CN101432018A - Il-13结合剂 - Google Patents

Abstract

公开了与IL－13特异性结合并调节IL－13与IL－13受体和信号传递介质相互作用能力的物质(如抗体及其片段)。

Description

IL-13结合剂

背景

白细胞介素-13(IL-13)是由T淋巴细胞和肥大细胞分泌的细胞因子(McKenzie等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3735-39；Bost等(1996)Immunology 87：663-41)。IL-13和IL-4具有一些共有的生物活性。例如，IL-4或IL-13可以在B细胞中引起IgE同种型转换(Tomkinson等(2001)J.Immunol.166：5792-5800)。此外，已经报道了哮喘患者中提高的细胞表面CD23和血清CD23(sCD23)水平(Sanchez-Guererro等(1994)Allergy 49：587-92；DiLorenzo等(1999)Allergy Asthma Proc.20：119-25)。另外，IL-4或IL-13可以上调II类MHC和低亲和力IgE受体(CD23)在B细胞和单核细胞上的表达，引起增强的抗原呈递和受到调节的巨噬细胞功能(Tomkinson等，同上)。重要的是，IL-4或IL-13可以提高VCAM-1在内皮细胞上的表达，促进嗜酸性粒细胞(和T细胞)优先募集到呼吸道组织(Tomkinson等，同上)。IL-4或IL-13还可以提高呼吸道粘液分泌，这可能加重呼吸道的应答性(Tomkinson等，同上)。这些观察提示尽管IL-13不是诱导Th2发育所必需的，或者甚至不能诱导Th2发育，但IL-13可能是呼吸道嗜酸粒细胞增多和AHR的关键因素(Tomkinson等，同上；Wills-Karp等(1998)Science 282：2258-61)。

概述

我们已经发现了IL-13结合剂等，特别是能够以高亲和力和特异性与人IL-13和/或猕猴IL-13结合的抗IL-13抗体分子。在一个实施方案中，抗体分子降低至少一种与IL-13相关的活性，如炎性状况的调节。例如，抗IL-13抗体分子能与IL-13结合并调节(如抑制)IL-13和IL-13受体(如IL-13受体α1(“IL-13Rα1)、IL-13受体α2(“IL-13Rα2”)和/或白细胞介素-4受体α链(“IL-4Rα”))之间的相互作用(如结合)，从而降低或阻止信号转导。

IL13结合剂如抗IL-13抗体分子可以用于在体内调节(如抑制)至少一种IL-13相关活性。IL-13结合剂可以用于治疗或预防IL-13相关的疾病或改善其至少一种症状。示例性的IL-13相关疾病包括炎性疾病(如肺炎)、呼吸系统疾病(如哮喘(包括过敏性和非过敏性哮喘)、慢性栓塞性肺病(COPD))以及与呼吸道炎症相关的病症、嗜酸粒细胞增多、纤维化疾病(如囊性纤维化、肝纤维化和肺纤维化)、硬皮病、粘液产生过度、特应性疾病(如特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎和过敏性肠胃炎)、IL-13相关癌症(如白血病、成胶质细胞瘤或淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤)、胃肠道疾病(如炎性肠病)、肝疾病(如肝硬化)以及病毒感染。

IL-13结合剂可以是与IL-13，特别是哺乳动物IL-13(如人或非人灵长类IL-13)相互作用(如结合或抑制)的蛋白质(如抗体分子)、肽或支架结构域。抗体分子可以是分离的抗体分子。在一个实施方案中，结合剂为拮抗剂，如中和、降低和/或抑制一种或多种IL-13相关活性的结合剂，所述活性包括但不仅限于，诱导CD23表达、由人B细胞产生IgE、转录因子(如STAT蛋白(如STAT6蛋白))的磷酸化、体内抗原诱导的嗜酸粒细胞增多、体内抗原诱导的支气管收缩；或体内药物诱导的呼吸道高反应性等等。例如，结合剂对本文所述的一种或多种测定具有统计学上显著的效应。除了抗IL-13抗体分子以外，可以使用的其他IL-13结合剂包括IL-13受体-Fc融合物、IL-13受体的其他可溶形式、IL-4Rα的可溶形式、与IL-13R结合的抗体和抑制IL-13和其一种受体之间相互作用的其他分子。

在一个方面中，本发明表征了IL-13结合剂，它以对应于小于5×10^-7M、1×10^-7M、5×10^-8、1×10^-8、5×10^-9、1×10^-9M、更一般的小于5×10^-10、1×10^-10、5×10^-11M、1×10^-11M的K_D或更好的亲和力与IL-13结合。例如，IL-13结合剂可以是包含第一个和第二个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体分子，所述序列中至少包含免疫球蛋白可变结构域的足够部分，以形成与IL-13结合的抗原结合位点。第一个和第二个免疫球蛋白可变结构域序列一般对应于重链和轻链(如配对的或相容的重链和轻链)的免疫球蛋白可变结构域序列。

在一个实施方案中，IL-13结合剂与一个或多个下列肽结合：

FVKDLLVHLKKLFREGQ₁₃₀FN(SEQ ID NO：1)，

FVKDLLVHLKKLFREGR₁₃₀FN(SEQ ID NO：2)，

FVKDLLLHLKKLFREGQ₁₃₀FN(SEQ ID NO：3)，

FVKDLLLHLKKLFREGR₁₃₀FN(SEQ ID NO：4)，

FVKDLLVHLKKLFREG(SEQ ID NO：5)，和

FVKDLLLHLKKLFREG(SEQ ID NO：6)，例如作为分离的肽或当肽折叠进成熟IL-13蛋白的结构时此类肽中的氨基酸。

例如，IL-13结合剂可以与肽或IL-13以相当的亲和力(如差别小于8、5、4或2倍的亲和力)结合，不管位置130是否存在R或Q。特别的，IL-13结合剂可以以相等的亲和力与肽或IL-13结合，不管位置130是否存在R或Q。

IL-13结合剂与一个或多个下列肽结合：

KDLLVHLKKLFREGQFN(SEQ ID NO：7)，

KDLLVHLKKLFREGRFN(SEQ ID NO：8)，

KDLLLHLKKLFREGQFN(SEQ ID NO：9)，

KDLLLHLKKLFREGRFN(SEQ ID NO：10)，

KDLLVHLKKLFRE(SEQ ID NO：11)，

KDLLLHLKKLFRE(SEQ ID NO：12)，和

HLKKLFRE(SEQ ID NO：13)，例如作为分离的肽或当肽折叠进成熟IL-13蛋白的结构时此类肽中的氨基酸。IL-13结合剂可以与IL-13上的表位结合，所述表位包含至少1个(如1个、2个、3个或4个)来自本文所述肽序列(如图1B)或在至少1个但不多于1个、2个或3个氨基酸残基存在区别的相应肽(例如来自人IL-13的相应肽)。

在一个实施方案中，IL-13结合剂接触(例如范德华接触)全长IL-13(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：178)螺旋D(氨基酸残基114-130)中的氨基酸残基，例如一个或多个以下氨基酸残基：SEQ ID NO：24或SEQ IDNO：178中的残基116、117、118、122、123、124、125、126、127或128。在一个实施方案中，IL-13结合剂结合螺旋D上的表位，或包含螺旋D上至少1个氨基酸残基(如至少1、2、3或4个)的表位和/或能抑制IL-13与IL-13Rα1和/或IL-13Rα2中一种或两种之间的相互作用。螺旋D对应于经加工的成熟IL-13(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：124)的氨基酸残基95-111。

在一个实施方案中，IL-13结合剂与IL-13(例如哺乳动物，如人IL-13)的表位(如线性或构象表位)特异性结合。例如，IL-13结合剂与MJ2-7和/或C65竞争结合IL-13(如人IL-13)。IL-13结合剂能竞争性抑制MJ2-7和/或C65与IL-13的结合。IL-13结合剂可以特异性结合表位中的至少1个氨基酸，所述表位通过MJ2-7与人IL-13的结合定义或通过C65与人IL-13的结合定义。在一个实施方案中，IL-13结合剂可以结合与MJ2-7或C65重叠的表位(如包含至少1、2、3或4个共同的氨基酸)或在结合后立体上阻止MJ2-7或C65的相互作用的表位。

在另一实施方案中，IL-13结合剂特异性结合表位中的至少1个氨基酸，所述表位通过IL-13Rα1与人IL-13的结合定义，或通过IL-13Rα2与人IL-13的结合定义，或与这些表位重叠。IL-13结合剂可以与IL-13Rα1和/或IL-13Rα2竞争结合IL-13(如人IL-13)。IL-13结合剂可以竞争性抑制IL-13Rα1和/或IL-13Rα2与IL-13的结合。IL-13结合剂可以与IL-13上的表位相互作用，所述表位在结合后立体上阻止与IL-13Rα1和/或IL-13Rα2的相互作用。

在一个实施方案中，IL-13结合剂具有与IL-13Rα2相当的功能活性，例如IL-13结合剂降低或抑制IL-13与IL-13Rα1的相互作用。IL-13结合剂可阻止IL-13和IL-13Rα1之间形成复合体，或者破坏IL-13和IL-13Rα1之间的复合体或使其去稳定。在一个实施方案中，IL-13结合剂抑制三元复合体的形成，如IL-13、IL-13Rα1和IL4-R之间复合体的形成。

在一个实施方案中，IL-13结合剂能以约50nM到5pM(一般约100到250pM或更低，如更好的抑制)的IC₅₀抑制一种或多种IL-13相关活性。抑制IL-13至少一种活性的物质认为是IL-13拮抗剂。在一个实施方案中，IL-13结合剂可以以10³到10⁸M^-1s^-1，一般为10⁴到10⁷M^-1s^-1范围内的动力学结合IL-13。在另一实施方案中，IL-13结合剂的解离动力学在10^-2到10^-6s^-1，一般为10^-2到10^-5s^-1范围内。在一个实施方案中，IL-13结合剂以与单克隆抗体MJ2-7或C65或其修饰形式(如其嵌合形式或人源化形式(如本文所述的人源化形式))相似(如在20、10或5倍以内)的亲和力和/或动力学结合IL-13(如人IL-13)。可以使用如生物传感器技术(BIACORE^TM)测试IL-13结合剂的亲和力和结合动力学。

IL-13结合剂可以是抗体分子，如抗体的抗原结合片段(如Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段)或包含Fc结构域的抗体。抗IL-13抗体分子一般是单克隆或者单特异性的。

IL-13结合剂特别是抗IL-13抗体分子可以是人有效的、人的、人源化的、CDR移植的、嵌合的、突变的、亲和成熟的、去免疫的、合成的或者是体外产生的蛋白质。在一个实施方案中，IL-13结合剂为人源化抗体。在一个实施方案中，IL-13结合剂在人中无抗原性或不引起HAMA应答。

在一个实施方案中，IL-13抗体分子包含重链和轻链。抗IL-13抗体分子的重链和轻链可以是基本全长的(如抗体分子包含至少1条、优选2条重链以及至少1条、优先两条轻链)或包含抗原结合片段(如Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段)。在另一实施方案中，抗体分子具有选自以下的重链恒定区：如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区、特别是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，更特别是IgG1(如人IgG1)的重链恒定区。重链恒定区一般是人的或者是人恒定区的修饰形式(如实施例5中所述)。在另一实施方案中，抗体分子具有选自如K或λ(优选κ，如人κ)轻链恒定区的轻链恒定区。在一个实施方案中，改变(如突变)了恒定区，以修饰抗体分子的特性(如提高或降低以下一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞的功能或补体的功能)。例如，可以在一个或多个残基(如实施例5所述残基234和237中一个或多个)突变人IgG1恒定区。

在一个实施方案中，IL-13结合剂(如抗IL-13结合分子)包含来自本文公开的抗体(如MJ2-7)的轻链或重链可变区的至少1个、2个并优选3个CDR。例如，蛋白质的CDR区内包含一个或多个以下序列：

GFNIKDTYIH(SEQ ID NO：15)，

RIDPANDNIKYDPKFQG(SEQ ID NO：16)，

SEENWYDFFDY(SEQ ID NO：17)，

RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：18)，

KVSNRFS(SEQ ID NO：19)，和

FQGSHIPYT(SEQ ID NO：20)，或具有与上文列出的序列相比，在每10个氨基酸中不多于4、3、2.5、2、1.5、1或0.5个改变(如替换、插入或缺失)(如差异数与CDR长度成比例)的氨基酸序列的CDR，如每个CDR中至少1个但不多于2、3或4个改变。

例如，IL-13结合剂在轻链可变结构域序列的CDR区内可包含至少1个、2个或3个以下的序列：

RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：18)，

KVSNRFS(SEQ ID NO：19)，和

FQGSHIPYT(SEQ ID NO：20)，或与上面列出的序列相比在每10个氨基酸中存在不超过4、3、2.5、2、1.5、1或0.5个替换、插入或缺失差异的氨基酸序列。

IL-13结合剂在重链可变结构域序列的CDR区内可包含至少1个、2个或3个以下序列：

GFNIKDTYIH(SEQ ID NO：15)，

RIDPANDNIKYDPKFQG(SEQ ID NO：16)，和

SEENWYDFFDY(SEQ ID NO：17)，或与上面列出的序列相比在每10个氨基酸中存在不超过4、3、2.5、2、1.5、1或0.5个替换、插入或缺失差异的氨基酸序列。重链CDR3区的长度可小于13或小于12个氨基酸，如长度为11个氨基酸(使用Chothia或Kabat定义)。

在另一实例中，IL-13结合剂在轻链可变结构域序列的CDR区内可包含至少1个、2个或3个以下序列(括号内的氨基酸代表特定位置的备选)：

(i)(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)(SEQ ID NO：25)或(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-E(SEQ ID NO：26)或(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-N-G-N-T-Y-L-(EDNQYAS)(SEQ IDNO：21)，

(ii)K-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-S(SEQ ID NO：27)或K-(LV)-S-(NY)-R-F-S(SEQ ID NO：22)，和

(iii)Q-(GSA)-(ST)-(HEQ)-I-P(SEQ ID NO：28)，F-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P(SEQ ID NO：23)或Q-(GSA)-(ST)-(HEQ)-I-P-Y-T(SEQ ID NO：193)或F-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P-Y-T(SEQ ID NO：29)。

在优选的实施方案中，IL-13结合剂包含来自MJ2-7或高度相关CDR(如相同或具有至少1个但不超过2个、3个或4个改变(如替换、缺失或插入)的CDR)的全部6个CDR。IL-13结合剂可包含MJ2-7的至少2个、3个、4个、5个、6个或7个IL-13接触氨基酸残基。

在另一实施例中，IL-13结合剂包含至少1个、2个或3个具有相同的典型结构(canonical structure)和MJ2-7相应CDR区的CDR区，如至少包含MJ2-7重链和/或轻链可变结构域的CDR1和CDR2。

IL-13结合剂可包含以下序列之一：

■DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT(SEQ ID NO：30)

■DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT(SEQ ID NO：31)

■DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT(SEQ ID NO：32)

■DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT(SEQ ID NO：33)

■DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT(SEQ ID NO：34)

■DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWLQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT(SEQ ID NO：35)

■DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC FQGSHIPYT(SEQ ID NO：36)

■DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHIPYT(SEQ ID NO：37)

■DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHIPYT(SEQ ID NO：38)

或具有少于8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个改变(如替换、插入或缺失，如保守性替换或替换为MJ2-7相应位置的氨基酸残基)的序列。示例性替换为以下Kabat位置之一：2、4、6、35、36、38、44、47、49、62、64-69、85、87、98、99、101和102。替换可以是例如将来自MJ2-7的相应位置的氨基酸替换进人构架区。

IL-13结合剂还可以包含以下序列

■DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISC-(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYLQKPGQSPQLLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P(SEQ ID NO：39)

■DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC-(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WFQQRPGQSPRRLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P(SEQ ID NO：40)

■DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC-(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYLQKPGQSPQLLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P(SEQ ID NO：41)

■DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYLQKPGQPPQLLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P(SEQ ID NO：42)

■DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYLQKPGQSPQLLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCF-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P(SEQ ID NO：43)

■DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISC(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WLQQRPGQPPRLLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-SGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P(SEQ ID NO：44)

■DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYQQKPGKAPKLLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCF-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P(SEQ ID NO：45)

■DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYLQKPGQSPKLLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCF-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P(SEQ ID NO：46)

或在构架区中具有少于8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个改变(如替换、插入或缺失，如保守性替换或替换为MJ2-7相应位置的氨基酸残基)的序列。示例性替换在一个或多个以下Kabat位置：2、4、6、35、36、38、44、47、49、62、64-69、85、87、98、99、101和102。替换可以是例如将来自MJ2-7相应位置的氨基酸替换进人构架区。序列还可以在二肽酪氨酸-苏氨酸之后。FR4区可包含如序列FGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：47)。

在另一实施方案中，IL-13结合剂在重链可变结构域序列中的CDR内可包含至少1个、2个或3个以下序列(括号内的氨基酸代表特定位置的备选)：

(i)G-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H(SEQ ID NO：48)，

(ii)(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-G(SEQ IDNO：49)和

(iii)SEENWYDFFDY(SEQ ID NO：17).

IL-13结合剂可包含以下序列之一：

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：50)

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQRLEWMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：51)

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQATGQGLEWMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：52)

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：53)

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：54)

■QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQALEWMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：55)

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：56)

■QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQARGQRLEWIGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAASEENWYDFFDY(SEQ ID NO：57)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：58)

■EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：59)

■QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWIRQAPGKGLEWVSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：60)

■EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：61)

■EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：62)

■EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：63)

■EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：64)

■QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAP

GKGLEWVARIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：65)

■QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：66)

■EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：67)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：68)

■EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFNIKDTYIHWFRQAPGKGLEWVGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：69)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEYVSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：70)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWIGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：71)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIDPANDNIKYDPKFQGKATISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：72)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：73)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：74)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIDPANDNIKYDPKFQGKATISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：75)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWIGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：76)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：77)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：78)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：79)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWIGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：80)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTGSGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWIGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：81)

■EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANDNIKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLNSLTSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：82)

或具有少于8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个改变(如替换、插入或缺失，如保守性替换或替换为MJ 2-7相应位置的氨基酸残基)的序列。示例性替换在一个或多个以下Kabat位置：2、4、6、25、36、37、39、47、48、93、94、103、104、106和107。示例性替换可以是一个或多个下面的位置(根据顺序编号)：48、49、67、68、72和79。替换可以是例如将来自MJ2-7相应位置的氨基酸替换进人构架区。在一个实施方案中，序列包含(按顺序编号)以下一项或多项：48位的异亮氨酸、49位的甘氨酸、67位的赖氨酸、68位的丙氨酸、72位的丙氨酸和79位的丙氨酸，优选如48位的异亮氨酸、49位的甘氨酸、72位的丙氨酸和79位的丙氨酸。

另外，重链可变结构域序列的构架可包含(i)49位的甘氨酸；(ii)72位的丙氨酸；(iii)48位的异亮氨酸和49位的甘氨酸(iv)；48位的异亮氨酸、49位的甘氨酸和72位的丙氨酸(v)67位的赖氨酸、68位的丙氨酸、72位的丙氨酸和/或(vi)48位的异亮氨酸、49位的甘氨酸、72位的丙氨酸、79位的丙氨酸。

IL-13结合剂还可包含以下序列之一：

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGQGLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：83)

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGQRLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：84)

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQATGQ GLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：85)

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGQGLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：86)

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：87)

■QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGQALEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：88)

■QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGQGLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：89)

■QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQARGQRLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAASEENWYDFFDY(SEQ ID NO：90)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：91)

■EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：92)

■QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WIRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：93)

■EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：94)

■EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：95)

■EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：96)

■EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：97)

■QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：98)

■QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：99)

■EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：100)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：101)

■EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WFRQAPGKGLEWVG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTR

SEENWYDFFDY(SEQ ID NO：102)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEYVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：103)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：104)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GKATISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：105)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：106)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：107)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GKATISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：108)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：109)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：110)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISRDNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：111)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWVG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISADNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：112)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISADNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：113)

■EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTGSG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVRQAPGKGLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：114)

■EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H，WVKQRPEQGLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-GKATITADTSSNTAYLQLNSLTSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY(SEQ ID NO：115)

或构架区中具有少于8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个改变(如替换、插入或缺失，如保守性替换或替换为MJ2-7相应位置的氨基酸残基)的序列。示例性替换在一个或多个以下Kabat位置：2、4、6、25、36、37、39、47、48、93、94、103、104、106和107。替换可以是例如将来自MJ2-7相应位置的氨基酸替换进人构架区。FR4区可包含如序列WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：116)或WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO：117)。

在一个实施方案中，重链可变结构域序列与V2.1、V2.2、V2.3、V2.4、V2.5、V2.6、V2.7、V2.11的重链可变结构域或本文所述的其他重链可变结构域具有至少90、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性或完全相同。在一个实施方案中，重链可变结构域序列包含含有核酸编码的序列的可变结构域序列，所述核酸在高严格条件下与编码V2.1、V2.2、V2.3、V2.4、V2.5、V2.6、V2.7、V2.11的重链可变结构域或本文所述的其他重链可变结构域的核酸的互补序列杂交。在一个实施方案中，轻链可变结构域序列与V2.11的轻链可变结构域或本文所述的其他轻链可变结构域具有至少90、92、93、94、95、96、97、98、99％同一性或完全相同。在一个实施方案中，轻链可变结构域序列包含核酸编码的序列，所述核酸在高严格条件下与编码V2.11的轻链可变结构域或本文所述的其他轻链可变结构域的核酸的互补序列杂交。

在一个实施方案中，重链构架区(如分别为FR1、FR2、FR3或含有FR1、FR2和FR3但不包括CDR的序列)包含与下列种系V区段序列之一的重链构架具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列：DP-25、DP-1、DP-12、DP-9、DP-7、DP-31、DP-32、DP-33、DP-58或DP-54或与典型结构类别1-3相容的另一V基因(参阅如Chothia等(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson等(1992)J.Mol.Biol.227：776-798)。与典型结构类别1-3相容的其他构架包括具有一个或多个以下残基(按照Kabat编号)的构架：位置26的丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或缬氨酸；位置26的甘氨酸；位置27的酪氨酸、苯丙氨酸或甘氨酸；位置29的苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；位置34的甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸或异亮氨酸；位置94的精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸；位置54的甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸和位置71的精氨酸。

在一个实施方案中，轻链构架区(如分别为FR1、FR2、FR3或含有FR1、FR2和FR3但不包括CDR的序列)包含与Vκ II亚组种系序列或以下种系V区段序列之一的轻链构架具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列：A17、A1、A18、A2、A19/A3或A23或与典型结构类别4-1相容的另一V基因(参阅如Tomlinson等(1995)EMBO J.14：4628)。与典型结构类别4-1相容的其他构架包括具有一个或多个以下残基(按照Kabat编号)的构架：位置2的缬氨酸或亮氨酸或异亮氨酸；位置25的丝氨酸或脯氨酸；位置29的异亮氨酸或亮氨酸；位置31d的甘氨酸；位置33的苯丙氨酸或亮氨酸和位置71的苯丙氨酸。

