行星式球磨机球磨,60mL玛瑙球磨罐,转速340r/min,玛瑙研磨球填充率为10%,交替运行间隔3min,球磨15min;原料经过球磨后,用10%的NaOH溶液中和后过滤、水洗,收集水洗液得到酸解糖液。
选择进行复配的纤维素酶和木糖酶:
A、纤维素酶Accellerase 1000(购自杰能科国际公司)
酶活测定结果为(/mL纤维素酶):滤纸酶活93FPIU,CMC酶活7.38IU,β-葡萄糖苷酶1632.9IU;
B、纤维素酶EN0029(购自上海斯高勒生物科技有限公司)
酶活测定结果为(/g纤维素酶):滤纸酶活52FPIU,CMC酶活105IU,β-葡萄糖苷酶910.5IU;
C、木聚糖酶(购自山东泽生生物科技公司),酶活为964IU/mL。
将上述三种酶按体积配比为A:B:C=2:3:2配比混合,得到滤纸酶活:CMC酶活:β-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:1:115:35的复配酶。
向球磨原料中加入标准柠檬酸缓冲液,调节pH值为4.8,料液比1:8,按照5.0FPIU(滤纸酶活)/g纤维素加入复配酶,置恒温震荡水浴锅50℃,100r/min,搅拌酶解36h。
酶解液用布氏漏斗过滤分离,该酶解糖液和酸解糖液合并后经减压蒸发浓缩后可以直接用于燃料乙醇的发酵工艺。通过测量酶解后固体残渣质量,可以算出木质纤维原料水解后糖得率95.7%。
实施例6
将玉米芯粉碎成1.5mm粒径。取5.00g粉碎好的原料,加入30mL0.2%的HCl溶液室温浸泡4h后,用行星式球磨机球磨,60mL玛瑙球磨罐,转速340r/min,玛瑙研磨球填充率为40%,交替运行间隔3min,球磨30min;原料经过球磨后,用10%的NaOH溶液中和后过滤、水洗,收集水洗液得到酸解糖液。
选择进行复配的纤维素酶和木糖酶:
A、纤维素酶R-10(购自上海楷洋生物技术有限公司)
酶活测定结果为(/g纤维素酶):滤纸酶活9FPIU,CMC酶活24IU,β-葡萄糖苷酶859IU;
B、纤维素酶(购自无锡高润洁生物工程有限公司)
酶活测定结果为(/g纤维素酶):滤纸酶活22FPIU,CMC酶活7.8IU,β-葡萄糖苷酶919.5IU;
C、纤维素酶ZSL-1300(购自山东泽生生物科技公司)
酶活测定结果为(/mL纤维素酶):滤纸酶活77FPIU,CMC酶活17.35IU,β-葡萄糖苷酶1356.5IU;
D、木聚糖酶(购自山东泽生生物科技公司),酶活为964IU/mL。
将上述四种酶按体积配比为A:B:C:D=4:3:1:3的配比混合,得到滤纸酶活:CMC酶活:β-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:3:120:45的复配酶。
向球磨原料中加入标准柠檬酸缓冲液,调节pH值为4.5,料液比1:15,按照15.0FPIU(滤纸酶活)/g纤维素加入复配酶,置恒温震荡水浴锅50℃,100r/min,搅拌酶解45h。
酶解液用布氏漏斗过滤分离,该酶解糖液和酸解糖液合并后经减压蒸发浓缩后可以直接用于燃料乙醇的发酵工艺。通过测量酶解后固体残渣质量,可以算出木质纤维原料水解后糖得率93.1%。
实施例7
将芦苇粉碎成1.0mm粒径。取3.00g粉碎好的原料,加入45mL H+浓度为0.01mol/L的H2SO4溶液室温浸泡8h后,用行星式球磨机球磨,60mL玛瑙球磨罐,转速390r/min,玛瑙研磨球填充率为20%,交替运行间隔3min,球磨15min;原料经过球磨后,用10%的NaOH溶液中和后过滤、水洗,收集水洗液得到酸解糖液。