在另一实施方案中，轻链构架区(如分别为FR1、FR2、FR3或含有FR1、FR2和FR3但不包括CDR的序列)包含与VκI亚组种系序列(如DPK9序列)具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。

在另一实施方案中，重链构架(如分别为FR1、FR2、FR3或含有FR1、FR2和FR3但不包括CDR的序列)包含与VH I亚组种系序列(如DP-25序列)或VH III亚种种系序列(如DP-54序列)的轻链构架具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，IL-13结合剂包含本文公开的抗体(如C65)的轻链或重链可变结构域的至少1个、2个并优选3个CDR。例如，IL-13结合剂在CDR区内包含一个或多个以下序列：

QASQGTSINLN(SEQ ID NO：118)，

GASNLED(SEQ ID NO：119)，和

LQHSYLPWT(SEQ ID NO：120)

GFSLTGYGVN(SEQ ID NO：121)，

IIWGDGSTDYNSAL(SEQ ID NO：122)，和

DKTFYYDGFYRGRMDY(SEQ ID NO：123)，或具有与上文列出的序列相比，在每10个氨基酸中不多于4、3、2.5、2、1.5、1或0.5个替换、插入或缺失(如差异数与CDR长度成比例)的氨基酸序列的CDR，如每个CDR中至少1个但不多于2、3或4个改变。例如，蛋白质在轻链可变结构域序列中的CDR区内可包含至少1、2或3个以下序列：

QASQGTSINLN(SEQ ID NO：118)，

GASNLED(SEQ ID NO：119)，和

LQHSYLPWT(SEQ ID NO：120)，或与上文列出的序列相比，在每10个氨基酸中不多于4、3、2.5、2、1.5、1或0.5个替换、插入或缺失的氨基酸序列。

IL-13结合剂在重链可变结构域序列的CDR区内可包含至少1、2或3个以下序列：

GFSLTGYGVN(SEQ ID NO：121)，

IIWGDGSTDYNSAL(SEQ ID NO：122)，和

DKTFYYDGFYRGRMDY(SEQ ID NO：123)，或与上文列出的序列相比，在每10个氨基酸中不多于4、3、2.5、2、1.5、1或0.5个替换、插入或缺失的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，IL-13结合剂包含来自C65或高度相关CDR(如相同或具有至少1个但不超过2个、3个或4个改变(如替换、缺失或插入)的CDR)的全部6个CDR。

在另一实施方案中，IL-13结合剂包含具有C65相同的典型结构和相应CDR区的至少1、2或3个CDR区，如至少包含C65重链和/或轻链可变结构域的CDR1和CDR2。

在一个实施方案中，重链构架(如分别为FR1、FR2、FR3或含有FR1、FR2和FR3但不包括CDR的序列)包含与下列种系V区段序列之一的重链构架具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列：DP-71或DP-67或与C65的典型结构类别相容的另一V基因(参阅如Chothia等(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson等(1992)J.Mol.Biol.227：776-798)。

在一个实施方案中，轻链构架(如分别为FR1、FR2、FR3或含有FR1、FR2和FR3但不包括CDR的序列)包含与DPK-1或DPK-9种系序列或与C65的典型结构类别相容的另一V基因的轻链构架具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列(参阅如Tomlinson等(1995)EMBOJ.14：4628)。

在一个实施方案中，轻链构架(如分别为FR1、FR2、FR3或含有FR1、FR2和FR3但不包括CDR的序列)包含与VκI亚组种系序列(如DPK-9或DPK-1序列)的轻链构架具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，重链构架(如分别为FR1、FR2、FR3或含有FR1、FR2和FR3但不包括CDR的序列)包含与VH IV亚组种系序列(如DP-71或DP-67序列)的轻链构架具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，轻链或重链可变构架(如至少包含FR1、FR2、FR3并任选地包含FR4的区域)可以选自：(a)包含来自人轻链或重链可变构架的氨基酸残基(如来自人成熟抗体、人种系序列、人共有序列或本文所述的人抗体的轻链或重链可变构架残基)的至少80％、85％、95％或100％的轻链或重链可变构架；(b)包含来自人轻链或重链可变构架的氨基酸残基(如来自人成熟抗体、人种系序列、人共有序列的轻链或重链可变构架残基)的从20％到80％、40％到60％、60％到90％或70％到95％的轻链或重链可变构架；(c)非人构架(如啮齿类构架)；或(d)经修饰以例如去除抗原决定簇或细胞毒性决定簇(如去免疫或部分人源化)的非人构架。在一个实施方案中，重链可变结构域序列在一个或多个(优选至少5、10、12个或全部)以下位置包含人残基或人共有序列残基：(轻链可变结构域的FR中的)4L、35L、36L、38L、43L、44L、58L、46L、62L、63L、64L、65L、66L、67L、68L、69L、70L、71L、73L、85L、87L、98L和/或(重链可变结构域的FR中的)2H、4H、24H、36H、37H、39H、43H、45H、49H、58H、60H、67H、68H、69H、70H、73H、74H、75H、78H、91H、92H、93H和/或103H(按照Kabat编号)。

在一个实施方案中，IL-13结合剂包含至少1个非人CDR(如鼠CDR，如来自MJ2-7或C65的CDR或其突变体)和通过至少1个氨基酸(如至少5、8、10、12、15或18个氨基酸)区别于MJ2-7或C65构架的至少1个构架。例如，蛋白质包含1、2、3、4、5或6个非人CDR并在HC FR1、HC FR2、HC FR3、LC FR1、LC FR2和LC FR3的至少3个中包含至少1个氨基酸差异。

在一个实施方案中，抗IL-13抗体分子的重链或轻链可变结构域序列包含与本文所述抗体如MJ2-7或C65的可变结构域序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，或在至少1或5个残基(但少于40、30、20或10个残基)与所述抗体如MJ2-7或C65的可变结构域序列存在差异的氨基酸序列。在一个实施方案中，蛋白质的重链或轻链可变结构域序列包含由本文所述的核酸序列或(如在低严格、中度严格、高严格或极高严格条件下)与本文所述核酸序列或其互补序列杂交的核酸编码的氨基酸序列。

在一个实施方案中，两个可变结构域序列中的一个或两个在构架区中同时包含多种来自非人抗体(如小鼠抗体，如mAb13-2)与人抗体或种系序列的氨基酸位置。例如，可变结构域序列可以包含氨基酸残基与非人抗体和人抗体(或人种系序列)中都相同的大量位置，因为二者在该位置是相同的。对于在非人和人中不同的剩余构架位置，可变结构域的至少50、60、70、80或90％的位置优选与人抗体(或人种系序列)相同，而不是与非人抗体相同。例如，这些剩余构架位置的0或至少1、2、3或4个可以与非人抗体相同，而不是与人抗体相同。例如在HC FR1中，1或2个这些位置可以是非人的；在HC FR2中，1或2个这些位置可以是非人的；在FR3中，1、2、3或4个这些位置可以是非人的；在LC FR1中，1、2、3或4个这些位置可以是非人的；在LC FR2中，1或2个这些位置可以是非人的；在LC FR3中，1或2个这些位置可以是非人的。构架可以包含其他非人位置。

IL-13结合剂(如IL-13抗体分子)可以衍生或连接另一功能性分子，如另一种肽或蛋白质(如Fab片段)。例如，结合剂可以与一个或多个其他分子实体功能性连接(如通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他)，所述分子实体为例如另一抗体分子(如形成双特异性或多特异性抗体分子)、毒素、放射性同位素、细胞毒性剂或细胞抑制剂等等。

在另一实施方案中，IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)干扰IL-13与受体IL-13Rα1之间的相互作用。在一个实施方案中，IL-13结合剂能干扰IL-13(SEQ ID NO：124；图13A)的苯丙氨酸107与IL-13Rα1中由亮氨酸319、半胱氨酸257、精氨酸256和半胱氨酸320(SEQ ID NO：125；图13B)残基的侧链形成的疏水口袋之间的相互作用(如通过直接结合这些残基或位阻)。在另一实施方案中，IL-13结合剂可以干扰IL-13Rα1(SEQ IDNO：125)的氨基酸残基Ile254、Ser255、Arg256、Lys318、Cys320和Tyr321和IL-13(SEQ ID NO：124)的氨基酸残基Arg11、Glu12、Leu13、Ile14、Glu15、Lys104、Lys105、Leu106、Phe107和Arg108之间的范德华相互作用。

在一个实施方案中，当针对Annex II of the DC CPMP GuidelineIII/5271/94 Draft 5“单克隆抗体的产生和质量控制”中“用于交叉反应性的免疫组织化学研究的人组织建议列表”的至少一半、三分之二、四分之三、90％或全部组织和1997 US FDA/CBER“用于人用途的单克隆抗体的生产和测试中需要考虑的要点”中推荐组织的至少一半、三分之二、四分之三、90％或全部进行筛选时，IL-13结合剂(如抗IL-13抗体)分子无显著的交叉反应性。

在一个实施方案中，IL-13结合剂(如抗IL-13抗体)与IL-13(如哺乳动物IL-13，如人或非人灵长类IL-13)特异性结合。例如，结合剂与IL-13结合的亲和力是其结合IL-13外的非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)的亲和力的至少2倍、10倍、50倍、100倍或更高(更小的K_d)，或者亲和力是其结合IL-13外的另一人白细胞介素的亲和力的至少2倍、10倍、50倍、100倍或更高(更小的K_d)。在一些实施方案中，当针对实施例1(“四元筛选”)所述的人IL-13粗样品进行印迹时，IL-13结合剂仅检测到1条突出带。在一些实施方案中，使用固定IL-13结合剂的珠子从该粗样品中拉下蛋白质而产生的沉淀是IL-13纯度至少为5％、10％、50％或80％的组合物。

在另一方面中，施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)或其药物组合物以治疗或预防IL-13相关病症。治疗指改善或维持(或这样尝试)受试者的病症。在典型情况下，治疗以医师可辨识的程度改善受试者的病症或预防病症恶化。IL-13相关病症包括但不仅限于一种或多种选自以下的病症：呼吸系统病症(如过敏性和非过敏性哮喘(如幼儿中呼吸道合胞病毒感染引起的哮喘))、慢性阻塞性肺病(COPD)和其他与呼吸道炎症相关的病症、嗜酸粒细胞增多、纤维化和粘液产生过度如囊性纤维化病和肺纤维化、特异性病症(如由对IL-13提高的敏感性引起)(如特应性皮炎、荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎和过敏性肠胃炎)、皮肤的炎性和/或自身免疫病症(如特异性皮炎)、胃肠道病症(如炎性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎和/或克隆病)、肝(如肝硬化、肝细胞癌)和硬皮病、肿瘤或癌症(如软组织或实体瘤)，如白血病、成胶质细胞瘤和淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤、病毒感染(如HTLV-1)、其他器官的纤维化如肝纤维化(如由乙型和/丙型肝炎病毒引起的纤维化)和如本文所述的保护性1型免疫应答表达的抑制(如在疫苗接种中)。

可以以有效治疗或预防疾病的用量施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子，如本文描述的一种)。在预防用途的情况下(如预防发病或延缓发病)，受试者具有或不具有该病症的一种或多种症状。可以选择用量以有效改善该病症的至少一种症状。优选地，受试者为哺乳动物(如患本文所述的IL-13相关病症的人)。对于呼吸系统病症如哮喘，可以通过吸入来递送IL-13结合剂。

在一个实施方案中，方法包括施用与IL-13结合的抗体分子的剂量。例如抗体分子抑制或中和IL-13。在一个实施方案中，皮下施用每一剂，例如约0.5-10mg/kg(如0.7-3.3mg/kg)的量，频率不超过每周一次(如隔周一次或每月一次或两次)。在一个实施方案中，抗体为本文描述的抗体。例如，抗体为抑制IL-13Rα1结合的抗体。在绵羊模型中，抗体至少在注射后6周赋予对暴露于蛔虫抗原的注射后保护效应。

在一个实施方案中，与另一治疗剂组合施用IL-13结合剂。组合治疗可以包括与一种或多种其他治疗剂共配制或共施用的IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)，所述其他治疗剂为如本文所述的一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂(如全身抗炎剂)、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性剂或细胞抑制剂。也可以分开施用IL-13结合剂和其他治疗剂。

可与IL-13结合剂共施用和/或共配制的其他优选治疗剂的实例包括：吸入的类固醇、β-激动剂如短效或长效β-激动剂、白三烯或白三烯受体的拮抗剂、组合药物如

、IgE抑制剂，如抗IgE抗体(如

)、磷酸二酯酶抑制剂(如PDE4抑制剂)、黄嘌呤、抗胆碱能药、肥大细胞稳定剂如色甘酸钠、IL-4抑制剂、IL-5抑制剂、eotaxin/CCR3抑制剂和抗组胺剂。这些组合可以用于治疗哮喘和其他呼吸系统病症。可与IL-13结合剂共施用和/或共配制的治疗剂的其他实例包括以下的一种或多种：TNF拮抗剂(如TNF受体的可溶性片段，如p55或p75人TNF受体或其衍生物，如75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL^TM))、TNF酶拮抗剂如TNFα转化酶(TACE)抑制剂、毒蕈碱性受体拮抗剂、TGF-β拮抗剂、干扰素γ、perfenidone、化学治疗剂如氨甲喋呤、来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物如CCI-779、COX2和cPLA2抑制剂、NSAID、免疫调节剂、p38抑制剂、TPL-2、Mk-2和NFPB抑制剂等等。

在另一方面中，本申请提供包含可药用载体和至少一种IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的药物组合物。在一个实施方案中，组合物(如药物组合物)含有两种或更多IL-13结合剂(如两种或更多抗IL-13抗体分子)的组合。还可以使用如本文所述的IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)和药物(如治疗剂(如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂(如全身抗炎剂)、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性剂或细胞抑制剂)的组合。

本申请描述了包含编码本文所述IL-13结合剂或其组分(如抗IL-13抗体分子，如抗-IL-13抗体分子(如本文所述抗体分子)的重链和/或轻链可变结构域序列)的核苷酸序列的核酸。例如，本申请特征在于分别编码选自如本文所述的MJ2-7或C65中一个或多个的抗IL-13抗体的重链和轻链可变结构域序列的第一个和第二个核酸。在另一方面中，本申请的特征在于含有本文所述核酸的宿主细胞和载体。

本发明还描述了MJ2-7或C65中一个或多个所识别的IL-13(如人IL-13)的表位。例如，含有该表位的蛋白质和肽可用于产生或筛选与该表位相互作用的其他结合化合物，如蛋白质如抗体或小分子。例如，包含该表位的肽可用作免疫原或筛选表达文库的靶标。还可以评估化合物与该肽相互作用的能力，或者通过作图或结构测定评估化合物与(如成熟IL-13中)该表位相互作用的能力。

在另一方面中，本申请描述了调节(如干扰(如抑制、阻断或降低))IL-13与同族IL-13结合蛋白(如IL-13受体复合体，如含有IL-13Rα1和IL-4Rα的复合体或其亚基)之间的相互作用(如结合)的方法。可以在体内或体外实现调节。在其他实施方案中，IL-13结合剂(如抗Il-13抗体分子)与IL-13结合并干扰(如抑制、阻断或降低)IL-13与IL-13受体复合体的亚基(如分别为IL-13Rα1或IL-4Rα)之间的相互作用(如结合)。在另一实施方案中，IL-13结合剂(如抗Il-13抗体分子)与IL-13结合并干扰(如抑制、阻断或其他方式的降低)IL-13与IL-13Rα1之间的相互作用(如结合)。在另一实施方案中，IL-13结合剂(如抗Il-13抗体分子)与IL-13结合并干扰(如抑制、阻断或其他方式的降低)IL-13与IL-13Rα1之间的相互作用(如结合)。抗IL-13抗体分子一般干扰(如抑制、阻断或其他方式的降低)IL-13和IL-13Rα1之间的相互作用(如结合)。

在另一方面中，本申请描述了调节IL-13和IL-13受体蛋白(如IL-13Rα1或IL-13Rα2)之间的相互作用的方法。例如，IL-13结合剂(如本文描述的结合剂)可用于降低或抑制IL-13与IL-13Rα1或IL-13Rα2之间的结合，或降低包含IL-13Rα1和IL-4Rα的复合体(如本文所述的复合体)的形成。该方法包括使IL-13或含有IL-13的复合体接触IL-13结合剂(如本文所述的蛋白质)。

主题方法可用于体外细胞(如无细胞系统)、培养物(如体外或离体)。例如，可以在培养基中体外培养表达IL-13受体的细胞，并可通过在培养基中加入IL-13结合剂实现接触步骤。或者，可以对受试者中存在的细胞实施该方法(如作为体内(如治疗或预防)方案的部分)。例如，可以局部或全身递送IL-13结合剂。

方法可包括在允许IL-13与IL-13受体复合体或其亚基发生相互作用，从而形成IL-13/IL-13受体混合物的条件下使IL-13接触IL-13受体复合体或其亚基。通常以有效量提供IL-13结合剂，例如使接触IL-13/IL-13受体混合物调节(如干扰(如抑制、阻断或其他方式的降低))IL-13和受体蛋白之间的相互作用或IL-13的至少一项功能(如IL-13介导的信号传递)。

在另一方面中，本申请提供体外检测样品(如生物样品，如血清、血浆、组织、活检)中IL-13的存在的方法。本发明的方法可用于诊断病症，如免疫细胞相关的病症。该方法包括：(i)使样品或对照样品接触如本文所述的IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)；和(ii)检测IL-13结合剂和样品或对照样品之间复合体的形成，其中样品中复合体形成相对于对照样品统计学显著的改变表示样品中存在IL-13。

在另一方面中，本申请提供了体内检测(如受试者的体内造影)IL-13的存在的方法。本发明的方法可用于诊断病症，如IL-13相关的病症。方法包括：(i)在允许结合剂与IL-13结合的条件下对受试者或对照受试者施用如本文所述的IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子；和(ii)检测结合剂和IL-13之间复合体的形成，其中受试者中复合体形成相对于对照受试者统计学显著的改变表示存在IL-13。

例如，用可检测物质直接或间接标记抗体分子，以便于检测结合或未结合的抗体。合适的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。

还公开了在体内将物质(如治疗剂或细胞毒性剂)递送或靶向至表达IL-13的细胞的方法。

在一个方面中，本发明描述了含有以下序列的多肽或其功能性片段：

SPVPPSTALKELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGVYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLNGFCPHKVSAGQFSSLRVRDTKIEVAQFVKDLLVHLKKLFREGQFN(SEQ ID NO：14)

多肽另外还可以含有(例如作为N端信号序列)：

MALLLTMVIALTCLGGFASP(SEQ ID NO：127)。

例如，多肽为来自猕猴的IL-13蛋白(本文的“NHP-IL-13”)。NHP-IL-13可以是成熟的IL-13蛋白或未加工的全长IL-13蛋白。以上序列的肽(如与人IL-13相应肽不同的肽)可用作如免疫原或靶标化合物。

还描述了在一个或多个以上粗体位置区别于人IL-13，但在以上非粗体位置与人IL-13相同的多肽。例如，一个或多个以上粗体位置可以是丙氨酸或(上文)猕猴序列的相应残基或人序列中相应残基的保守性替换。本发明还描述了如来自以上序列的至少5或6个氨基酸的肽。肽可以包含在异源蛋白(如除IL-13外的其他蛋白质)、嵌合蛋白(如人IL-13)中，或者可以是分离的肽(如不包含其他序列的肽)。肽还可以与其他化合物(如载体)融合或缀合。在一个实施方案中，肽包含与人IL-13不同的至少一个氨基酸残基。下文描述了示例肽。

还描述了编码猕猴IL-13序列的核酸及其变体。多肽可用于提供与猕猴IL-13(和任选的来自另一物种的IL-13蛋白，如人IL-13)结合的IL-13结合剂。

在一个方面中，本发明描述了提供与人靶蛋白特异性结合的靶结合分子的方法。例如，靶结合分子为抗体分子。该方法包括：提供含有非人蛋白质的至少一部分的靶蛋白，所述部分与人靶蛋白的相应部分同源(至少70、75、80、85、87、90、92、94、95、96、97或98％同一)，但至少1个氨基酸(如至少1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸)不同；获得与该抗原特异性结合的结合剂；并评估结合剂是否与人靶蛋白特异性结合或评估结合剂在调节人靶蛋白活性中的效力。方法还可以包括对人受试者施用结合剂(如抗体分子)或衍生物(如人源化抗体分子)。在一个实施方案中，人靶蛋白为细胞因子，如白细胞介素，如IL-13或IL-14。非人蛋白可以来自非人灵长类，如恒河猴、猕猴或发辫猴(pigtail macaque)。

在一个实施方案中，获得步骤包括使用蛋白质表达文库，如噬菌体或核糖体展示文库。例如，文库展示抗体分子如Fab或scFv。在一个实施方案中，获得步骤包括使用该抗原作为免疫原免疫动物。例如，动物可以是啮齿类，如小鼠或大鼠。动物可以是具有至少一种人免疫球蛋白基因的转基因动物。

本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以其整体引入本文为参考。

定义

本文使用的术语“IL-13结合剂”指包含与IL-13蛋白(如哺乳动物IL-13，特别是人或非人灵长类IL-13)结合的界面的任何化合物，如蛋白质(如多链多肽、多肽)或肽。结合剂一般以小于5×10^-7M的Kd结合。示例IL-13结合剂为包含抗原结合位点的蛋白质，如抗体分子。

本文使用的术语“抗体分子”指含有至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的的蛋白质。术语抗体分子包括如全长的成熟抗体和抗体的抗原结合片段。例如，抗体分子可以包含重(H)链可变结构域序列(本文缩写为VH)和轻(L)链可变结构域序列(本文缩写为VL)。在另一实例中，抗体分子包含两个重(H)链可变结构域序列和两个轻(L)链可变结构域序列，从而形成两个抗原结合位点。抗原结合片段的实例包括：(i)Fab片段：由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段：含有在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段；(vi)camelid或camelized的可变结构域；和(vii)单链Fv(scFv)。

VH和VL区可进一步细分为称为“互补性决定区”(CDR)的高变区，其分散在更保守的称为“构架区”(FR)的区域中。已经通过大量方法精确定义了构架区和CDR的范围(参阅Kabat，E.A.，等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH出版号91-3242；Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917和Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用的AbM定义)。一般可参阅如Antibody Engineering Lab Manual(Duebel，S.和Kontermann，R.编辑，Springer-Verlag，Heidelberg)中的ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains。除非特别指出，否则一般使用以下定义：重链可变结构域的CDR1的AbM定义和其他CDR的Kabat定义。此外，本发明的实施方案关于Kabat或AbM CDR的描述也可以使用Chothia高变环实现。每个VH和VL一般包含3个CDR和4个FR，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

本文使用的“免疫球蛋白可变结构域序列”指可以形成免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列。例如，序列可以包括天然存在的可变结构域的氨基酸序列的全部或部分。例如，序列可以包括或不包括1个、2个或更多N端或C端氨基酸，或者可以包括与形成该蛋白质结构相容的其他改变。

术语“抗原结合部位”指IL-13结合剂中含有决定簇的部分，所述决定簇形成与IL-13(如哺乳动物IL-13，如人或非人灵长类IL-13或其表位)结合的界面。就蛋白质(或蛋白质模拟物)而言，抗原结合部位一般包括形成与IL-13的结合界面的一个或多个(至少4个氨基酸或氨基酸模拟物的)环。抗体分子的抗原结合部位一般包括至少1个或2个CDR，或者更一般地至少3、4、5或6个CDR。

本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单结合特异性和亲和力。可通过杂交瘤技术或通过不使用杂交瘤技术的方法(如重组方法)来制备单克隆抗体。

“有效的人”蛋白质是不引发中和抗体应答(如人抗鼠抗体(HAMA)应答)的蛋白质。HAMA可能在多种情况下出现问题，例如在如果(如在慢性或复发性疾病病症的治疗中)重复施用抗体分子时。由于抗体从血清提高的清除(参阅如Saleh等，Cancer Immunol.Immunother.，32：180-190(1990))和潜在的变应性反应(参阅如LoBuglio等，Hybridoma，5：5117-5123(1986))，HAMA应答可以使重复性抗体给药无效。

术语“分离的”指分子基本上脱离其天然环境。例如，分离的蛋白质基本不含有其来源的细胞或组织来源的细胞物质或其他蛋白质。该术语指其中分离的蛋白质纯度足以作为治疗组合物施用的制剂，或者纯度为至少70％到80％(重量/重量)，更优选纯度至少为80％-90％(重量/重量)，甚至更优选纯度为90-95％；并且更优选纯度至少为95％、96％、97％、98％、99％或100％(重量/重量)。“分开的”化合物指一种化合物，其中从获得该化合物的样品中除去至少90％的至少一种组分。可以以分离的或分开的化合物提供本文所述的任一化合物。

“表位”指靶化合物上被结合剂(如抗体分子)结合的位点。表位可以是线性或构象表位或其组合。例如在靶化合物是蛋白质的情况下，表位可以指被结合剂结合的氨基酸。重叠表位包括至少一个共有氨基酸残基。

本文使用的术语“在低严格、中度严格、高严格或极高严格条件下杂交”描述用于杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可见于《CurrentProtocols in Molecular Biology》，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。此参考文献中描述了水性和非水性方法，可以使用其中任意一种。本文涉及的具体杂交条件如下：1)6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃，接着在0.2×SSC、0.1％SDS中以至少50℃(对于低严格条件，洗涤温度可以提高至55℃)洗涤两次的低严格杂交条件；2)6×SSC中约45℃，接着在0.2×SSC、0.1％SDS中以60℃洗涤一次或多次的中度严格杂交条件；3)6×SSC中约45℃，接着在0.2×SSC、0.1％SDS中以65℃洗涤一次或多次的高严格杂交条件；并优选4)在0.5M磷酸钠、7％SDS中65℃，接着在65℃以0.2×SSC、1％SDS洗涤一次或多次的极高严格杂交条件。极高严格杂交条件(4)为优选的条件，除非另外说明，否则均使用此条件。

“IL-13相关病症”是其中IL-13促成病症的病理或症状的病症。因此，IL-13结合剂(如是一种或多种IL-13相关活性拮抗剂的IL-13结合剂)可用于治疗或预防此病症。

术语“IL-13”包括本领域称为IL-13的细胞因子的全长未加工形式(不考虑物种来源，包括哺乳动物如人和非人灵长类IL-13)及其成熟的已加工形式和这些细胞因子的(至少5个氨基酸的)任何片段或变体。可以根据全长未加工的人IL-13序列的编号来命名IL-13序列中的位置。示例全长猴IL-13见SEQ ID NO：24；成熟的已加工的猴IL-13见SEQ ID NO：14；全长人IL-13见SEQ ID NO：178；成熟的已加工的人IL-13见SEQ IDNO：124。示例序列引用如下：

MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN(SEQID NO：178)

例如，位置130为共有多态性位点。

IL-13受体蛋白(如IL-13Rα1和IL-13Rα2)的示例序列描述于Donaldson等(1998)J Immunol.161：2317-24；U.S.6,214,559；U.S.6,248,714和U.S.6,268,480。

附图简述

图1A是全长人和猕猴IL-13(分别为SEQ ID NO：178和SEQ IDNO：14)的比对。

图1B是来自猕猴IL-13的示例肽列表(分别为SEQ ID NO：179-188)。

图2是描述通过CD23⁺单核细胞的百分比(y轴)测量的多种IL-13结合剂中和NHP IL-13活性的图。在x轴上标出了MJ2-7(Δ)、C65(◆)和sIL-13Rα2-Fc(●)的浓度。

图3是描述MJ2-7(小鼠，●)或人源化MJ2-7v2.11(○)中和NHP IL-13活性的图。NHP IL-13活性作为抗体浓度(x轴)的函数通过STAT6的磷酸化(y轴)来测量。

图4是描述MJ2-7v2.11(○)或sIL-13Rα2-Fc(▲)中和NHP IL-13活性的图。NHP IL-13活性作为拮抗剂浓度(x轴)的函数通过STAT6的磷酸化(y轴)来测量。

图5是描述MJ2-7(Δ)、C65(◆)或sIL-13Rα2-Fc(●)中和NHP IL-13活性的图。NHP IL-13活性作为拮抗剂浓度(x轴)的函数通过STAT6的磷酸化(y轴)来测量。

图6A是描述通过天然人IL-13(x轴)诱导粘蛋白产生(y轴)的图。

图6B是描述MJ2-7中和NHP IL-13活性的图，作为抗体浓度(x轴)的函数通过对生腱蛋白产生诱导的抑制(y轴)来测量。

图7是描述MJ2-7或对照抗体与NHP-IL-13的结合的图，其中NHP-IL-13与偶联至SPR芯片的sIL-13Rα2-Fc结合。

图8是描述多种浓度(0.09-600nM)的NHP IL-13与捕获的hMJ2-7V2-11抗体的结合的图。

图9是描述小鼠MJ2-7(●)或人源化形式1(○)、形式2(◆)或形式3(Δ)抗体中和NHP IL-13活性的图。NHP IL-13活性作为抗体浓度(x轴)的函数通过STAT6的磷酸化(y轴)来测量。

图10是描述通过包括小鼠MJ2-7VH和VL(●)、小鼠VH和人源化形式2VL(Δ)或形式2VH和VL(◆)的抗体中和NHP IL-13活性的图。NHP IL-13活性作为抗体浓度(x轴)的函数通过STAT6的磷酸化(y轴)来测量。

图11A和11B是描述MJ2-7抗体抑制IL-13与固定化IL-13受体的结合的图，通过ELISA测量。以450nm处的吸收(y轴)描述结合。MJ2-7抗体的浓度描述于x轴。图11A描述与IL-13Rα1的结合。图11B描述与IL-13Rα2的结合。

图12是DPK18种系氨基酸序列(SEQ ID NO：193)与人源化MJ2-7形式3VL(SEQ ID NO：190)的比对。

图13A是成熟的已加工的人IL-13的氨基酸序列(SEQ ID NO：124)。

图13B是人IL-13Rα1的氨基酸序列(SEQ ID NO：125)。

发明详述

公开了与IL-13特异性结合并调节IL-13与IL-13受体和信号介质相互作用的能力的结合剂(如抗IL-13抗体分子)。该试剂可用于调节(如抑制)一种或多种IL-13相关活性。IL-13结合剂(如本文所公开的)可用于(如在体内)调节一种或多种IL-13相关活性，如用于治疗或预防IL-13介导的病症(如哮喘、呼吸道炎症、特应性病症、过敏反应、嗜酸粒细胞增多、纤维化和IL-13相关癌症)。

抗IL-13抗体分子

众多方法都可用于获得抗体分子。一个示例方法包括筛选蛋白质表达文库，如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于例如Ladner等，美国专利号5,223,409、Smith(1985)Science 228：1315-1317、WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690和WO 90/02809。除了使用展示文库以外，可以使用其他方法获得抗IL-13抗体分子。例如，可以在非人动物(如啮齿类，如小鼠、仓鼠或大鼠)中将IL-13蛋白质或其肽用作抗原。

在一个实施方案中，非人动物包含人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可以用人Ig基因座的大片段改造小鼠抗体产生不足的小鼠品系。使用杂交瘤技术可以产生和选择来自具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参阅如XENOMOUSE^TM、Green等(1994)Nature Genetics7：13-21、US 2003-0070185、1996年10月31日出版的WO 96/34096和1996年4月29日提交的PCT申请号PCT/US96/05928。

在另一实施方案中，从非人动物获得单克隆抗体并在其后进行修饰，如人源化或去免疫。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例CDR移植方法(美国专利号5,225,539)。可以用至少部分的非人CDR替换特定人抗体的所有CDR，或者可以用非人CDR替换仅一些CDR。仅有必要替换人源化抗体与预定抗原的结合所需数目的CDR。

可以通过用来自人Fv可变结构域的等价序列替换不直接涉及抗原结合的Fv可变结构域序列来产生人源化抗体。Morrison(1985)Science229：1202-1207、Oi等(1986)Bio Techniques 4：214和US 5,585,089、US5,693,761、US 5,693,762、US 5,859,205和US 6,407,213提供了产生人源化抗体分子的示例方法。这些方法包括分离、操作和表达编码来自重链或轻链之一的免疫球蛋白Fv可变结构域的全部或部分的核酸序列。这些核酸可得自产生针对如上述预定靶标的抗体的杂交瘤以及得自其他来源。接着可以将编码人源化抗体的重组DNA克隆进适当的表达载体。

还可以通过人T细胞表位的特异性缺失或WO 98/52976和WO00/34317中公开的方法“去免疫”来修饰IL-13结合抗体分子。简言之，可以分析重链和轻链可变结构域中与II类MHC结合的肽，这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定义)。为了检测潜在的T细胞表位，可以应用称为“肽穿线”(peptide threading)的计算机建模方法，此外，可以从人II类MHC结合肽的数据库中搜索VH和VH序列中存在的基序，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序与18个主要II类MHC DR同种异型中的任一种结合，从而构成潜在T细胞表位。可以通过替换可变结构域中的少数氨基酸残基(或优选通过单个氨基酸替换)来消除检测到的潜在T细胞表位。一般进行保守性替换。经常(但不排他地)使用人种系抗体序列中的位置共有的氨基酸。人种系序列公开于例如Tomlinson，等(1992)J.Mol.Biol.227：776-798、Cook，G.P.等(1995)Immunol.Today第16卷(5)：237-242、Chothia，D.等(1992)J.Mol.Biol.227：799-817和Tomlinson等(1995)EMBO J.14：4628-4638。VBASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的详尽目录(由Tomlinson，I.A.等MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK汇编)。这些序列可用作(如构架区和CDR的)人序列的来源。还可以使用共有人构架区，如US 6,300,064中所述。

此外，可以使用标准重组DNA技术产生嵌合的、人源化的和单链的抗体分子(如包含人和非人部分的蛋白质)。还可以例如使用表达人重链和轻链基因但不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的转基因小鼠产生人源化抗体。

此外，本文描述的抗体分子还包括与IL-13结合、干扰功能性IL-13信号复合体的形成并在重链恒定区中具有突变的抗体分子。有时需要突变和失活恒定区中的某些片段。例如，可以在重链恒定区中进行突变以产生具有对Fc受体(FcR)和/或补体降低的结合的抗体，这些突变为本领域所熟知。SEQ ID NO：128中提供了这样突变IgG重链的恒定区的氨基酸序列的实例。CL和CH亚单位(如CH1)的某些活性片段彼此共价连接。另一方面提供获得对参与形成功能性IL-13信号复合体的IL-13的表面特异的抗原结合部位的方法。

示例抗体分子可以包含SEQ ID NO：30-46中公开的VL链序列和/或SEO ID NO：50-115中公开的VH链序列，但也可以包含保留IL-13结合能力的这些序列的变体。这些变体可以来自使用本领域熟知的技术提供的序列。可以在FR或CDR中进行氨基酸替换、缺失或添加。而构架区中的变化通常设计用于提高稳定性和降低抗体分子的免疫原性，CDR中的变化通常设计用于提高抗体分子对其靶标的亲和力。通过改变CDR并测试抗体分子来经验性的确定这种亲和力提高的变化。可以按照《AntibodyEngineering》，第二版(1995)，Borrebaeck编辑，Oxford University Press中描述的方法进行这些改变。

获得是本文所述重链可变结构域序列的变体的重链可变结构域序列的示例方法包括在本文所述的重链可变结构域序列中添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸、任选的组合重链可变结构域序列和一个或多个轻链可变结构域序列和测试包含经修饰的重链可变结构域序列的蛋白质与IL-13的特异性结合，并(优选)测试这些抗体结合结构域调节一种或多种IL-13相关活性的能力。可以使用本文所述轻链可变结构域序列的一种或多种序列变体应用类似的方法。

可以通过产生具有一个或多个改变的CDR的文库并筛选文库以寻找(例如以提高的亲和力)与IL-13结合的成员来制备抗体分子的变体。例如，Marks等(Bio/Technology(1992)10：779-83)描述了产生抗体可变结构域库的方法，其中靶向或毗邻可变结构域5’末端的通用引物与人VH基因第三个构架区的通用引物一起使用，以提供缺乏CDR3的VH可变结构域库。库可以与特定抗体的CDR3组合。另外，来自CDR3的序列可以与缺乏CDR3的VH或VL结构域库改组，改组的完整VH或VL结构域可以与同族VL或VH结构域组合以提供特异性抗原结合片段。接着可以在适当的宿主系统(如WO 92/01047的噬菌体展示系统)中展示库，从而可以选择合适的抗原结合片段。Stemmer(Nature(1994)370：389-91)还公开了类似的改组或组合技术。其他变化是产生改变的VH或VL区，其中使用一个或多个选定的VH和/或VL基因的随机诱变在整个可变结构域中产生突变。参阅如Gram等Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1992)89：3576-80。

可以使用的另一方法是VH或VL基因CDR区的定向诱变。Barbas等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1994)91：3809-13)和Schier等(J.Mol.Biol.(1996)263：551-67)公开了这些技术。同样，可以将一个或多个或全部三个CDR移植到VH或VL结构域的库或甚至一些其他支架(如纤连蛋白结构域)中。评估得到的蛋白质与IL-13结合的能力。

在一个实施方案中，修饰了与靶标结合的结合剂(如通过诱变修饰以提供经修饰结合剂的混合物)。接着评估经修饰的结合剂以鉴定具有改变的功能特性(如提高的结合、提高的稳定性、延长的体内稳定性)的一种或多种改变的结合剂。在一种实现方式中，使用展示文库技术选择或筛选经修饰结合剂的混合物。接着(例如通过使用较高的严格度或更具竞争性的结合和洗涤条件)从第二个文库中鉴定较高亲和力的结合剂。也可以使用其他筛选技术。

在一些实施方案中，诱变靶向已知或可能在结合界面上的区域。例如，如果鉴定的结合剂为抗体分子，则诱变可以针对本文所述重链或轻链的CDR区。另外，诱变可以针对靠近或毗邻CDR的构架区，如特别是CDR结合处10、5或3个氨基酸内的构架区。对于抗体的情况，诱变还可以限制在一个或少数CDR中，例如提供逐步的改进。

在一个实施方案中，诱变用于使抗体与一个或多个种系序列更相似。示例种系方法可以包括：鉴定与分离的抗体序列相似的(如特定数据库中最相似的)一个或多个种系序列。接着可以在分离的抗体中进行(氨基酸水平的)(增量或组合或二者均有的)突变。例如，产生包含编码一些或全部可能的种系突变的序列的核酸文库。接着评估突变的抗体，例如鉴定与分离的抗体相比具有一个或多个其他种系残基并仍然有用(如具有功能活性)的抗体。在一个实施方案中，在分离的抗体中引入尽可能多的种系残基。

在一个实施方案中，诱变用于在CDR区中替换或插入一个或多个种系残基。例如，种系CDR残基可以来自与被修饰的可变结构域相似的(如最相似的)种系序列。诱变后，可以评估抗体的活性(如结合或其他功能活性)以确定一个或多个种系残基是否被耐受。可以在构架区中进行类似的诱变。

可以以不同的方式进行种系序列的选择。例如，如果满足对选择性或相似性预定的标准时(如至少某个百分比同一性，如至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5％同一性)，则可以选择该种系序列。可以使用至少2、3、5或10个种系序列进行选择。对于CDR1和CDR2的情况，鉴定相似的种系序列可以包括选择一个这样的序列。对于CDR3的情况，鉴定相似的种系序列可以包括选择一个这样的序列，但也可以包括使用分别对氨基端部分和羧基端部分做出贡献的两个种系序列。在其他实现方式中，使用了超过一个或两个的种系序列，例如用于形成共有序列。

在其他实施方案中，可以修饰抗体以具有改变的糖基化模式(即由最初的或天然的糖基化模式改变)。在此上下文中，“改变的”指在最初抗体中缺失一个或多个碳水化合物部分和/或添加一个或多个糖基化位点。可以通过改变氨基酸序列以包含糖基化位点共有序列来实现本发明公开的抗体中糖基化位点的加入，这些技术为本领域所熟知。提高抗体上碳水化合物部分数的另一种方法是通过将糖苷化学或酶偶联至抗体的氨基酸残基。这些方法描述于例如WO 87/05330和Aplin和Wriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.22：259-306。可以如本领域所述化学或酶促地去除抗体上存在的碳水化合物部分(Hakimuddin等(1987)Arch.Biochem.Biophys.259：52；Edge等(1981)Anal.Biochem.118：131和Thotakura等(1987)Meth.Enzymol.138：350)。通过提供补救受体结合表位来提高体内半衰期的修饰参阅如U.S.5,869,046。

在一个实施方案中，抗体分子具有与MJ2-7或C65仅存在不显著差异的CDR序列。不显著差异包括次要氨基酸变化，如替换CDR(如Chothia或Kabat CDR)序列中一般5-7个氨基酸中的1或2个。一般用具有相似的电荷、疏水性或立体化学特征的相关氨基酸替换氨基酸。这些替换在本领域普通技术人员的能力之内。与CDR中不同，可以在结构构架区(FR)中进行更显著的变化而不对抗体的结合特性产生不利影响。FR的变化包括但不仅限于人源化非人来源的构架区或改造对抗原接触或结合位点的稳定很重要的某些构架区残基，如改变恒定区的类别或亚类、改变可能改变效应子功能(如Fc受体结合)(Lund等(1991)J.Immunol.147：2657-62；Morgan等(1995)Immunology 86：319-2)的特定氨基酸残基或改变恒定区来源的物种。抗体可以在重链的CH2区具有降低或改变效应子功能(如Fc受体结合和补体活化)的突变。例如，抗体可以具有如美国专利号5,624,821和5,648,260中所述的突变。例如在IgG1和IgG2重链中，可以进行这些突变以使其与SEQ ID NO：17中公开的氨基酸序列相似。抗体还可以具有稳定免疫球蛋白两条重链间二硫键的突变，如本领域公开的IgG4铰链区中的突变(如Angal等(1993)Mol.Immunol.30：105-08)。

IL-13结合剂可以是完整抗体、抗体的抗原结合片段(如Fab、F(ab’)2、Fd、dAb和scFv片段)和在其恒定和/或可变结构域(如突变以产生嵌合、部分人源化或完全人源化的抗体以及产生具有所需性状(如增强的IL-13结合和/或降低的FcR结合)的抗体)中突变了的完整抗体和片段的形式。

抗体产生。一些抗体分子(如Fab)可以在细菌细胞(如大肠杆菌细胞)中产生。例如，如果Fab由在展示实体和噬菌体蛋白(或其片段)之间包含可抑制终止密码子的噬菌体展示载体中的序列编码，则可将载体核酸转移进不能抑制终止密码子的细菌细胞。在此情况下，Fab不与基因III蛋白融合，并分泌到周质和/或培养基中。

还可以在真核细胞中产生抗体分子。在一个实施方案中，在酵母细胞如毕赤酵母属(Pichia)(参阅如Powers等(2001)J Immunol Methods.251：123-35)、汉逊酵母属(Hansenula)或酵母属(Saccharomyces)中表达抗体(如scFv’)。

在一个优选的实施方案中，在哺乳动物细胞中产生抗体分子。用于表达克隆抗体或其抗原结合片段的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220中描述的与DHFR选择标记一起使用的dhfr^-CHO细胞，如Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述)、淋巴细胞系如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞和来自转基因动物(如转基因哺乳动物)的细胞。例如，细胞为哺乳动物上皮细胞。

除了编码抗体分子的核酸序列以外，重组表达载体还可以带有其他序列，如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因便于选择其中引入了载体的宿主细胞(参阅如美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，选择标记基因通常赋予其中引入了载体的宿主细胞对药物(如G418、潮霉素或氨甲喋呤)的抗性。

在用于重组表达抗体分子的示例系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和轻链的重组表达载体引入dhfr^-CHO细胞。在重组表达载体内，抗体重链和轻链基因各自与增强子/启动子调节元件(如来自SV40、CMV、腺病毒，如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)有效连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还带有DHFR基因，它使用氨甲喋呤选择/扩增来选择转染了载体的CHO细胞。可以培养选择的转化体宿主细胞以表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整抗体。可以使用标准分子生物学技术制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收抗体分子。例如，一些抗体分子可以用蛋白A或蛋白G偶联基质通过亲和层析分离。

对于包含Fc结构域的抗体分子，抗体产生系统优选合成Fc区被糖基化的抗体。例如，IgG分子的Fc结构域在CH2结构域中天冬酰胺297处被糖基化。此天冬酰胺是用双触角型寡糖修饰的位点。已经证明Fcγ受体和补体C1q介导的效应子功能需要这种糖基化(Burton和Woof(1992)Adv.Immunol.51：1-84、Jefferis等(1998)Immunol.Rev.163：59-76)。在一个实施方案中，在使天冬酰胺297对应的残基被正确糖基化的哺乳动物表达系统中产生Fc结构域。Fc结构域还可以包括其他真核翻译后修饰。

还可以在转基因动物中产生抗体分子。例如，美国专利号5,849,992描述了在转基因哺乳动物的乳腺中表达抗体的方法。构建包含乳特异性启动子和编码抗体分子的核酸和用于分泌的信号序列的转基因。这些雌性转基因哺乳动物产生的乳中包含分泌到其中的目的抗体。可以从乳中纯化抗体分子或者在一些应用中直接使用。

表征

可以通过任何方法测量结合剂的结合特性，如通过以下方法之一：BIACORETM分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、x射线晶体学、序列分析和扫描诱变。可以通过以下方法测量蛋白质中和和/或抑制一种或多种IL-13相关活性的能力：用于测量IL-13依赖性细胞系的增殖的测定，如TFI；用于测量IL-13介导的多肽的表达的测定，如CD23表达的流式细胞术分析；评估下游信号分子(如STAT6)活性的测定；评估生腱蛋白产生的测定；测试相关动物模型(如猕猴)中本文所述抗体预防哮喘的效力的测定以及其他测定。IL-13结合剂(特别是IL-13抗体分子)可以在一种或多种这些测定中具有统计学显著的效应。结合特性的示例测定包括以下的。