选择进行复配的纤维素酶和木糖酶:
A、纤维素酶Accellerase 1000(购自杰能科国际公司)
酶活测定结果为(/mL纤维素酶):滤纸酶活93FPIU,CMC酶活7.38IU,β-葡萄糖苷酶1632.9IU;
B、纤维素酶ZSL-1300(购自山东泽生生物科技公司)
酶活测定结果为(/mL纤维素酶):滤纸酶活77FPIU,CMC酶活17.35IU,β-葡萄糖苷酶1356.5IU;
将上述三种酶按体积配比为A:B:C=3:2配比混合,得到滤纸酶活:CMC酶活:β-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:2:119:0的复配酶。
向球磨原料中加入标准柠檬酸缓冲液,调节pH值为4.8,料液比1:8,按照25.0FPIU(滤纸酶活)/g纤维素加入复配酶,置恒温震荡水浴锅50℃,100r/min,搅拌酶解42h。
酶解液用布氏漏斗过滤分离,该酶解糖液和酸解糖液合并后经减压蒸发浓缩后可以直接用于燃料乙醇的发酵工艺。通过测量酶解后固体残渣质量,可以算出木质纤维原料水解后糖得率91.1%。
Claims (5)
1、一种糖化处理木质纤维素的新方法,其特征在于包括稀酸预处理、球磨粉碎、纤维素酶复配和酶解糖化过程:将粉碎后的木质纤维素原料用稀酸在常温下浸泡预处理、球磨粉碎后得到酸解糖液,将至少两种纤维素酶与木聚糖酶混合得到复配纤维素酶,并对酸解球磨后剩余的固体进行一步酶解糖化处理后得到酶解糖液。
2、根据权利要求1所述的一种糖化处理木质纤维素的新方法,其特征在于其具体步骤包括:
(1)稀酸预处理
将木质纤维素原料进行粗粉碎,取粉碎后的原料按照1:5~1:15(kg:L)的比例与H+浓度为0.01mol/L~0.1mol/L的稀酸在常温下浸泡4h~12h;
(2)球磨粉碎
将稀酸浸泡后的原料加入球磨罐,装料量为球磨罐容积的50%~80%,其中研磨介质填充率为10%~50%,装入球磨机进行球磨,球磨15min~30min后,用一价金属碱液溶液或者Ca(OH)2中和、过滤、水洗,得到酸解糖液;
(3)纤维素酶复配
确定各种纤维素酶的滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶酶活,以及木聚糖酶的酶活后,将至少两种纤维素酶与木聚糖酶按照
滤纸酶活:CMC酶活:β-葡萄糖苷酶酶活:木聚糖酶酶活=6:(1~3):(100~130):(0~55)的比例混合,得到各酶系比例一定的复配纤维素酶;
(4)酶解糖化
向球磨后过滤得到的固体中以料液比1:5~1:15加入标准柠檬酸缓冲液,调节pH值为4.5~5.0,反应温度50℃,按照5.0~30.0FPIU(滤纸酶活)/g纤维素的量加入第(3)步的复配纤维素酶,搅拌酶解36h~50h后过滤得到酶解糖液。
3、根据权利要求1或2所述的一种糖化处理木质纤维素的新方法,其特征在于所述的木质纤维素原料包括秸秆类、草类、木材类、玉米芯、甘蔗渣、或者其它各种粮食和水果加工残渣。
4、根据权利要求1或2所述的一种糖化处理木质纤维素的新方法,其特征在于所述的稀酸预处理步骤中使用的稀酸溶质包括HCl或H2SO4。
5、根据权利要求1或2所述的一种糖化处理木质纤维素的新方法,其特征在于所述的一价金属碱液溶液包括NaOH溶液、KOH溶液。
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