可以使用表面等离振子共振(SPR)分析IL-13结合剂和靶标(如IL-13)的结合相互作用。SPR或生物分子相互作用分析(BIA)实时检测生物特异性相互作用而不标记任何相互作用者。结合在BIA芯片表面质量的变化(指示结合事件)引起靠近表面的光折射率的改变。折射率的变化产生可检测的信号，所述信号测量为生物分子间实时反应的指标。使用SPR的方法描述于例如美国专利号5,641,640；Raether(1988)Surface PlasmonsSpringer Verlag；Sjolander和Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63：2338-2345；Szabo等(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705和BIAcore International AB(Uppsala，Sweden)提供的在线资源中。

来自SPR的信息可用于提供分子与靶标结合的平衡解离常数和动力学参数(包括K_on和K_off)的准确的定量测量。此类数据可以用于比较不同的分子。来自SPR的信息还可用于开发结构-活性关系(SAR)。例如，可以评估不同抗体分子的动力学和平衡结合参数。可以鉴定给定位置处与特定的结合参数(如高亲和力和缓慢的K_off)相关的变体氨基酸。此信息可以与结构建模(如使用同源性建模、能量最低化或通过x射线晶体学或NMR测定结构)组合。结果，可以得到对蛋白质与其靶标之间物理相互作用的理解，并用于指导其他设计过程。

呼吸系统病症

IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)可用于治疗或预防呼吸系统病症，包括但不仅限于哮喘(如变应性和非变应性哮喘(如幼儿中呼吸道合胞病毒(RSV)感染引起的哮喘))、支气管炎(如慢性支气管炎)、慢性阻塞性肺病(COPD)(如肺气肿(如吸烟引发的肺气肿))、与呼吸道炎症相关的病症、嗜酸粒细胞增多、纤维化和粘液产生过度，如囊性纤维化、肺纤维化和变应性鼻炎。例如，可以以有效治疗或预防病症或改善病症的至少一种症状的量施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)。

很多条件都可以触发哮喘，如吸入变应原、存在上呼吸道或耳感染等(Opperwall(2003)Nurs.Clin.North Am.38：697-711)。变应性哮喘的特征在于对多种特异性和非特异性刺激的呼吸道高反应性(AHR)、升高的血清免疫球蛋白E(IgE)、呼吸道粘液产生过度、水肿和支气管上皮损伤(Wills-Karp，见上文)。当变应原激发立即早期呼吸道应答时(若干小时后常跟随延迟的晚期呼吸道应答(LAR))，则变应性哮喘开始(Henderson等(2000)J.Immunol.164：1086-95)。在LAR期间在整个呼吸道壁和支气管液中流入嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞(Henderson等，见上文)。肺嗜酸粒细胞增多是变应性哮喘的标志，并是呼吸上皮损伤的主要原因(Li等(1999)J.Immunol.162：2477-87)。

CD4⁺ T辅助(Th)细胞对于与哮喘相关的慢性炎症是很重要的(Henderson等，见上文)。一些研究已经显示CD4⁺细胞定型为2类T辅助(Th2)细胞和其后2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-10和IL-13)的产生对导致AHR的变应性炎症应答是很重要的(Tomkinson等(2001)J.Immunol.166：5792-5800及其引用的参考文献)。首先，已经显示CD4⁺ T细胞对小鼠模型中变态反应诱导的哮喘是必要的。其次，产生2型细胞因子的CD4⁺ T细胞不仅在这些动物模型中增殖，而且在患有变异性哮喘的患者中增殖。第三，2型细胞因子的水平在动物模型和哮喘患者的呼吸道组织中提高。第四，在变应性哮喘的小鼠模型中已经发现Th2细胞因子在嗜酸性粒细胞募集中发挥中心作用，并且过继转移的Th2细胞与肺中eotaxin(潜在嗜酸性粒细胞的化学引诱物)的水平提高和肺嗜酸粒细胞增多相关(Wills-Karp等，见上文；Li等，见上文)。

本文所述治疗或预防哮喘的方法包括用于外源性哮喘(也称为变应性哮喘或特应性哮喘)、内源性哮喘(也称为非变应性哮喘或非特应性哮喘)或二者组合(称为混合性哮喘)的方法。外源性或变应性哮喘包括由例如变应原如花粉、孢子、草或种子、宠物皮屑、粉尘、螨等引起或与其相关的事件。由于变应原和其他刺激物在一年中不同的时间点出现，因此这些类型的事件也称为季节性哮喘。外源性哮喘组中还包括支气管哮喘和变应性支气管肺曲霉病。

可用本文所述的治疗剂治疗或缓解的病症包括由传染原引起的呼吸系统病症和哮喘，所述传染原为如病毒(如感冒和流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV))、副粘病毒、鼻病毒和流感病毒。RSV、鼻病毒和流感病毒感染在儿童中很普遍，并且是婴儿和幼儿呼吸道疾病的主要原因。患病毒性细支气管炎的儿童可能发展为慢性哮鸣和哮喘，它们可以使用本文描述的方法进行治疗。还包括一些哮喘患者中可以由锻炼和/或冷空气引起的哮喘疾病。该方法可用于与烟接触(如吸烟引起的或工业烟)以及工业和职业性接触相关的哮喘，所述接触为如烟、臭氧、有毒气体、二氧化硫、氧化亚氮、烟尘，包括来自油漆、塑料、聚氨基甲酸酯、清漆等的异氰酸盐、木材、植物或其他有机粉尘等。该方法还可用于与食品添加剂、防腐剂或药剂相关的哮喘事件。还包括用于治疗、抑制或缓解称为沉默性哮喘或咳嗽变异哮喘的哮喘类型。

本文公开的方法还可用于治疗和缓解与可刺激支气管收缩的胃食管反流(GERD)相关的哮喘。GERD与保留的身体分泌物、被抑制的咳嗽和接触卧室中的变应原和刺激物可以促成哮喘疾病，统称为夜间哮喘或夜间发生的哮喘。在治疗、抑制或缓解与GERD相关的哮喘的方法中，可以如本文所述使用药学有效量的IL-13与药学有效量的治疗GERD的物质的组合。这些物质包括但不仅限于质子泵抑制剂如商标的缓释泮托拉唑钠片剂、

商标的奥美拉唑缓释胶囊剂、

商标的利贝拉唑钠(rebeprazole sodium)缓释片剂或

商标的缓释兰索拉唑胶囊剂。

特应性疾病及其症状

已经观察到来自特应性患者的细胞对IL-13具有增强的敏感性。因此，可以以有效量施用IL-13结合剂(例如，如本文所述的抗体分子的IL-13结合剂)，以治疗或预防特应性病症。“特应性”指这样一组疾病：其中经常存在发展出变应性反应的遗传趋势。

特应性病症的实例包括变态反应、变应性鼻炎、特应性皮炎、哮喘和花粉症。哮喘是与间歇性呼吸系统症状(如支气管高应答性和可逆气流阻塞)相关的表型异质病症。哮喘的免疫组织病理学特征包括如呼吸道上皮剥脱、基底膜下的胶原沉积、水肿、肥大细胞活化和炎性细胞浸润(如通过嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)。呼吸道炎症还可促成呼吸道高反应性、气流限制、急性支气管收缩、粘液栓的形成、呼吸道壁重塑和其他呼吸系统症状。可以以有效量施用IL-13结合剂(例如，如本文所述的抗体分子的IL-13结合剂)以改善一种或多种这些症状。

变应性鼻炎(花粉症)的症状包括鼻痒、流鼻涕、打喷嚏或鼻塞以及眼痒。可以施用IL-13结合剂以改善一种或多种这些症状。特应性皮炎是影响皮肤的慢性(长期)疾病。关于特应性皮炎的信息可获得自例如NIH出版号03-4272。在特应性皮炎中，皮肤变得非常痒，引起发红、肿胀、裂缝、渗出清液并最终引起结痂和脱皮。在许多情况下都存在疾病严重(称为恶化或活动)的时间段和其后皮肤改善或完全好转(称为缓和)的时间段。特应性皮炎常称为“湿疹”，它是若干类型的皮肤炎症的通称。特应性皮炎是湿疹中最普遍的类型。特应性皮炎的实例包括：变应性接触性湿疹(皮炎：在皮肤接触免疫系统识别为外源的物质(如霜剂或乳液中的毒常春藤或某些防腐剂)的地方发红、痒、渗液的反应)、接触性湿疹(在皮肤接触变应原(引起变态反应的物质)或刺激物如酸、清洁剂或其他化学品的地方包括发红、痒和灼热的局部反应)、汗疱(手掌或足底皮肤的刺激，特征在于痒并灼热的透明位于深处的水疱)、神经性皮炎(由挠抓时变得极端剧烈的局部痒(如昆虫叮咬)引起的头、小腿、腕或前臂皮肤的鳞状斑)、钱币状湿疹(受刺激皮肤处硬币形的斑(多发于手臂、背、臀部和下肢)，可结痂、鳞屑并极端搔痒)、脂溢性湿疹(头皮、脸(有时在身体其他部位)处皮肤上淡黄色、油性鳞状斑)。其他具体症状包括停滞性皮炎、特应性褶(Dennis-Morgan褶)、唇炎、掌纹增多、眼睑色素过度沉着(由炎症或花粉症引起颜色变深的眼睑)、鱼鳞病、毛发角化病、苔藓化、丘疹和荨麻疹。可以施用IL-13结合剂以改善一种或多种这些症状。

治疗变应性鼻炎或其他变应性病症的示例方法包括在接触变应原之前(如季节性接触变应原之前，如在变应原旺盛之前)使用IL-13结合剂的最初疗法。这些疗法可以包括一次或多次给药，如以规则的间隔给药。

癌症

IL-13及其受体可能与至少一些类型癌症的发生相关，例如来自造血细胞的癌症或来自脑或神经元细胞的癌症(如成胶质细胞瘤)。例如，阻断IL-13信号途径(例如通过使用可溶性IL-13受体或STAT6-/-缺陷型小鼠)分别引起延迟的肿瘤发生和/或霍奇金淋巴瘤细胞系或转移乳腺癌的生长(Trieu等(2004)Cancer Res.64：3271-75、Ostrand-Rosenberg等(2000)J.Immunol.165：6015-6019)。本文所述的抗IL-13抗体可特异性靶向表达IL-13Rα2的癌症(Husain和Puri(2003)J.Neurooncol.65：37-48、Mintz等(2003)J.Neurooncol.64：117-23)。IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)可用于抑制癌细胞增殖或其他癌细胞活性。癌症指这样的一种或多种细胞：其丧失了对正常生长控制的应答性，并且通常相比相应正常细胞，增殖受到更低的调节。

可以使用IL-13结合剂(如IL-13结合剂，如本文所述的抗体或抗原结合片段)治疗的癌症实例包括白血病(如B-细胞慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病和人T-细胞白血病1型病毒(HTLV-1)转化的T细胞)、淋巴瘤(如T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、成胶质细胞瘤、胰腺癌、肾细胞癌、卵巢癌和AIDS-卡波西肉瘤)。例如，可以以有效剂量施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)以治疗或预防病症，如降低细胞增殖或改善病症的至少一种症状。

纤维化

IL-13结合剂还可用于治疗炎症和纤维化，如肝纤维化。已经将IL-13产生和肝炎症(如病毒性肝炎)向肝硬化的发展相联系，并可能与肝细胞癌相联系(de Lalla等(2004)J.Immunol.173：1417-1425)。纤维化发生在例如正常组织被瘢痕组织取代时，经常发生在炎症之后。乙肝病毒和丙肝病毒都引起肝中的纤维化反应，可以发展为肝硬化。继而肝硬化可演变为严重的并发症，如肝衰竭或肝细胞癌。使用本文所述的IL-13结合剂(如抗IL-13抗体)阻断IL-13活性可降低炎症和纤维化，例如与肝病特别是乙肝和丙肝相关的炎症、纤维化和肝硬化。例如，可以以有效剂量施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)以治疗或预防病症，或改善炎性和/或纤维化病症的至少一种症状。

炎性肠病

炎性肠病(IBD)是引起肠道炎症的疾病的通称。炎性肠病的两个实例是克隆病和溃疡性结肠炎。已经发现IL-13/STAT6信号与炎症诱导的小鼠平滑肌高收缩性(炎性肠病的模型)相关(Akiho等(2002)Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.282：G226-232)。例如，可以以有效剂量施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)以治疗或预防病症，或改善炎性肠病的至少一种症状。

其他IL-13结合剂

还提供了与IL-13结合的不同于抗体及其片段结合剂以外的结合剂，特别是与MJ2-7或C65及本文所述的其他抗体竞争结合IL-13的结合剂。例如，结合剂可以与MJ2-7或C65结合IL-13上相同的表位或重叠的表位。结合剂优选抑制或中和IL-13活性。例如，结合剂抑制IL-13与IL-13Rα1的结合，例如不阻止IL-13与IL4Rα的结合。这些结合剂可用于本文所述的方法，例如用于治疗或预防病症的方法。本文所述的所有实施方案都可调整用于IL-13结合剂。

可以通过多种方法鉴定结合剂，包括修饰本文所述的可变结构域或将本文所述可变结构域的一个或多个CDR移植到另一支架结构域上。还可以例如通过筛选从多样文库中鉴定结合剂。筛选蛋白质文库的一种方法使用噬菌体展示。改变蛋白质的特定区域，并鉴定与IL-13相互作用的蛋白质(如通过固定在固相支持体上或通过其他物理结合)。为鉴定与MJ2-7或C65结合IL-13上相同的表位或重叠表位的特定结合剂，可以通过加入MJ2-7或C65(或相关抗体)稀释结合剂，或者在与MJ2-7或C65(或相关抗体)的竞争实验中评估结合剂。还可以通过使文库接触含有IL-13和MJ-27或C65(或相关抗体)的复合体来减少文库中结合其他表位的物质。接着使经减少的文库接触IL-13，以获得与IL-13结合但在结合MJ2-7或C65后不与IL-13结合的结合剂。还可以使用含有MJ2-7或C65表位的来自IL-13的肽作为靶标。

噬菌体展示描述于例如美国专利号5,223,409、Smith(1985)Science228：1315-1317、WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690、WO 90/02809、WO 94/05781、Fuchs等(1991)Bio/Technology 9：1370-1372、Hay等(1992)Hum AntibodHybridomas 3：81-85、Huse等(1989)Science 246：1275-1281、Griffiths等(1993)EMBO J 12：725-734、Hawkins等(1992)JMol Biol 226：889-896、Clackson等(1991)Nature 352：624-628、Gram等(1992)PNAS89：3576-3580、Garrard等(1991)Bio/Technollogy9：1373-1377、Rebar等(1996)Methods Enzymol.267：129-49和Barbas等(1991)PNAS88：7978-7982。酵母表面展示描述于例如Boder和Wittrup(1997)Nat.Biotechnol.15：553-557。其他形式的展示为核糖体展示。参阅如Mattheakis等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9022和Hanes等(2000)NatBiotechnol.18：1287-92、Hanes等(2000)MethodsEnzymol.328：404-30和Schaffitzel等(1999)J Immunol Methods.231(1-2)：119-35。

与IL-13结合的结合剂可以具有支架蛋白的结构特征，如折叠结构域。基于抗体的示例支架结构域是通过从单克隆抗体重链可变结构域中缺失三个β链而设计的“微抗体”支架(Tramontano等，1994，J.Mol.Recognit.7：9和Martin等，1994，EMBO J.13：5303-5309)。此结构域包括61个残基，可用于呈递两个高变环，如本文所述可变结构域和本文所述变体的一个或多个高变环。在另一方法中，结合剂包含是V样结构域的支架结构域(Coia等WO99/45110)。V样结构域指具有与抗体重链可变(VH)或轻链可变(VL)结构域相似的结构特征的结构域。另一支架结构域来自tendamistatin——通过两个二硫键结合的74残基、6条链的β折叠片夹层(McConnell和Hoess，1995，J.Mol.Biol.250：460)。此亲本蛋白包含3个环。环可以修饰(如使用本文所述的CDR或高变环)或变化，如用于选择与IL-13结合的结构域。WO 00/60070描述了可用作支架结构域的来自CTLA-4的天然存在的胞外结构域的β夹层结构。

IL-13结合剂的另一支架结构域是基于III型纤连蛋白结构域或相关纤连蛋白样蛋白的结构域。III型纤连蛋白(Fn3)结构域的总体折叠方式与最小的功能性抗体片段(抗体重链的可变结构域)的折叠方式高度相似。Fn3是与抗体VH结构域相似的β夹层，只是Fn3具有7个β链，而不是9个。Fn3末端有3个环，BC、DE和FG环大致对应于抗体VH结构域的CDR1、2和3。Fn3是有利的，因为它不具有二硫键。因此，与抗体及其片段不同，Fn3在还原条件下是稳定的(参阅WO 98/56915、WO 01/64942、WO 00/34784)。Fn3结构域可以是修饰的(如使用本文所述的CDR或高变环)或变化的，例如用于选择与IL-13结合的结构域。

其他示例支架结构域包括：T细胞受体、MHC蛋白、胞外结构域(如III型纤连蛋白重复、EGF重复)、蛋白酶抑制剂(如Kunitz结构域、大肠杆菌素、BPTI等等)、TPR重复、trifoil结构、锌指结构域、DNA结合蛋白；特别是单体DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、酶如蛋白酶(特别是失活的蛋白酶)、核糖核酸酶、陪伴分子如硫氧还蛋白和热休克蛋白；和胞内信号结构域(如SH2和SH3结构域)。US 20040009530描述了一些备选支架的实例。

小支架结构域的实例包括：Kunitz结构域(58个氨基酸，3个二硫键)、Cucurbida maxima胰蛋白酶抑制剂结构域(31个氨基酸，3个二硫键)、鸟苷肽相关结构域(14个氨基酸，2个二硫键)、来自革兰氏阴性菌的热稳定肠毒素IA相关结构域(18个氨基酸，3个二硫键)、EGF结构域(50个氨基酸，3个二硫键)、Kringle结构域(60个氨基酸，3个二硫键)、真菌碳水化合物结合结构域(35个氨基酸，2个二硫键)、内皮缩血管肽结构域(18个氨基酸，2个二硫键)和链球菌GIgG结合结构域(35个氨基酸，无二硫键)。小胞内支架结构域的实例包括SH2、SH3和EVH结构域。一般地，可以使用胞内或胞外的任何模块结构域。

评估支架结构域的示例标准包括：(1)氨基酸序列、(2)若干同源结构域的序列、(3)3维结构和/或(4)对pH、温度、盐度、有机溶剂、氧化剂浓度范围内的稳定性数据。在一个实施方案中，支架结构域是小稳定蛋白结构域，如小于100、70、50、40或30个氨基酸的蛋白质。结构域可包含一个或多个二硫键，或者可以螯合金属，如锌。

其他结合剂基于肽，如具有小于30、25、24、20、18、15或12个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。肽可以整合进大蛋白质中，但一般是整合进独立与IL-13结合的区域，如本文所述的表位。可以通过噬菌体展示鉴定肽。参阅如US 20040071705。

IL-13结合剂可以包含非肽连接和其他化学修饰。例如，可以以肽模拟物(如拟肽)合成结合剂的部分或全部(参阅如Simon等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9367-71和Horwell(1995)Trends Biotechnol.13：132-4)。结合剂可以包含一个或多个(如全部)不可水解的键。本领域已知许多不可水解肽键以及含有这些键的肽的合成方法。示例的不可水解的键包括--[CH₂NH]--还原的酰胺肽键、--[COCH₂]—酮亚甲基肽键、--[CH(CN)NH]--(氰基亚甲基)氨基肽键、--[CH₂CH(OH)]—羟基亚乙基肽键、--[CH₂O]—肽键，和--[CH₂S]—硫代亚甲基肽键(参阅如美国专利号6,172,043)。

药物组合物

可以体外、离体(ex vivo)或体内使用IL-13结合剂，如与IL-13结合的抗体分子(如本文所述的那些)。它们可以(例如通过将IL-13结合剂与可药用载体组合)掺入药物组合物中。除了IL-13结合剂和载体以外，这样的组合物还可以含有多种稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域已知的其他物质。可药用物质一般是不干扰IL-13结合剂生物活性的效力的无毒物质。载体的特征可以取决于给药途径。

本文所述的药物组合物还可以含有其他因子，如(但不仅限于)下文更详细描述的其他抗细胞因子抗体分子或其他抗炎剂。药物组合物中可以包含这些额外的因子和/或物质，以产生与IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的协同效应。例如，在变应性哮喘的治疗中，本文所述的药物组合物可以包含抗IL-4抗体分子或已知减小变应性应答的药物。

本文所述的药物组合物可以是脂质体形式，其中除了其他可药用载体以外，IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)(例如本文所述的结合剂)与两亲性物质如脂质组合，所述两亲性物质在水溶液中以微粒、不溶单层、液晶或片状层的聚集形式存在。用于脂质体制剂的合适脂质包括但不仅限于甘油一酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。制备这些脂质体制剂的示例方法包括美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和4,737,323中所述的方法。

本文使用的术语“治疗有效量”指药物组合物或方法中每种活性成分足以显示对患者有意义的益处(如这些疾病症状的改善、治愈或治愈率的提高)的总量。当应用于单独施用的单一活性成分时，该术语仅指该成分。当应用于组合时，该术语指引起疗效的(组合、顺序或同时施用)活性成分的组合量。

在治疗或使用方法的实践中，对受试者(如哺乳动物，如人)施用治疗有效剂量的IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子，如与IL-13结合并干扰功能性Il-13信号复合体的形成(并且如中和或抑制一种或多种IL-13相关活性)的抗体分子)。可以按照本文所述的方法单独以及与其他疗法(如使用细胞因子、淋巴因子或其他造血因子、癌疗法或抗炎剂)组合施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)。当与一种或多种物质共同施用时，IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)可以与第二种物质同时施用，或者顺序施用。如果顺序施用，医师可以选择与其他物质组合施用的IL-13结合剂的适当顺序。

可以以多种常规方式施用药物组合物中使用的IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)，如口服、吸入或皮肤、皮下或静脉内注射。当通过静脉内、皮肤或皮下注射治疗有效剂量的IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)时，结合剂可以制备为无热原的肠胃外可接受的水溶液。可以考虑如pH、等渗性、稳定性等因素调整这些肠胃外可接受的蛋白质溶液的组成，例如为生理条件、结合剂稳定性等优化组成。用于静脉内、皮肤或皮下注射的药物组合物可以含有如等渗载体如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸化的林格注射液或本领域已知的其他载体。药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或其他添加剂。

药物组合物中IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的量可取决于受治疾病的性质和严重性，并取决于患者先前经受的治疗的性质。可以对正常患者或未显示症状的患者(如以预防模式)施用药物组合物。主治医师可以决定治疗每个个体患者的IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的量。例如，主治医师可以施用低剂量的拮抗剂并观察患者的反应。可以施用更高剂量的拮抗剂，直至得到对患者最佳的疗效，在这个点上一般不再提高剂量。例如，药物可以含有每kg体重在约0.1mg至50mg之间的抗体，如每kg体重在约0.1mg至5mg之间或约8mg至50mg之间。在以不超过每月两次的频率(如隔周一次或每月一次)皮下递送抗体的一个实施方案中，组合物包含约0.7-3.3(如1.0-3.0mg/kg，如约0.8-1.2、1.2-2.8或2.8-3.3mg/kg)的量。

使用药物组合物的疗法的持续时间可以变化，取决于受治疾病的严重性和每个个体患者的条件和潜在的特应性应答。在一个实施方案中，也可以以每周一次、每24、48、96小时一次或不超过这些间隔的频率通过皮下途径施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)。示例剂量可以在0.1-20mg/kg、更优选1-10mg/kg的范围内。可以例如通过速率小于20、10、5或1mg/分钟的静脉内输注施用物质以达到约1至50mg/m²或约5至20mg/m²的剂量。

在一个实施方案中，对患者施用IL-13结合剂包括改变蛋白质的剂量，例如用以使副作用降低或最小化。例如，可以对受试者施用第一次剂量，如小于治疗有效剂量的剂量。在其后的间隔(如至少6、12、24或48小时后)，可以对患者施用第二次剂量，如至少超过第一次剂量的25％、50％、75％或100％的剂量。例如，第二次剂量和/或相当的第三、第四和第五次剂量可以是治疗有效剂量的至少约70％、80％、90％或100％。

吸入

可以将含有IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的组合物配制为用于吸入或其他的肺递送模式。因此，可以通过吸入到肺组织施用IL-13结合剂。本文使用的术语“肺组织”指呼吸道的任何组织，并包括上呼吸道和下呼吸道，除非另有说明。可以与一种或多种用于治疗肺疾病的已有样式组合施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)。

在一个实例中，将IL-13结合剂配制为用于喷雾器。在一个实施方案中，可以以冻干的形式储存IL-13结合剂(如在室温下)，并在吸入前在溶液中重建。还可以将IL-13结合剂配制为用于使用医学装置如吸入器吸入。参阅如U.S.6,102,035(干粉吸入器)和6,012,454(干粉吸入器)。吸入器可以包括用于在适于储存的pH下的IL-13结合剂的分开的隔室和中和缓冲液的另一隔室和用于刚好在雾化前组合IL-13结合剂与中和缓冲液的机械。在一个实施方案中，吸入器是定量吸入器。

用于局部递送药物至肺气道的三个常用系统包括干粉吸入器(DPI)、定量吸入器(MDI)和喷雾器。吸入给药最常用的方法MDI可用于递送可溶形式或作为分散体的药物。一般MDI包括氟利昂或其他相对高蒸汽压的推进剂，其通过装置激活将雾化的药物推入呼吸道。与MDI不同，DPI一般完全依赖患者的吸入将干粉形式的药物引入肺。喷雾器通过对液体溶液传递能量形成可吸入的药物气雾剂。已经探索出使用含氟化合物在液体通气或肺灌洗中直接递送药物至肺的方法。这些及其他方法可用于递送IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)。在一个实施方案中，IL-13结合剂与聚合物(如稳定化合物或提高化合物半衰期的聚合物)结合。

例如，对于通过吸入给药而言，以来自压力容器或含有适当的推进剂或喷雾器的分散器的气雾剂喷雾的形式递送IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)。IL-13结合剂可以是干微粒形式或液体形式。如通过喷雾干燥、用电荷中和剂干燥IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的水溶液并接着从干粉产生微粒来制备含有IL-13结合剂的微粒，或者通过干燥有机改性剂中水溶液并接着从干粉产生微粒来制备。

可以使用合适的推进剂(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以来自增压包装或喷雾器的气雾剂喷雾形式便利地递送IL-13结合剂。在增压气雾剂的情况下，可以通过提供阀以递送测定的量来测定剂量单位。如果微粒是配制的微粒，则用于吸入器或吹入器的胶囊或药筒可以配制为含有IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)和合适的粉剂基质(如：乳糖或淀粉)的粉剂混合物。除了配制或非配制的化合物以外，可以将其他物质(如100％DPPC或其他表面活性剂)与IL-13结合剂混合，以促机配制或非配制化合物的递送和分散。制备干微粒的方法描述于例如WO 02/32406。

IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)可配制为用于气雾剂递送(如作为干气溶胶粒子)，从而在施用时它可被快速吸收并产生快速的局部或全身治疗结果。可以修改施用以提供在施用2分钟、5分钟、1小时或3小时内可检测的活性。在一些实施方案中，甚至可以更快地获得峰值活性，例如在半小时或甚至在10分钟内。IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)可以配制为更长的生物半衰期(例如通过与聚合物如PEG结合)以用作其他施用方式的备选，例如从而使IL-13结合剂从肺进入循环并分布到其他器官或具体的靶器官。

在一个实施方案中，以使至少5％的多肽质量递送到下呼吸道或肺深处的量递送IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)。肺部深处具有及其丰富的毛细血管网。分开毛细血管腔和肺泡空气腔的呼吸膜非常薄(≤6μm)并且渗透性极高。此外，肺泡表面的液层富含肺表面活性剂。在其他实施方案中，至少2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)组合物递送到下呼吸道或肺部深处。递送到这些组织的一种或两种引起IL-13结合剂的有效吸收和高生物利用率。在一个实施方案中，使用吸入器或喷雾器以测定的剂量提供IL-13结合剂。例如，可以以至少约0.02、0.1、0.5、1、1.5、2、5、10、20、40或50mg/次或更高的剂量单位形式递送IL-13结合剂。可按如下计算生物利用率百分比：生物利用率百分比＝(AUC_非侵入/AUC_{静脉内或皮 下})×(剂量_{静脉内或皮下}/剂量_非侵入)×100。

尽管不是必要的，但仍可使用递送增强剂如表面活性剂进一步增强肺递送。本文使用的“表面活性剂”指具有亲水和亲脂部分的IL-13结合剂，其通过与两个不混溶相间界面的相互作用促进药物的吸收。有若干原因可将表面活性剂用于干微粒，如减少微粒团聚、减少巨噬细胞的吞噬作用等。当与肺表面活性剂偶联时可以得到对IL-13结合剂更有效的吸收，因为表面活性剂如DPPC大幅促进化合物的扩散。表面活性剂是本领域所熟知的，包括但不仅限于磷酸甘油酯，如磷脂酰胆碱、二棕榈酰L-α-磷脂酰胆碱(DPPC)和二磷脂酰甘油(DPPG)；十六醇；脂肪酸；聚乙二醇(PEG)；聚氧化乙烯-9-；月桂醚(auryl ether)；棕榈酸；油酸；失水山梨醇三油酸酯(Span^TM85)；甘胆酸盐；表面活性肽；泊洛沙姆(poloxomer)；失水山梨醇脂肪酸酯；失水山梨醇三油酸酯；四丁酚醛；及磷脂类。

稳定化

在一个实施方案中，IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)与改善其稳定性和/或循环(如血、血清、淋巴、支气管肺灌洗或其他组织)中滞留(如至少1.5、2、5、10或50倍)的部分物理结合。

例如IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)可以与聚合物(如基本非抗原性的聚合物如聚环氧烷或聚氧化乙烯)结合。合适的聚合物的重量可显著变化。可以使用平均分子量范围从约200至约35000(或约1000至约15000和2000至约12500)的聚合物。

例如，IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)可以与水溶性聚合物(如亲水聚乙烯聚合物如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮)缀合。这些聚合物的非限制性列表包括聚环氧烷均聚物，如：聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧化乙烯化的多元醇，其共聚物及其嵌段共聚物，其先决条件为维持该嵌段共聚物的水溶性。其他有用的聚合物包括聚氧化烃如聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(普流罗尼)、聚甲基丙烯酸酯、卡波姆、含有糖单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(如聚甘露糖醛酸或海藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸的支链或非支链多糖，包括同多糖和杂多糖如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、支链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖如透明质酸的多糖亚单位、糖醇的聚合物如聚山梨醇和聚甘露醇、肝素或类肝素。

可以(如通过凝胶过滤或离子交换层析如HPLC)将未反应的起始材料和IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)与聚合物的缀合物分开。以相同的方式从彼此中纯化缀合物的异质种类。还可以由于未反应氨基酸的离子特性的差异拆分不同的种类(如含有一个或两个PEG残基)。参阅如WO 96/34015。

使用IL-13结合剂体内调节一种或多种IL-13相关活性

在另一方面中，本发明描述了通过以足以抑制其活性的量施用本文所述的IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)体内调节(如减小、中和和/或抑制)一种或多种IL-13相关活性的方法。IL-13结合剂还可以施用于需要抑制其IL-13介导的炎性应答的受试者。这些疾病包括呼吸道炎症、哮喘、纤维化、嗜酸粒细胞增多和增加的粘液产生。

可以例如通过评估接触猪蛔虫(Ascaris suum)变应原的猕猴中拮抗剂调节呼吸道炎症的能力来评估IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的效力。IL-13结合剂，特别是抑制至少一种IL-13活性的IL-13结合剂可用于中和或抑制一种或多种IL-13相关活性，如在体内降低IL-13介导的炎症，如用于治疗或预防IL-13相关的病理学、包括哮喘和/或其相关症状。

在一个实施方案中，在组合疗法中施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子，如其药物组合物)，即与其他物质如用于治疗病理状况或病症(如变应性或炎性病症)的治疗剂组合。此上下文中“组合”指基本在同一时间同时或顺序给予物质。如果顺序给予，则在开始施用第二种化合物时优选两种化合物的第一种仍在治疗部位可检测到有效浓度。

例如，组合疗法可以包括与一种或多种其他治疗剂(如下文更详细描述的一种或多种细胞因子或生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性剂或细胞抑制剂)共配制和/或共施用的一种或多种与IL-13结合并干扰功能性IL-13信号复合体形成的一种或多种IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子及其片段)。另外，一种或多种IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)可以与两种或更多本文所述的治疗剂组合使用。这些组合疗法可以有利地使用所施用的治疗剂的较低剂量，从而避免可能的毒性或与多种单一疗法相关的并发症。此外，本文公开的治疗剂作用于与IL-13/IL-13受体途径不同的途径，从而预期可以增强和/或协同IL-13结合剂的效力。

干扰哮喘或呼吸道炎症的不同触发的治疗剂(如用于治疗变态反应、上呼吸道感染或耳感染的治疗剂)可以与IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)组合使用。在一个实施方案中，一种或多种IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子及其片段)可以与一种或多种其他物质共配制和/或共施用，所述其他物质为例如其他细胞因子或生长因子拮抗剂(如可溶性受体、肽抑制剂、小分子、黏附素)、与其他靶标结合的抗体分子(如与其他细胞因子或生长因子、其受体或其他细胞表面分子结合的抗体)、抗炎细胞因子或其激动剂。可以与IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子及其片段)组合使用的物质的非限制性实例包括但不仅限于吸入类固醇、β-激动剂如短效或长效β-激动剂、白三烯或白三烯受体的拮抗剂、组合药物如

IgE抑制剂如抗IgE抗体(如

)、磷酸二酯酶抑制剂(如PDE4抑制剂)、黄嘌呤、抗胆碱能药、肥大细胞稳定剂如色甘酸钠、IL-4抑制剂、IL-5抑制剂、eotaxin/CCR3抑制剂和抗组胺剂。

在其他实施方案中，一种或多种IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)可以与一种或多种抗炎药、免疫抑制剂或代谢或酶抑制剂共配制和/或共施用。可以与IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子及其片段)组合使用的药物或抑制剂的实例包括但不仅限于以下一种或多种：TNF拮抗剂(如TNF受体如p55或p75人TNF受体的可溶性片段或其衍生物，如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL^TM))、TNF酶拮抗剂如TNFα转化酶(TACE)抑制剂、毒蕈碱性受体拮抗剂、TGF-β拮抗剂、干扰素γ、perfenidone、化学治疗剂如氨甲喋呤、来氟米特、或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物如CCI-779、COX2和cPLA2抑制剂、NSAID、免疫调节剂、p38抑制剂、TPL-2、Mk-2和NFκB抑制剂等。

疫苗制剂

在另一方面中，本发明描述了修饰与免疫相关的免疫应答的方法。IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)可用于通过抑制IL-13活性提高免疫效能。可以在递送免疫原(如施用疫苗)之前、其中或之后施用IL-13结合剂。在一个实施方案中，通过接种产生的免疫是细胞免疫，如针对癌细胞或病毒感染的(如逆转录病毒感染的，如HIV感染的)细胞的免疫。在一个实施方案中，疫苗制剂含有一种或多种IL-13结合剂和抗原(如免疫原)。在另一实施方案中，分别施用IL-13结合剂和免疫原，例如彼此在1小时、3小时、1天或2天内。IL-13结合剂可以是中和或抑制一种或多种IL-13活性的结合剂。

IL-13的抑制可以提高例如细胞疫苗(如针对如癌症和病毒感染(如逆转录病毒感染，如HIV感染)等疾病的疫苗)的效能。CD4⁺ T细胞可能是通过细胞因子IL-13下调疫苗对CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的诱导。已经显示IL-13的抑制增强CTL应答的疫苗诱导(Ahlers等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：13020-10325)。IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子、本文所述的抗体)可以与疫苗结合使用，以提高疫苗效能。癌症和病毒感染(如逆转录病毒(如HIV)感染)是细胞疫苗应答可以有效的示例性病症。通过在接种时阻断IL-13信号传递增强了疫苗效能(Ahlers等(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99：13020-25)。可以以药物组合物或治疗组合物的形式对受试者施用疫苗制剂。

诊断、预后和监测病症的方法

IL-13结合剂可以作为诊断剂在体外和体内使用。一个示例方法包括：(i)对受试者施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)；和(ii)检测受试者中的IL-13结合剂。检测可以包括测定受试者中IL-13结合剂的定位。另一示例方法包括使IL-13结合剂接触样品，如来自受试者的样品。可以测定样品中IL-13的存在与否或IL-13的水平(定性或定量)。

在另一方面中，本发明提供体外(如生物样品、如组织、活组织检查)或体内(如受试者中的体内成像)检测IL-13的存在的诊断方法。

方法包括：(i)使样品接触IL-13结合剂；和(ii)检测IL-13结合剂和样品间复合体的形成。方法还可以包括使参照样品(如对照样品)与结合剂接触并测定与参照样品相比，结合剂与样品间的复合体形成的程度。与对照样品或受试者相比，样品或受试者中复合体形成的变化(如统计学显著的变化)可以指示样品中IL-13的存在。

另一方法包括：(i)对受试者施用IL-13结合剂；和(ii)检测IL-13结合剂和受试者间的复合体形成。检测可以包括测定复合体形成的定位或时间。

可以用可检测物质直接或间接标记IL-13结合剂，以便于检测结合或未结合的蛋白质。合适的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。

可以通过测量或显影与IL-13结合的结合剂或未结合的结合剂来检测IL-13结合剂和IL-13之间的复合体形成。可以使用的常规检测方法如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。除了标记IL-13结合剂以外，还可以使用标记了可检测物质的标准品和未标记的IL-13结合剂通过竞争性免疫测定来测定样品中IL-13的存在。在此测定的一个实例中，组合生物样品、已标记的标准品和IL-13结合剂，并测定与未标记结合剂结合的已标记标准品的量。样品中IL-13的量和与IL-13结合剂结合的已标记标准品的量成反比。

诊断、预后和/或监测哮喘的方法

本文所述的结合剂可通过测量生物样品中IL-13的水平用于例如诊断、预后和监测哮喘发展的方法中。此外，此发现使得可以鉴定IL-13信号传递的新抑制剂，它们也可用于哮喘的治疗。

这些诊断变应性和非变应性哮喘的方法可以包括检测生物样品(如血清、血浆、支气管肺泡灌洗液、痰等)中IL-13的改变(如下降或上升)。“诊断的”或“诊断”指鉴定病理状况的存在与否。诊断方法涉及通过测定来自受试者(人或非人哺乳动物)的生物样品(如支气管肺泡灌洗液)中IL-13多肽的测试量并将测试量与IL-13多肽的正常量或范围(即已知不患有哮喘的个体的量或范围)进行比较。尽管具体的诊断方法也许不能提供哮喘的确定诊断，但是如果方法提供辅助诊断的阳性指征，那么则是足够的。

预后哮喘和/或特异性病症的方法可包括检测IL-13在mRNA或蛋白质水平的上调。“预后的”或“预后”指预测病理状况可能的发展和/或严重性。预后方法涉及测定来自受试者的生物样品中IL-13的测试量并将测试量与IL-13预后量或范围(即具有不同严重性哮喘的个体的量或范围)进行比较。测试样品中IL-13的多种量与哮喘的某些预后一致。检测具体预后水平的IL-13量提供了对受试者的预后。

本申请还提供通过检测IL-13的上调来监测哮喘病程的方法。监测方法包括第一次和第二次测定来自受试者的生物样品中IL-13的测试量，并比较所述量。在第一次和第二次之间IL-13量的变化可指示哮喘和/或特异性病症中病程的变化，量的降低指示哮喘的缓解，而量的提高指示哮喘和/或特应性病症的发展。这些监测测定还可用于评估治疗IL-13相关病症的患者中具体治疗介入的效力(如疾病减弱和/或逆转)。

可以制备用荧光团和生色团标记的结合剂。可以选择荧光部分以在大于310nm、优选大于400nm波长处具有显著的吸收。Stryer(1968)Science，162：526和Brand，L.等(1972)Annual Review of Biochemistry，41：843-868描述了多种合适的荧光剂和生色团。可以通过常规方案(如美国专利号3,940,475、4,289,747和4,376,110中公开的方案)用荧光生色团标记结合剂。具有许多上文所述目的特性的一组荧光剂是呫吨染料，包括荧光素和罗丹明。另一组荧光化合物为萘胺。一旦以荧光团或发色团标记后，可使用结合剂来检测(如：利用荧光显微术，诸如：共焦显微术或去褶合显微术)样品中是否存在IL-13或其定位。

组织学分析.可以使用本文所述的结合剂进行免疫组织化学。例如，就抗体的情况而言，可以用标记物(如纯化或表位标签)合成抗体，或者例如通过缀合标记物或标记物结合基团可检测地标记抗体。例如，可以在抗体上附着螯合剂。接着使抗体接触组织学制备物，如载玻片上的固定组织切片。温育以结合后，洗涤制备物以去除未结合的抗体。然后例如使用显微镜分析制备物以鉴定抗体是否与制备物结合。结合时抗体(或其他多肽或肽)可以是未标记的。结合和洗涤之后，标记抗体以使其可检测。

蛋白质阵列.还可以将IL-13结合剂(如是IL-13结合剂的蛋白质)固定在蛋白质阵列上。蛋白质阵列可用作诊断工具，如用于筛选医学样品(如分离的细胞、血、血清、活组织检查等)。蛋白质阵列还可包括其他结合剂，如与IL-13或其他靶分子结合的结合剂。

产生蛋白质阵列的方法描述于例如De Wildt等(2000)Nat.Biotechnol.18：989-994、Lueking等(1999)Anal.Biochem.270：103-111；Ge(2000)Nucleic Acids Res.28，e3，I-VII、MacBeath和Schreiber(2000)Science289：1760-1763、WO 01/40803和WO 99/51773A1。可以高速点样(例如使用如来自Genetic MicroSystems或BioRobotics的市售机器人器械)用于阵列的多肽。阵列基质可以是例如硝酸纤维素、塑料、玻璃(表面进行了修饰的玻璃)。阵列还可以包括多孔基质，如丙烯酰胺、琼脂糖或其他聚合物。例如，阵列可以是抗体阵列，如De Wildt(见上文)中所述。可以以阵列形式在滤器上培养产生蛋白质的细胞。诱导蛋白质产生，并将表达的蛋白质固定在滤器上细胞的位置。

可以使蛋白质阵列接触样品以测定样品中IL-13的程度。如果样品是未标记的，可以使用夹层方法(如使用已标记的探针)检测IL-13的结合。关于阵列每个地址结合程度的信息可以作为图谱储存(例如在计算机数据库中)。可以一式二份产生蛋白质阵列并用于比较(如不同样品的)结合谱。

流式细胞术.IL-13结合剂可用于标记细胞，如样品(如患者样品)中的细胞。结合剂可以附着(或可附着)在荧光化合物上。接着可以使用荧光激活细胞分选(如使用可得自Becton Dickinson ImmunocytometrySystems，San Jose CA的分选仪，还参阅美国专利号5,627,037、5,030,002和5,137,809)通过流式细胞术对细胞进行分析和/或分选。当细胞通过分选仪时，激光束激发荧光化合物，同时探测器计数通过的细胞并通过检测荧光测定荧光化合物是否附着于细胞。可以定量并分析与每个细胞结合的标记的量以表征样品。分选仪还可以偏转细胞并使与结合剂结合的细胞与未结合结合剂的细胞分开。可以培养和/或表征分开的细胞。

体内成像.在另一实施方案中，本发明提供体内检测受试者中IL-13的存在的方法。方法包括(i)对受试者(如患IL-13相关病症的患者)施用与可检测标记物缀合的抗IL-13抗体；(ii)使患者接触检测可检测标记物的手段。例如，通过NMR或其他断层摄影方法使受试者成像。

可用于诊断成像的标记物的实例包括放射性标记物如¹³¹I、¹¹¹In、¹²³I、^99mTc、³²P、³³P、¹²⁵I、³H、¹⁴C和¹⁸⁸Rh、荧光标记物如荧光黄和罗丹明、核磁共振活性标记物、可被正电子成像术(“PET”)扫描器检测的正电子发射同位素、化学发光剂如萤光素以及酶标记物如过氧化物酶或磷酸酶。还可以使用可被短程探测器探头检测的短程辐射体，如同位素。可以使用已知的技术用这些试剂标记结合剂。例如涉及放射标记抗体的技术参阅Wensel和Meares(1983)Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy，Elsevier，New York和Colcher等(1986)Meth.Enzymol.121：802-816。放射性标记的结合剂还可用于体外的诊断测试。同位素标记的结合剂的比活性取决于放射性标记物的半衰期、同位素的纯度和标记物掺入抗体的方式。用放射性同位素(如¹⁴C、³H、³⁵S、¹²⁵I、^99mTc、³²P、³³P和¹³¹I)标记多肽的方案是广泛已知的。参阅如U.S.4,302,438、Goding，J.W.(Monoclonalantibodies：principles and practice：production and application ofnonoclonal antibodies in cell biology，biochemistry，and immunology第二版.London；Orlando：Academic Press，1986.pp 124-126)及其引用的参考文献以及A.R.Bradwell等，“Developments in Antibody Imaging”，Monoclonal Antibodies for Cancer Detectionand Therapy，R.W.Baldwin等编辑，65-85页(Academic Press 1985)。

本文所述的IL-13结合剂可以与磁共振成像(MRI)造影剂缀合。这些MRI技术概述于EP-A-0 502 814。通常使用不同环境中水质子弛豫时间常数T1和T2的差异产生影像。然而，这些差异可能不足以提供清晰的高分辨率影像。这些弛豫时间常数的差异可以通过造影剂增强。这些造影剂的实例包括大量磁性物质顺磁性物质(主要改变T1)和铁磁性或超顺磁性物质(主要改变T2响应)。螯合剂(如EDTA、DTPA和NTA螯合剂)可用于附着一些顺磁物质(如Fe³⁺、Mn²⁺、Gd³⁺)(并降低其毒性)。其他物质可以是微粒(如直径小于10μm至约10nm)的形式，并具有铁磁性、反铁磁性或超顺磁性特性。还可以用如Pykett(1982)Scientific American，246：78-88所述含有NMR活性¹⁹F原子的指示基团标记IL-13结合剂，以定位和成像IL-13的分布。

用于诊断用途的包含IL-13结合剂和说明书的试剂盒也在本发明范围内，例如使用IL-13结合剂(如抗体分子或其他多肽或肽)在体外(如样品，如来自患IL-13相关病症的患者的活组织检查或细胞)或体内(如通过使受试者成像)检测IL-13。试剂盒还可以含有至少一种额外的试剂，如标记物或额外的诊断剂。对于体内用途，结合剂可以配制为药物组合物。

药盒

可以在药盒中(例如作为药盒的组分)提供IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)。例如，药盒包括(a)IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)和任选地(b)信息材料。信息材料可以是与方法(如本文所述的方法)相关的描述性、说明性、销售或其他材料。药盒的信息材料不限制于其形式。在一个实施方案中，信息材料可包括关于化合物的产生、化合物的分子量、浓度、有效期、批次或产地信息等的信息。在一个实施方案中，信息材料涉及使用IL-13结合剂治疗、预防、诊断、预后或监测本文所述的病症。

在一个实施方案中，信息材料可包括以合适的方式(如合适的剂量、剂型或给药方式(如本文所述的剂量、剂型或给药方式))施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)以实施本文所述的方法的说明书。在另一实施方案中，信息材料可以包括对合适的受试者(如人，如患有或有风险患有变应性哮喘、非变应性哮喘或IL-13介导的病症(如变应性和/或炎性病症)或HTLV-1感染)施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的说明书。已经将IL-13的产生与HTLV-1感染相联系(Chung等，(2003)Blood 102：4130-36)。

例如，材料可以包括对患者、患有或有风险患有变应性哮喘、非变应性哮喘或IL-13介导的病症(如变应性和/或炎性病症)或HTLV-1感染)的患者施用IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的说明书。

药盒可以包括用于含有IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的组合物的一个或多个容器。在一些实施方案中，药盒包含用于组合物和信息材料的分开的容器、分隔器或隔室。例如，组合物可以装在瓶、管形瓶或注射器中，信息材料可以装在塑料套或包中。在另一实施方案中，药盒的独立元件装在单个不分开的容器中。例如，组合物装在以标签形式附上信息材料的瓶、管形瓶或注射器中。在一些实施方案中，药盒包括多个(如一包)单个容器，每个含有IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的一个或多个单位剂型(如本文所述的剂型)。例如，药盒包括多个注射器、安瓿、箔包、喷雾器或吸入设备，每个含有IL-13结合剂(如抗IL-13抗体分子)的单个单位剂量或多个单位剂量。

药盒任选地包括适于施用组合物的设备，如注射器、吸入器、移液管、镊子、量匙、滴管(如滴眼管)、拭子(如棉头拭子或木拭子)或任何这样的递送设备。在优选的实施方案中，设备是分配结合剂的测定剂量的植入性装置。

公开以下实施例以帮助理解本发明，但不以任何方式限制(或理解为限制)其范围。

实施例

实施例1

(a)NHP-IL-13的克隆和与人IL-13的同源性

使用杂交探针克隆猕猴IL-13(NHP IL-13)。图1A显示了猕猴IL-13氨基酸序列与人IL-13的比较。由于8个氨基酸差异，在两个序列间具有94％的氨基酸同一性。这些差异之一R130Q代表了在哮喘受试者中优先表达的普遍人多态性(Heinzmann等(2000)Hum.Mol.Genet.9：549-559)。

(b)NHP-IL-13与人IL13Rα2的结合

人IL-13以高亲和力与IL-13受体的α2形式(IL13Rα2)结合。此受体的可溶性形式与人IgG1Fc尾(sIL13Rα2-Fc)一起表达。通过与IL-13结合并螯合来自细胞表面IL13Rα1-IL4R信号复合体的细胞因子，sIL13Rα2-Fc可以作为人IL-13生物活性的有效抑制剂。已经显示sIL13Rα2-Fc与CHO细胞或大肠杆菌产生的NHP-IL-13结合。

(c)NHP-IL-13对人单核细胞的生物活性

(i)人单核细胞上的CD23表达。在大肠杆菌中表达了编码猕猴IL-13的cDNA，并再折叠以保持生物活性。使用生物测定证明人细胞对猕猴IL-13的反应性，其中在37℃用IL-13过夜处理来自健康供体的正常外周血单核细胞。这诱导单核细胞表面CD23表达的上调。结果显示猕猴IL-13对原代人单核细胞上具有生物活性。

(ii)HT-29细胞上的STAT6磷酸化。人HT-29上皮细胞系通过经历STAT6磷酸化(通过IL-13受体信号转导的结果)应答IL-13。为测定重组NHP-IL-13诱导STAT6磷酸化的能力，在37℃用NHP-IL-13刺激HT-29细胞30分钟，其后固定、透化并用针对磷酸-STAT6的荧光抗体染色。结果显示猕猴IL-13在此人细胞系中有效诱导STAT6的磷酸化。

(d)与NHP-IL-13结合的抗体的产生

可以例如使用一种或多种以下方法用猕猴IL-13免疫并免疫增强小鼠或其他合适的动物。一种免疫方法可以与相同或不同的免疫增强方法组合：

(i)用大肠杆菌中表达的猕猴IL-13蛋白进行免疫，从包含体中纯化所述猕猴IL-13蛋白并再折叠以保留生物活性。为进行免疫，用弗氏完全佐剂(CFA)乳化蛋白质，并按照标准方案免疫小鼠。为增强免疫，用弗氏不完全佐剂(IFA)乳化相同的蛋白质。

(ii)用跨越成熟猕猴IL-13完整序列的肽进行免疫。每种肽含有猕猴IL-13特有但在人蛋白质中不存在的至少一个氨基酸。见图1B。当肽具有除半胱氨酸以外的C端残基时，加入半胱氨酸用于与载体蛋白缀合。肽与免疫原性载体蛋白如KLH缀合，并按照标准方案用于免疫小鼠。为进行免疫，用弗氏完全佐剂(CFA)乳化蛋白质，并按照标准方案免疫小鼠。为增强免疫，用弗氏不完全佐剂(IFA)乳化相同的蛋白质。

(iii)用表达的NHP-IL-13编码cDNA进行免疫。将编码NHP-IL-13(包括前导序列)的cDNA克隆进适当的载体。将此DNA包裹在通过基因枪皮内注射的金珠上。

(iv)蛋白质或肽可用作筛选蛋白质文库(如噬菌体或核糖体展示文库)的靶标。例如，文库可展示不同的免疫球蛋白分子，如Fab’、scFv’或Fd’。

(e)选择与NHP和任选地人IL-13(如天然人IL-13)交叉反应的抗体克隆。

首轮筛选

抗体的首轮筛选是通过ELISA选择与重组NHP-IL-13结合的抗体。在此ELISA中，用重组NHP-IL-13包被孔。以连续稀释加入免疫血清并在室温下温育1小时。用含有0.05％

-20的PBS(PBS-Tween)洗涤孔。使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG和四甲基联苯胺(TMB)底物检测结合的抗体。在450nm处读出吸光度。通常所有的免疫小鼠都产生针对NHP-IL-13的高抗体效价。

次轮筛选

次轮筛选通过ELISA选择对重组HNP-IL-13与sIL-13Rα1-Fc之间结合的抑制。用FLAG标记的NHP-IL-13可以结合的可溶性IL-13Rα1-Fc包被孔。用与HRP缀合的抗FLAG抗体检测这种结合。以450nm处的吸光度读出TMB底物的水解。在测定中，与提高浓度的免疫血清一起加入FLAG标记的NHP-IL-13。如果免疫血清含有与NHP-IL-13结合并阻止其与包被孔的sIL13Rα1-Fc结合的抗体，则ELISA信号会降低。所有的免疫小鼠都产生与sIL13Rα1-Fc竞争结合NHP-IL-13的抗体，但小鼠之间的效价存在差异。选择在最高稀释度下显示抑制sIL13Rα1-Fc与NHP-IL-13结合的动物的血清用于融合。

第三轮筛选

第三轮筛选测试对NHP-IL-13生物活性的抑制。可以使用若干生物测定，包括TF-1增殖测定、单核细胞CD23表达测定和HT-29细胞STAT6磷酸化测定。测试免疫血清对NHP-IL-13介导的STAT6磷酸化的抑制。在存在或不存在标明浓度的小鼠免疫血清的情况下，在37℃用重组NHP-IL-13刺激HT-29人上皮细胞系30分钟。接着固定细胞、透化并用缀合ALEXA^TM Fluor 488的针对磷酸-STAT6的mAb(Pharmingen)染色。通过流式细胞术测定通过经历STAT6磷酸化应答IL-13的细胞百分比。选择(通过在高血清稀释度下最强烈的抑制NHP-IL-13生物活性测定的)具有最有效的中和活性的小鼠的脾用于产生杂交瘤。

第四轮筛选

从人脐带血单核细胞(Bio Whittaker/Cambrex)产生含有人IL-13的粗制剂。在5％的CO₂、37℃下在含有10％热灭活FCS、50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基中培养细胞。用促分裂原PHA-P(Sigma)刺激细胞3天，并用重组人IL-4(R&D Systems)和抗人IL-12使其倾向于Th2。用IL-2扩大Th2细胞一周，接着用12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波醇(PMA)和伊屋诺霉素处理活化三天以产生细胞因子。收集上清液并透析除去PMA和伊屋诺霉素。为耗尽可能干扰用于IL-13的生物测定的GM-CSF和IL-4，用针对GM-CSF和IL-4的生物素化抗体(R&D Systems，Inc)处理上清液，接着与包被了链霉抗生物素蛋白的磁珠(Dynal)一起温育。通过ELISA(Biosource)测定IL-13的终浓度，并通过Bradford测定法(Bio-Rad)测定总蛋白。典型制剂含有以重量计<0.0005％的IL-13。

选择杂交瘤克隆

使用已确立的方法从与P3X63_AG8.653骨髓瘤细胞系(ATCC)融合的如上文选择的小鼠的脾产生杂交瘤。以有限稀释接种细胞并按照上文所述的筛选标准选择克隆。收集数据用于基于与NHP-IL-13竞争结合sIL13Rα1-Fc的能力通过ELISA选择克隆。进一步测试克隆中和NHP-IL-13生物活性的能力。测试杂交瘤的上清液在HT-29人上皮细胞系中对由NHP-IL-13诱导的STAT-6磷酸化的竞争。

实施例2：MJ2-7抗体

使用QIAGEN RNEASY^TM小量试剂盒(Qiagen)从MJ 2-7杂交瘤细胞制备总RNA。使用SMART^TM PCR Synthesis试剂盒(BD BiosciencesClontech)将RNA逆转录为cDNA。通过PCR外推MJ 2-7的重链可变区，所述PCR使用SMART^TM寡核苷酸作为正向引物，与编码小鼠IgG1恒定区CH1结构域N端部分的DNA退火的mIgG1引物作为反向引物。使用SMART^TM和小鼠κ特异性引物产生编码MJ 2-7轻链可变区的DNA片段。使用DEEP VENT^TM DNA聚合酶(New England Biolabs)和25nM dNTP进行24个循环(94℃1分钟、60℃1分钟、72℃1分钟)的PCR反应。将PCR产物亚克隆入pED6载体，并通过DNA测序鉴定插入片段的序列。纯化的小鼠MJ 2-7抗体的N端蛋白质测序用于证实对应于观察到的蛋白质序列的翻译的序列。

与NHP IL-13相互作用并具有提示可能与人IL-13相互作用的特征的小鼠单克隆抗体MJ 2-7的示例核苷酸和氨基酸序列如下：

编码重链可变结构域的示例核苷酸序列包括：

GAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAGCTT GTGAAGCCAG

GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGGTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC

ACCTATATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT

TGGAAGGATT GATCCTGCGA ATGATAATAT TAAATATGAC CCGAAGTTCC

AGGGCAAGGC CACTATAACA GCAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTA

CAGCTCAACA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCGTCTATT ACTGTGCTAG

ATCTGAGGAA AATTGGTACG ACTTTTTTGA CTACTGGGGC CAAGGCACCA

CTCTCACAGT CTCCTCA(SEQ ID NO：129)

重链可变结构域的示例氨基酸序列包括：

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIKDTYIHWVKQRPEOGLEWIGRIDPANDNIKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLNSLTSEDTAVYYCARSEENWYDFFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：130)

CDR带有下划线。可变结构域之前可任选地存在前导序列，如MKCSWVIFFLMAVVTGVNS(SEQ ID NQ：131)。编码轻链可变结构域的示例核苷酸序列包括：

GAT GTTTTGATGA CCCAAACTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC

TTGGAGATCA AGCCTCCATC TCTTGCAGGT CTAGTCAGAG CATTGTACAT

AGTAATGGAA ACACCTATTT AGAATGGTAC CTGCAGAAAC CAGGCCAGTC

TCCAAAGCTC CTGATCTACA AAGTTTCCAA CCGATTTTCT GGGGTCCCAG

ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATTAGC

AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TACTGCTTTC AAGGTTCACA

TATTCCGTAC ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATA AAA(SEQID NO：132)

轻链可变结构域的示例氨基酸序列包括：

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：133)

CDR带有下划线。氨基酸序列之前可任选地存在前导序列，如MKLPVRLLVLMFWIPASSS(SEQ ID NO：134)。本文中术语“MJ2-7”与术语“mAb7.1.1“可互换使用。

实施例3：C65抗体

与NHP IL-13相互作用并具有提示可能与人IL-13相互作用的特征的小鼠单克隆抗体C65的示例核苷酸和氨基酸序列如下：

重链可变结构域的示例核苷酸序列包括：

1    ATGGCTGTCC TGGCATTACT CTTCTGCCTG GTAACATTCC CAAGCTGTAT

51   CCTTTCCCAG GTGCAGCTGA AGGAGTCAGG ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT

101  CACAGAGCCT GTCCATCACA TGCACCGTCT CAGGGTTCTC ATTAACCGGC

151  TATGGTGTAA ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT

201  GGGAATAATT TGGGGTGATG GAAGCACAGA CTATAATTCA GCTCTCAAAT

251  CCAGACTGAT CATCAACAAG GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA

301  ATGAACAGTC TGCAAACTGA TGACACAGCC AGGTACTTCT GTGCCAGAGA

351  TAAGACTTTT TACTACGATG GTTTCTACAG GGGCAGGATG GACTACTGGG

401  GTCAAGGAAC CTCAGTCACC GTCTCCTCA(SEQID NO：135)

重链可变结构域的示例氨基酸序列包括：

QVQLKESGPGL VAPSQSLSIT CTVSGFSLTG YGVNWVRQPPGKGLEWLGII WGDGSTDYNS ALKSRLIINK DNSKSQVFLKMNSLQTDDTA RYFCARDKTF YYDGFYRGRM DYWGQGTSVT VSS(SEQ ID NO：136)

CDR带有下划线。氨基酸序列之前可任选地含有前导序列，如MAVLALLFCL VTFPSCILS(SEQ ID NO：137)。

编码轻链可变结构域的示例核苷酸序列包括：

1   ATGAACACGA GGGCCCCTGC TGAGTTCCTT GGGTTCCTGT TGCTCTGGTT

51  TTTAGGTGCC AGATGTGATG TCCAGATGAT TCAGTCTCCA TCCTCCCTGT

101 CTGCATCTTT GGGAGACATT GTCACCATGA CTTGCCAGGC AAGTCAGGGC

151 ACTAGCATTA ATTTAAACTG GTTTCAGCAA AAACCAGGGA AAGCTCCTAA

201 GCTCCTGATC TTTGGTGCAA GCAACTTGGA AGATGGGGTC CCATCAAGGT

251 TCAGTGGCAG TAGATATGGG ACAAATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG

301 GAGGATGAAG ATATGGCAAC TTATTTCTGT CTACAGCATA GTTATCTCCC

351 GTGGACGTTC GGTGGCGGCA CCAAACTGGA AATCAAA(SEQ ID NO：138)

轻链可变结构域的示例氨基酸序列包括：

DVQMIQSP SSLSASLGDI VTMTCQASQG TSINLNWFQQKPGKAPKLLI FGASNLEDGV PSRFSGSRYG TNFTLTISSLEDEDMATYFC LQHSYLPWTF GGGTKLEIK(SEQ ID NO：139)

CDR带有下划线。氨基酸序列之前可任选地含有前导序列，如MNTRAPAEFLGFLLLWFLGARC(SEQ ID NO：140)。

实施例4：猕猴模型

可以使用对猪蛔虫(Ascaris suum)天然具有变应性的猕猴中抗原诱导的呼吸道炎症模型测试抗体在体内中和一种或多种IL-13相关活性的效力。在此模型中，用猪蛔虫刺激攻击变应性猴引起炎性细胞特别是嗜酸性粒细胞涌入呼吸道。为测试抗体阻止这种细胞涌入的能力，可以在用猪蛔虫抗原刺激之前24小时施用抗体。刺激当天可以从左肺取出基线支气管肺泡灌洗(BAL)样品。接着可将抗原气管内滴注至右肺。24小时后灌洗右肺，将来自用10mg/kg重组抗体静脉内处理的动物的BAL液与来自未处理动物的BAL液进行比较，所述抗体表达自CHO细胞。如果抗体减弱了呼吸道炎症，则可以观察到未处理组中BAL嗜酸性粒细胞百分比的提高，而抗体处理组则不然。这些测定可用于确认抗体有效的防止用抗原刺激的变应性动物中的呼吸道嗜酸粒细胞增多。

实施例5：Fc序列

SEQ ID NO：128位置#1处的丝氨酸代表第一个示例全长抗体编号方案中的氨基酸残基#119，在所述方案中丝氨酸之前是重链可变结构域的残基#118。在第一个示例全长抗体编号方案中，突变的氨基酸在编号234和237，并对应于SEQ ID NO：128的位置116和119。因此根据第一个示例全长抗体编号方案，以下序列代表具有两个突变：L234A和G237A的Fc结构域。

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：128)

以下是另一示例性人Fc结构域序列：

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：141)

可用于降低效应子功能的其他示例改变包括(L234A；L235A)、(L235A；G237A)和N297A。

实施例6：小鼠中的IL-13和IgE

IL-13涉及IgE的产生，IgE是特应性疾病的重要介体。缺乏IL-13的小鼠具有部分降低的血清IgE和肥大细胞IgE应答，而缺乏天然IL-13结合剂IL-13Rα2-/-的小鼠具有增强的IgE水平和IgE效应子功能。

BALB/c雌性小鼠得自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)。IL-13Rα2-/-小鼠描述于例如Wood等(2003)J.Exp.Med.197：703-9。缺乏IL-13的小鼠描述于例如McKenzie等(1998)Immunity 9：423-32。所有的突变株都在BALB/c背景下。

通过ELISA测量血清IgE水平。在4℃用大鼠抗小鼠IgE(BDBiosciences，San Diego，CA)包被ELISA平板(MaxiSorp；Nunc，Rochester，NY)过夜。室温下用PBS中的0.5％明胶封闭平板1小时、用含有0.05％

-20的PBS(PBS-Tween)洗涤并在室温下与作为标准品的纯化小鼠IgE(BD Biosciences)或血清稀释液温育6小时。使用小鼠IgG(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)作为阻断剂用生物素化的抗小鼠IgE(BDBiosciences)检测结合。用连接链霉抗生物素蛋白的过氧化物酶(SouthernBiotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL)和SURE BLUE^TM底物(KPL Inc.，Gaithersburg，MD)检测结合。

为了研究首次用于实验的小鼠中支持静息IgE水平所需的IL-13，在不存在来自野生型小鼠和来自遗传缺乏IL-13和IL-13Rα2的小鼠的特异性免疫的情况下检查血清。缺乏IL-13的小鼠具有几乎不可检测的血清IgE水平。相反，缺乏抑制性受体IL-13Rα2的小鼠显示了提高水平的血清IgE。这些结果证明阻断IL-13可用于治疗或预防特应性病症。

实施例7：IL-13和特应性病症

在STAT6磷酸化的测定中评估MJ2-7抑制天然人IL-13(1ng/ml)生物活性的能力。在此测定中MJ2-7以约0.293nM的IC50抑制天然人IL-13的活性。在此测定中具有MJ2-7小鼠重链和人源化轻链的抗体以约0.554nM的IC50抑制天然人IL-13的活性。

在CD23表达的测定中评估MJ2-7抑制非人灵长类IL-13(1ng/ml)的能力。在出测定中MJ2-7以约0.242nM的IC50抑制非人灵长类IL-13的活性。在此测定中具有MJ2-7小鼠重链和人源化轻链的抗体以约0.308nM的IC50抑制非人灵长类IL-13。

实施例8：小鼠MJ2-7抗体的核苷酸和氨基酸序列

编码(任选地带有前导序列的)重链可变区的核苷酸序列如下：

1    ATGAAATGCA GCTGGGTTAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT

51   CAATTCAGAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAGCTT GTGAAGCCAG

101  GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGGTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC

151  ACCTATATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT

201  TGGAAGGATT GATCCTGCGA ATGATAATAT TAAATATGAC CCGAAGTTCC

251  AGGGCAAGGC CACTATAACA GCAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTA

301  CAGCTCAACA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCGTCTATT ACTGTGCTAG

351  ATCTGAGGAA AATTGGTACG ACTTTTTTGA CTACTGGGGC CAAGGCACCA

401  CTCTCACAGT CTCCTCA(SEQID NO：142)

(任选地带有前导序列的)重链可变区的氨基酸序列如下：

1   MKCSWVIFFL MAVVTGVNSE VQLQQSGAEL VKPGASVKLS CTGSGFNIKD

51  TYIHWVKQRP EQGLEWIGRI DPANDNIKYD PKFQGKATIT ADTSSNTAYL

101 QLNSLTSEDT AVYYCARSEE NWYDFFDYWG QGTTLTVSS

(SEQID NO：143)

编码轻链可变区的核苷酸序列如下：

1   ATGAAGTTGC CTGTTAGGCTGTTGGTGCTG ATGTTCTGGA TTCCTGCTTC

51  CAGCAGTGAT GTTTTGATGA CCCAAACTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC

101 TTGGAGATCA AGCCTCCATC TCTTGCAGGT CTAGTCAGAG CATTGTACAT

L51 AGTAATGGAA ACACCTATTT AGAATGGTAC CTGCAGAAAC CAGGCCAGTC

201 TCCAAAGCTC CTGATCTACA AAGTTTCCAA CCGATTTTCT GGGGTCCCAG

251 ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATTAGC

301 AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TACTGCTTTC AAGGTTCACA

351 TATTCCGTAC ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATA AAA(SEQ ID NO：144)

任选地带有前导序列(下划线)的轻链可变区的氨基酸序列如下：

1   MKLPVRLLVL MFWIPASSSD VLMTQTPLSL PVSLGDQASI SCRSSQSIVH

51  SNGNTYLEWY LQKPGQSPKL LIYKVSNRFS GVPDRFSGSG SGTDFTLKIS

101 RVEAEDLGVY YCFQGSHIPY TFGGGTKLEI K(SEQ ID NO：145)

实施例9：MJ2-7抗体的第一种示例人源化变体的核苷酸和氨基酸序 列

人源化抗体形式1(V1)基于最接近的人种系克隆。(带有编码任选的前导序列的序列的)hMJ 2-7 V1重链可变区(hMJ 2-7VH V1)的核苷酸序列如下：

1   ATGGATTGGA CCTGGCGCAT CCTGTTCCTG GTGGCCGCTG CCACCGGCGC

51  TCACTCTCAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG CGCCGAGGTG AAGAAGCCTG

101 GCGCTTCCGT GAAGGTGTCC TGTAAGGCCT CCGGCTTCAA CATCAAGGAC

151 ACCTACATCC ACTGGGTGCG GCAGGCTCCC GGCCAGCGGC TGGAGTGGAT

201 GGGCCGGATC GATCCTGCCA ACGACAACAT CAAGTACGAC CCCAAGTTTC

251 AGGGCCGCGT GACCATCACC CGCGATACCT CCGCTTCTAC CGCCTACATG

301 GAGCTGTCTA GCCTGCGGAG CGAGGATACC GCCGTGTACT ACTGCGCCCG

351 CTCCGAGGAG AACTGGTACG ACTTCTTCGA CTACTGGGGC CAGGGCACCC

401 TGGTGACCGT GTCCTCT(SEQ ID NO：146)

重链可变区(hMJ2-7 V1)的氨基酸序列基于移植到DP-25的CDRVH-I，1-03。带有任选的前导序列(第一个下划线区，基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)的氨基酸序列如下：

1   MDWTWRILFL VAAATGAHS-Q VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGFNIKD

51  TYIHWVRQAP GQRLEWMGRI DPANDNIKYD PKFQGRVTIT RDTSASTAYM

101 ELSSLRSEDT AVYYCARSEE NWYDFFDYWG QGTLVTVSSG ESCR(SEQ ID NO：147)

(带有编码任选的前导序列的序列的)hMJ2-7V1轻链可变区(hMJ2-7VL V1)的核苷酸序列如下：

1   ATGCGGCTGC CCGCTCAGCT GCTGGGCCTG CTGATGCTGT GGGTGCCCGG

51  CTCTTCCGGC GACGTGGTGA TGACCCAGTC CCCTCTGTCT CTGCCCGTGA

101 CCCTGGGCCA GCCCGCTTCT ATCTCTTGCC GGTCCTCCCA GTCCATCGTG

151 CACTCCAACG GCAACACCTA CCTGGAGTGG TTTCAGCAGA GACCCGGCCA

201 GTCTCCTCGG CGGCTGATCT ACAAGGTGTC CAACCGCTTT TCCGGCGTGC

251 CCGATCGGTT CTCCGGCAGC GGCTCCGGCA CCGATTTCAC CCTGAAGATC

301 AGCCGCGTGG AGGCCGAGGA TGTGGGCGTG TACTACTGCT TCCAGGGCTC

351 CCACATCCCT TACACCTTTG GCGGCGGAACC AAGGTGGAG ATCAAG(SEQ ID NO：148)

这种形式基于移植到DPK18的CDR VκII。hMJ2-7 V1轻链可变区(hMJ 2-7VL V1)(带有第一个下划线区的任选前导序列；基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)的氨基酸序列如下：

1   MRLPAQLLGL LML WVPGSSG-DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSIV

51  HSNGNTYLEW FQQRPGQSPR RLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI

101 SRVEAEDVGV YYCFQGSHIP YTFGGGTKVE IK(SEQ ID NO：149)

实施例10：MJ2-7抗体的示例性第二种人源化变体的核苷酸和氨基酸 序列

以下重链可变区基于移植到DP-54的CDR VH-3，3-07。(带有编码任选的前导序列的序列的)hMJ 2-7形式2(V2)重链可变区(hMJ 2-7VHV2)的核苷酸序列如下：

1   ATGGAGCTGG GCCTGTCTTG GGTGTTCCTG GTGGCTATCC TGGAGGGCGT

51  GCAGTGCGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG CGGCGGACTG GTGCAGCCTG

101 GCGGCTCTCT GCGGCTGTCT TGCGCCGCTT CCGGCTTCAA CATCAAGGAC

151 ACCTACATCC ACTGGGTGCG GCAGGCTCCC GGCAAGGGCC TGGAGTGGGT

201 GGCCCGGATC GATCCTGCCA ACGACAACAT CAAGTACGAC CCCAAGTTCC

251 AGGGCCGGTT CACCATCTCT CGCGACAACG CCAAGAACTC CCTGTACCTC

301 CAGATGAACT CTCTGCGCGC CGAGGATACC GCCGTGTACT ACTGCGCCCG

351 GAGCGAGGAG AACTGGTACG ACTTCTTCGA CTACTGGGGC CAGGGCACCC

401 TGGTGACCGT GTCCTCT(SEQ ID NO：150)

带有任选的前导序列(第一个下划线区，基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)的hMJ2-7 V2重链可变区(hMJ2-7VH V2)的氨基酸序列如下：

1   MELGLSWVFL VAILEGVQC-E VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFNIKD

51  TYIHWVRQAP GKGLEWVARI DPANDNIKYD PKFQGRFTIS RDNAKNSLYL

101 QMNSLRAEDT AVYYCARSEE NWYDFFDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO：151)

hMJ 2-7 V2轻链可变区基于移植到DPK9的CDR VκI，02。hMJ 2-7V2轻链可变区(hMJ 2-7VL V2)(带有编码任选的前导序列的序列的)的核苷酸序列如下：

1   ATGGATATGC GCGTGCCCGC TCAGCTGCTG GGCCTGCTGC TGCTGTGGCT

51  GCGCGGAGCC CGCTGCGATA TCCAGATGAC CCAGTCCCCT TCTTCTCTGT

101 CCGCCTCTGT GGGCGATCGC GTGACCATCA CCTGTCGGTC CTCCCAGTCC

151 ATCGTGCACT CCAACGGCAA CACCTACCTG GAGTGGTATC AGCAGAAGCC

201 CGGCAAGGCC CCTAAGCTGC TGATCTACAA GGTGTCCAAC CGCTTTTCCG

251 GCGTGCCTTC TCGGTTCTCC GGCTCCGGCT CCGGCACCGA TTTCACCCTG

301 ACCATCTCCT CCCTCCAGCC CGAGGATTTC GCCACCTACT ACTGCTTCCA

351 GGGCTCCCAC ATCCCTTACA CCTTTGGCGG CGGAACCAAG GTGGAGATCA

401 AGCGT(SEQ ID NO：152)

hMJ 2-7 V2轻链可变区(hMJ 2-7VL V2)(任选的前导肽带有下划线；基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)的氨基酸序列如下：

1   MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RC-DIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRSSQS

51  IVHSNGNTYL EWYQQKPGKA PKLLIYKVSN RFSGVPSRFS GSGSGTDFTL

101 TISSLQPEDF ATYYCFQGSH IPYTFGGGTK VEIKR(SEQ ID NO：153)

还产生了MJ 2-7 V2重链可变区的其他人源化形式。这些形式包括在选定的构架位置具有小鼠氨基酸的回复突变。

编码带有回复突变V48I、A29G的重链可变区“形式2.1”或V2.1的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GATCGGCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG

201 GTTCACCATC TCTCGCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

351 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：154)

V2.1重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWIGR

51  IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

101 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：155)

编码带有回复突变(R67K、F68A)的重链可变区V2.2的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGCCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCAA

201 GGCCACCATC TCTCGCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

351 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：156)

V2.2重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR

51  IDPANDNIKY DPKFQGKATI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

102 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：157)

编码带有回复突变(R72A)的重链可变区V2.3的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGCCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG

201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

351 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：158)

V2.3重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR

51  IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SADNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

103 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：159)

编码带有回复突变(A49G)的重链可变区V2.4的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGGCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG

201 GTTCACCATC TCTCGCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

351 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：160)

V2.4重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGL EWVGR

51  IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

104 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：161)

编码带有回复突变(R67K、F68A、R72A)的重链可变区V2.5的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGCCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCAA

201 GGCCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

352 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：162)

V2.5重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR

51  IDPANDNIKY DPKFQGKATI SADNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

105 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEO ID NO：163)

编码带有回复突变(V48I、A49G、R72A)的重链可变区V2.6的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GATCGGCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG

201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

351 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：164)

V2.6重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQL VESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWIGR

51  IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SADNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

106 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEO ID NO：165)

编码带有回复突变(A49G、R72A)的重链可变区V2.7的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGGCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG

201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

351 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：166)

V2.7重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVGR

51  IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SADNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

107 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：167)

编码带有回复突变(L79A)的重链可变区V2.8的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGCCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG

201 GTTCACCATC TCTCGCGACA ACGCCAAGAA CTCCGCCTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

351 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：168)

V2.8重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR

51  IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SRDNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

108 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：169)

编码带有回复突变(A49G、R72A、L79A)的重链可变区V2.10的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGGCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG

201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCGCCTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

351 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：170)

V2.10重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQL VESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVGR

51  IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SADNAKNS AY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

109 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：171)

编码带有回复突变(V48I、A49G、R72A、L79A)的重链可变区V2.11的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GATCGGCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG

201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCGCCTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

351 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：172)

V2.11重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWIGR

51  IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

110 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：173)

编码带有回复突变(V48I、A49G、R72A)的重链可变区V2.16的核苷酸序列如下：

1   GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC

51  TCTGCGGCTG TCTTGCACCG GCTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA

101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GATCGGCCGG

151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG

201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA

251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG

301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC

351 CGTGTCCTCT(SEQ ID NO：174)

V2.16重链可变区的氨基酸序列(基于AbM定义的CDR显示在其后的下划线区)如下：

1   EVQLVESGGGL VQPGGSLRLSCTGSGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWIGR

51  IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SADNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE

111 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO：175)

以下是带有突变的CH2结构域的人源化MH 2-7V2.11IgG1的氨基酸序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWIGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：176)

可变结构域在氨基酸1-120，CH1在121-218，铰链在219-233，CH2在234-343，CH3在344-450。轻链包括带有1-133的可变结构域的以下序列。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSHIPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：177)

实施例11：MJ2-7示例变体的功能性测定

我们在IL-13活性的测定中评估了MJ2-7抗体和人源化变体抑制人IL-13的能力。

STAT6磷酸化测定

在含有10％FBS、青霉素-链霉素、谷氨酰胺和碳酸氢钠的McCoy5A培养基中以贴壁单层培养HT-29人结肠上皮细胞(ATCC)。为进行测定，使用胰蛋白酶从瓶上移下细胞、冲洗到新鲜培养基并分配到12×75mm聚苯乙烯管中。以100-0.01ng/ml范围的浓度加入重组人IL-13(R&DSystems，Inc.)。对于测试抗体抑制IL-13应答能力的测定，与500-0.4ng/ml的抗体稀释液一起加入1ng/ml的重组人IL-13。在水浴中以37℃温育细胞30-60分钟，接着洗涤到用冰预冷的含有1％BSA的PBS中。通过在PBS中的1％多聚甲醛中在37℃温育15分钟来固定细胞，接着洗涤到含有1％BSA的PBS中。为透化细胞核，在无水甲醇中以-20℃温育细胞过夜。将它们洗涤到含有1％BSA的PBS中，接着用ALEXA^TM Fluor 488的标记针对STAT6的抗体(BD Biosciences)染色。用FACSCAN^TM和CELLQUEST^TM软件(BD Biosciences)分析荧光。

人单核细胞上的CD23诱导

通过在(Sigma)上分层从人外周血中分离单核细胞。将细胞洗涤到含有10％热灭活的FCS、50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺的RPMI中，并平板接种到48孔组织培养板(Costar/Corning)中。以100-0.01ng/ml范围的稀释度加入重组人IL-13(R&D Systems，Inc.)。对于测试抗体抑制IL-13应答能力的测定，与500-0.4ng/ml的抗体稀释液一起加入1ng/ml的重组人IL-13。在5％CO₂培养箱中在37℃温育细胞过夜。第二天，使用非酶细胞解离溶液(Sigma)从孔中获得细胞，接着洗涤到用冰预冷的含1％BSA的PBS中。细胞与用藻红蛋白(PE)标记的针对人CD23的抗体(BD Biosciences，San Diego，CA)和Cy-Chrome标记的针对人CD11b的抗体(BD Biosciences)一起温育。基于高的正向和侧向光散射和CD11b的表达来选通(gate)单核细胞。使用FACSCAN^TM(BD Biosciences)通过流式细胞术测定单核细胞上的CD23表达，并用CELLQUEST^TM软件(BD Biosciences)分析CD23⁺细胞的百分比。

TF-1细胞增殖

TF-1细胞是因子依赖性人造血细胞系，其长期生长需要白细胞介素3(IL-3)或粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。TF-1细胞还应答多种其他细胞因子，包括白细胞介素13(IL-13)。在含有10％热灭活FCS、50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺和5ng/ml重组人GM-CSF(R&D Systems)的RPMI培养基中维持TF-1细胞(ATCC)。测定之前使细胞饥饿GM-CSF过夜。为进行测定，以5000个细胞/孔一式二份将TF-1细胞接种在96孔平底微量滴定板(Costar/Corning)中，并用100-0.01ng/ml范围的人IL-13(R&D Systems)刺激。置于含5％CO₂的37℃培养箱中72小时后，以1μCi/孔的³H-胸苷(Perkin Elmer/NewEngland Nuclear)脉冲细胞。再温育4.5小时，接着使用TOMTEK^TM收获器将细胞收获在滤纸垫上。通过液体闪烁计数评估³H-胸苷的掺入。

生腱蛋白产生测定

在含有补充物的BEGM培养基(Clonetics)中维持BEAS-2B人支气管上皮细胞(ATCC)。将细胞每孔20000个接种在96孔平底培养板中过夜。在存在或不存在指示抗体的情况下加入含有IL-13的新鲜培养基。过夜温育后收获上清液并通过ELISA测定细胞外基质组分生腱蛋白C的存在。用PBS中1μg/ml针对人生腱蛋白的小鼠单克隆抗体(IgG1，k；Chemicon International)包被ELISA平板。用含有0.05％

的PBS(PBS-Tween)洗涤平板，并用含有1％BSA的PBS封闭。每6分钟加入新的封闭液，共更换三次。用PBS-Tween洗涤平板三次。加入细胞上清液或者人生腱蛋白标准品(Chemicon International)并在37℃温育60分钟。用PBS-Tween洗涤平板三次。用针对生腱蛋白的小鼠单克隆抗体(IgG2a，k；Biohit)检测生腱蛋白。用HRP标记的针对小鼠IgG2a的抗体和其后的TMB底物检测结合。用0.01N硫酸终止反应。在450nm处读出吸光度。

HT29人上皮细胞系可用于测定STAT6磷酸化。将HT29细胞在提高浓度的测试抗体存在下与1ng/ml天然人IL-13粗制备物一起在37℃温育30分钟。使用针对磷酸化STAT6的抗体对细胞裂解物的蛋白质印迹分析可用于检测剂量依赖性的IL-13介导的STAT6磷酸化。类似地，流式细胞术分析可以检测HT29细胞中磷酸化的STAT6，所述HT29细胞用饱和浓度的IL-13在37℃处理30分钟、固定、透化并用ALEXA^TM Fluor 488标记的针对磷酸-STAT6的mAb染色。表1中公开了一组示例性结果。V2.11的抑制活性与sIL-13Ra2-Fc相当。

表1

实施例12：IL-13与IL-13Rα1之间的结合相互作用

通过x射线晶体学研究了IL-13、IL-13Rα1胞外结构域(SEQ IDNO：125的残基27-342)和结合人IL-13的抗体的复合体。参阅如Ap.16163-029001。在IL-13和IL-13Rα1之间发现了两个显著相互作用点。IL-13Rα1的Ig结构域1与IL-13之间的相互作用导致形成跨越两个分子的延伸的β折叠。IL-13(SEQ ID NO：124、成熟序列[全长序列(SEQ IDNO：178)])的残基Thr88[Thr107]、Lys89[Lys108]、Ile90[Ile109]和Glu91[Glu110]形成与受体(SEQ ID NO：125)的残基Lys76、Lys77、Ile78和Ala79相互作用的β链。此外，IL-13(SEQ ID NO：124[SEQ ID NO：178])的Met33[Met52]延伸到由这些相邻链的侧链形成的疏水口袋中。

与Ig结构域3的相互作用的主要特征是IL-13(SEQ ID NO：124[SEQID NO：178])的疏水残基(苯丙氨酸107[苯丙氨酸126])插入受体IL-13Rα1Ig结构域3中的疏水口袋中。IL-13Rα1的疏水口袋由残基亮氨酸319、半胱氨酸257、精氨酸256和半胱氨酸320(SEQ ID NO：125)的侧链形成。与IL-13(SEQ ID NO：124[SEQ ID NO：178])的苯丙氨酸107[苯丙氨酸126]的相互作用导致IL-13Rα1(SEQ ID NO：125)的氨基酸残基Ile254、Ser255、Arg256、Lys318、Cys320和Tyr321与IL-13(SEQ ID NO：124[SEQ IDNO：178])的氨基酸残基Arg11[Arg30]、Glu12[Glu31]、Leu13[Leu32]、Ile14[Ile33]、Glu15[Ile34]、Lys104[Lys123]、Lys105[Lys124]、Leu106[Leu125]、Phe107[Phe126]和Arg108[Arg 127]之间广泛的范德华相互作用。这些结果证明与涉及IL-13Rα1相互作用的IL-13区域结合的IL-13结合剂可用于抑制IL-13信号传递。

实施例13：人源化MJ2-7抗体在COS细胞中的表达

为评估嵌合抗NHP IL13抗体在哺乳动物重组系统中的表达，将小鼠MJ 2-7抗体可变区亚克隆进含有人κ和IgG1 mut恒定区的pED6表达载体中。在含有10％热灭活胎牛血清、1mM谷氨酰胺和0.1mg/ml青霉素/链霉素的DME培养基(Gibco)中培养猴肾COS-1细胞。使用TRANSITIT^TM-LT1转染试剂(Mirus)按照试剂供应商建议的方案进行COS细胞的转染。在10％CO₂的存在下37℃下温育转染的COS细胞24小时、用无菌PBS洗涤并接着在无血清培养基R1CD1(Gibco)中培养48小时，以允许抗体分泌并在条件培养基中累积。使用纯化的人IgG1/κ抗体作为标准品通过总人IgG ELISA定量chMJ 2-7抗体的表达。

嵌合MJ 2-7抗体在COS细胞中的产生显著低于对照嵌合抗体(表2)。因此在MJ 2-7人源化过程中包括了Ab表达的优化。通过将小鼠MJ 2-7重链CDR移植到最同源的人种系克隆DP 25上来构建人源化MJ 2-7V1，DP 25良好表达并代表了典型的人抗体应答。将轻链CDR亚克隆到人种系克隆DPK 18上，以产生huMJ 2-7 V1 VL。通过将CDR移植产生人源化MJ 2-7V2：将MJ 2-7重链可变区CDR移植到DP 54人种系基因构架上，将MJ 2-7轻链可变区CDR移植到DPK9人种系基因构架上。DP 54克隆属于人VH III种系亚组，DPK9来自人种系基因Vκ I亚组。包含VH III和Vκ I构架的抗体分子在大肠杆菌系统中具有高表达水平，并在水溶液中具有高稳定性和溶解度(参阅如Stefan Ewert等，J.Mol.Biol.(2003)，325；531-553、Adrian Auf等，Methods(2004)34：215-224)。我们已在若干重组抗体的产生中使用了DP54/DPK9人构架的组合，并在瞬时COS转染实验中实现了抗体的高表达(>20μg/ml)。

表2

 

mAb	表达，μg/ml
		3D6	10.166
Ch MJ 2-7 pED6(1)	2.44
		Ch MJ 2-7 pED6(2)	2.035
h12A11 V2	1.639

将移植了CDR的MJ 2-7 V1和V2 VH和VL基因亚克隆进两个哺乳动物表达载体系统(pED6κ/pED6 IgG1 mut和pSMEN2κ/pSMED2IgG1mut)，并如上文所述在瞬时COS转染实验中评估人源化MJ2-7抗体的产生。在第一组实验中评估了的huMJ 2-7 VL和VH的多种组合对抗体表达的影响(表3)。将MJ 2-7 VL构架区改变为DKP9提高抗体产生8-10倍，而VL V1(移植到DPK 18上的CDR)在抗体产生中仅显示中等程度的提高。在将人源化VL与嵌合MJ 2-7 VH和人源化MJ 2-7 V1和V2组合时观察到了这种效果。在相同的测定条件下，移植了CDR的MJ 2-7 V2的表达水平比移植了CDR的MJ 2-7 V1高3倍。

表3

 

mAb	表达，μg/ml
		ChMJ 2-7	1.83
hVH V1/mVL	3.04
		hVH V1/hVL V1	6.34
hVH V1/hVL V2	15.4
		hVH-V2/mVL	0.2
mVH/hVL-V2	18.41
		hVH-V2/hVL-V1	5.13
hVH-V2/hVL-V2	10.79

用重链可变区中含有回复突变的hu MJ 2-7 V2进行了类似的实验(表4)。对保留小鼠MJ 2-7抗体的抗原结合和中和特性的hu MJ 2-7 V2-11检测到了最高表达水平。在位置48和49(V48I和A49G)引入回复突变提高了hu MJ 2-7 V2抗体在COS细胞中的产生，而位置23、24、67和68处氨基酸的回复突变(A23T、A24G、R67K和F68A)对抗体表达具有负面影响。

表4

实施例14：通过NHP IL-13FLAG ELISA评估人源化MJ 2-7抗体的 抗原结合特性

通过ELISA评估完全人源化的MJ 2-7mAb(V1，V2 v2)与生物素化的小鼠MJ 2-7竞争结合NHP IL-13-FLAG的能力。用1μg/ml的抗FLAG单克隆抗体M2(Sigma)包被微量滴定板(Costar)。将10ng/ml浓度的FLAGNHP IL-13蛋白与10ng/ml生物素标记的小鼠MJ 2-7抗体和多种浓度的未标记小鼠和人源化MJ 2-7抗体混合。将混合物在室温下温育2小时，接着加入抗FLAG抗体包被的平板。用链霉抗生物素蛋白-HRP和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)检测FLAG NHP-IL-13/bioMJ2-7Ab复合体的结合。人源化MJ 2-7 V2显著丧失了活性，而hu MJ 2-7 V2.11完全恢复了抗原结合活性并能与生物素化的MJ 2-7 mAb竞争结合FLAG-NHP IL-13。BIACORE^TM分析也证实了NHP IL-13与固定化的h1u MJ 2-7 V2.11快速结合并缓慢解离。

实施例15：人源化MJ 2-7 V2VH的分子建模

基于对蛋白质数据库(PDB)的BLAST同源性搜索选择用于建模人源化MJ2-7重链形式2(MJ2-7V2VH)的结构模板。除了从BLAST搜索输出中选择的两个结构以外，从蛋白质结构的内部数据库中选择了另一个模板。使用三个模板结构1JPS(人组织因子与人源化Fab D3h44的复合体的共结晶结构)、1N8Z(人Her2与Herceptin Fab的复合体的共结晶结构)和F13.2(IL-13与小鼠抗体Fab片段的复合体)作为模板并用InsightII(Accelrys，San Diego)同源性模块建立MJ2-7 V2VH的模型。基于每个分子的Cα距离矩阵测定1JPS、1N8Z和F13.2(可得自Ap.16163-029001)的结构保守区(SCR)，并基于SCR中相应原子的最小RMS偏差重叠模板结构。将靶蛋白MJ2-7 V2VH的序列与重叠的模板蛋白序列进行比对，并给靶蛋白的相应残基分配SCR的坐标。基于每个SCR中靶标和模板之间序列相似性的程度在不同的SCR中使用来自不同模板的坐标。通过同源性模块中应用的Search Loop或Generate Loop方法产生不包括在SCR中的环和可变区的坐标。简言之，Search Loop方法通过用预计算的矩阵比较SCR侧翼残基的Cα距离矩阵来扫描两个SCR之间正确匹配的蛋白质结构，所述预计算的矩阵来自具有相同数目的侧翼残基和给定长度的间插肽区段的蛋白质结构。在Search Loop未产生所需结果的情况下使用从头产生原子坐标的Generate Loop方法。如果模板和靶标中的氨基酸残基相同，则氨基酸侧链的构象保持与模板相同。然而进行了对旋转异构体的构象搜索，对模板和靶标中不同的残基保持其能量上最有利的构象。其后是Splice Repair，它建立分子力学模拟以推导出两个SCR之间或SCR与可变区之间结合处正确的键长和键角。最后使用最速下降(Deepest Descents)算法使模型能量最小化直至得到5kcal/(mol

)的最大导数或500个循环或使用共轭梯度(Conjugate Gradients)算法直至得到5kcal/(mol

)的最大导数或2000个循环。使用ProStat/Struct_Check命令评估模型的质量。

按照所述用于人源化MJ2-7 V2VH的方案建立小鼠MJ2-7 VH的分子模型，只是其中使用的模板为马抗细胞色素c抗体FabE8的晶体结构1QBL和1QBM。

通过模型预测的CDR构架H键中的可能差异：

hMJ2-7V2VH：G26-hMJ2-7V2VH：A24

hMJ2-7V2VH：Y109-hMJ2-7V2VH：S25

mMJ2-7VH：D61-mMJ2-7VH：I48

mMJ2-7VH：K63-mMJ2-7VH：E46

mMJ2-7VH：Y109-mMJ2-7VH：R98

这些差异提示以下的任选回复突变：A23T、A24G和V48I。

基于单个氨基酸的显著RMS差和其毗邻氨基酸残基的差异提示的其他任选回复突变为：G9A、L115T和R87T。

实施例16：MJ2-7和C65的IL-13中和活性

在一系列生物测定中测试了MJ2-7和C65的IL-13中和能力。首先在单核细胞CD23表达测定中测试了这些抗体中和NHP IL-13的生物活性的能力。在渐增浓度的MJ2-7、C65或sIL-13Rα2-Fc存在下将新分离的人PBMC与3ng/ml NHP IL-13温育过夜。收获细胞，用CYCHROME^TM标记的针对单核细胞特异性标记CD11b的抗体和PE标记的针对CD23的抗体染色。在对IL-13处理的应答中，CD23在单核细胞表面上的表达被上调，基于CD11b的表达对单核细胞进行选通(gate)。在此测定中MJ2-7、C65和sIL13Rα2-Fc都能中和NHP IL-13的活性。MJ2-7与sIL-13Rα2-Fc的效能相当。C65的活性约为1/20(图2)。

在第二个生物测定中，在STAT6磷酸化测定中测试MJ2-7和C65对天然人IL-13的中和能力。渐增浓度的MJ2-7、C65或sIL-13Rα2-Fc存在下将HT-29上皮细胞系与0.3ng/ml天然人IL-13在37℃温育30分钟。固定细胞、透化并用ALEXA^TM Fluor 488标记的针对磷酸化STAT6的抗体染色。IL-13处理刺激STAT6磷酸化。在此测定中MJ2-7、C65和sIL13Ra2-Fc都能中和天然人IL-13的活性(图3)。小鼠MJ2-7抗体和人源化形式(V2.11)的IC50分别为0.48nM和0.52nM。MJ2-7和sIL-13Rα2-Fc的效能大致相等。sIL-13Ra2-Fc的IC50为0.33nM(图4)。C65的活性约为1/20(图5)。

在第三个生物测定中，在生腱蛋白产生测定中测试了MJ2-7中和天然人IL-13的能力。在渐增浓度的MJ2-7存在下将人BEAS-2B肺上皮细胞系与3ng/ml天然人IL-13温育过夜。收获上清液并通过ELISA测试细胞外基质蛋白生腱蛋白C的产生(图6A)。MJ2-7以约0.1nM的IC50抑制此应答(图6B)。

这些结果证明MJ2-7是NHP IL-13和天然人IL-13的有效中和剂。MJ2-7的IL-13中和能力与sIL-13Rα2-Fc相等。MJ1-65也具有IL-13中和活性，但效能为MJ2-7的约1/20。

实施例17：通过SPR对MJ2-7抗体进行表位作图

通过标准胺偶联将sIL-13Rα2-Fc直接包被到CM5芯片上。注射100nM浓度的NHP-IL-13，通过BIACORE^TM检测其与固定化IL-13Rα2-Fc的结合。再注射100nM的抗IL-13抗体并监测结合的变化。当与huIL-13Rα2形成复合体时，MJ2-7抗体不与NHP-IL-3结合，而阳性对照抗IL-13抗体则结合(图7)。这些结果说明hu IL-13Rα2和MJ2-7结合NHPIL-13上相同或重叠的表位。

实施例18：NHP-IL-13与人源化MJ2-7 V2-11抗体之间相互作用的 动力学速率常数的测量

为制备生物传感器表面，使用胺偶联将山羊抗人IgG Fc特异性抗体固定在研究级羧甲基葡聚糖芯片(CM5)上。用0.1M1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物活化表面。以乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中10μg/ml的浓度注射捕获抗体。用1.0M乙醇胺(pH 8.0)封闭剩余的活化基团。作为对照，用第一个流动室作为参照表面以校正总体折射率(bulk refractive index)、基质效应和非特异性结合，用捕获分子包被第2、3和4个流动室。

为进行动力学分析，通过注射40μl 1μg/ml溶液将单克隆抗体hMJ2-7 V2-11捕获至抗IgG抗体表面。取注射完成30秒后的点与基线之间的净差值代表结合的靶的量。一式三份以每分钟100μl的流速注射600、200、66.6、22.2、7.4、2.5、0.8、0.27、0.09和0nM浓度的NHP-IL-13溶液2分钟，以时间的函数记录结合的物质的量(图8)。以相同的流速在HBS/EP缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4，含有150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％(体积/体积)表面活性剂P20)中监测解离相5分钟，接着注射5μl甘氨酸(pH 1.5)两次以产生具有完全活性的捕获表面。所有动力学实验都在HBS/EP缓冲液中在22.5℃下进行。使用双参照为每个传感图(sensorgram)减去空白和缓冲液效应。

使用应用于1:1模型的BIAEVALUATION^TM软件3.0.2分析动力学数据。使用全局分析从传感图的适当区域计算表观解离(kd)和结合(ka)速率常数。通过下式从动力学速率常数计算抗体与NHP IL-13之间相互作用的亲和力常数：Kd＝kd/ka。这些结果说明huMJ2-7 V2-11具有分别为2.05 x 10⁷M^-1s^-1和8.89 x 10^-4j 1/s的结合和解离速率，使抗体对NHP-IL-13具有43pM的亲和力。

实施例19：MJ2-7人源化中间体在生物测定中的抑制活性

通过STAT6磷酸化和生腱蛋白产生生物测定测试了人源化过程中多种中间体的抑制活性。用次最高水平的NHP IL-13或天然人IL-13粗制备物引发生物应答，测定应答的半最大抑制所需的MJ2-7人源化形式的浓度。对与人IgG1和κ恒定区一起表达的hMJ2-7 V1、hMJ2-7 V2、hMJ2-7 V3的分析显示形式2保留了针对天然人IL-13的中和活性。天然人IL-13生物活性的半最大抑制所需的形式2人源化抗体的浓度比小鼠MJ2-7高约110倍(图9)。对半人源化形式(其中将V1或V2VL与小鼠MJ2-7VH组合)的分析证明天然人IL-13中和活性的降低不是由于人源化的VL，而是由于VH序列(图10)。而具有VL V1的半人源化MJ2-7抗体仅部分保留了中和活性，具有人源化VL V2的形式与亲本小鼠抗体活性相同。因此，在V1 VH序列中引入了一系列的回复突变以提高小鼠MJ2-7的天然人IL-13中和活性。

实施例20：MJ2-7阻断IL-13与IL-13Rα1和IL-13Rα2的相互作用

MJ2-7对NHP IL-13的C端19-mer具有特异性，该19mer对应于未成熟蛋白(SEQ ID NO：24)的氨基酸残基114-132和成熟蛋白(SEQ IDNO：14)的残基95-113。就人IL-13而言，已经报道形成蛋白质Dα螺旋的部分的这一区域含有对与IL-13Rα1和IL-13Rα2的结合重要的残基。对人IL-13突变体的分析鉴定了A、C和D螺旋含有IL-13Rα1/IL-4Rα信号复合体的重要接触位点(Thompson和Debinski(1999)J.Biol.Chem.274：29944-50)。D螺旋的丙氨酸扫描诱变鉴定了残基K123、K124和R127(SEQID NO：24)负责与IL-13Rα2的相互作用，残基E110、E128和L122是IL-13Rα1的重要接触点(Madhankmuar等(2002)J.Biol.Chem.277：43194-205)。通过NMR测定的人IL-13的高分辨率溶液结构已经基于与已知结构的相关配体-受体对的相似性预测了IL-13的结合相互作用。这些NMR研究支持IL-13A和D螺旋在与IL-13Rα1的重要接触中发挥关键作用(Eisenmesser等(2001)J.Mol.Biol.310：231-241；Moy等(2001)J.Mol.Biol.310：219-230)。预期MJ2-7与位于IL-13C端D螺旋的这一表位结合将破坏IL-13与IL-13Rα1和IL-13Rα2的相互作用。

通过ELISA测试MJ2-7抑制NHP IL-13与IL-13Rα1和IL-13Rα2的结合的能力。将重组可溶形式的人IL-13Rα1-Fc和IL-13Rα2-Fc包被在ELISA平板上。在渐增浓度的MJ2-7的存在下加入FLAG标记的NHPIL-13。结果显示MJ-27与两种可溶性受体形式都竞争结合NHP IL-13(图11A和11B)。这提供了MJ2-7中和IL-13生物活性的基础。

实施例21：MJ2-7轻链CDR促成抗原结合

为评估MJ2-7抗体与NHP IL-13的结合是否需要全部三个轻链CDR区，通过CDR移植构建了MJ2-7VL的另外两个人源化形式。基于人种系克隆DPK18设计VL形式3，其含有人种系克隆的CDR1和CDR2和来自小鼠MJ2-7抗体的CDR3(图12)。在第二个构建体(hMJ2-7V4)中仅将MJ2-7抗体的CDR1和CDR2移植到DPK18构架上，CDR3来自无关的小鼠单克隆抗体。

通过将hMJ 2-7V HV1与hMJ 2-7 VL V3和V4组合，在COS细胞中产生人源化MJ 2-7 V3和V4。通过直接NHP IL-13结合ELISA检查抗体的抗原结合特性。缺少MJ 2-7轻链CDR3的hMJ 2-7 V4保留了与NHPIL-13结合的能力，而轻链中含有人种系CDR1和CDR2的V3不与固定化的NHP IL-13结合。这些结果证明MJ2-7抗体轻链的CDR1和CDR2最有可能负责此抗体的抗原结合特性。

hMJ2-7VLV3的核苷酸序列

1   ATGCGGCTGC CCGCTCAGCT GCTGGGCCTG CTGATGCTGT GGGTGCCCGG

51  CTCTTCCGGC GACGTGGTGA TGACCCAGTC CCCTCTGTCT CTGCCCGTGA

101 CCCTGGGCCA GCCCGCTTCT ATCTCTTGCC GGTCCTCCCA GTCCCTGGTG

151 TACTCCGACG GCAACACCTA CCTGAACTGG TTCCAGCAGA GACCCGGCCA

201 GTCTCCTCGG CGGCTGATCT ACAAGGTGTC CAACCGCTTT TCCGGCGTGC

251 CCGATCGGTT CTCCGGCTCC GGCAGCGGCA CCGATTTCAC CCTGAAGATC

301 AGCCGCGTGG AGGCCGAGGA TGTGGGCGTG TACTACTGCT TCCAGGGCTC

351 CCACATCCCT TACACCTTTG GCGGCGGAAC CAAGGTGGAG ATCAAG(SEQID NO：189)

hMJ2-7VL V3的氨基酸序列

MRLPAQLLGLLMLWVPGSSG-DVVMTQSPLSLPVTLGQPAS1SCRSSQSLVYSDGNTYLNW

FQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIP

YTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：190)

hMJ2-7VL V4的核苷酸序列

GATGTTGTGATGACCCAATCTCCACTCTCCCTGCCTGTCACTCCTGGAGAGCCAGCCTCC

ATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTGCATAGTAATGGAAACACCTACCTGGAATGG

TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTT

TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATC

AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAAGTTCACATGTTCCT

CTCACCTTCGGTCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA(SEQ ID NO：191)

hMJ2-7VL V4的氨基酸序列

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPQ LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCFQSSHVP LTFGQGTKLE IK(SEQ ID NO：192)

Claims (35)

1.抗体分子，其包含形成抗原结合部位的重链免疫球蛋白可变结构域序列和轻链免疫球蛋白可变结构域序列，所述抗原结合部位以小于10^-7M的K_D与IL-13结合，其中该抗体或抗原结合片段具有一种或多种以下特性：

(a)重链免疫球蛋白可变结构域序列包含重链CDR3，所述CDR3与mAbMJ2-7的重链CDR3相差少于3个氨基酸替换；

(b)轻链免疫球蛋白可变结构域序列包含轻链CDR，所述CDR与mAbMJ2-7的对应的轻链CDR相差少于3个氨基酸替换；

(c)重链免疫球蛋白可变结构域序列包含核酸编码的序列，所述核酸在高严格条件下与编码V2.1、V2.3、V2.4、V2.5、V2.6、V2.7或V2.11的重链可变结构域的核酸的互补序列杂交；

(d)轻链免疫球蛋白可变结构域序列包含核酸编码的序列，所述核酸在高严格条件下与编码V2.11的轻链可变结构域的核酸的互补序列杂交；

(e)重链免疫球蛋白可变结构域序列与V2.1、V2.3、V2.4、V2.5、V2.6、V2.7或V2.11的重链可变结构域具有至少90％的同一性；

(f)轻链免疫球蛋白可变结构域序列与V2.11的轻链可变结构域具有至少90％的同一性；

(g)抗体分子与mAb MJ2-7竞争结合人IL-13；

(h)抗体分子与IL-13的一个或多个氨基酸残基接触，所述残基选自：SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：178的残基116、117、118、122、123、124、125、126、127和128；

(i)重链可变结构域序列在高变环1、2和/或3中与mAb MJ2-7具有相同的典型结构；

(j)轻链可变结构域序列在高变环1、2和/或3中与mAb MJ2-7具有相同的典型结构；

(k)重链可变结构域序列和/或轻链可变结构域序列中分别具有来自种系基因DP-54和DPK-9编码的VH区段的FR1、FR2和FR3构架区或与种系基因DP-54和DPK-9编码的VH区段具有至少95％同一性的序列。

2.权利要求1的抗体分子，其是纯化的。

3.权利要求1的抗体分子，其是含有Fc结构域的重组IgG。

4.权利要求1的抗体分子，其是Fab或scFv。

5.权利要求1的抗体分子，其包含与人种系构架区具有至少90％同一性的构架区。

6.权利要求1的抗体分子，其包含人构架区、人Fc区或两者。

7.权利要求1的抗体分子，其中重链可变结构域序列的高变环具有与mAb MJ2-7的高变环相同的典型结构，且重链可变结构域包含mAb MJ2-7的至少四个IL-13接触氨基酸残基。

8.权利要求1的抗体分子，其中重链可变结构域序列的构架包含：

(i)对应于49的位置上的甘氨酸；

(ii)对应于72的位置上的丙氨酸；

(iii)对应于48的位置上的异亮氨酸和对应于49的位置上的甘氨酸；

(iv)对应于48的位置上的异亮氨酸、对应于49的位置上的甘氨酸和对应于72的位置上的丙氨酸；

(v)对应于67的位置上的赖氨酸、对应于68的位置上的丙氨酸和对应于72的位置上的丙氨酸；和/或

(vi)对应于48的位置上的异亮氨酸、对应于49的位置上的甘氨酸、对应于72的位置上的丙氨酸和对应于79的位置上的丙氨酸。

9.权利要求1的抗体分子，其降低IL-13与IL-13Rα1结合的能力。

10.权利要求1的抗体分子，其不受SEQ ID NO：24中位置130处存在的多态性影响而与IL-13结合。

11.权利要求1的抗体分子，其结合由SEQ ID NO：1组成的肽和由SEQID NO：2组成的肽的一种或两种。

12.权利要求1的抗体分子，其中重链可变结构域序列包含：

(i)CDR1中的G-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H(SEQ ID NO：48)；

(ii)CDR2中的(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-G(SEQ ID NO：49)；和

(iii)CDR3中的SEENWYDFFDY(SEQ ID NO：17)。

13.权利要求12的抗体分子，其中重链可变结构域序列包含：

CDR1中的GFNIKDTYIH(SEQ ID NO：15)，

CDR2中的RIDPANDNIKYDPKFQG(SEQ ID NO：16)，和

CDR3中的SEENWYDFFDY(SEQ ID NO：17)。

14.权利要求1的抗体分子，其中轻链可变结构域序列包含：

(i)CDR1中的(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)(SEQ ID NO：25)；

(ii)CDR2中的K-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-S(SEQ ID NO：27)；和

(iii)CDR3中的Q-(GSA)-(ST)-(HEQ)-I-P(SEQ ID NO：28)。

15.权利要求14的抗体分子，其中轻链可变结构域序列包含：

CDR1中的RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：18)，

CDR2中的KVSNRFS(SEQ ID NO：19)，和

CDR3中的FQGSHIPYT(SEQ ID NO：20)。

16.分离的重组IgG抗体，其包含两条多肽链：含有V2.11轻链可变结构域的轻链和含有V2.1、V2.3、V2.4、V2.5、V2.6、V2.7或V2.11重链可变结构域的重链。

17.权利要求16的分离的重组IgG抗体，其中重链还包含Fc结构域。

18.药物组合物，其包含权利要求1的抗体分子和可药用载体。

19.权利要求18的药物组合物，其适于皮下、吸入或局部施用。

20.核酸，其包含的序列：

(i)编码包含重链免疫球蛋白可变结构域序列的多肽，该重链免疫球蛋白可变结构域序列：

(a)包含与mAb MJ2-7的对应的CDR3相差少于3个氨基酸替换的重链CDR3；或

(b)与V2.1、V2.3、V2.4、V2.5、V2.6、V2.7或V2.11的重链可变结构域具有至少90％的同一性；或

(ii)在高严格条件下与编码V2.1、V2.3、V2.4、V2.5、V2.6、V2.7或V2.11的重链可变结构域的核酸的互补序列杂交。

21.核酸，其包含的序列：

(i)编码包含轻链免疫球蛋白可变结构域序列的多肽，该轻链免疫球蛋白可变结构域序列：

(a)包含与mAb MJ2-7的对应的CDR相差少于3个氨基酸替换的轻链CDR；或

(b)与V2.11的轻链可变结构域具有至少90％的同一性；或

(ii)在高严格条件下与编码V2.11轻链可变结构域的核酸的互补序列杂交。

22.宿主细胞，其包含编码权利要求1的抗体分子的一种或多种核酸序列。

23.提供重组抗体的方法，所述方法包括：

为宿主细胞提供编码权利要求1的抗体分子的核酸序列，和

在表达抗体分子的条件下维持细胞。

24.权利要求23的方法，所述方法还包括从宿主细胞或维持宿主细胞的培养基中分离蛋白质。

25.权利要求24的方法，所述方法还包括将分离的蛋白质配制为药物组合物。

26.治疗IL-13相关病症的方法，所述方法包括：

对患有病症或有该病症风险的受试者施用有效量的权利要求1的抗体分子。

27.权利要求26的方法，其中IL-13相关病症选自：哮喘病、特应性病症、慢性阻塞性肺病(COPD)、与呼吸道炎症相关的疾病、嗜酸粒细胞增多、纤维化和粘液产生过度、炎性疾病、自身免疫疾病、肿瘤或癌症、病毒感染和保护性1型免疫应答表达的抑制。

28.权利要求26的方法，其中所述病症为哮喘病或变应性鼻炎。

29.权利要求26的方法，其中所述病症为炎性肠病。

30.权利要求26的方法，其中所述病症为慢性阻塞性肺病(COPD)。

31.权利要求26的方法，其中所述病症为特应性病症。

32.权利要求26的方法，其中皮下、吸入或局部施用蛋白质。

33.检测样品中IL-13的存在的方法，所述方法包括：

(i)将样品与根据权利要求1的抗IL-13抗体分子接触；和

(ii)使用抗IL-13抗体分子检测样品中的IL-13。

34.权利要求33的方法，其中样品来自受试者。

35.治疗显示出哮喘症状的受试者的方法，所述症状选自：哮鸣、呼吸急促、支气管收缩、呼吸道高反应性、缩小的肺容量、纤维化、呼吸道炎症和粘液产生，所述方法包括对患者施用根据权利要求1的抗体的步骤，其中抗体与IL-13结合并干扰功能性IL-13信号复合体的形成。

Images